Summary
המאמר הנוכחי מפרט פרוטוקול שלב אחר שלב לאלקטרואנטנוגרמות מוצלחות ובעלות רעש נמוך במספר סוגים של יתושים, כולל נקבות וזכרים כאחד.
Abstract
נקבות יתושים הן החיות הקטלניות ביותר על פני כדור הארץ, ותובעות את חייהם של יותר ממיליון בני אדם מדי שנה בשל פתוגנים שהם מעבירים בעת רכישת ארוחת דם. כדי לאתר פונדקאי להיזון ממנו, יתושים מסתמכים על מגוון רחב של רמזים חושיים, כולל חזותיים, מכניים, תרמיים וחוש ריח. המחקר מפרט טכניקה, אלקטרואנטנוגרפיה (EAG), המאפשרת לחוקרים להעריך אם היתושים יכולים לזהות כימיקלים בודדים ותערובות של כימיקלים באופן תלוי ריכוז. בשילוב עם כרומטוגרפיית גז (GC-EAG), טכניקה זו מאפשרת לחשוף את האנטנות לתערובת מלאה של מרחב ראש / מורכב וקובעת אילו כימיקלים נוכחים במדגם המעניין, היתוש יכול לזהות. זה חל על ריחות גוף מארחים, כמו גם זרי פרחים צמחיים או ריחות רלוונטיים אחרים מבחינה אקולוגית (למשל, ריחות אתרי oviposition). כאן, תיארנו פרוטוקול המאפשר משכי זמן ארוכים של היענות הכנה והוא ישים הן ליתושים נקבות והן ליתושים זכרים מסוגים שונים, כולל יתושי Aedes, Culex, Anopheles ו - Toxorhynchits . מכיוון שחוש הריח ממלא תפקיד מרכזי באינטראקציות יתושים-מארחים ובביולוגיה של יתושים באופן כללי, EAGs ו-GC-EAG יכולים לחשוף תרכובות מעניינות לפיתוח אסטרטגיות חדשות לשליטה בווקטורי מחלות (למשל, פיתיונות). יחד עם בדיקות התנהגותיות, ניתן לקבוע את הערכיות (למשל, מושכת, דוחה) של כל כימיקל.
Introduction
יתושים הם האורגניזמים הקטלניים ביותר על פני כדור הארץ, גובים את חייהם של יותר ממיליון בני אדם בשנה ומעמידים יותר ממחצית אוכלוסיית העולם בסיכון לחשיפה לפתוגנים שהם מעבירים, תוך עקיצה1. חרקים אלה מסתמכים על מגוון רחב של רמזים (כלומר, תרמיים, חזותיים, מכניים, חוש ריח, שמיעתי) כדי לאתר פונדקאי להיזון ממנו (הן צמח והן בעל חיים), להזדווגות ולביציות, כמו גם כדי להימנע מטורפים הן בשלב הזחל והן בשלב הבוגר 2,3. בין חושים אלה, חוש הריח ממלא תפקיד קריטי בהתנהגויות שהוזכרו לעיל, במיוחד לזיהוי לטווח בינוני עד ארוך של מולקולות ריח 2,3. ריחות הנפלטים על ידי מארח או אתר oviposition מזוהים על ידי קולטני ריח ספציפיים שונים (למשל, GRs, ORs, IRs) הממוקמים על יתוש palps proboscis, tarsi, ואנטנות 2,3.
מכיוון שחוש הריח הוא מרכיב מרכזי בהתנהגויות החיפוש אחר פונדקאים (צמחים ובעלי חיים), הזדווגות וביציות, הוא מהווה מטרה אידיאלית למחקר לפיתוח כלים חדשים להדברת יתושים4. מחקר על חומרים דוחי יתושים (למשל, DEET, IR3535, picaridin) ופיתיונות (למשל, BG sentinel human lure) הוא פורה ביותר5, אבל בגלל האתגרים הנוכחיים בהדברת יתושים (למשל, עמידות לקוטלי חרקים, מינים פולשים), חיוני לפתח שיטות הדברה יעילות חדשות המבוססות על הביולוגיה של היתושים.
טכניקות רבות (למשל, אולפקטומטר, בדיקות נחיתה, אלקטרופיזיולוגיה) שימשו להערכת הפעילות הביולוגית של תרכובות או תערובות של תרכובות ביתושים. ביניהם, electroantennography (או electroantennograms (EAGs)) ניתן להשתמש כדי לקבוע אם ריחות מזוהים על ידי אנטנות יתושים. טכניקה זו פותחה לראשונה על ידי שניידר6 ושימשה בסוגים רבים ושונים של חרקים מאז, כולל עשים 7,8,9, דבורי בומבוס 10,11, דבורי דבש 12,13 וזבובי פירות 14,15 אם להזכיר כמה. אלקטרואנטנוגרפיה שימשה גם באמצעות פרוטוקולים שונים, כולל אנטנות בודדות או מרובות ביתושים 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25.
יתושים הם חרקים קטנים ועדינים יחסית עם אנטנות דקות למדי. בעוד ביצוע EAGs על חרקים גדולים יותר כגון עש או דבורי בומבוס הוא קל יחסית בגלל גודלם הגדול יותר ואנטנות עבות יותר, ביצוע EAGs ביתושים יכול להיות מאתגר. בפרט, שמירה על יחס אות לרעש טוב והכנה תגובתית מתמשכת הן שתי דרישות עיקריות לשחזור נתונים ואמינות.
המדריך שלב אחר שלב ל-EAGs ברעש נמוך המוצע כאן מציע ישירות פתרונות למגבלות אלה והופך פרוטוקול זה לישים, עבור מספר מיני יתושים מסוגים שונים, כולל Aedes, Anopheles, Culex ו - Toxorhynchites, ומתאר את הטכניקה עבור נקבות וזכרים כאחד. אלקטרואנטנוגרפיה מציעה דרך מהירה אך אמינה לסנן ולקבוע תרכובות ביו-אקטיביות שניתן למנף לאחר מכן בפיתוח פיתיון לאחר קביעת ערכיות באמצעות בדיקות התנהגותיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת תמיסת מלח
- מכינים את המלוחים מראש ומאחסנים במקרר.
- עקוב אחר Beyenbach ו- Masia26 כדי להכין את הפתרון.
