Summary
Här presenterar vi en enkel metod för att separera follikulära celler och äggceller i zebrafisk äggstockssäckar, vilket kommer att underlätta undersökningar av äggstocksutveckling hos zebrafisk.
Abstract
Zebrafisk har blivit en idealisk modell för att studera äggstocksutvecklingen hos ryggradsdjur. Follikeln är äggstockens grundläggande enhet, som består av oocyter och omgivande follikulära celler. Det är viktigt att separera både follikulära celler och oocyter för olika forskningsändamål såsom för primär odling av follikulära celler, analys av genuttryck, oocytemognad och in vitro-befruktning etc. Den konventionella metoden använder tång för att separera båda facken, vilket är mödosamt, tidskrävande och har hög skada på äggcellen. Här har vi etablerat en enkel metod för att separera båda facken med hjälp av en dragen glas kapillär. Under ett stereomikroskop kan oocyter och follikulära celler enkelt separeras genom pipettering i ett utdraget fint glas kapillär (diametern beror på follikeldiametern). Jämfört med den konventionella metoden har denna nya metod hög effektivitet vid separation av både oocyter och follikulära celler och har låg skada på äggcellerna. Ännu viktigare är att denna metod kan tillämpas på tidiga folliklar inklusive i pre-vitellogenesis-stadiet. Således kan denna enkla metod användas för att separera follikulära celler och oocyter av zebrafisk.
Introduction
Zebrafisk är en viktig modellorganism för studier av ryggradsdjursutveckling och fysiologi. Zebrafisken kan fungera som en bra modell för att studera de molekylära mekanismerna för äggstocksutveckling1,2,3. Många funktioner i äggstocksutveckling är mycket bevarade under evolutionen från fisk till däggdjur1,2. I likhet med de andra ryggradsdjuren har zebrafisk vuxna asynkrona äggstockar, innehållande äggstockssäckar i alla utvecklingsstadier4. Follikeln är äggstockens grundläggande reproduktiva element. Follikeln består av oocyten som är omgiven av ett eller flera lager av somatiska celler som kallas follikulära celler. Utvecklingen av folliklar beror på den dubbelriktade kommunikationen mellan oocyter och follikulära celler5. Det är viktigt att separera follikulära celler och oocyter från äggstockssäckar för olika forskningsändamål såsom follikulär cell primärkultur, genuttrycksanalys, oocytemognad och in vitro-befruktning.
Traditionella separationsmetoder inkluderar mekanisk separation med tång och enzymatisk matsmältning6,7,8,9,10. Den mekaniska separationen med tång är dock tidskrävande och mödosam. Det kommer också att orsaka de höga skadorna på äggcellen under separationen. Även om enzym matsmältningsmetoden är enkel att använda och kräver en kort tid, bör behandlingstiden och enzymkoncentrationen valideras, och integriteten och överlevnadsgraden för de isolerade äggcellerna är inte idealisk. Därför har vi etablerat en enkel metod för att separera båda facken i olika utvecklingsstadier med hjälp av dragna kapillärrör i glas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer som utförs i fiskförsök är i enlighet med bestämmelserna i Animal Experimentation Ethics Committee of Northwest Normal University.
1. Förberedelser
- Djur
- Använd vuxna kvinnliga zebrafiskar med en kroppslängd på 4-6 cm.
Obs: Vi använde zebrafisk från en lokal marknad. - Håll zebrafisken i ett cirkulerat vattensystem med en 14 h ljus och 10 h mörk cykel vid ca 28 °C.
- Mata fisk två gånger dagligen med nykläckta saltlakeräkor.
- Använd vuxna kvinnliga zebrafiskar med en kroppslängd på 4-6 cm.
- Dragen glas kapillär
- Använd en 15 cm glas kapillär och placera huvudet i en alkoholbrännare för att värma det. Håll ena änden av glas kapillären för hand och håll den andra änden med tång.
- Efter uppvärmning 5-10 sekunder blir glaset på elden av alkoholbrännare rött och mjukt. Sträck på glas kapillärens huvud med tång för att göra kapilläröppningen med önskad diameter.
