Summary
تفصل هذه المقالة بروتوكولا خطوة بخطوة للمخططات الكهربائية الناجحة ومنخفضة الضوضاء في العديد من أجناس البعوض ، بما في ذلك الإناث والذكور.
Abstract
أنثى البعوض هي أكثر الحيوانات فتكا على وجه الأرض ، حيث تودي بحياة أكثر من 1 مليون شخص كل عام بسبب مسببات الأمراض التي تنقلها عند الحصول على وجبة دم. لتحديد موقع مضيف يتغذى عليه ، يعتمد البعوض على مجموعة واسعة من الإشارات الحسية ، بما في ذلك البصرية والميكانيكية والحرارية والشمية. تفصل الدراسة تقنية ، تخطيط كهربية (EAG) ، تسمح للباحثين بتقييم ما إذا كان البعوض يمكنه اكتشاف المواد الكيميائية الفردية ومزيج المواد الكيميائية بطريقة تعتمد على التركيز. عندما تقترن هذه التقنية بكروماتوغرافيا الغاز (GC-EAG) ، فإنها تسمح بتعريض الهوائيات لخليط كامل من فراغ الرأس / معقد وتحدد المواد الكيميائية الموجودة في العينة ذات الاهتمام ، والتي يمكن للبعوض اكتشافها. ينطبق هذا على روائح جسم المضيف وكذلك باقات الأزهار النباتية أو الروائح الأخرى ذات الصلة بيئيا (على سبيل المثال ، روائح مواقع وضع البيض). هنا ، وصفنا بروتوكولا يسمح بفترات طويلة من وقت استجابة التحضير وينطبق على كل من إناث وذكور البعوض من أجناس متعددة ، بما في ذلك بعوض الزاعجة و Culex و Anopheles و Toxorhynchite . نظرا لأن حاسة الشم تلعب دورا رئيسيا في التفاعلات بين البعوض والمضيف وبيولوجيا البعوض بشكل عام ، يمكن ل EAGs و GC-EAG الكشف عن مركبات ذات أهمية لتطوير استراتيجيات جديدة لمكافحة ناقلات الأمراض (مثل الطعوم). مع استكمال المقايسات السلوكية ، يمكن تحديد التكافؤ (على سبيل المثال ، جاذب ، طارد) لكل مادة كيميائية.
Introduction
البعوض هو أكثر الكائنات فتكا على وجه الأرض ، حيث يودي بحياة أكثر من مليون شخص سنويا ويعرض أكثر من نصف سكان العالم لخطر التعرض لمسببات الأمراض التي ينقلونها ، بينما يلدغ1. تعتمد هذه الحشرات على مجموعة واسعة من الإشارات (أي الحرارية والبصرية والميكانيكية والشمية والسمعية) لتحديد موقع مضيف يتغذى عليه (نباتيا وحيوانيا) ، للتزاوج ووضع البيض ، وكذلك لتجنب الحيوانات المفترسة في كل من مراحل اليرقات والبالغين 2,3. من بين هذه الحواس ، يلعب حاسة الشم دورا مهما في السلوكيات المذكورة أعلاه ، لا سيما للكشف المتوسط إلى بعيد المدى عن جزيئات الرائحة 2,3. يتم الكشف عن الروائح المنبعثة من مضيف أو موقع وضع البيض بواسطة مستقبلات شمية محددة مختلفة (على سبيل المثال ، GRs ، ORs ، IRs) الموجودة على خرطوم ملامسة البعوض ، الترسي ، والهوائيات2،3.
نظرا لأن حاسة الشم هي عنصر أساسي في سلوكيات البحث عن المضيف (النبات والحيوان) والتزاوج ووضع البيض ، فإنها تشكل بالتالي هدفا مثاليا للدراسة لتطوير أدوات جديدة لمكافحة البعوض4. البحث عن المواد الطاردة (على سبيل المثال ، DEET ، IR3535 ، picaridin) والطعوم (على سبيل المثال ، إغراء الإنسان BG الحارس) غزير الإنتاج5 ، ولكن بسبب التحديات الحالية في مكافحة البعوض (على سبيل المثال ، مقاومة المبيدات الحشرية ، الأنواع الغازية) ، من الضروري تطوير طرق مكافحة فعالة جديدة مستنيرة ببيولوجيا البعوض.
تم استخدام العديد من التقنيات (مثل مقياس الشم ، ومقايسات الهبوط ، والفيزيولوجيا الكهربية) لتقييم النشاط الحيوي للمركبات أو مخاليط المركبات في البعوض. من بينها ، يمكن استخدام electroantennography (أو electroantennograms (EAGs)) لتحديد ما إذا كان يتم الكشف عن الروائح بواسطة هوائيات البعوض. تم تطوير هذه التقنية في البداية بواسطة Schneider6 وتم استخدامها في العديد من أجناس الحشرات المختلفة منذ ذلك الحين ، بما في ذلك العث7،8،9 ، النحل الطنان10،11 ، نحل العسل12،13 ، وذباب الفاكهة14،15 على سبيل المثال لا الحصر. كما تم استخدام تخطيط كهربية الأنتنانت باستخدام بروتوكولات مختلفة ، بما في ذلك هوائيات مفردة أو متعددة في البعوض16،17،18،19،20،21،22،23،24،25.
البعوض حشرات صغيرة وحساسة نسبيا مع هوائيات رقيقة إلى حد ما. في حين أن إجراء EAGs على الحشرات الكبيرة مثل العث أو النحل الطنان أمر سهل نسبيا بسبب حجمها الأكبر وهوائياتها الأكثر سمكا ، فإن إجراء EAGs في البعوض قد يكون أمرا صعبا. على وجه الخصوص ، يعد الحفاظ على نسبة إشارة إلى ضوضاء جيدة وإعداد سريع الاستجابة متطلبين رئيسيين لاستنساخ البيانات وموثوقيتها.
يقدم الدليل التفصيلي لمجموعات EAG منخفضة الضوضاء المقترحة هنا حلولا مباشرة لهذه القيود ويجعل هذا البروتوكول قابلا للتطبيق على العديد من أنواع البعوض من أجناس مختلفة ، بما في ذلك الزاعجة والأنوفيليس وكوليكس وتوكسورينكيتس ، ويصف التقنية لكل من الإناث والذكور. يوفر تخطيط كهربية الأنتل طريقة سريعة وموثوقة لفحص وتحديد المركبات النشطة بيولوجيا التي يمكن بعد ذلك الاستفادة منها في تطوير الطعم بعد تحديد التكافؤ باستخدام المقايسات السلوكية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد محلول ملحي
- تحضير المياه المالحة مقدما وتخزينها في الثلاجة.