הערה: מתכון מלוחים ב-mM: 150.0 NaCl, 25.0 HEPES, 5.0 גלוקוז, 3.4 KCl, 1.8 NaHCO3, 1.7 CaCl 2 ו-1.0 MgCl2. ה- pH מותאם ל- 7.1 עם 1 M NaOH. אין להוסיף גלוקוז או סוכרוז להכנה בשלב זה כדי להגדיל את אחסון המדף. הוסיפו את הכמות הדרושה לתמיסת מלח ממש לפני הרצת ה-EAGs (כ-50 מ"ל לניסוי).
2. הכנת ריחות ואחסונם
- הכינו מראש את תערובות הריח או דילולי תרכובת בודדת בבקבוקוני ענבר של 1.5 מ"ל ואחסנו בטמפרטורה של -20°C כדי למנוע התפרקות תרכובת.
הערה: הריכוזים יהיו תלויים בבדיקה שתיערך. 0.1% או 1% משמשים בדרך כלל כדי לקבוע אם ניתן לזהות תרכובת או לא. לעקומת מנה-תגובה, הכינו דילולים סדרתיים של כימיקל נתון ובדקו אותם מהריכוזים הנמוכים ביותר לגבוהים ביותר. - הכינו את הדילולים במים, אתנול, הקסאן, שמן פרפין או שמן מינרלי, בהתאם למסיסות הכימיקל שנבדק.
- הקפידו להכין בקרת ממס (בקבוקון המכיל רק את הממס) לניסוי.
- הוציאו את הריחות מהמקפיא 30 דקות לפני תחילת הניסויים כדי לאפשר להם להפשיר. מערבבים כל בקבוקון לפני השימוש כדי לערבב היטב את הכימיקל והממס.
- פיפטה 10 מיקרוליטר של תמיסה על פיסת נייר סינון (0.5 ס"מ x 2 ס"מ) טעונה בתוך מזרק זכוכית מסומן או פיפטה פסטר.
- טען כל תרכובת או תערובת בפיפטת פסטר או מזרק ספציפיים כדי למנוע זיהום.
הערה: טען 10 דקות לפני תחילת הניסוי כדי שהריח יוכל להתפזר במזרק אך לא למשך זמן רב יותר כדי למנוע התפרקות. תן פיפטה פסטר או מזרק להישאר מכוסה בשלב זה כדי לאפשר דיפוזיה טובה של הכימיקל לפני תחילת הניסוי. - לאחר כל ריצת EAG, השליכו את פיסת נייר הסינון והחליפו אותה בחדשה כדי למנוע מהנייר להיספג יתר על המידה ולהסתכן בחסימת מחט. החלף את המחטים באופן קבוע (כל 10 ריצות).
3. הפרדת יתושים
- בודדו את היתושים ביום הניסויים.
- השתמשו ביתושים בני 6 ימים לפחות ביום הניסויים כדי להגדיל את הסיכוי שהנקבות יזדווגו כדי לשפר את תגובתן לריחות הקשורים לפונדקאי.
הערה: התאימו את גיל היתוש בזמן הבדיקה בהתאם לפרויקט. בדוק והרמוניה את המצב הפיזיולוגי (למשל, ניזון מדם, מורעב, מעולם לא הוזן קודם לכן וכו '). - הרעיבו את היתושים עד 12 שעות (כלומר, ללא גישה לסוכר) כדי להגביר את המוטיבציה והרגישות שלהם.
- הכניסו את מיכל היתושים למקרר (4°C) עד שהם יפסיקו לעוף, כך שניתן יהיה להעביר אנשים בקלות לכוסות בודדות עם מלקחיים.
הערה: מינים עם עמידות גבוהה יותר לקור ניתן להניח באמצעות כרית זבוב CO2 . ודא כי היתושים לא להישאר על זה במשך זמן רב כדי למנוע התייבשות, אשר יפחית את ההיענות של הכנת EAG יתושים. - אחסנו את הכוסות המכילות יתושים בודדים בטמפרטורת החדר לפני ביצוע ה-EAGs והשליכו את כל היתושים שאסור להשתמש בהם במהלך היום.
4. מחזיק אלקטרודות והכנת נימים
- משיכה נימית, הכנה ואחסון
- השתמש נימי בורוסיליקט עם חוטים (מזהה: 0.78 מ"מ, O.D: 1 מ"מ). משוך אותם בהתאם לציוד27.
הערה: אחסנו את הנימים שנמשכו בצלחת פטרי. הניחו את צלחת הפטרי על חתיכות שעווה או חימר דוגמנות לא מבושם כדי למנוע מהם לזוז ולהישבר. - לפני ביצוע ניסוי EAG, שברו בעדינות את קצה 2 הנימים בעזרת זוג מלקחיים מתחת למיקרוסקופ.
הערה: ודא שאחד גדול מעט מהשני כדי להתאים לצוואר (נימים גדולים יותר) או לקצות האנטנות (נימים קטנים יותר). ודא כי החתך נקי ללא סדק נוכח על דופן הנימים. זה דורש סבלנות ותרגול. - אם הם עדיין שלמים, יש לעשות שימוש חוזר בנימים אלה לאחר שטיפה במים דה-יוניים (DI) לאחר סיום הניסוי. הסירו את עודפי המים על ידי מריחה עדינה של מגבון ניקוי על הקצה. החזירו לצלחת פטרי לאחסון. אם הקצה עקום, השליכו את הנימים.
- השתמש נימי בורוסיליקט עם חוטים (מזהה: 0.78 מ"מ, O.D: 1 מ"מ). משוך אותם בהתאם לציוד27.
- מחזיק אלקטרודות והרכבה נימית
- תייגו את שני מחזיקי האלקטרודות כ"הקלטה" ו"התייחסות" באמצעות פיסות נייר דבק בצבעים שונים. זה יעזור להנחות את הרכבה של ראש יתוש אלקטרודות.
- ודא שמחזיקי האלקטרודות שקופים בפנים ושאין פסולת בורוסיליקט.
- הכלורידיזציה: משרים את חוטי הכסף של מחזיקי האלקטרודות באקונומיקה טהורה למשך כ-5 דקות. החוטים הופכים מאפור בהיר מבריק לאפור כהה מט.