OBS: Diametern beror på follikeldiametrar: previtellogenic (PV; ca 0,30 mm i diameter), tidig vitellogenic (EV; ca 0,40 mm i diameter), midvitellogenic (MV; ca 0,50 mm i diameter), sen vitellogenic (LV; ca 0,60 mm i diameter) och fullvuxen men omogen (FG; ca 0,65 mm i diameter). - Sträck öppningen av glas kapillär till lämplig diameter, som är något mindre storleken på separerade folliklar. Glaskapillären med en öppning som är mycket större än storleken på äggstockssäckar kan inte utföra separation, men de mycket mindre skulle bryta folliklarna under separationen. Öva sträckningen av glas kapillären flera gånger.
OBS: Uppvärmningstiden beror på storleken på glas kapillären. Sträck inte direkt på glaskeillären vid brand av alkoholbrännare. Det kommer att bryta glaskaperiet. - Skär glaskapärlen med en ampullskärare och bryt glaskapäriet med tång för att få ett smidigt snitt.
OBS: En skarp eller trasig öppning av glas kapillären skulle skada folliklarna. - Använd ett 30 cm plaströr, sätt in en 1 ml pipettspets med ett filterelement i ena änden, sätt i den dragna glaskapillären i slutet av pipetten och anslut en 200 μL pipettspets i en annan ände.
2. Separation av zebrafiskoocyter och follikulära celler i olika stadier
- Dissekering av zebrafiskens äggstock
- Fyll en ishink till 4/5 full med flytis och tillsätt tillräckligt med fiskvatten för att låta uppslamningsisen flyta. Vänta 2-5 minuter, kontrollera vattentemperaturen och se till att temperaturen ligger mellan 2-4 °C.
- Söv vuxna honor genom att placera fisk i isvattnet i minst 2-5 minuter tills fisken stoppar gillrörelsen. Halshugg fisken genom att skära av ryggmärgen med en vass sax för att säkerställa döden.
- Placera fisken på dissekeringsplattan med tång.
- Använd dissekerande sax för att skära enligt följande. Dissekera från cloaca till gälarna längs bukens mittlinje. Skär från baksidan av cloaca. Skär från den främre spetsen till den dorsala sidan. Ta försiktigt bort huden och musklerna på ena sidan av kroppen. Exponera de inre organen och ta ut hela äggstocken med tång.
- Placera omedelbart äggstockarna försiktigt i en 100 mm kulturrätt som innehåller 60% Leibovitz L-15 (L-15) medium.
- Isolering av äggstockssäckar
OBS: Det mellanlagringssystem som vi har antagit är baserat på den ursprungliga definitionen av Selman et al.4.- Isolera folliklar i olika stadier manuellt med hjälp av ett par fina tångar som beskrivits tidigare8.
- Gruppera äggstockssäckarna i följande steg: PV-, EV-, MV-, LV- och FG-stadier.
- Separation av follikulära celler och oocyt från äggstockssäckar
- Lägg äggstockssäckarna i olika stadier i en ren Petri-maträtt som innehåller 60% L-15 medium.
- Använd den dragna glas kapillären från steg 1.2, sug folliklarna i glas kapillären 2-3 cm och blås ut dem.
OBS: När glas kapillärernas öppningsdiameter är lämplig kan follikeln separeras från äggcellen genom inandning en gång.- Om follikulära cellskiktet är fastsatt på äggcellen ordentligt, upprepa 2-3 gånger för att åstadkomma en fullständig separation. Undvik flera försök att tvinga en follikel genom en mindre kapillär, vilket skulle skada follikeln.
OBS: Vid inandning och utblåsning faller follikulära skiktet av och separeras från äggcellen, och slutligen separeras follikulära celler och denuderade äggceller (figur 1).
- Om follikulära cellskiktet är fastsatt på äggcellen ordentligt, upprepa 2-3 gånger för att åstadkomma en fullständig separation. Undvik flera försök att tvinga en follikel genom en mindre kapillär, vilket skulle skada follikeln.
