Summary
Hier stellen wir eine einfache Methode zur Trennung von Follikelzellen und Eizellen in Zebrafisch-Ovarialfollikel vor, die Untersuchungen der Eierstockentwicklung bei Zebrafischen erleichtern.
Abstract
Zebrafische sind zu einem idealen Modell geworden, um die Eierstockentwicklung von Wirbeltieren zu untersuchen. Der Follikel ist die Grundeinheit des Eierstocks, die aus Eizellen und umgebenden Follikelzellen besteht. Es ist wichtig, sowohl Follikelzellen als auch Eizellen für verschiedene Forschungszwecke zu trennen, wie z. B. für die Primärkultur von Follikelzellen, die Analyse der Genexpression, die Oozytenreifung und die In-vitro-Fertilisation usw. Die herkömmliche Methode verwendet Zangen, um beide Fächer zu trennen, was mühsam, zeitaufwändig ist und hohe Schäden an der Eizelle hat. Hier haben wir eine einfache Methode etabliert, um beide Fächer mit einer gezogenen Glaskapillare zu trennen. Unter einem Stereomikroskop können Eizellen und Follikelzellen leicht durch Pipettieren in einer gezogenen feinen Glaskapillare getrennt werden (der Durchmesser hängt vom Follikeldurchmesser ab). Im Vergleich zur herkömmlichen Methode hat diese neue Methode eine hohe Effizienz bei der Trennung von Eizellen und Follikelzellen und hat geringe Schäden an den Eizellen. Noch wichtiger ist, dass diese Methode auf Follikel im Frühstadium angewendet werden kann, auch im Stadium der Prävitellogenese. Somit kann diese einfache Methode verwendet werden, um Follikelzellen und Eizellen von Zebrafischen zu trennen.
Introduction
Zebrafisch ist ein wichtiger Modellorganismus für die Erforschung der Wirbeltierentwicklung und Physiologie. Der Zebrafisch kann als gutes Modell für die Untersuchung der molekularen Mechanismen der Eierstockentwicklungdienen 1,2,3. Viele Merkmale der Eierstockentwicklung sind während der Evolution von Fischen zu Säugetieren sehr erhalten1,2. Ähnlich wie die anderen Wirbeltiere haben Zebrafische Erwachsene asynchrone Eierstöcke, die Eierstockfollikel aller Entwicklungsstadien enthalten4. Der Follikel ist das grundlegende Fortpflanzungselement des Eierstocks. Der Follikel besteht aus der Eizelle, die von einer oder mehreren Schichten somatischer Zellen umgeben ist, die als Follikelzellen bezeichnet werden. Die Entwicklung von Follikel hängt von der bidirektionalen Kommunikation zwischen Eizellen und Follikelzellenab 5. Es ist wichtig, Follikelzellen und Eizellen von Eierstockfollikel für verschiedene Forschungszwecke wie Follikelzellprimärkultur, Genexpressionsanalyse, Eizellenreifung und In-vitro-Fertilisation zu trennen.
Herkömmliche Trennverfahren umfassen die mechanische Trennung durch Zangen und die enzymatische Verdauung6,7,8,9,10. Die mechanische Trennung durch Zangen ist jedoch zeitaufwändig und mühsam. Es wird auch die hohen Schäden an der Oozyte während der Trennung verursachen. Obwohl die Enzymverdauungsmethode einfach zu bedienen ist und eine kurze Zeit erfordert, sollten die Behandlungszeit und die Enzymkonzentration validiert werden, und die Integrität und Überlebensrate der isolierten Eizellen sind nicht ideal. Daher haben wir eine einfache Methode entwickelt, um beide Fächer in verschiedenen Entwicklungsstadien mit gezogenen Glaskapillarrohren zu trennen.
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Protocol
Alle Verfahren, die in Fischversuchen durchgeführt werden, entsprechen den Vorschriften der Animal Experimentation Ethics Committee der Northwest Normal University.
1. Vorbereitungen
- Tiere
- Verwenden Sie erwachsene weibliche Zebrafische mit einer Körperlänge von 4-6 cm.
HINWEIS: Wir haben Zebrafische von einem lokalen Markt verwendet. - Halten Sie den Zebrafisch in einem zirkulierenden Wassersystem mit einem 14 h Licht und 10 h dunklen Zyklus bei etwa 28 °C.
- Füttern Sie Fisch zweimal täglich mit frisch geschlüpften Solegarnelen.