- اتبع Beyenbach و Masia26 لإعداد الحل.
ملاحظة: وصفة المالحة في mM: 150.0 كلوريد الصوديوم ، 25.0 HEPES ، 5.0 الجلوكوز ، 3.4 KCl ، 1.8 NaHCO3 ، 1.7 CaCl 2 ، و 1.0 MgCl2. يتم ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.1 مع 1 M NaOH. لا تضيف الجلوكوز أو السكروز إلى التحضير في هذا الوقت لزيادة تخزين الرف. أضف الكمية المطلوبة إلى المحلول الملحي مباشرة قبل تشغيل EAGs (حوالي 50 مل لكل تجربة).
2. تحضير الرائحة وتخزينها
- تحضير مخاليط الروائح أو التخفيفات المركبة المفردة مسبقا في قوارير كهرمانية سعة 1.5 مل وتخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية لمنع تدهور المركب.
ملاحظة: تعتمد التركيزات على الاختبار الذي سيتم إجراؤه. تستخدم 0.1٪ أو 1٪ بشكل شائع لتحديد ما إذا كان يمكن اكتشاف مركب أم لا. بالنسبة لمنحنى الاستجابة للجرعة ، قم بإعداد التخفيفات التسلسلية لمادة كيميائية معينة واختبرها من تلك التركيزات الأدنى إلى الأعلى. - تحضير التخفيفات في الماء أو الإيثانول أو الهكسان أو زيت البارافين أو الزيوت المعدنية ، اعتمادا على قابلية ذوبان المادة الكيميائية المختبرة.
- تأكد من تحضير عنصر تحكم في المذيبات (قارورة تحتوي على المذيب فقط) للتجربة.
- قم بإزالة الروائح من الفريزر قبل 30 دقيقة من بدء التجارب للسماح لها بالذوبان. دوامة كل قارورة قبل استخدامها لخلط جيدا الكيميائية والمذيب.
- ماصة 10 ميكرولتر من المحلول على قطعة من ورق الترشيح (0.5 سم × 2 سم) محملة داخل حقنة زجاجية ملصقة أو ماصة باستور.
- قم بتحميل كل مركب أو خليط في ماصة أو حقنة باستور محددة لمنع التلوث.
ملاحظة: قم بالتحميل قبل 10 دقائق من بدء التجربة حتى تنتشر الرائحة في المحقنة ولكن ليس لفترة أطول لمنع التدهور. دع ماصة باستور أو المحقنة تظل مغطاة في هذا الوقت للسماح بانتشار جيد للمادة الكيميائية قبل بدء التجربة. - بعد كل تشغيل ل EAG ، تخلص من قطعة ورق الترشيح واستبدلها بأخرى جديدة لمنع الورق من النقع الزائد والمخاطرة بانسداد الإبرة. استبدل الإبر بانتظام (كل 10 أشواط).
3. فصل البعوض
- عزل البعوض في يوم التجارب.
- استخدم البعوض الذي لا يقل عمره عن 6 أيام في يوم التجارب لزيادة فرص تزاوج الإناث لتعزيز استجابتها للروائح المرتبطة بالمضيف.
ملاحظة: اضبط عمر البعوض في وقت الاختبار حسب المشروع. تحقق من الحالة الفسيولوجية ووائمها (على سبيل المثال ، تغذية الدم ، الجوع ، لم يسبق إطعامها ، إلخ). - تجويع البعوض لمدة تصل إلى 12 ساعة (أي عدم الوصول إلى السكر) لزيادة دوافعهم وحساسيتهم.
- ضع حاوية البعوض في الثلاجة (4 درجات مئوية) حتى تتوقف عن الطيران حتى يمكن بسهولة نقل الأفراد بدقة إلى أكواب مفردة بالملقط.
ملاحظة: يمكن إخماد الأنواع ذات القدرة العالية على تحمل البرد باستخدام وسادة ذبابة CO2 . تأكد من أن البعوض لا يبقى عليه لفترة طويلة لمنع الجفاف ، مما يقلل من استجابة إعداد EAG البعوض. - قم بتخزين الأكواب التي تحتوي على بعوض واحد في درجة حرارة الغرفة قبل إجراء EAGs وتخلص من أي بعوض قد لا يتم استخدامه خلال النهار.
4. حامل القطب وإعداد الشعيرات الدموية
- سحب الشعيرات الدموية وتحضيرها وتخزينها
- استخدم الشعيرات الدموية البورسليكات مع خيوط (ID: 0.78 مم ، OD: 1 مم). اسحبهم حسب المعدات27.
ملاحظة: قم بتخزين الشعيرات الدموية المسحوبة في طبق بتري. ضع طبق بتري على قطع من الشمع أو طين النمذجة غير المعطر لمنعها من الحركة والكسر. - قبل إجراء تجربة EAG ، قم بكسر طرف الشعيرات الدموية 2 برفق باستخدام ملقط تحت المجهر.
ملاحظة: تأكد من أن أحدهما أكبر قليلا من الآخر ليناسب إما الرقبة (الشعيرات الدموية الأكبر) أو أطراف الهوائيات (الشعيرات الدموية الأصغر). تأكد من أن القطع نظيف مع عدم وجود صدع على جدار الشعيرات الدموية. هذا يتطلب الصبر والممارسة. - إذا كانت لا تزال سليمة ، فأعد استخدام هذه الشعيرات الدموية بعد شطفها بالماء غير المتأين (DI) بعد انتهاء التجربة. قم بإزالة الماء الزائد عن طريق وضع مناديل تنظيف برفق على الحافة. ضع مرة أخرى في طبق بتري التخزين. إذا كان الطرف ملتويا ، فتخلص من الشعيرات الدموية.
- استخدم الشعيرات الدموية البورسليكات مع خيوط (ID: 0.78 مم ، OD: 1 مم). اسحبهم حسب المعدات27.
- حامل القطب الكهربائي وتركيب الشعيرات الدموية
- قم بتسمية حاملي الأقطاب الكهربائية على أنهما "تسجيل" و "مرجع" باستخدام قطع من شريط المختبر بألوان مختلفة. هذا سوف يساعد في توجيه تصاعد رأس البعوض والأقطاب الكهربائية.
- تأكد من أن حوامل الأقطاب الكهربائية واضحة من الداخل وعدم وجود حطام البورسليكات.
- الكلورة: انقع الأسلاك الفضية لحاملات الأقطاب الكهربائية في مبيض نقي لمدة 5 دقائق تقريبا. تتحول الأسلاك من الرمادي الفاتح اللامع إلى الرمادي الداكن غير اللامع.