- Poola de denuded men intakta äggcellerna och samla de överlevande denuded oocytes för ytterligare analyser.
- För att undersöka om follikulära celler separerades från intakta folliklar, färga de intakta folliklarna och separerade äggceller med 4',6-diamidino-2-fenylindole (DAPI).
- Fixera proverna i 4% buffrad paraformaldehyd vid rumstemperatur (RT) i 1 timme. Tvätta flera gånger av PBS.
- Fläck av DAPI på RT i 30 min. Tvättas flera gånger med PBS. Visa och fotografera med ett fluorescensmikroskop (t.ex. Leica DFC7000 T).
- För att bekräfta den slutförda separationen, fixera de intakta folliklarna och separerade äggceller i 4% buffrad paraformaldehyd över natten vid 4 °C och bädda in intissue-frysningsmediet (t.ex. Leica) vid -25 °C.
- Skär de fasta vävnaderna på en mikrotom och montera på glasrutschbanor.
- Tvätta sektionerna i PBS och visualisera cellkärnorna med DAPI. Visa och fotografera på ett fluorescensmikroskop.
3. In vitro-mognad (IVM) och in vitro-befruktning (IVF)
OBS: Förfarandet för IVM av IVF följdes enligt beskrivningen tidigare med mindre modifiering 11,12,13.
- Förbered färskt mognadsmedium (+DHP medium) före ägglossning från vuxen zebrafiskhona. För att förbereda det färska mognadsmediet, tillsätt 9 ml Leibovitz L-15 medium, pH 9,0, till 15 ml koniska rör. Tillsätt 10 μL 17α-20β-dihydroxy-4 pregnen-3-one (DHP) (5 mg/ml), 490 μL dH2O och 500 μL 10% bovin serumalbumin (BSA).
- Förbered Hanks lösning och E3-lösning i förväg. Förbered Hanks lösning enligt beskrivningen i Baars et al.14. Förbered E3 medium: 5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2,0,33 mM MgSO4och 1-5% Metylenblått.
- Utför dissekering av zebrafiskens äggstock och isolering av äggstockssäckar som i steg 2.
- Samla fullvuxna scensäckar och använd som omogna oocyter. För varje vuxen kvinnlig zebrafisk kan minst 150-200 fullvuxna scensäckar isoleras. Välj intakta och friska folliklar för IVM.
- Inkubera de fullvuxna scensäckarna i +DHP-medium i 12-brunnsplattor och kontrollera regelbundet att äggcellerna förblir intakta. Ta bort lysande äggceller med en Pasteur-pipett.
OBS: Under äggcellsmognaden blir äggcellerna gradvis genomskinliga. En majoritet av äggcellerna blir genomskinliga efter behandling av DHP i 2 h. Detta kan observeras under ett dissekerande mikroskop med överförd ljusoptik. - Ta bort de yttersta follikulära cellerna från varje mognadscellocyt enligt beskrivningen i steg 2.3.
- Överför de denuded oocyterna till en Petri-maträtt med några droppar odlingsmedium och fortsätt till befruktning.
- Förbered den färska spermielösningen med testikörer dissekerade från minst tre hanar i 500 μL av Hanks lösning. Lägg spermielösningen på is, där den kan hålla sin styrka av befruktning i upp till 2-3 timmar.
- Tillsätt 100 μL spermielösning för att dementera och mogna oocyter på en petriskål. Tillsätt försiktigt spermielösningen bland äggen och virvla ihop spermierna och äggen med en pipettspets.
- Tillsätt omedelbart 1 ml E3 medium lösning för att aktivera äggen och snurra försiktigt ägg och spermier försiktigt med hjälp av en pipettspets.
- Efter cirka 1 minut efter befruktning (mpf), översvämma plattan med E3 medium lösning. Full chorion expansion kan observeras inom 10-15 mpf.
- Mellan 35-45 mpf, välj embryon som genomgår symmetrisk klyvning i 2-cellsstadiet och som därför befruktas. Ta bort embryon som inte genomgår cellklyvning.