- שחררו את פקק הגומי ומלאו את החלק הפנימי של הנימים בתמיסת מלח 10% באמצעות מחט 20 גרם.
- ממלאים את נימי הבורוסיליקט בתמיסת המלח באמצעות מזרק. ודא שאין בועות לא במחזיק האלקטרודה ולא בנימי המשיכה.
הערה: כדי להפחית את הסיכויים לבועות בנימים, המשיכו לדחוף מי מלח בנימים תוך משיכת המחט החוצה בעדינות והשתמשו בנימים עם חוט להט. ניתן לטעון את הנימים בתמיסה המורכבת מג'ל אלקטרודות 1:3 ותמיסת מלח. זה יכול לעזור למנוע אידוי של מלוחים ויכול להיות שימושי במיוחד כאשר לומדים ומתרגלים EAGs, כמו הנסיין יצטרך יותר זמן כדי להשלים את השלבים השונים. - לאחר ההשרייה, שטפו את חוטי הכסף במי DI והכניסו אותם לשני הנימים. ודא כי קצה החוט הוא פחות מ 1 מ"מ מקצה הנימים. ודא שהנימים מעבירים את טבעת הגומי בתוך מחזיק האלקטרודה מבלי להישבר. הדקו בעדינות את פקק הגומי. ודא שאין בועות אוויר.
- השתמש בנימים עם הפתח הרחב יותר על מחזיק אלקטרודת הייחוס (צוואר), והפתח הקטן יותר על מחזיק אלקטרודת ההקלטה (אנטנות).
- השאירו את שני מחזיקי האלקטרודות המותקנים על מגבון ניקוי רטוב כדי למנוע מהקצה להתייבש עד שיהיה מוכן להרכיב את הראש.
5. הכנת אסדת EAG (איור 1)
- ודא כי שולחן האוויר הוא למעלה, כי אין חסימה בחברת התעופה. ודא שמיכל האוויר הרפואי עדיין מלא כדי למנוע שינוי באמצע הניסוי. ודא שיש בועות במכשיר האדים.
- מערכת אספקת אוויר ופולסים
- הפעל את מיכל דלק האוויר הרפואי.
- בדוק את רמת שני מדי הזרימה.
הערה: מד הזרימה השולט על זרם האוויר העיקרי השוטף את ההכנה במהלך כל הניסוי צריך להיות ב 140 מ"ל / דקה והשני הקשור לדופק הריח צריך לקרוא 15 מ"ל / דקה.
- אם אתה עושה GC-EAD, הפעל את המכונה, מיכלי הגז וצור/טען את הקובץ / השיטה.
- הפעל את המחשבים, את יישומי התוכנה, את ספק הכוח של השסתומים ובדוק את חיבור האינטרנט כדי שיישום התוכנה יפעל.
- יישום תוכנה: ניתן לכתוב תסריט קצר כדי לספק את הדופק.
- תוכנת EAG: השתמש בכל תוכנת אלקטרופיזיולוגיה.
- ליישם את הפרמטרים בתוכנה (למשל, מגבר, משך ההקלטה, משך הפולסים וכו ').
- ספק דופק בקרה כדי לוודא שהשסתום המספק את הפולסים תקין.
- הגדר את ספק הכוח על 5.2 V. אמת את הפרמטרים של המגבר.
הערה: הפרמטרים המשמשים לנתונים המוצגים כאן הם: מסנן חיתוך נמוך של 0.1 הרץ; מסנן חיתוך גבוה של 500 הרץ; רווח של x100.
6. הכנה והרכבה של ראש יתושים (איור 2)
- מניחים צלחת אלומיניום על קרח ומניחים עליה חתיכת מגבון ניקוי רטוב.
- שים בובה קטנה של אלקטרודה ג'ל בפינה.
- הניחו יתושים על קרח ותנו ליתוש להתקרר למשך מספר דקות, או עד שהוא מפסיק לעוף.
הערה: מינים מסוימים עמידים לקור ועשויים לדרוש הרדמה מהירה מעל משטח זבוב CO2 כדי לרדת. כמה שפחות היתוש נשאר על אף אחד מהם, כן ייטב. - מניחים את היתוש על גבו וחותכים את קצה כל אנטנה (רק חלק קטן מהקטע האחרון) במספריים מיקרו.
- השתמש במלקחיים כדי לגרור את היתוש ליד בובת ג'ל האלקטרודה וטבול את קצה האנטנה בעדינות בג'ל. הימנע מטבילה יותר מאשר רק את החלק האחרון בג'ל האלקטרודות.
- בעזרת מלקחיים, משכו את אנטנות היתושים החוצה תוך שמירה עליהן זו ליד זו. תנו להם לצאת יחד מהג'ל. ודאו שהאנטנות אינן נוגעות בפני השטח של מגבון הניקוי, אחרת הן עלולות להיפרד.
- מניחים את היתוש על צידו וקוצצים את הראש באמצעות מספריים זעירים או סכין גילוח.
הערה: לאחר חיתוך הראש, המשך במהירות לשלבים הבאים ולאסדת EAG כדי להתחיל את ההקלטות. התכשיר צריך להישאר רספונסיבי במשך כ -30 דקות. - קח את אלקטרודת הייחוס ועמוק בעדינות את הקצה בג'ל. שמור על קשר עם רקמות הצוואר ולתת את הראש מקל על זה.
- הזיזו את מחזיקי האלקטרודות מתחת למיקרוסקופ EAG וצפו דרך המיקרוסקופ כדי למקם את אלקטרודת הראש (כלומר, הייחוס) על מיקרומניפולטור. ודא שהאנטנות נמצאות במרכז.
- תפוס את אלקטרודת ההקלטה, הנח אותה לפני קצות האנטנות. העבר ויישר אותו קרוב ככל האפשר לקצוות באמצעות המיקרומניפולטור. באמצעות המיקרוסקופ, הזז את קצה אלקטרודת ההקלטה לכיוון האנטנות.
- חבר את שני מחזיקי האלקטרודות למגבר לפני הכנסת הקצוות כדי למנוע מהם לזוז לאחר החדרתם.
- הכנס את קצות האנטנות לאלקטרודת ההקלטה. ודא שהם רק באים במגע עם המלח וג'ל האלקטרודות ונראים בשקיפות דרך הנימים. האנטנה נכנסת לפי "אפקט היניקה".