- Verwenden Sie erwachsene weibliche Zebrafische mit einer Körperlänge von 4-6 cm.
- Gezogene Glaskapillare
- Verwenden Sie eine 15 cm Glaskapillare und legen Sie ihren Kopf in einen Alkoholbrenner, um es zu erhitzen. Halten Sie ein Ende der Glaskapillare von Hand und halten Sie das andere Ende mit Zange.
- Nach dem Erhitzen 5-10 Sekunden, das Glas auf dem Feuer des Alkoholbrenners werden rot und weich. Dehnen Sie den Kopf der Glaskapillare mit Zangen, um die Kapillaröffnung mit dem erforderlichen Durchmesser zu machen.
HINWEIS: Der Durchmesser hängt von den Follikeldurchmessern ab: prävitellogene (PV; ca. 0,30 mm Durchmesser), frühe vitellogene (EV; ca. 0,40 mm Durchmesser), mittelvitellogene (MV; ca. 0,50 mm Durchmesser), spät vitellogene (LV; ca. 0,60 mm Durchmesser) und ausgewachsen, aber unreif (FG; ca. 0,65 mm Durchmesser). - Dehnen Sie die Öffnung der Glaskapillare auf den entsprechenden Durchmesser, der etwas kleiner ist als die Größe der abgetrennten Follikel. Die Glaskapillare mit einer Öffnung, die viel größer ist als die Größe der Eierstockfollikel, kann keine Trennung durchführen, aber die viel kleineren würden die Follikel während der Trennung brechen. Üben Sie die Dehnung der Glaskapillare mehrmals.
HINWEIS: Die Heizzeit hängt von der Größe der Glaskapillare ab. Dehnen Sie die Glaskapillare nicht direkt auf das Feuer des Alkoholbrenners. Es wird die Glaskapillare brechen. - Schneiden Sie die Glaskapillare mit einem Ampullenschneider und brechen Sie die Glaskapillare mit Zangen, um einen glatten Schnitt zu erhalten.
HINWEIS: Eine scharfe oder gebrochene Öffnung der Glaskapillare würde die Follikel beschädigen. - Mit einem 30 cm Kunststoffrohr eine 1 ml Pipettespitze mit einem Filterelement an einem Ende einlegen, die gezogene Glaskapillare am Ende der Pipette einlegen und eine 200-L-Pipettespitze an einem anderen Ende anschließen.
2. Trennung von Zebrafisch-Oozyten und Follikelzellen in verschiedenen Stadien
- Zerlegung des Zebrafisch-Ovarial
- Füllen Sie einen Eiskübel bis 4/5 voll mit Güllee und fügen Sie genügend Fischwasser hinzu, um Gülleis schweben zu lassen. Warten Sie 2-5 Minuten, überprüfen Sie die Wassertemperatur und stellen Sie sicher, dass die Temperatur zwischen 2-4 °C liegt.
- Anästhesisieren Sie erwachsene Weibchen, indem Sie Fische mindestens 2-5 Minuten in das Eiswasser legen, bis fische die Kiemenbewegung stoppen. Enthaupten Sie den Fisch, indem Sie das Rückenmark mit einer scharfen Schere abtrennen, um den Tod zu gewährleisten.
- Legen Sie den Fisch mit Zange auf die Sezierenplatte.
- Verwenden Sie sezierende Schere wie folgt zu schneiden. Sezieren Sie von der Kloake zu den Kiemen entlang der Mittellinie des Bauches. Von der Rückseite der Kloake schneiden. Von der vorderen Spitze auf die dorsale Seite schneiden. Entfernen Sie vorsichtig die Haut und Muskeln auf einer Seite des Körpers. Setzen Sie die inneren Organe aus und nehmen Sie den gesamten Eierstock mit Zangen heraus.
- Die Eierstöcke sofort in ein 100 mm großes Kulturgericht geben, das 60% Leibovitz's L-15 (L-15) Medium enthält.
- Isolierung von Eierstockfollikel
HINWEIS: Das Staging-System, das wir angenommen haben, basiert auf der ursprünglichen Definition von Selman et al.4.- Isoliert die Follikel verschiedener Stadien manuell mit einem Paar feiner Zangen, wie zuvor beschrieben8.
- Gruppieren Sie die Ovarialfollikel in die folgenden Stadien: PV-, EV-, MV-, LV- und FG-Stufen.