- Låt embryon utvecklas i petriskålen vid 28 °C, med en gräns på 80 embryon per 10 cm tallrik. Visa och fotografera embryoutvecklingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denna metod kan användas för att separera follikulära celler och oocyter i olika stadier av äggstocks follikelutveckling hos zebrafisk. Figur 1 visar separationen av zebrafiskoocyter och follikulära celler från äggstockssäckar med hjälp av ett kapillärglasrör (figur 1). För att undersöka om follikulära celler separerades från intakta folliklar, var de intakta folliklarna och separerade oocyter från olika stadier av folliklar från PV-stadiet till FG-stadiet färgade med DAPI (50 μg/mL) vid 37 °C i 30 minuter. Kärnan i follikulära celler kan färgas av DAPI. Dapis blå signal observerades i intakta folliklar men inte desarmerade äggceller (figur 2). Detta indikerar att follikelns oocyter och follikulära celler kan separeras rent med denna metod. För att ytterligare bekräfta den tydliga separationen, de intakta folliklarna och separerade äggcellerna skars i de histologiska avsnitten. DAPI-färgningsresultat visade att follikulära celler tydligt avlägsnades i denuderade äggceller (figur 3). Alla dessa resultat tyder på att denna metod kan användas för att separera follikulära celler och oocyter i olika steg folliklar av zebrafisk.
Denna metod kan användas för att studera oocyte mognad av zebrafisk. För att studera den dubbelriktade kommunikationen mellan oocyter och follikulära celler under oocytmognaden måste de denuderade äggcellerna erhållas för olika analyser. Med hjälp av en dragen glas kapillär konstaterades de denuded oocytes separerade från fullvuxna stadium zebrafish folliklar att genomgå spontana oocyte mognad utan någon behandling efter 4 timmar inkubation, vanligtvis minst 30% separerade äggceller överlevde och mognadsgraden för dessa överlevde äggceller kan vara upp till 80% (Figur 4). Dessa mogna oocyter kunde genomgå full chorion expansion efter placering i vattnet, vilket tyder på att follikulära celler var helt bort (Figur 4). Således kan denna metod användas för att erhålla de denuded äggcellerna för att studera oocyte mognad av zebrafisk.
Denna metod kan användas för IVF i zebrafisk. In vitro-mognadsmetoder (IVM) har varit väletablerade i zebrafisk. Med hjälp av dessa metoder kan de fullvuxna scensäckarna induceras till mogna steg11,12,13,15,16. För att ytterligare utföra in vitro-befruktning (IVF) måste follikelskiktet av mogna folliklar fortfarande avlägsnas manuellt. Här inducerades IVM av zebrafisk genom behandling av DHP. Follikulära skiktet av mogna folliklar togs bort av ett kapillärglasrör. Dessa defollikulerade äggceller kan befruktas och utvecklas till kläckningsstadiet (figur 5). Resultatet tyder på att denna metod kan användas för IVF i zebrafisk. Vanligtvis kan cirka 10% av friska embryon erhållas från de mogna äggcellerna.