- התאימו את מיקום הראש והקצוות בעזרת מלקחיים מתחת למיקרוסקופ, במידת הצורך.
- הניחו את צינורות חברת התעופה קרוב להכנת ראש היתוש (מרחק: 1 ס"מ).
הערה: אם הראש נופל, חזור לתחנת הדיסקציה והרכיב מחדש את הראש או הכין ראש חדש אם הוא אבד או אם עברו יותר מ-5 דקות מאז שהראש נכרת. חיבור טוב בין הנימים לצוואר/אנטנות חיוני לרעש נמוך ולהקלטה אמינה. באופן אידיאלי, קצות האנטנות יהיו במרחק של פחות מ -1 מ"מ מהחוט של אלקטרודת ההקלטה לאחר הכנסתה. - כבה את מקור האור, אם נעשה בו שימוש.
- מקמו את קו הוואקום ליד הכנת ראש היתוש (מרחק: 20 ס"מ) ויישרו קו עם חברת התעופה הראשית.
הערה: הוואקום יסייע להסיר כימיקלים סביב הכנת הראש לאחר הגירוי, מה שעלול להוביל לתגובות EAG לאחר הפעלת הפולסים.
7. הקלטות
- לאחר הכנסת קצות האנטנות, הפעל את המגבר ואת מפחית הרעש. התבונן באות הבסיס וודא שהוא אינו רועש.
הערה: שים לב אם קיימות תנודות גדולות באות החשמלי. התאם את מיקום הראש וקצות האנטנות לפי הצורך עד שהאות נקי. השתמשו בקליפסי תנין כדי לקרקע כל דבר שמכניס רעש לכלוב פאראדיי או לשולחן האוויר. אות בסיסי של פחות מ-0.01 mV באמפליטודה אידיאלי לזיהוי ולהבחנה של תגובות EAG זעירות. - ברגע שרמת הרעש מספקת, הכניסו את מזרק הריח הראשון לבדיקה בחור חברת התעופה.
- סגור את כלוב פאראדיי. אל תישארו מול התכשיר, כדי להפחית רעש.
- לחץ על הקלט בתוכנת EAG.
- ספק את הדופק(ים) באמצעות יישום התוכנה.
הערה: מספר ומשך הפולסים ישתנו בהתאם לניסויים. כאן, 1 s. פולסים בודדים לכל ריח שימשו. ריחות הופרדו על ידי 45 שניות. - שימו לב לתגובת אנטנות היתושים במחברת המעבדה.
הערה: אם הריח מזוהה על-ידי אנטנות היתוש, נצפתה סטייה ברורה של האות (ראו איור 3A). - המשך עם הריח או הריכוז הבא. אל תשכחו לבצע הצגה אקראית של ריחות אלא אם כן מבוצעת עקומת מנה-תגובה.
הערה: יש להשתמש בבקרה שלילית ובבקרה חיובית בניסויים. זה יבטיח שהתגובות שנצפו הן אכן תגובות חוש הריח ולא בגלל רעש מכני או חשמלי. - בסוף ההקלטה, החל בקרה חיובית כדי לוודא שהאנטנות עדיין מגיבות.
הערה: יש להשתמש ב-0.1% או 1% בנזלדהיד, שכן כל מיני היתושים שנבדקו עד כה הגיבו לתרכובת זו. - המשיכו בהכנת היתושים הבאה.
8. ניקוי
- כבו את המגבר, את מפחית הרעשים, את חברת התעופה ואת המחשב.
- מחזירים את הריחות למקפיא.
- הסר את ניירות הסינון ממזרקי הזכוכית ונקה עם 100% אתנול אם שאריות נראות על הקירות. הניחו לייבוש על מגבון ניקוי למשך הלילה.
- נקו את מחזיקי האלקטרודות במי DI כדי להסיר כל זכר אפשרי למלח. יש לייבש על ידי מריחה עדינה על פיסת מגבון ניקוי.
- מניחים את שאריות היתושים במקפיא ומסלקים כעבור 24 שעות.
הערה: אם אתה עובד עם יתושים נגועים, פעל בהתאם לדרישות הבטיחות במוסד שלך.
9. ניתוח נתונים
- מדוד באופן ידני או אוטומטי את תגובות EAG.
הערה: משרעת EAG (-mV) נמדדת כאן. ממוצע אם הוחלו פולסים מרובים עבור כל תרכובת. בהתאם לתוכנה שבה נעשה שימוש, ניתן לזהות ולמדוד EAGs באופן אוטומטי. עם זאת, חיוני לבדוק כל תגובה בנפרד כדי לאמת את צורת התגובה ולהעריך את הנשיאה האפשרית, תגובה מאוחרת וכו '. תגובת EAG האידיאלית מיושרת עם הדופק, מראה סטייה ברורה, וניתן לחזור עליה בין תכשירי יתושים (איור 3). - הציגו את הנתונים הגולמיים כדי להציג שונות מינימלית, אות רעש נמוך ותגובות ברורות (איור 3B).
הערה: ניתן גם לנרמל את הנתונים (למשל, ציון Z). ניתן להחסיר את ערך הבקרה השלילי (למשל, שמן מינרלי) (כלומר, קו הבסיס) מהתגובה, ואם לא, יש להציג אותו באיורים. יש להציג גם שליטה חיובית. - ביצוע ניתוח סטטיסטי באמצעות כל תוכנת סטטיסטיקה28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אלקטרואנטנוגרפיה היא כלי רב עוצמה כדי לקבוע אם כימיקל או תערובת של כימיקלים מזוהה על ידי אנטנת חרקים. הוא יכול לשמש גם כדי לקבוע את סף הזיהוי של כימיקל נתון באמצעות עלייה הדרגתית בריכוז (כלומר, תגובת עקומת המינון, איור 4B). יתר על כן, כדאי לבדוק את ההשפעות של דוחה על התגובה לריחות הקשורים למארח29.
תמיד יש להשתמש בבקרות חיוביות ושליליות ב- EAGs. כאן, בנזלדהיד שימש כבקרה חיובית (איור 3B, 3C, 4A). תרכובת זו נמצאה כמעוררת תגובת אנטנה בכל מיני היתושים שנבדקו עד כה24,25,29. יש להשתמש גם בבקרה שלילית, והיא יכולה להיות מורכבת מהממס המשמש לדילול הכימיקלים (למשל, שמנים מינרליים או פרפין, הקסאן וכו') ולא אמורה לעורר תגובה (איור 3B, 3C, 4A).