- قم بفك السدادة المطاطية واملأ الجزء الداخلي من الشعيرات الدموية بمحلول ملحي بنسبة 10٪ باستخدام إبرة 20 جرام.
- ملء الشعرية البورسليكات مع محلول ملحي باستخدام حقنة. تأكد من عدم وجود فقاعات في حامل القطب ولا الشعيرات الدموية المسحوبة.
ملاحظة: لتقليل فرص وجود فقاعات في الشعيرات الدموية ، استمر في دفع المحلول الملحي في الشعيرات الدموية أثناء سحب الإبرة برفق واستخدم الشعيرات الدموية مع خيوط. من الممكن تحميل الشعيرات الدموية بمحلول يتكون من هلام كهربائي 1: 3 ومحلول ملحي. يمكن أن يساعد ذلك في منع تبخر المحلول الملحي ويمكن أن يكون مفيدا بشكل خاص عند تعلم وممارسة EAGs ، حيث سيحتاج المجرب إلى مزيد من الوقت لإكمال الخطوات المختلفة. - بعد النقع ، شطف الأسلاك الفضية بماء DI وأدخلها في الشعيرات الدموية. تأكد من أن طرف السلك أقل من 1 مم من طرف الشعيرات الدموية. تأكد من أن الشعيرات الدموية تمر بالحلقة المطاطية داخل حامل القطب دون أن تنكسر. شد السدادة المطاطية برفق. تحقق من عدم وجود فقاعات هواء.
- استخدم الشعيرات الدموية مع الفتحة الأوسع على حامل القطب المرجعي (الرقبة) ، والفتحة الأصغر على حامل قطب التسجيل (الهوائيات).
- اترك حاملي الأقطاب الكهربائية المثبتين على منديل تنظيف مبلل لمنع الطرف من الجفاف حتى يصبح جاهزا لتركيب الرأس.
5. إعداد منصة EAG (الشكل 1)
- تأكد من أن طاولة الهواء مرتفعة ، وأنه لا يوجد انسداد في شركة الطيران. تأكد من أن خزان الهواء الطبي لا يزال ممتلئا لتجنب تغييره في منتصف التجربة. تأكد من وجود فقاعات في جهاز الترطيب.
- نظام توصيل الهواء والنبض
- قم بتشغيل خزان غاز الهواء الطبي.
- تحقق من مستوى اثنين من مقاييس التدفق.
ملاحظة: يجب أن يكون مقياس التدفق الذي يتحكم في تيار الهواء الرئيسي أثناء التحضير أثناء التجربة بأكملها عند 140 مل / دقيقة ويجب أن يقرأ الآخر المتعلق بنبض الرائحة 15 مل / دقيقة.
- في حالة القيام ب GC-EAD ، قم بتشغيل الجهاز وخزانات الغاز وإنشاء / تحميل الملف / الطريقة.
- قم بتشغيل أجهزة الكمبيوتر والتطبيقات البرمجية ومصدر طاقة الصمام وتحقق من اتصال الإنترنت حتى يعمل تطبيق البرنامج.
- تطبيق برمجي: يمكن كتابة نص قصير لتوصيل النبض.
- برنامج EAG: استخدم أي برنامج للفيزيولوجيا الكهربية.
- قم بتنفيذ المعلمات في البرنامج (على سبيل المثال ، مكبر الصوت ، ومدة التسجيل ، ومدة النبضات ، وما إلى ذلك).
- قم بتوصيل نبضة تحكم للتحقق من أن الصمام الذي يوصل النبضات يعمل.
- اضبط مصدر الطاقة على 5.2 فولت. تحقق من معلمات مكبر الصوت.
ملاحظة: المعلمات المستخدمة للبيانات المعروضة هنا هي: مرشح قطع منخفض قدره 0.1 هرتز؛ مرشح قطع عالي 500 هرتز ؛ كسب x100.
6. إعداد رأس البعوض وتركيبه (الشكل 2)
- ضع صفيحة من الألومنيوم على الثلج وضع قطعة من التنظيف الرطب فوقها.
- ضع قطعة صغيرة من هلام القطب في الزاوية.
- ضع كوب البعوض على الثلج واترك البعوضة تبرد لبضع دقائق ، أو حتى تتوقف عن الطيران.
ملاحظة: بعض الأنواع مقاومة للبرد وقد تتطلب تخديرا سريعا فوق منصة ذبابة CO2 للنزول. أقل البعوض يبقى على أي منهما ، كان ذلك أفضل. - ضع البعوضة على ظهرها وقم بقص طرف كل هوائي (جزء صغير فقط من الجزء الأخير) بمقص صغير.
- استخدم ملقط لسحب البعوض بجوار هلام القطب الكهربائي واغمس طرف كل هوائي برفق في الجل. تجنب غمس أكثر من مجرد الجزء الأخير في جل القطب.
- باستخدام ملقط ، اسحب هوائيات البعوض للخارج مع الحفاظ عليها بجانب بعضها البعض. دعهم يخرجون معا من الجل. تأكد من أن الهوائيات لا تلمس سطح مناديل التنظيف ، وإلا فقد تنفصل.
- ضع البعوضة على جانبها واقطع الرأس باستخدام مقص صغير أو شفرة حلاقة.
ملاحظة: بمجرد تقطيع الرأس، انتقل بسرعة إلى الخطوات التالية وإلى جهاز EAG لبدء التسجيلات. يجب أن يظل التحضير مستجيبا لمدة 30 دقيقة تقريبا. - خذ القطب المرجعي وقم بعمق الطرف في الجل برفق. ابق على اتصال مع أنسجة الرقبة واترك الرأس يلتصق بها.
- حرك حوامل الأقطاب الكهربائية تحت مجهر EAG وشاهدها من خلال المجهر لوضع قطب الرأس (أي المرجعي) على جهاز مناولة دقيقة. تأكد من أن الهوائيات في المركز.
- أمسك قطب التسجيل ، ضعه أمام أطراف الهوائيات. حركه وقم بمحاذاته في أقرب وقت ممكن من النصائح باستخدام micromanipulator. باستخدام المجهر ، حرك طرف قطب التسجيل نحو الهوائيات.
- قم بتوصيل كلا حاملي الأقطاب الكهربائية بمكبر الصوت قبل إدخال الأطراف لمنعهما من التحرك بعد الإدخال.
- أدخل أطراف الهوائيات في قطب التسجيل. تأكد من أنها تلامس فقط المحلول الملحي وهلام القطب الكهربائي وتكون مرئية بالشفافية من خلال الشعيرات الدموية. يدخل الهوائي من خلال "تأثير الشفط".