- Trennung von Follikelzellen und Eizelle von Ovarialfollikel
- Die Eierstockfollikel in verschiedenen Stadien in eine saubere Petrischale geben, die 60% L-15 Medium enthält.
- Mit der gezogenen Glaskapillare aus Schritt 1.2 die Follikel in die Glaskapillare 2-3 cm saugen und ausblasen.
HINWEIS: Wenn der Öffnungsdurchmesser der Glaskapillaren angemessen ist, kann der Follikel durch Einmaleinatmen von der Oozyte getrennt werden.- Wenn die follikelzellige Zellschicht fest an der Oozyte befestigt ist, wiederholen Sie 2-3 Mal, um eine vollständige Trennung zu erreichen. Vermeiden Sie mehrere Versuche, einen Follikel durch eine kleinere Kapillare zu zwingen, was den Follikel beschädigen würde.
HINWEIS: Beim Einatmen und Ausblasen fällt die Follikelschicht ab und trennt sich von der Oozyte, und schließlich werden Follikelzellen und denudierte Eizellen getrennt (Abbildung 1).
- Wenn die follikelzellige Zellschicht fest an der Oozyte befestigt ist, wiederholen Sie 2-3 Mal, um eine vollständige Trennung zu erreichen. Vermeiden Sie mehrere Versuche, einen Follikel durch eine kleinere Kapillare zu zwingen, was den Follikel beschädigen würde.
- Pool die denuded, aber intakte Eizellen und sammeln Sie die überlebenden denuded Eizellen für weitere Assays.
- Um zu untersuchen, ob die Follikelzellen von intakten Follikel getrennt wurden, färben Sie die intakten Follikel und die abgetrennten Eizellen mit 4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI).
- Fixieren Sie die Proben in 4% gepuffertem Paraformaldehyd bei Raumtemperatur (RT) für 1 h. Mehrmals mit PBS waschen.
- Stain von DAPI bei RT für 30 min. Mehrmals mit PBS gewaschen. Anzeigen und Fotografieren mit einem Fluoreszenzmikroskop (z.B. Leica DFC7000 T).
- Um die abgeschlossene Trennung zu bestätigen, fixieren Sie die intakten Follikel und getrennten Eizellen in 4% gepuffertem Paraformaldehyd über Nacht bei 4 °C und betten Sie das Gefriermedium (z. B. Leica) bei -25 °C ein.
- Schneiden Sie die festen Gewebe auf einem Mikrotom, und montieren Sie auf Glasrutschen.
- Waschen Sie die Abschnitte in PBS und visualisieren Sie die Zellkerne mit DAPI. Sehen und fotografieren Sie auf einem Fluoreszenzmikroskop.
3. In-vitro-Reifung (IVM) und In-vitro-Fertilisation (IVF)
HINWEIS: Das Verfahren von IVM von IVF wurde wie zuvor beschrieben mit geringfügigen Modifikationen 11,12,13befolgt.
- Bereiten Sie frische reifung Medium (+DHP Medium) vor Eierstock-Sektion von erwachsenen Zebrafisch Weibchen. Um das frische Reifungsmedium vorzubereiten, fügen Sie 9 ml des L-15-Mediums von Leibovitz, pH 9,0, auf 15 ml konische Rohre hinzu. Fügen Sie 10 l von 17-20-Dihydroxy-4 Pregne-3-ein (DHP) (5 mg/ml), 490 l dH2O und 500 l mit 10% Rinderserumalbumin (BSA) hinzu.
- Bereiten Sie Hanks Lösung und E3-Lösung im Voraus vor. Bereiten Sie Hanks' Lösung vor, wie von Baars et al.14beschrieben. E3 medium: 5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4und 1-5% Methylenblau vorbereiten.
- Durchführen Sie die Zerlegung des Zebrafisch-Ovarials und die Isolierung der Eierstockfollikel wie in Schritt 2.
- Sammeln Sie ausgewachsene Bühnenfollikel und verwenden Sie als unreife Eizellen. Für jeden erwachsenen weiblichen Zebrafisch können mindestens 150-200 ausgewachsene Bühnenfollikel isoliert werden. Wählen Sie die intakten und gesunden Follikel für IVM.
- Inkubieren Sie die ausgewachsenen Bühnenfollikel in +DHP Medium in 12-Well-Platten, regelmäßig überprüfen, um sicherzustellen, dass die Eizellen intakt bleiben. Entfernen Sie alle Lysing-Oozyten mit einer Pasteur-Pipette.