ואכן, בעת ביצוע EAGs, אין להבחין בסטייה בעת החלת הבקרה (איור 3B, 3C, 4A). אם נצפתה תגובה, סביר להניח שהמזרק, בקרת הממס ו/או קו הריח מזוהמים. אם זה המקרה, יש להכין פתרון חדש, לנקות את המזרק עם 100% אתנול ולייבש ו / או את חברת התעופה לטהר על ידי שטיפה עם 100% אתנול ומיובש. אם הבקרה שנבחרה מעוררת תגובה (למשל, אתנול), יש להפחית את הערך המתקבל ב-mV עבור הבקרה מהערך המתקבל עבור אתנול ולבדוק כימיקל משולב כדי להעריך את ההשפעה של הכימיקל הנבדק על האנטנות.
מיני יתושים נבדלים זה מזה ביכולתם להגיב לתרכובות שונות, כמו גם בעוצמת התגובה שלהם. לדוגמה, יתושי Toxorhynchites מייצרים EAGs גדולים מאוד בהשוואה ל-Ae. aegypti, An. Stephensi ו-Cx. quinquefasciatus (איור 3C, איור 4A).
ב-EAGs, הפעימה השנייה והבאה אחריה מובילות בדרך כלל לתגובות EAG קטנות יותר. הצגת ריח אחד יכולה להשפיע גם על התגובה לדברים הבאים, ולכן חשוב לבצע אקראיות של סדר הריחות ובדיקות מרובות כדי לבדוק ביעילות פאנל של ריחות (אלא אם כן מבוצעת עקומת מנה-תגובה). יתר על כן, הפרדת פולסים (למשל, 5 שניות) וריחות (למשל, 45 שניות) תסייע לייעל את תגובות ה-EAG.
התנודתיות של הכימיקלים שנבדקו משתנה ויכולה להשפיע על תגובת חוש הריח ועלולה להוביל לתגובה מאוחרת אם לכימיקל הנבדק יש תנודתיות נמוכה מאוד. יש לדעת תנודתיות כימית ומסיסות לפני ביצוע EAGs כדי לייעל את הבדיקה. יש לבחור בקפידה גם את הממס המשמש להכנת הדילולים (למשל, אתנול, הקסאן, מינרלים או שמן פרפין). יתר על כן, ריכוזים צריכים להיבחר בתבונה באופן אידיאלי צריך להיות רלוונטי מבחינה אקולוגית. לעתים קרובות משתמשים בריכוז של 1% או 0.1% אך הוא גבוה יחסית ולא בהכרח מייצג את מה שהחרקים יכולים לחוות בטבע. עם זאת, כדאי לסנן תרכובות עם ריכוזים גבוהים יחסית במקרים מסוימים (למשל, לפיתוח פיתיון). ניתן לבדוק חומרים דוחי יתושים בריכוז הזמין מסחרית שלהם (למשל, DEET נמכר בדרך כלל בריכוז של 40%).
בשילוב עם כרומטוגרפיית גז (כלומר, GC-EADs)25, ניתן לזהות את התרכובות המעוררות תגובה עם GC-MS ולאחר מכן לבדוק אותן בנפרד בריכוזים שונים או בתערובות עם EAGs. ראוי להזכיר כי הערכיות של הכימיקלים שנבדקו לא ניתן לקבוע עם EAGs. רק ניסוי התנהגותי משלים (למשל, אולפקטומטר, בדיקת האכלה) יכול להעריך אם הכימיקל שזוהה על ידי האנטנות מושך, דוחה או ניטרלי עבור היתוש. לבסוף, ניסויי EAG מראים רק תגובות של מערכת העצבים ההיקפית.
איור 1: מערך אלקטרואנטנוגרמה המורכב מ: A) מיקרוסקופ: המיקרוסקופ שבו משתמשים אמור לאפשר לנסיין לראות בבירור את ההכנה כדי לאפשר להכניס את קצות אנטנות היתושים לאלקטרודות ההקלטה. ב) מנורת אור קרה: יש לכבות את המנורה עם תחילת ההקלטות. ג) קו ואקום: זה מפחית את הסיכון להצטברות של ריחות סביב הכנת ראש היתוש, מה שעלול לגרום לתגובות אנטנה מנותקות מהגירוי בפועל. D) מיקרומניפולטורים (x2): אלה יאפשרו תנועות עדינות מאוד של מחזיקי האלקטרודות, הנדרשות להחדרת אנטנות היתוש לנימי אלקטרודת ההקלטה. ה) מחזיק אלקטרודות הקלטה. ו) מחזיק אלקטרודת ייחוס. ז) שלב ראש: שתי האלקטרודות מחוברות לשלב הראש אשר מחובר לאחר מכן למגבר. ח) חברת תעופה ראשית: זרימת אוויר נקייה קבועה שטפה את ראש היתוש. קצב הזרימה מווסת על ידי מד זרימה. I) מזרק להעברת ריח המחובר לשסתום הסולנואיד ולמד הזרימה; י) שולחן אוויר: שולחן האוויר יפחית רעש. יא) כלוב פאראדיי: כלוב פאראדיי ימנע רעש חשמלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הכנת ראש יתוש Aedes albopictus שלב אחר שלב עבור רישומי EAG. A) נקבת יתוש על גבה על צלחת קפואה כדי לוודא ששתי האנטנות שלמות. ב) קטע אחרון של כריתת האנטנות במספריים מיקרו. ג) אנטנות טבולות בג'ל אלקטרודות. ד) האנטנות נדבקות זו לזו לאחר שליפתן החוצה. רק קטע אחד מכל אנטנה צריך להיות בג'ל האלקטרודות. ה) כריתת ראש יתוש. F) ראש רכוב על אלקטרודת הייחוס. זה צריך להיות יציב מספיק כדי להיות מועבר לאסדת EAG. א'-פ'. אותם צעדים כפי שהוצגו לעיל עבור EAGs גברים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: סכמה של עקבות EAG של יתוש ועקבות EAG גולמיים. A) סכמת EAG (משמאל) ומאפיינים של תגובת EAG (מימין). (משמאל) ראש היתוש מורכב בין אלקטרודת ייחוס לאלקטרודת הקלטה המחוברת למגבר. האנטנות