- اضبط موضع الرأس والنصائح بالملقط تحت المجهر ، إذا لزم الأمر.
- ضع أنبوب الطيران بالقرب من مستحضر رأس البعوض (المسافة: 1 سم).
ملاحظة: إذا سقط الرأس ، فارجع إلى محطة التشريح وأعد تركيب الرأس أو قم بإعداد واحدة جديدة إذا فقد أو إذا مر أكثر من 5 دقائق منذ قطع الرأس. يعد الاتصال الجيد بين الشعيرات الدموية والرقبة / الهوائيات أمرا ضروريا للضوضاء المنخفضة والتسجيل الموثوق. من الناحية المثالية ، ستكون أطراف الهوائيات على بعد أقل من 1 مم من سلك قطب التسجيل بمجرد إدخالها. - قم بإيقاف تشغيل مصدر الضوء ، إذا تم استخدامه.
- ضع خط الفراغ بالقرب من مستحضر رأس البعوض (المسافة: 20 سم) ومحاذاة مع شركة الطيران الرئيسية.
ملاحظة: سيساعد الفراغ على إزالة المواد الكيميائية المحيطة بإعداد الرأس بعد التحفيز ، مما قد يؤدي إلى استجابات EAG بعد تطبيق النبضات.
7. التسجيلات
- بعد إدخال أطراف الهوائيات ، قم بتشغيل مكبر الصوت ومخفض الضوضاء. راقب إشارة خط الأساس وتأكد من أنها ليست صاخبة.
ملاحظة: لاحظ ما إذا كانت هناك تذبذبات كبيرة في الإشارة الكهربائية. اضبط موضع الرأس وأطراف الهوائيات حسب الحاجة حتى تصبح الإشارة نظيفة. استخدم مشابك التمساح لتأريض أي شيء يدخل ضوضاء إلى قفص فاراداي أو طاولة الهواء. تعد إشارة خط الأساس التي تقل سعتها عن 0.01 مللي فولت مثالية لاكتشاف استجابات EAG الدقيقة وتمييزها. - بمجرد أن يكون مستوى الضوضاء مرضيا ، أدخل أول حقنة رائحة لاختبارها في فتحة شركة الطيران.
- أغلق قفص فاراداي. لا تبقى أمام التحضير ، للحد من الضوضاء.
- انقر فوق تسجيل على برنامج EAG.
- قم بتوصيل النبضة (النبضات) باستخدام تطبيق البرنامج.
ملاحظة: سيختلف عدد النبضات ومدتها حسب التجارب. هنا ، تم استخدام نبضات واحدة 1 ثانية لكل رائحة. تم فصل الروائح بمقدار 45 ثانية. - لاحظ استجابة هوائيات البعوض في دفتر ملاحظات المختبر.
ملاحظة: إذا تم اكتشاف الرائحة بواسطة هوائيات البعوض ، ملاحظة انحراف واضح في الإشارة (انظر الشكل 3 أ). - تابع الرائحة أو التركيز التالي. لا تنس أن تختار عرض الروائح بشكل عشوائي ما لم يتم إجراء منحنى استجابة الجرعة.
ملاحظة: يجب استخدام عنصر تحكم سلبي وتحكم إيجابي في التجارب. سيضمن ذلك أن الاستجابات التي لوحظت هي بالفعل استجابات شمية وليست بسبب الضوضاء الميكانيكية أو الكهربائية. - في نهاية التسجيل ، قم بتطبيق عنصر تحكم إيجابي للتحقق من أن الهوائيات لا تزال مستجيبة.
ملاحظة: استخدم 0.1٪ أو 1٪ بنزالديهايد لأن جميع أنواع البعوض التي تم اختبارها حتى الآن كانت مستجيبة لهذا المركب. - المضي قدما في إعداد البعوض المقبل.
8. التنظيف
- قم بإيقاف تشغيل مكبر الصوت ومخفض الضوضاء وشركة الطيران والكمبيوتر.
- أعد الروائح إلى الفريزر.
- قم بإزالة أوراق الترشيح من المحاقن الزجاجية ونظفها بالإيثانول بنسبة 100٪ إذا كانت البقايا مرئية على الجدران. اتركيه يجف على منديل التنظيف طوال الليل.
- نظف حوامل الأقطاب الكهربائية بماء DI لإزالة أي أثر محتمل للملح. جفف برفق على قطعة من مناديل التنظيف.
- ضع بقايا البعوض في الثلاجة وتخلص منها بعد 24 ساعة.
ملاحظة: إذا كنت تعمل مع البعوض المصاب، فاتبع متطلبات السلامة في مؤسستك.
9. تحليل البيانات
- قم بقياس استجابات مجموعة EAG يدويا أو تلقائيا.
ملاحظة: يتم قياس سعة EAG (-mV) هنا. متوسط إذا تم تطبيق نبضات متعددة لكل مركب. اعتمادا على البرنامج المستخدم ، يمكن اكتشاف EAGs وقياسها تلقائيا. ومع ذلك ، من الضروري فحص كل استجابة على حدة للتحقق من شكل الاستجابة وتقييم الاستجابة المحتملة المرحلة والمتأخرة وما إلى ذلك. تتماشى استجابة EAG المثالية مع النبض ، وتظهر انحرافا واضحا ، ويمكن تكرارها بين مستحضرات البعوض (الشكل 3). - قدم البيانات الأولية لإظهار الحد الأدنى من التباين وإشارة الضوضاء المنخفضة والاستجابات الواضحة (الشكل 3B).
ملاحظة: يمكن أيضا تسوية البيانات (على سبيل المثال ، درجة Z). يمكن طرح قيمة التحكم السلبية (مثل الزيوت المعدنية) (أي خط الأساس) من الاستجابة ، وإذا لم يكن الأمر كذلك ، فيجب تقديمها في الأرقام. يجب أيضا تقديم تحكم إيجابي. - إجراء التحليل الإحصائي باستخدام أي برنامج إحصائي28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يعد التصوير الكهربائي أداة قوية لتحديد ما إذا كان يتم اكتشاف مادة كيميائية أو مزيج من المواد الكيميائية بواسطة هوائي الحشرات. يمكن استخدامه أيضا لتحديد عتبة الكشف عن مادة كيميائية معينة باستخدام زيادة تدريجية في التركيز (أي استجابة منحنى الجرعة ، الشكل 4B). علاوة على ذلك ، من المفيد اختبار آثار طارد الحشرات على الاستجابة للروائح المرتبطة بالمضيف29.