Figur 1. Separation av follikulära celler och äggceller från zebrafisk äggstockssäckar med hjälp av en dragen glas kapillär. 1) Morfologin hos den intakta follikeln på FG-stadiet. 2)Inandning av den intakta follikeln i den dragna glas kapillären. 3)Follikulära cellen lossnar från äggcellen när follikeln blåses ut från den dragna glas kapillären. 4) Framgångsrik separation av follikulära celler och oocyt. Skalstänger: 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Morfologi av intakta folliklar och denuded oocyter separeras från olika stadier av folliklar efter DAPI färgning. Intakt folliklar och separerade äggceller från olika stadier av folliklar från PV steg till FG stadium var färgas av DAPI. De blå signalerna av DAPI observerades i intakta folliklar men inte nekas oocyte. Skalstänger: 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 3. Histologiska delar av intakta folliklar och isolerade äggceller efter DAPI färgning. Cellkärnor av follikulära celler visualiserades med DAPI färgning. Den blå signalen kan observeras. Follicular celler avlägsnades tydligt i denuded oocytes. Skalstänger: 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Mognaden och full chorion expansion av denuded oocytes separeras från fullvuxna stadium folliklar med hjälp av en pulled glas kapillär. A)Morfologin hos intakta folliklar i fullvuxna folliklar. B)De denuderade äggcellerna separerade från fullvuxna folliklar i stadiet kan genomgå spontan oocytemognad utan behandling efter 4 timmars inkubation. C)De mogna äggcellerna kan genomgå fullständig koritionsutvidgning efter aktivering med vatten. Skalbar: 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Morfologin hos tidiga embryon som erhållits av IVM och IVF. IVM inducerades genom behandling av DHP (5 μg/ml) i 2 h. Efter IVM avlägsnades follikulära celler från mogna oocyter av en pulled glas kapillär. De mogna äggcellerna befruktades av IVF. Utvecklingen av embryon i olika stadier sågs och fotograferades. Skalstänger: (A-I) 200 μm, (J) 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver här en ny metod för enkel och snabb separation av follikulära celler och äggceller från zebrafisk äggstockssäckar. Denna metod har flera fördelar jämfört med den konventionella metoden. Primärt bland dessa är den kraftigt ökade lättheten att separera med hög effektivitet och effektivitet, eftersom endast en enda och extern manipulering krävs. Denna punkt ökar tillämpligheten för forskare som inte är bra på mikroskopisk anatomi. Enligt vår erfarenhet kan man framgångsrikt separera follikulära celler och äggceller från en fullvuxen stadium follikel inom 5-10 s med hjälp av glas kapillär. Det behövs dock minst 30-60 s för att göra denna separation med tång. Ännu viktigare, vanligtvis kan minst 20% av de denuded oocyterna separerade av glas kapillären genomgå spontan oocyte mognad. Däremot kan inte mer än 1% av de denuded äggcellerna genomgå spontan oocyte mognad med hjälp av tång. Således är effektiviteten och effektiviteten hos den nya metoden med hjälp av s glas kapillär bättre än den tidigare etablerade metoden med tång. För det andra kan denna metod användas för att separera follikulär cell och oocyted av äggstockssäckar i tidiga utvecklingsstadier såsom PV, EV och MV stadier. Sådan separation kan inte utföras i tidiga skeden folliklar med nuvarande metoder.
Det finns också några begränsningar med den här metoden. Till exempel är lämplig diameter på glas kapilläröppning avgörande för separation av follikulära celler och äggceller i denna metod. En öppning som är mycket större eller mindre än storleken på äggstockssäckar skulle leda till att separationen misslyckas. Således bör öppningsdiametern för glas kapillär justeras beroende på storleken på äggstockssäckar, vilket behöver lite övning.
Separation av follikulära celler och äggceller har flera tillämpningar för att studera äggstockscancer utveckling. Follikulära celler och oocyter i olika stadier av äggstockssäckar som erhålls med denna metod kan användas för att analysera genuttryck. Follikulära celler separerade kan användas för primär cellkultur. Denuded oocytes separerade är användbara för att undersöka korsstjälken mellan follikulära celler och äggceller, och leverera en bra modell för att studera oocyte mognad. Dessutom kan denna metod användas för att avlägsna follikulära celler i vissa analyser såsom in vitro-oocytemognad eller in vitro-befruktning. Tillgången till en metod som kraftigt ökar lättheten och hastigheten i separationen bör underlätta ett bredare utnyttjande av zebrafiskar av äggstockssäckar i det långsiktiga målet att förstå invecklingarna i äggstocksutvecklingen. Dessutom är strukturen hos äggstockssäckar liknande bland olika fiskarter; Således är det intressant att testa om denna metod också kan tillämpas i andra fiskar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta forskningsarbete stöddes av National Natural Science Foundation of China [32060170, 31601205 och 31560334], gästforskare projekt som stöds av China Scholarship Council och fonden för State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology [2020FB05].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 17α,20β-DHP | Cayman | 16146-5 (5 mg) | |
| 24-well plate | Corning | 3524 | |
| Ampoule cutter | AS ONE | 5-124-22 1 bag (100 pieces) | |
| Anhydrous Na2HPO4 | Kaixin Chemical | 500 g | |
| Brine shrimp | Hongjie | 250 g | |
| CaCl2 | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Culture dish | Biosharp | BS-90-D (10PCS/PK) | |
| DAPI | Solarbio | S2110 (25mL) | |
| Dissecting Microscope | ZEISS | Stemi 305 | |
| Dissection forcep | VETUS | HRC30 | |
| Dissection scissor | Kefu | 160 mm | |
| Fluorescence Stereomicroscope | Leica | M205C | |
| Glass capillary | IWAKI | IK-PAS-5P (200 pcs/PACK) | |
| Hoechst 33342 | Solarbio | C0031 (1 mg) | |
| KCl | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| KH2PO4 | Kaixin Chemical | 500 g | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Gibco | 41300-039 (10×1L) | |
| MgSO4•7H2O | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Micropipette tips | Axygen | MCT-150-C | |
| NaCl | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| NaHCO3 | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Penicilia-streptomycia | Gibco | #15140122 (100 mL) | |
| Stereomicroscope | ZEISS | Discover.v20 |
References
- Clelland, E., Peng, C.