שטופות בזרימת אוויר מתמדת שבה פועמים גירויי ריח. זיהוי של כימיקל מוביל להטייה (ב- mV) באות. (ימין) הזיהוי הכימי מוביל לדפולריזציה של תאים (DPR) ואחריה רפולריזציה של תאים (RPR) עד לחזרה לקו הבסיס. דופק הריח מיוצג על ידי המלבן האפור. הקו האדום מציין את המשרעת של תגובת EAG. B) צילום מסך של תוכנת WinEDR המדגישה עקבות הקלטה שלמים של EAG של נקבת יתוש Culex quinquefasciatus. למעלה: אות לא מסונן (כלומר, גולמי). באמצע: פולסי ריח של 1 שניות מסומנים במספרים. למטה: אות מסונן (כלומר, 1.5 הרץ מעבר נמוך) ל-3 ריחות ובקרה (שמן מינרלי). שימו לב לסטיות בתגובה ל-1% 1-הקסנול (1), 1% בנזלדהיד (2) ו-1% חומצה בוטירית (3). שימו לב להיעדר תגובה לבקרה השלילית, שמן מינרלי (4). C) משמאל לימין: תגובות EAG מייצגות (ב-mV) ל-1% בנזלדהיד (למעלה) ובקרת שמן מינרלי (למטה) בנקבות Aedes aegypti, Anopheles stephensi, Culex quinquefasciatus ו-Toxorhynchites rutilus septentrionalis. הפעימה של שנייה אחת מיוצגת על ידי המלבן הצבעוני מעל עקבות EAG. שימו לב לסטייה הגדולה בתגובה לבנזלדהיד ולחוסר התגובה לשמן המינרלי. כמו כן, שימו לב לסולם השונה ב-Toxorhynchites rutilus septentrionalis. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ייצוג לדוגמה של תוצאות EAG והניתוחים הסטטיסטיים שלהן. א. תגובות EAG ממוצעות של נקבות Culex quinquefasciatus (N=8), אנופלס סטפנסי (N=10), Aedes aegypti (N=8) ו-Toxorhynchites rutilus septentrionalis (N=7) ל-1% 1-הקסנול (ירוק), 1% חומצה בוטירית (כתום), 1% בנזלדהיד (צהוב) ושמן מינרלי (כחול). B. נקבות Culex quinquefasciatus עקומת מנה-תגובה EAG עבור 1-הקסנול (משמאל) (N = 9) ובנזלדהיד (מימין) (N = 8). עמודות מייצגות שגיאת תקן של הממוצע. אותיות מעל קווי שגיאה מציינות הבדלים סטטיסטיים (Pairwise Wilcoxon rank sum test with a Bonferroni correction). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
התנהגויות מתווכות ריח מושפעות מגורמים רבים, כולל פיזיולוגיים (למשל, גיל, שעה ביום) וסביבתיים (למשל, טמפרטורה, לחות יחסית)30. לכן, בעת ביצוע EAGs, חיוני להשתמש חרקים הנמצאים באותו מצב פיזיולוגי (כלומר, ניטור גיל, רעב, הזדווגות)31 וגם לשמור על סביבה חמה ולחה סביב התכשיר כדי למנוע התייבשות. טמפרטורה סביב 25 °C (75 °F) היא אידיאלית ו 60% עד 80% לחות עבור חברת התעופה הראשית. ניתן להשיג זאת בקלות על ידי הצבת בועה במעגל התעופה הראשי.
יתר על כן, חשוב לקחת בחשבון את האקולוגיה של כל מין כדי לקבל תוצאות רלוונטיות לביולוגיה של החרק. לדוגמה, אם אתם משתמשים במין לילי, שקלו להפוך את מחזור האור שלהם כדי לבחון את תגובתם במהלך הלילה הסובייקטיבי שלהם. הבחירה לבצע EAGs ברגעים מסוימים של היום (כלומר, כאשר החרק פעיל) היא גם חשובה. לדוגמה, אם אתם משתמשים ביתושים Ae. aegypti, שקלו לערוך את הניסויים במהלך שיא הפעילות של מין זה (כלומר, מוקדם ביום ומאוחר יותר אחר הצהריים). שוב, ניתן להזיז בקלות את מחזור האור לנוחות באמצעות תאי אקלים או תיבות אור עם תוכנית אור הפוכה באמצעות טיימר32 הניתן לתכנות. Eilerts et al.33 ו- Krishnan et al.34, הראו כי הרגישות לריחות ספציפיים משתנה לאורך היום. לכן, ידע טוב של האקולוגיה והביולוגיה של החרק יבטיח תוצאות מדויקות יותר.
רעש (חשמלי או מכני) ניתן להכניס בקלות EAGs. לדוגמה, הפרעות מכניות יכולות להיווצר על ידי מערכת AC הנושפת אוויר לכיוון תכשיר EAG. רעש חשמלי יכול להיות מופחת עם Humbug, אבל, אם הוא מתמיד, ניתן לאתר אותו על-ידי חיבור אלמנטים והארקתם לכלוב פאראדיי באמצעות קליפסי תנין (איור 3B). זה חל על כל האלמנטים הנוכחים סביב ההכנה (כלומר, מיקרוסקופ, מנורה, micromanipulators). יש לנתק חלק מהציוד בכלוב פאראדיי לפני ההקלטה מכיוון שהם עדיין עלולים לייצר רעש חשמלי (למשל, מקור אור קר) או להציב מחוץ לכלוב. סוג אחר של "רעש" הוא בעל אופי חוש הריח. על הנסיין להימנע מלבישת בושם או להשתמש בשמפו או חומר ניקוי בניחוח חזק. ואכן, תרכובות רבות הנמצאות בהם ניתנות לזיהוי על ידי יתושים (למשל, לינאלול, ציטרונלול, גרניול, יוג'נול) ועלולות להפריע ולהשפיע על תוצאות הניסויים. לבישת מעיל מעבדה וכפפות חיונית גם כדי להגביל זיהום לא רצוי של חברת התעופה, מזרקים ואלקטרודות.