يجب دائما استخدام الضوابط الإيجابية والسلبية في EAGs. هنا ، تم استخدام البنزالديهايد كعنصر تحكم إيجابي (الشكل 3B ، 3C ، 4A). تم العثور على هذا المركب لإثارة استجابة هوائية في جميع أنواع البعوض التي تم اختبارها حتى الآن24،25،29. يجب أيضا استخدام عنصر تحكم سلبي ويمكن أن يتكون من المذيب المستخدم لتخفيف المواد الكيميائية (مثل الزيوت المعدنية أو البارافين ، الهكسان ، إلخ) ويجب ألا يثير استجابة (الشكل 3B ، 3C ، 4A).
في الواقع ، عند إجراء EAGs ، لا ينبغي ملاحظة الانحراف عند تطبيق عنصر التحكم (الشكل 3B ، 3C ، 4A). إذا لوحظت استجابة ، فمن المحتمل أن تكون المحقنة و / أو التحكم في المذيبات و / أو خط الرائحة ملوثة. إذا كان الأمر كذلك ، فيجب تحضير محلول جديد ، وتنظيف المحقنة بالإيثانول بنسبة 100٪ وتجفيفها و / أو تطهير شركة الطيران عن طريق الشطف بالإيثانول بنسبة 100٪ وتجفيفها. إذا كان عنصر التحكم المختار يثير استجابة (على سبيل المثال ، الإيثانول) ، فيجب طرح القيمة التي تم الحصول عليها في -mV للتحكم من القيمة التي تم الحصول عليها للإيثانول والمواد الكيميائية المختبرة مجتمعة لتقييم تأثير المادة الكيميائية المختبرة على الهوائيات.
تختلف أنواع البعوض في قدرتها على الاستجابة للمركبات المختلفة وكذلك في حجم استجابتها. على سبيل المثال ، ينتج بعوض Toxorhynchites EAGs كبيرة جدا مقارنة ب Ae. aegypti و An. Stephensi و Cx. quinquefasciatus (الشكل 3C ، الشكل 4A).
في EAGs ، عادة ما تؤدي النبضة الثانية وما يليها إلى استجابات EAG أصغر. يمكن أن يؤثر عرض رائحة واحدة أيضا على الاستجابة لما يلي ، لذلك من المهم التوزيع العشوائي لترتيب الرائحة والمقايسات المتعددة لاختبار لوحة من الروائح بكفاءة (ما لم يتم إجراء منحنى استجابة الجرعة). علاوة على ذلك ، فإن فصل النبضات (على سبيل المثال ، 5 ثوان) والروائح (على سبيل المثال ، 45 ثانية) سيساعد على تحسين استجابات EAG.
يختلف تقلب المواد الكيميائية المختبرة ويمكن أن يؤثر على الاستجابة الشمية ويحتمل أن يؤدي إلى تأخر الاستجابة إذا كانت المادة الكيميائية المختبرة ذات تقلب منخفض للغاية. يجب معرفة التقلبات الكيميائية والذوبان قبل إجراء EAGs لتحسين الفحص. يجب أيضا اختيار المذيب المستخدم في تحضير التخفيفات بعناية (على سبيل المثال ، زيت الإيثانول أو الهكسان أو المعدن أو البارافين). علاوة على ذلك ، يجب اختيار التركيزات بحكمة ويجب أن تكون ذات صلة بالبيئة بشكل مثالي. غالبا ما يستخدم تركيز 1٪ أو 0.1٪ ولكنه مرتفع نسبيا ولا يمثل بالضرورة ما يمكن أن تختبره الحشرات في الطبيعة. ومع ذلك ، من المفيد فحص المركبات ذات التركيزات العالية نسبيا في بعض الحالات (على سبيل المثال ، لتطوير الطعم). يمكن اختبار المواد الطاردة بتركيزها المتاح تجاريا (على سبيل المثال ، يباع DEET عادة بتركيز 40٪).
إذا اقترنت بكروماتوغرافيا الغاز (أي GC-EADs)25 ، يمكن تحديد المركبات التي تثير استجابة باستخدام GC-MS ثم اختبارها بشكل فردي بتركيزات مختلفة أو في مخاليط مع EAGs. تجدر الإشارة إلى أنه لا يمكن تحديد تكافؤ المواد الكيميائية المختبرة باستخدام EAGs. فقط تجربة سلوكية تكميلية (على سبيل المثال ، مقياس الشم ، مقايسة التغذية) يمكنها تقييم ما إذا كانت المادة الكيميائية المكتشفة بواسطة الهوائيات جذابة أو طاردة أو محايدة للبعوض. وأخيرا، لا تظهر تجارب EAG سوى استجابات الجهاز العصبي الطرفي.
الشكل 1: يتكون إعداد مخطط كهربائي من: أ) المجهر: يجب أن يسمح المجهر المستخدم للمجرب برؤية التحضير بوضوح للسماح بإدخال أطراف هوائيات البعوض في أقطاب التسجيل. ب) مصباح الضوء البارد: يجب إيقاف تشغيل المصباح عند بدء التسجيلات. ج) خط الفراغ: هذا يقلل من خطر تراكم الروائح حول تحضير رأس البعوض ، مما قد يؤدي إلى فصل استجابات الهوائي عن التحفيز الفعلي. د) Micromanipulators (x2): ستسمح هذه بحركات حاملات الأقطاب الكهربائية الدقيقة جدا ، وهو أمر مطلوب لإدخال هوائيات البعوض في الشعيرات الدموية لقطب التسجيل. ه) حامل قطب التسجيل. و) حامل القطب المرجعي. ز) مرحلة الرأس: يتم توصيل كلا القطبين في مرحلة الرأس التي يتم توصيلها بعد ذلك بمكبر الصوت. ح) شركة الطيران الرئيسية: تدفق الهواء النظيف المستمر استحم رأس البعوض. يتم تنظيم معدل التدفق بواسطة مقياس التدفق. ط) حقنة لتوصيل الرائحة متصلة بصمام الملف اللولبي ومقياس التدفق ؛ ي) طاولة الهواء: طاولة الهواء سوف تقلل من الضوضاء. ك) قفص فاراداي: سيمنع قفص فاراداي الضوضاء الكهربائية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: إعداد رأس بعوضة الزاعجة المرقطة خطوة بخطوة لتسجيلات EAG. أ) أنثى البعوض على ظهرها على صفيحة جليدية للتحقق من أن كلا الهوائيين سليمان. ب) الجزء الأخير من استئصال الهوائيات بالمقص الدقيق. ج) يتم غمس الهوائيات في هلام القطب. د) تلتصق الهوائيات ببعضها البعض بعد سحبها للخارج. يجب أن يكون جزء واحد فقط من كل هوائي في هلام القطب. ه) استئصال رأس البعوض. و) رئيس شنت على القطب المرجعي. يجب أن تكون مستقرة بما يكفي ليتم نقلها إلى منصة EAG. أ '-ف'. نفس الخطوات الموضحة أعلاه لمجموعات EAG للذكور. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: رسم تخطيطي لبعوض EAG وآثار EAG الخام. أ) مخطط EAG (يسار) وخصائص استجابة EAG (يمين). (يسار) يتم تثبيت رأس البعوض بين قطب كهربائي مرجعي وقطب تسجيل متصل بمكبر للصوت. يتم غسل الهوائيات في تدفق هواء مستمر تنبض فيه محفزات الرائحة. يؤدي اكتشاف مادة كيميائية إلى انحراف (بالمللي فولت) في الإشارة. (يمين) يؤدي الكشف الكيميائي إلى إزالة استقطاب الخلايا (DPR) متبوعا بإعادة استقطاب الخلايا (RPR) حتى العودة إلى خط الأساس. يتم تمثيل نبض الرائحة بالمستطيل الرمادي. يشير الخط الأحمر إلى سعة استجابة EAG. ب) لقطة شاشة لبرنامج WinEDR تسلط الضوء على أثر تسجيل EAG كامل لأنثى البعوض Culex quinquefasciatus. أعلى: إشارة غير مفلترة (أي خام). الوسط: يشار إلى نبضات الرائحة 1 ثانية بالأرقام. القاع: إشارة مفلترة (أي تمرير منخفض 1.5 هرتز) إلى 3 روائح وعنصر تحكم (زيت معدني). لاحظ الانحرافات استجابة ل 1٪ 1-هكسانول (1) ، 1٪ بنزالديهايد (2) ، و 1٪ حمض الزبد (3). لاحظ عدم وجود استجابة للسيطرة السلبية ، الزيوت المعدنية (4). ج) من اليسار إلى اليمين: استجابات EAG التمثيلية (بالمللي فولت) إلى 1٪ بنزالديهايد (أعلى) والتحكم في الزيوت المعدنية (أسفل) في الإناث الزاعجة المصرية ، أنوفيليس ستيفينسي ، كوليكس كوينكويفاسياتوس ، وتوكسورينشيتس روتيلوس سبتنتريوناليس. يتم تمثيل نبضة الثانية الواحدة بالمستطيل الملون فوق تتبع EAG. لاحظ الانحراف الكبير استجابة للبنزالديهايد وعدم الاستجابة للزيت المعدني. لاحظ أيضا المقياس المختلف في Toxorhynchites rutilus septentrionalis. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: مثال على تمثيل نتائج مجموعة الاتحاد للطيران وتحليلاتها الإحصائية . أ. متوسط استجابات EAG للإناث Culex quinquefasciatus (N = 8) و Anopheles stephensi (N = 10) و Aedes aegypti (N = 8) و Toxorhynchites rutilus septentrionalis (N = 7) إلى 1٪ 1-hexanol (أخضر) ، 1٪ حمض الزبد (برتقالي) ، 1٪ بنزالديهايد (أصفر) وزيت معدني (أزرق). B. منحنى استجابة جرعة Culex quinquefasciatus لإناث EAG ل 1-هكسانول (يسار) (N = 9) وبنزالديهايد (يمين) (N = 8). تمثل الأشرطة الخطأ القياسي للمتوسط. تشير الأحرف الموجودة أعلى أشرطة الخطأ إلى الاختلافات الإحصائية (اختبار مجموع رتبة ويلكوكسون الزوجي مع تصحيح بونفيروني). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تتأثر السلوكيات بوساطة حاسة الشم بالعديد من العوامل ، بما في ذلك الفسيولوجية (على سبيل المثال ، العمر ، الوقت من اليوم) والبيئية (مثل درجة الحرارة والرطوبة النسبية)30. وبالتالي ، عند إجراء EAGs ، من الضروري استخدام الحشرات التي هي في نفس الحالة الفسيولوجية (أي مراقبة العمر ، والجوع ، والتزاوج)31 وكذلك الحفاظ على بيئة دافئة ورطبة حول التحضير لتجنب الجفاف. درجة حرارة حوالي 25 درجة مئوية مثالية ورطوبة 60٪ إلى 80٪ لشركة الطيران الرئيسية. يمكن تحقيق ذلك بسهولة عن طريق وضع فقاعة على دائرة الطيران الرئيسية.
علاوة على ذلك ، من المهم مراعاة بيئة كل نوع للحصول على نتائج ذات صلة ببيولوجيا الحشرة. على سبيل المثال ، إذا كنت تستخدم نوعا ليليا ، ففكر في عكس دورة الضوء الخاصة بها لاختبار استجابتها أثناء ليلتها الذاتية. من المهم أيضا اختيار إجراء EAGs في لحظات محددة من اليوم (أي عندما تكون الحشرة نشطة). على سبيل المثال ، إذا كنت تستخدم Ae. aegypti mosquitoes ، ففكر في إجراء التجارب خلال ذروة نشاط هذا النوع (أي في وقت مبكر من اليوم وبعد الظهر). مرة أخرى ، يمكن تحويل دورة الضوء بسهولة للراحة باستخدام الغرف المناخية أو صناديق الإضاءة مع برنامج إضاءة معكوس باستخدام مؤقت قابل للبرمجة32. أظهر Eilerts et al.33 و Krishnan et al.34 أن الحساسية لروائح معينة تختلف على مدار اليوم. وبالتالي ، فإن المعرفة الجيدة ببيئة الحشرة وبيولوجيتها ستضمن نتائج أكثر دقة.
يمكن إدخال الضوضاء (سواء الكهربائية أو الميكانيكية) بسهولة في مجموعات EAG. على سبيل المثال ، يمكن إنشاء اضطرابات ميكانيكية بواسطة نظام تكييف ينفخ الهواء نحو إعداد EAG. يمكن تقليل الضوضاء الكهربائية باستخدام Humbug ، ولكن ، إذا استمرت ، يمكن تعقبها عن طريق توصيل العناصر وتأريضها في قفص فاراداي باستخدام مقاطع التمساح (الشكل 3 ب). وهذا ينطبق على جميع العناصر الموجودة حول التحضير (أي المجهر ، المصباح ، micromanipulators). يجب فصل بعض قطع المعدات الموجودة في قفص فاراداي قبل التسجيل لأنها قد لا تزال تنتج ضوضاء كهربائية (مثل مصدر الضوء البارد) أو توضع خارج القفص. نوع آخر من "الضوضاء" ذو طبيعة شمية. يجب على المجرب تجنب وضع العطور أو استخدام الشامبو أو المنظفات ذات الرائحة القوية. في الواقع ، يمكن اكتشاف العديد من المركبات الموجودة في هذه بواسطة البعوض (على سبيل المثال ، لينالول ، سيترونيلول ، جيرانيول ، الأوجينول) وقد تتداخل وتؤثر على نتائج التجارب. يعد ارتداء معطف المختبر والقفازات ضروريا أيضا للحد من التلوث غير المرغوب فيه لشركة الطيران والمحاقن والأقطاب الكهربائية.