HINWEIS: Während der Eizellenreifung werden die Eizellen zunehmend durchscheinend. Ein Großteil der Eizellen wird nach der Behandlung von DHP für 2 h durchscheinend. Dies kann unter einem Sezierenvonmikroskop mit Durchlichtoptik beobachtet werden. - Entfernen Sie die äußersten Follikelzellen aus jeder ausgereiften Oozyte, wie in Schritt 2.3 beschrieben.
- Die denuded Oozyten auf eine Petrischale mit ein paar Tropfen Kulturmedium übertragen und zur Düngung überführen.
- Bereiten Sie die frische Spermienlösung mit Hoden vor, die von mindestens drei Männchen in 500 L der Hanks-Lösung seziert wurden. Setzen Sie die Spermienlösung auf Eis, wo sie ihre Befruchtungskraft bis zu 2-3 h halten kann.
- Fügen Sie 100 L Spermienlösung zu denuded & gereiften Eizellen auf einer Petrischale hinzu. Fügen Sie vorsichtig die Spermienlösung unter die Eier, und wirbeln Sie die Spermien und Eier zusammen mit einer Pipette Spitze.
- Sofort 1 ml E3-Mittellösung hinzufügen, um die Eier zu aktivieren und mit einer Pipettespitze wieder sanft Eier und Spermien zu wirbeln.
- Nach ca. 1 Minute Nachdüngung (mpf) die Platte mit E3-Mittellösung überfluten. Eine vollständige Chorionenexpansion kann innerhalb von 10-15 mpf beobachtet werden.
- Wählen Sie zwischen 35-45 mpf die Embryonen aus, die sich einer symmetrischen Spaltung in das 2-Zell-Stadium unterziehen und daher befruchtet werden. Entfernen Sie Embryonen, die sich keiner Zellspaltung unterziehen.
- Lassen Sie Embryonen in der Petrischale bei 28 °C entwickeln, mit einem Grenzwert von 80 Embryonen pro 10 cm Platte. Sehen und fotografieren Sie die Embryoentwicklung.
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Representative Results
Diese Methode kann verwendet werden, um Follikelzellen und Eizellen in verschiedenen Stadien der Eierstockfollikelentwicklung bei Zebrafischen zu trennen. Abbildung 1 zeigt die Trennung von Zebrafisch-Oozyten und Follikelzellen von Eierstockfollikel mit einem Kapillarglasrohr (Abbildung 1). Um zu untersuchen, ob die Follikelzellen von intakten Follikel getrennt waren, wurden die intakten Follikel und die abgetrennten Eizellen aus verschiedenen Follikelstadien von der PV-Stufe bis zur FG-Stufe 30 Minuten lang mit DAPI (50 g/ml) bei 37 °C gefärbt. Der Kern der Follikelzellen kann durch DAPI gefärbt werden. Das blaue Signal von DAPI wurde in intakten Follikel beobachtet, aber nicht denuded Oozyten (Abbildung 2). Dies deutet darauf hin, dass die Eizellen und Follikelzellen des Follikels durch diese Methode sauber getrennt werden können. Um die klare Trennung weiter zu bestätigen, wurden die intakten Follikel und getrennten Eizellen in die histologischen Abschnitte geschnitten. Die DAPI-Färbungsergebnisse zeigten, dass Follikelzellen in denuded Oozyten eindeutig entfernt wurden (Abbildung 3). Alle diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass diese Methode verwendet werden kann, um Follikelzellen und Eizellen in verschiedenen Stadiumfollikel von Zebrafischen zu trennen.
Diese Methode kann verwendet werden, um die Eizellenreifung von Zebrafischen zu untersuchen. Um die bidirektionale Kommunikation zwischen Eizellen und Follikelzellen während der Eizellreifung zu untersuchen, müssen die denudierten Eizellen für verschiedene Assays erhalten werden. Mit Hilfe einer gezogenen Glaskapillare wurden die denuded Oozyten getrennt von ausgewachsenen Stadium Zebrafisch Follikel gefunden, um die spontane Eizelle Reifung ohne Behandlung nach 4 Stunden Inkubation zu unterziehen, in der Regel mindestens 30% getrenntE Eizellen überlebt und die Reiferate dieser überlebenden Oozyten könnte bis zu 80%(Abbildung 4). Diese gereiften Eizellen könnten nach der Platzierung ins Wasser die volle Chorionexpansion durchlaufen, was darauf hindeutet, dass die Follikelzellen vollständig entfernt wurden (Abbildung 4). So kann diese Methode verwendet werden, um die denuded Eizellen für die Untersuchung der Eizellenreifung von Zebrafischen zu erhalten.