לפרוטוקול המוצג יש יתרון בכך שהוא ישים בקלות לכל מיני היתושים, הן בזכרים והן בנקבות, תוך הארכת תוחלת החיים של התכשיר (> 30 דקות) ועם שונות מוגבלת בין התכשירים. שיטה זו מובילה לרעש מינימלי מאוד באות EAG, המאפשר בדיקת כימיקלים בריכוזים נמוכים מאוד. לאחר השליטה בשלבי הדיסקציה וההרכבה, טכניקה זו יכולה להפיק נתונים אמינים בזמן קצר יחסית, וניתוחי נתונים פשוטים.
אלקטרואנטנוגרפיה רק מאפשרת לנסיין להעריך אם היתוש יכול לזהות כימיקל או לא. עם זאת, כדי לקבוע את הערכיות של כימיקל זה, בדיקות התנהגותיות משלימות, כגון בדיקות אולפקטומטר, הן קריטיות כדי לקבוע אם ריח או תערובת מסוימים הם מושכים, דוחים או ניטרליים על מנת לפתח כלים יעילים להדברת יתושים35.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחבר אין מה לחשוף.
Acknowledgments
אני אסיר תודה לד"ר קלמנט וינאוז'ה ולד"ר ג'פרי ריפל על הדיונים המועילים. הריאגנטים הבאים הושגו באמצעות BEI Resources, NIAID, NIH: Anopheles stephensi, Strain STE2, MRA-128, שנתרמו על ידי Mark Q. Benedict; Aedes aegypti, Strain ROCK, MRA-734, נתרם על ידי David W. Severson; Culex quinquefasciatus, זן JHB, ביצים, NR-43025. המחבר מודה לד"ר ג'ייק טו, ד"ר נישה דוגאל, ד"ר ג'יימס ווגר וג'פרי מראנו על אספקת ביצי יתושים מסוג Culex quinquefasciatus ו-Anopheles stephensi (זן: ליסטון). Aedes albopictus ו - Toxorhynchites rutilus septentrionalis מופקים מיתושי שדה שנאספו על ידי המחבר באזור עמק הנהר החדש (VA, ארה"ב). עבודה זו נתמכה על ידי המחלקה לביוכימיה ומכון פרלין למדעי החיים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air table Clean Bench | TMC | https://www.techmfg.com/products/labtables/cleanbench63series/accessoriess | Noise reducer |
| Analog-to-digital board | National Instruments | BNC-2090A | |
| Benchtop Flowbuddy Complete | Genesee Scientific | 59-122BC | To anesthesize mosquitoes |
| Borosillicate glass capillary | Sutter Instrument | B100-78-10 | To make the recording and references capillaries |
| Chemicals | Sigma Aldrich | Benzaldehyde: 418099-100 mL; Butyric acid: B103500-100mL; 1-Hexanol: 471402-100mL; Mineral oil: M8410-1L | Chemicals used for the experiments presented here |
| CO2 | Airgas or Praxair | N/A | To anesthesize mosquitoes |
| Cold Light Source | Volpi | NCL-150 | |
| Disposable syringes | BD | 1 mL (309628) / 3 mL (309657) | |
| Electrode cables | World Precision Instruments | 5371 | |
| Electrode gel salt free | Parkerlabs | 12-08-Spectra-360 | |
| Faraday cage | TMC | https://www.techmfg.com/products/electric-and-magnetic-field-cancellation/faradaycages | Noise reducer |
| Flowmeters | Bel-art | 65 mm (H40406-0010) / 150 mm (H40407-0075) | One of each |
| GCMS vials and caps | Thermo-fisher scientific | 2-SVWKA8-CPK | To prepare odorant dilutions |
| Glass syringes (Fortuna) | Sigma Aldrich | Z314307 | For odor delivery to the EAG prep |
| Humbug | Quest Scientific | http://www.quest-sci.com/ | Noise reducer |
| 2 mm Jack Holder, Narrow, 90 deg., With Wire | A-M Systems | 675748 | Electrode holder |
| Magnetic bases | Kanetec | MB-FX | x 2 |
| MATLAB + Toolboxes | Mathworks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | For delivering the pulses |
| Medical air | Airgas or Praxair | N/A | For main airline |
| Microscope | Nikkon | SMZ-800N | |
| Micromanipulators Three-Axis Coarse/Fine Compact Micromanipulator | Narishige | MHW-3 | x 2 |
| Microelectrode amplifier with headstage | A-M Systems | Model 1800 | |
| Mosquito rearing supplies | Bioquip | https://www.bioquip.com/Search/WebCatalog.asp | |
| Needles | BD | 25G (305127) / 21G (305165) | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-6A | For odor delivery to the EAG prep |
| PTFE Tubing of different diameters | Mc Master Carr | N/A | To connect solenoid valve, flowmeter, airline ect. |
| 30V/5A DC Power Supply | Dr. Meter | PS-305DM | |
| R version 3.5.1 | R project | https://www.r-project.org/ | For data analyses |
| Relay for solenoid valve | N/A | Custom made | |
| Silver wire 0.01” | A-M Systems | 782500 | |
| Solenoid valve (3-way) | The Lee Company | LHDA0533115H | |
| WinEDR software | Strathclyde Electrophysiology Software | WinEDR V3.9.1 | For EAG recording |
| Whatman paper | Cole Parmer | UX-06648-03 | To load chemical in glass syringe / Pasteur pipette |
References
- World Health Organization. World health statistics 2019: monitoring health for the SDGs, sustainable development goals. World Health Organization. , Geneva. (2019).
- Takken, W. The role of olfaction in host-seeking of mosquitoes: a review. International Journal of Tropical Insect Science. 12 (1-2-3), 287-295 (1991).
- Zwiebel, L. J., Takken, W.
- Potter, C. J. Stop the biting: targeting a mosquito's sense of smell. Cell. 156 (5), 878-881 (2014).
- Paluch, G., Bartholomay, L., Coats, J. Mosquito repellents: a review of chemical structure diversity and olfaction. Pest Management Science. 66 (9), 925-935 (2010).
- Schneider, D. Electrophysiological investigation on the antennal receptors of the silk moth during chemical and mechanical stimulation. Experientia. 13 (2), 89-91 (1957).