يتميز البروتوكول المقدم بكونه قابلا للتطبيق بسهولة على جميع أنواع البعوض ، في كل من الذكور والإناث ، مع إطالة عمر التحضير (> 30 دقيقة) ومع تباين محدود بين المستحضرات. تؤدي هذه الطريقة إلى الحد الأدنى من الضوضاء في إشارة EAG ، مما يسمح باختبار المواد الكيميائية بتركيزات منخفضة جدا. بمجرد إتقان خطوات التشريح والتركيب ، يمكن لهذه التقنية إنتاج بيانات موثوقة في فترة زمنية قصيرة نسبيا ، وتحليل بيانات مباشر.
يسمح التصوير الكهربائي فقط للمجرب بتقييم ما إذا كان بإمكان البعوض اكتشاف مادة كيميائية أم لا. ومع ذلك ، لتحديد تكافؤ هذه المادة الكيميائية ، تعد المقايسات السلوكية التكميلية ، مثل مقايسات مقياس الشم ، ضرورية لتحديد ما إذا كانت رائحة أو خليط معين جذابا أو طاردا أو محايدا من أجل تطوير أدوات فعالة لمكافحة البعوض35.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلف ما يكشف عنه.
Acknowledgments
أنا ممتن للدكتور كليمان فينوجر والدكتور جيفري ريفيل على المناقشات المفيدة. تم الحصول على الكواشف التالية من خلال موارد BEI ، NIAID ، المعاهد الوطنية للصحة: Anopheles stephensi ، Strain STE2 ، MRA-128 ، بمساهمة مارك ك. بنديكت. Aedes aegypti ، Strain ROCK ، MRA-734 ، ساهم بها ديفيد دبليو سيفرسون ؛ كوليكس كوينكويفاسياتوس ، سلالة JHB ، بيض ، NR-43025. يشكر المؤلف الدكتور جيك تو والدكتورة نيشا دوجال والدكتور جيمس ويجر وجيفري مارانو على توفير بيض البعوض Culex quinquefasciatus و Anopheles stephensi (سلالة: ليستون). الزاعجة المرقطة و Toxorhynchites rutilus septentrionalis مشتقة من البعوض الحقلي الذي جمعه المؤلف في منطقة وادي النهر الجديد (فيرجينيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم دعم هذا العمل من قبل قسم الكيمياء الحيوية ومعهد فرالين لعلوم الحياة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air table Clean Bench | TMC | https://www.techmfg.com/products/labtables/cleanbench63series/accessoriess | Noise reducer |
| Analog-to-digital board | National Instruments | BNC-2090A | |
| Benchtop Flowbuddy Complete | Genesee Scientific | 59-122BC | To anesthesize mosquitoes |
| Borosillicate glass capillary | Sutter Instrument | B100-78-10 | To make the recording and references capillaries |
| Chemicals | Sigma Aldrich | Benzaldehyde: 418099-100 mL; Butyric acid: B103500-100mL; 1-Hexanol: 471402-100mL; Mineral oil: M8410-1L | Chemicals used for the experiments presented here |
| CO2 | Airgas or Praxair | N/A | To anesthesize mosquitoes |
| Cold Light Source | Volpi | NCL-150 | |
| Disposable syringes | BD | 1 mL (309628) / 3 mL (309657) | |
| Electrode cables | World Precision Instruments | 5371 | |
| Electrode gel salt free | Parkerlabs | 12-08-Spectra-360 | |
| Faraday cage | TMC | https://www.techmfg.com/products/electric-and-magnetic-field-cancellation/faradaycages | Noise reducer |
| Flowmeters | Bel-art | 65 mm (H40406-0010) / 150 mm (H40407-0075) | One of each |
| GCMS vials and caps | Thermo-fisher scientific | 2-SVWKA8-CPK | To prepare odorant dilutions |
| Glass syringes (Fortuna) | Sigma Aldrich | Z314307 | For odor delivery to the EAG prep |
| Humbug | Quest Scientific | http://www.quest-sci.com/ | Noise reducer |
| 2 mm Jack Holder, Narrow, 90 deg., With Wire | A-M Systems | 675748 | Electrode holder |
| Magnetic bases | Kanetec | MB-FX | x 2 |
| MATLAB + Toolboxes | Mathworks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | For delivering the pulses |
| Medical air | Airgas or Praxair | N/A | For main airline |
| Microscope | Nikkon | SMZ-800N | |
| Micromanipulators Three-Axis Coarse/Fine Compact Micromanipulator | Narishige | MHW-3 | x 2 |
| Microelectrode amplifier with headstage | A-M Systems | Model 1800 | |
| Mosquito rearing supplies | Bioquip | https://www.bioquip.com/Search/WebCatalog.asp | |
| Needles | BD | 25G (305127) / 21G (305165) | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-6A | For odor delivery to the EAG prep |
| PTFE Tubing of different diameters | Mc Master Carr | N/A | To connect solenoid valve, flowmeter, airline ect. |
| 30V/5A DC Power Supply | Dr. Meter | PS-305DM | |
| R version 3.5.1 | R project | https://www.r-project.org/ | For data analyses |
| Relay for solenoid valve | N/A | Custom made | |
| Silver wire 0.01” | A-M Systems | 782500 | |
| Solenoid valve (3-way) | The Lee Company | LHDA0533115H | |
| WinEDR software | Strathclyde Electrophysiology Software | WinEDR V3.9.1 | For EAG recording |
| Whatman paper | Cole Parmer | UX-06648-03 | To load chemical in glass syringe / Pasteur pipette |
References
- World Health Organization. World health statistics 2019: monitoring health for the SDGs, sustainable development goals. World Health Organization. , Geneva. (2019).
- Takken, W. The role of olfaction in host-seeking of mosquitoes: a review. International Journal of Tropical Insect Science. 12 (1-2-3), 287-295 (1991).
- Zwiebel, L. J., Takken, W.
- Potter, C. J. Stop the biting: targeting a mosquito's sense of smell. Cell. 156 (5), 878-881 (2014).