Diese Methode kann für IVF in Zebrafischen verwendet werden. In-vitro-Reifungsmethoden (IVM) haben sich bei Zebrafischen gut etabliert. Mit diesen Methoden können die ausgewachsenen Stadiumfollikel in das ausgereifte Stadium11,12,13,15,16induziert werden. Um die In-vitro-Fertilisation (IVF) weiter durchführen zu können, muss die Follikelschicht der gereiften Follikel noch manuell entfernt werden. Hier wurde IVM von Zebrafischen durch die Behandlung von DHP induziert. Die Follikelschicht aus gereiften Follikel wurde durch ein Kapillarglasrohr entfernt. Diese entschärften Eizellen könnten befruchtet und in die Schraffurphase entwickelt werden (Abbildung 5). Das Ergebnis legt nahe, dass diese Methode für IVF bei Zebrafischen verwendet werden kann. In der Regel können etwa 10% der gesunden Embryonen aus den gereiften Eizellen gewonnen werden.
Abbildung 1. Trennung von Follikelzellen und Eizellen von Zebrafisch-Ovarialfollikel mit einer gezogenen Glaskapillare. 1) Die Morphologie des intakten Follikels im FG-Stadium. 2) Einatmen des intakten Follikels in die gezogene Glaskapillare. 3)Die Follikelzelle wird von der Oozyte gelöst, wenn der Follikel aus der gezogenen Glaskapillare herausgeblasen wird. 4) Erfolgreiche Trennung von Follikelzellen und Eizelle. Maßstabsbalken: 200 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2. Die Morphologie intakter Follikel und denudierter Eizellen, die nach der DAPI-Färbung von verschiedenen Stadien der Follikel getrennt sind. Die intakten Follikel und getrennten Eizellen aus verschiedenen Follikelstadien vom PV-Stadium bis zum FG-Stadium wurden von DAPI gefärbt. Die blauen Signale von DAPI wurden in intakten Follikel beobachtet, aber nicht denuded Oozyte. Maßstabsbalken: 200 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3. Histologische Abschnitte intakter Follikel und isolierter Eizellen nach DAPI-Färbung. Zellkerne von Follikelzellen wurden mit DAPI-Färbung visualisiert. Das blaue Signal kann beobachtet werden. Follikuläre Zellen wurden in denuded Oozyten deutlich entfernt. Maßstabsbalken: 100 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4. Die Reifung und volle Chorionexpansion der denuded Oozyten getrennt von ausgewachsenen Bühnenfollikel mit einer gezogenen Glaskapillare. (A) Die Morphologie intakter Follikel bei ausgewachsenen Stadiumfollikel. (B) Die denuded Oozyten getrennt von ausgewachsenen Stadium Follikel können spontane Eizellenreifung ohne Behandlung nach 4 Stunden Inkubation unterzogen werden. (C) Die gereiften Eizellen können nach aktivierung durch Wasser eine vollständige Chorionenausdehnung durchlaufen. Maßstabsleiste: 500 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5. Die Morphologie der frühen Embryonen, die durch IVM und IVF gewonnen wurden. IVM wurde durch die Behandlung von DHP (5 g/ml) für 2 h induziert. Nach IVM wurden die Follikelzellen durch eine gezogene Glaskapillare aus den gereiften Eizellen entfernt. Die gereiften Eizellen wurden durch IVF befruchtet. Die Entwicklung von Embryonen in verschiedenen Stadien wurde betrachtet und fotografiert. Skalenbalken: (A-I) 200 m, (J) 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Wir beschreiben hier eine neuartige Methode zur einfachen und schnellen Trennung von Follikelzellen und Eizellen von Zebrafisch-Ovarialfollikel. Diese Methode hat gegenüber der herkömmlichen Methode mehrere Vorteile. Dazu gehört vor allem die stark erhöhte Trennungsfreundlichkeit mit hoher Effizienz und Wirksamkeit, da nur eine einzige und externe Manipulation erforderlich ist. Dieser Punkt erhöht die Anwendbarkeit für Forscher, die nicht gut in der mikroskopischen Anatomie sind. Nach unserer Erfahrung kann man Follikelzellen und Eizellen mit der Glaskapillare innerhalb von 5-10 s erfolgreich von einem ausgewachsenen Stadiumfollikel trennen. Allerdings sind mindestens 30-60 s erforderlich, um diese Trennung mit Zangen zu tun. Noch wichtiger ist, dass in der Regel mindestens 20% der denuded Oozyten durch die Glaskapillare getrennt enthoben können spontane Eizellenreifung durchlaufen. Im Gegensatz dazu können nicht mehr als 1% der denuded Oozyten spontane Eizellenreifung mit Zangen durchlaufen. Somit ist die Effizienz und Wirksamkeit der neuen Methode mit s Glaskapillare besser als die zuvor etablierte Methode mit Zangen. Zweitens kann diese Methode verwendet werden, um Follikelzellen und Eizellen follikel in frühen Entwicklungsstadien wie PV-, EV- und MV-Stadien zu trennen. Eine solche Trennung kann nicht in den Follikel im Frühstadium mit den aktuellen Methoden durchgeführt werden.