- Raguso, R. A., Light, D. M., Pickersky, E. Electroantennogram responses of Hyles lineata (Sphingidae: Lepidoptera) to volatile compounds from Clarkia breweri (Onagraceae) and other moth-pollinated flowers. Journal of Chemical Ecology. 22 (10), 1735-1766 (1996).
- Schweitzer, E. S., Sanes, J. R., Hildebrand, J. G. Ontogeny of electroantennogram responses in the moth, Manduca sexta. Journal of Insect Physiology. 22 (7), 955-960 (1976).
- Martel, V., Anderson, P., Hansson, B. S., Schlyter, F. Peripheral modulation of olfaction by physiological state in the Egyptian leaf worm Spodoptera littoralis (Lepidoptera: Noctuidae). Journal of Insect Physiology. 55 (9), 793-797 (2009).
- Spaethe, J., Brockmann, A., Halbig, C., Tautz, J. Size determines antennal sensitivity and behavioral threshold to odors in bumblebee workers. Naturwissenschaften. 94 (9), 733-739 (2007).
- Suchet, C., et al. Floral scent variation in two Antirrhinum majus subspecies influences the choice of naïve bumblebees. Behavioral Ecology and Sociobiology. 65 (5), 1015-1027 (2011).
- De Jong, R., Pham-Delègue, M. H. Electroantennogram responses related to olfactory conditioning in the honeybee (Apis mellifera ligustica). Journal of Insect Physiology. 37 (4), 319-324 (1991).
- Patte, F., Etcheto, M., Marfaing, P., Laffort, P. Electroantennogram stimulus-response curves for 59 odourants in the honeybee, Apis mellifica. Journal of Insect Physiology. 35 (9), 667-675 (1989).
- Alcorta, E. Characterization of the electroantennogram in Drosophila melanogaster and its use for identifying olfactory capture and transduction mutants. Journal of Neurophysiology. 65 (3), 702-714 (1991).
- Park, K. C., Ochieng, S. A., Zhu, J., Baker, T. C. Odor discrimination using insect electroantennogram responses from an insect antennal array. Chemical Senses. 27 (4), 343-352 (2002).
- Du, Y. J., Millar, J. G. Electroantennogram and oviposition bioassay responses of Culex quinquefasciatus and Culex tarsalis (Diptera: Culicidae) to chemicals in odors from Bermuda grass infusions. Journal of Medical Entomology. 36 (2), 158-166 (1999).
- Costantini, C., et al. Electroantennogram and behavioural responses of the malaria vector Anopheles gambiae to human-specific sweat components. Medical and Veterinary Entomology. 15 (3), 259-266 (2001).
- Collins, L. E., Blackwell, A. Electroantennogram studies of potential oviposition attractants for Toxorhynchites moctezuma and T. amboinensis mosquitoes. Physiological Entomology. 23 (3), 214-219 (1998).
- Seenivasagan, T., Sharma, K. R., Sekhar, K., Ganesan, K., Prakash, S., Vijayaraghavan, R. Electroantennogram, flight orientation, and oviposition responses of Aedes aegypti to the oviposition pheromone n-heneicosane. Parasitology Research. 104 (4), 827-833 (2009).
- Puri, S. N., Mendki, M. J., Sukumaran, D., Ganesan, K., Prakash, S., Sekhar, K. Electroantennogram and behavioral responses of Culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae) females to chemicals found in human skin emanations. Journal of Medical Entomology. 43 (2), 207-213 (2014).
- Cooperband, M. F., McElfresh, J. S., Millar, J. G., Carde, R. T. Attraction of female Culex quinquefasciatus Say (Diptera: Culicidae) to odors from chicken feces. Journal of Insect Physiology. 54 (7), 1184-1192 (2008).
- Dekker, T., Ignell, R., Ghebru, M., Glinwood, R., Hopkins, R. Identification of mosquito repellent odours from Ocimum forskolei. Parasites & Vectors. 4 (1), 183 (2011).
- Choo, Y. M., et al. Reverse chemical ecology approach for the identification of an oviposition attractant for Culex quinquefasciatus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), 714-719 (2018).
- Wolff, G. H., Lahondère, C., Vinauger, C., Riffell, J. A. Neuromodulation and differential learning across mosquito species. bioRxiv. , 755017 (2019).
- Lahondère, C., et al. The olfactory basis of orchid pollination by mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (1), 708-716 (2020).
- Beyenbach, K., Masia, R. Membrane conductances of principal cells in Malpighian tubules of Aedes aegypti. Journal of Insect Physiology. 48, 375-386 (2002).
- Oesterle, A. The Pipette Cookbook. , (2018).
- R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. (2018).
- Afify, A., Betz, J. F., Riabinina, O., Lahondère, C., Potter, C. J. Commonly used insect repellents hide human odors from Anopheles mosquitoes. Current Biology. 29 (21), 3669-3680 (2019).
- Martin, F., Riveron, J., Alcorta, E. Environmental temperature modulates olfactory reception in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 57 (12), 1631-1642 (2011).
- Qiu, Y. T., Gort, G., Torricelli, R., Takken, W., van Loon, J. J. Effects of blood-feeding on olfactory sensitivity of the malaria mosquito Anopheles gambiae: application of mixed linear models to account for repeated measurements. Journal of Insect Physiology. 59 (11), 1111-1118 (2013).
- Taylor, B., Jones, M. D. R. The circadian rhythm of flight activity in the mosquito Aedes aegypti (L.): the phase-setting effects of light-on and light off. Journal of Experimental Biology. 51 (1), 59-70 (1969).
- Eilerts, D. F., VanderGiessen, M., Bose, E. A., Broxton, K., Vinauger, C. Odor-specific daily rhythms in the olfactory sensitivity and behavior of Aedes aegypti mosquitoes. Insects. 9 (4), 147 (2018).
- Krishnan, B., Dryer, S. E., Hardin, P. E. Circadian rhythms in olfactory responses of Drosophila melanogaster. Nature. 400 (6742), 375-378 (1999).
- Pelletier, J., Guidolin, A., Syed, Z., Cornel, A. J., Leal, W. S. Knockdown of a mosquito odorant-binding protein involved in the sensitive detection of oviposition attractants. Journal of Chemical Ecology. 36 (3), 245-248 (2010).