- Paluch, G., Bartholomay, L., Coats, J. Mosquito repellents: a review of chemical structure diversity and olfaction. Pest Management Science. 66 (9), 925-935 (2010).
- Schneider, D. Electrophysiological investigation on the antennal receptors of the silk moth during chemical and mechanical stimulation. Experientia. 13 (2), 89-91 (1957).
- Raguso, R. A., Light, D. M., Pickersky, E. Electroantennogram responses of Hyles lineata (Sphingidae: Lepidoptera) to volatile compounds from Clarkia breweri (Onagraceae) and other moth-pollinated flowers. Journal of Chemical Ecology. 22 (10), 1735-1766 (1996).
- Schweitzer, E. S., Sanes, J. R., Hildebrand, J. G. Ontogeny of electroantennogram responses in the moth, Manduca sexta. Journal of Insect Physiology. 22 (7), 955-960 (1976).
- Martel, V., Anderson, P., Hansson, B. S., Schlyter, F. Peripheral modulation of olfaction by physiological state in the Egyptian leaf worm Spodoptera littoralis (Lepidoptera: Noctuidae). Journal of Insect Physiology. 55 (9), 793-797 (2009).
- Spaethe, J., Brockmann, A., Halbig, C., Tautz, J. Size determines antennal sensitivity and behavioral threshold to odors in bumblebee workers. Naturwissenschaften. 94 (9), 733-739 (2007).
- Suchet, C., et al. Floral scent variation in two Antirrhinum majus subspecies influences the choice of naïve bumblebees. Behavioral Ecology and Sociobiology. 65 (5), 1015-1027 (2011).
- De Jong, R., Pham-Delègue, M. H. Electroantennogram responses related to olfactory conditioning in the honeybee (Apis mellifera ligustica). Journal of Insect Physiology. 37 (4), 319-324 (1991).
- Patte, F., Etcheto, M., Marfaing, P., Laffort, P. Electroantennogram stimulus-response curves for 59 odourants in the honeybee, Apis mellifica. Journal of Insect Physiology. 35 (9), 667-675 (1989).
- Alcorta, E. Characterization of the electroantennogram in Drosophila melanogaster and its use for identifying olfactory capture and transduction mutants. Journal of Neurophysiology. 65 (3), 702-714 (1991).
- Park, K. C., Ochieng, S. A., Zhu, J., Baker, T. C. Odor discrimination using insect electroantennogram responses from an insect antennal array. Chemical Senses. 27 (4), 343-352 (2002).
- Du, Y. J., Millar, J. G. Electroantennogram and oviposition bioassay responses of Culex quinquefasciatus and Culex tarsalis (Diptera: Culicidae) to chemicals in odors from Bermuda grass infusions. Journal of Medical Entomology. 36 (2), 158-166 (1999).
- Costantini, C., et al. Electroantennogram and behavioural responses of the malaria vector Anopheles gambiae to human-specific sweat components. Medical and Veterinary Entomology. 15 (3), 259-266 (2001).
- Collins, L. E., Blackwell, A. Electroantennogram studies of potential oviposition attractants for Toxorhynchites moctezuma and T. amboinensis mosquitoes. Physiological Entomology. 23 (3), 214-219 (1998).
- Seenivasagan, T., Sharma, K. R., Sekhar, K., Ganesan, K., Prakash, S., Vijayaraghavan, R. Electroantennogram, flight orientation, and oviposition responses of Aedes aegypti to the oviposition pheromone n-heneicosane. Parasitology Research. 104 (4), 827-833 (2009).
- Puri, S. N., Mendki, M. J., Sukumaran, D., Ganesan, K., Prakash, S., Sekhar, K. Electroantennogram and behavioral responses of Culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae) females to chemicals found in human skin emanations. Journal of Medical Entomology. 43 (2), 207-213 (2014).
- Cooperband, M. F., McElfresh, J. S., Millar, J. G., Carde, R. T. Attraction of female Culex quinquefasciatus Say (Diptera: Culicidae) to odors from chicken feces. Journal of Insect Physiology. 54 (7), 1184-1192 (2008).
- Dekker, T., Ignell, R., Ghebru, M., Glinwood, R., Hopkins, R. Identification of mosquito repellent odours from Ocimum forskolei. Parasites & Vectors. 4 (1), 183 (2011).
- Choo, Y. M., et al. Reverse chemical ecology approach for the identification of an oviposition attractant for Culex quinquefasciatus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), 714-719 (2018).
- Wolff, G. H., Lahondère, C., Vinauger, C., Riffell, J. A. Neuromodulation and differential learning across mosquito species. bioRxiv. , 755017 (2019).
- Lahondère, C., et al. The olfactory basis of orchid pollination by mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (1), 708-716 (2020).
- Beyenbach, K., Masia, R. Membrane conductances of principal cells in Malpighian tubules of Aedes aegypti. Journal of Insect Physiology. 48, 375-386 (2002).
- Oesterle, A. The Pipette Cookbook. , (2018).
- R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. (2018).
- Afify, A., Betz, J. F., Riabinina, O., Lahondère, C., Potter, C. J. Commonly used insect repellents hide human odors from Anopheles mosquitoes. Current Biology. 29 (21), 3669-3680 (2019).
- Martin, F., Riveron, J., Alcorta, E. Environmental temperature modulates olfactory reception in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 57 (12), 1631-1642 (2011).
- Qiu, Y. T., Gort, G., Torricelli, R., Takken, W., van Loon, J. J. Effects of blood-feeding on olfactory sensitivity of the malaria mosquito Anopheles gambiae: application of mixed linear models to account for repeated measurements. Journal of Insect Physiology. 59 (11), 1111-1118 (2013).
- Taylor, B., Jones, M. D. R. The circadian rhythm of flight activity in the mosquito Aedes aegypti (L.): the phase-setting effects of light-on and light off. Journal of Experimental Biology. 51 (1), 59-70 (1969).
- Eilerts, D. F., VanderGiessen, M., Bose, E. A., Broxton, K., Vinauger, C. Odor-specific daily rhythms in the olfactory sensitivity and behavior of Aedes aegypti mosquitoes. Insects. 9 (4), 147 (2018).
- Krishnan, B., Dryer, S. E., Hardin, P. E. Circadian rhythms in olfactory responses of Drosophila melanogaster. Nature. 400 (6742), 375-378 (1999).
- Pelletier, J., Guidolin, A., Syed, Z., Cornel, A. J., Leal, W. S. Knockdown of a mosquito odorant-binding protein involved in the sensitive detection of oviposition attractants. Journal of Chemical Ecology. 36 (3), 245-248 (2010).