Es gibt auch einige Einschränkungen mit dieser Methode. Beispielsweise ist der geeignete Durchmesser der Glaskapillaröffnung für die Trennung von Follikelzellen und Eizellen bei dieser Methode von entscheidender Bedeutung. Eine Öffnung, die viel größer oder kleiner als die Größe der Eierstockfollikel ist, würde zum Scheitern der Trennung führen. Daher sollte der Öffnungsdurchmesser der Glaskapillare in Abhängigkeit von der Größe der Eierstockfollikel angepasst werden, was etwas Übung erfordert.
Die Trennung von Follikelzellen und Eizellen hat mehrere Anwendungen bei der Untersuchung der Eierstockentwicklung. Follikuläre Zellen und Eizellen in verschiedenen Stadien der Eierstockfollikel, die mit dieser Methode gewonnen werden, können verwendet werden, um die Genexpression zu analysieren. Die getrennten Follikelzellen können für die primäre Zellkultur verwendet werden. Denuded Oozyten getrennt sind nützlich für die Untersuchung der Überlauf zwischen Follikelzellen und Oozyten, und liefern ein gutes Modell für die Untersuchung der Oozytenreifung. Darüber hinaus kann diese Methode verwendet werden, um die Follikelzellen in einigen Assays wie In-vitro-Oozytenreifung oder In-vitro-Fertilisation zu entfernen. Die Verfügbarkeit einer Methode, die die Leichtigkeit und Geschwindigkeit der Trennung erheblich erhöht, sollte eine breitere Ausbeutung von Zebrafisch-Ovarialfollikel erleichtern, um das langfristige Ziel zu erreichen, die Feinheiten der Eierstockentwicklung zu verstehen. Darüber hinaus ist die Struktur der Eierstockfollikel bei verschiedenen Fischarten ähnlich; Daher ist es interessant zu testen, ob diese Methode auch bei anderen Fischen angewendet werden kann.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Forschungsarbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China [32060170, 31601205 und 31560334] unterstützt, einem Gastwissenschaftlerprojekt, das vom China Scholarship Council und dem Fundus des State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology [2020FB05] unterstützt wurde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 17α,20β-DHP | Cayman | 16146-5 (5 mg) | |
| 24-well plate | Corning | 3524 | |
| Ampoule cutter | AS ONE | 5-124-22 1 bag (100 pieces) | |
| Anhydrous Na2HPO4 | Kaixin Chemical | 500 g | |
| Brine shrimp | Hongjie | 250 g | |
| CaCl2 | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Culture dish | Biosharp | BS-90-D (10PCS/PK) | |
| DAPI | Solarbio | S2110 (25mL) | |
| Dissecting Microscope | ZEISS | Stemi 305 | |
| Dissection forcep | VETUS | HRC30 | |
| Dissection scissor | Kefu | 160 mm | |
| Fluorescence Stereomicroscope | Leica | M205C | |
| Glass capillary | IWAKI | IK-PAS-5P (200 pcs/PACK) | |
| Hoechst 33342 | Solarbio | C0031 (1 mg) | |
| KCl | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| KH2PO4 | Kaixin Chemical | 500 g | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Gibco | 41300-039 (10×1L) | |
| MgSO4•7H2O | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Micropipette tips | Axygen | MCT-150-C | |
| NaCl | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| NaHCO3 | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Penicilia-streptomycia | Gibco | #15140122 (100 mL) | |
| Stereomicroscope | ZEISS | Discover.v20 |
References
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