- Ge, W. Intrafollicular paracrine communication in the zebrafish ovary: the state of the art of an emerging model for the study of vertebrate folliculogenesis. Molecular and Cellular Endocrinology. 237, 1-10 (2005).
- Li, J., Ge, W. Zebrafish as a model for studying ovarian development: Recent advances from targeted gene knockout studies. Molecular and Cellular Endocrinology. 507, 1-19 (2020).
- Selman, K., Wallace, R. A., Sarka, A., Qi, X. Stages of oocyte development in the zebrafish, Brachydanio rerio. Journal of Morphology. 218, 203-224 (1993).
- Matzuk, M. M., Burns, K. H., Viveiros, M. M., Eppig, J. J. Intercellular communication in the mammalian ovary: oocytes carry the conversation. Science. 296, 2178-2180 (2002).
- Liu, L., Ge, W. Growth differentiation factor 9 and its spatiotemporal expression and regulation in the zebrafish ovary. Biology of Reproduction. 76, 294-302 (2007).
- Zhou, R., Tsang, A. H., Lau, S. W., Ge, W. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) and its receptors in the zebrafish ovary: evidence for potentially dual roles of PACAP in controlling final oocyte maturation. Biology of Reproduction. 85, 615-625 (2011).
- Li, J., Liu, Z., Wang, D., Cheng, C. H. K. Insulin-like growth factor 3 is involved in oocyte maturation in zebrafish. Biology of Reproduction. 84, 476-486 (2011).
- Pang, Y., Thomas, P. Role of G protein-coupled estrogen receptor 1, GPER, in inhibition of oocyte maturation by endogenous estrogens in zebrafish. Developmental Biology. 342, 194-206 (2010).
- Peyton, C., Thomas, P. Involvement of epidermal growth factor receptor signaling in estrogen inhibition of oocyte maturation mediated through the G protein-coupled estrogen receptor (Gper) in zebrafish (Danio rerio). Biology of Reproduction. 85, 42-50 (2011).
- Welch, E. L., Eno, C. C., Nair, S., Lindeman, R. E., F, P. Functional manipulation of maternal gene products using in vitro oocyte maturation in zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (122), e55213 (2017).
- Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. In vitro oocyte culture-based manipulation of zebrafish maternal genes. Developmental Dynamics. 242, 44-52 (2013).
- Seki, S., et al. Development of a reliable in vitro maturation system for zebrafish oocytes. Reproduction. 135, 285-292 (2008).
- Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. Ploidy manipulation of zebrafish embryos with heat shock 2 treatment. Journal of Visualized Experiments. , e54492 (2016).
- Xie, S. L., et al. A novel technique based on in vitro oocyte injection to improve CRISPR/Cas9 gene editing in zebrafish. Scientific Reports. 6, 34555 (2016).
- Li, J., Bai, L., Liu, Z., Wang, W. Dual roles of PDE9a in meiotic maturation of zebrafish oocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2020).
