모기 전기 조영술에 대한 단계별 가이드
Summary
이 기사는 암컷과 수컷을 포함한 여러 속의 모기에서 성공적이고 저소음 근위전도를 위한 단계별 프로토콜을 자세히 설명합니다.
Abstract
암컷 모기는 지구상에서 가장 치명적인 동물로, 혈액 식사를 할 때 전염되는 병원체로 인해 매년 100만 명이 넘는 사람들의 목숨을 앗아갑니다. 먹이를 먹을 숙주를 찾기 위해 모기는 시각적, 기계적, 열적, 후각적 등 다양한 감각 신호에 의존합니다. 이 연구는 연구자들이 모기가 농도에 따라 개별 화학 물질과 화학 물질의 혼합을 감지 할 수 있는지 여부를 평가할 수있는 전기 전기 검사 (EAG) 기술에 대해 자세히 설명합니다. 가스 크로마토 그래피 (GC-EAG)와 결합 할 때,이 기술은 안테나를 전체 헤드 스페이스 / 복잡한 혼합물에 노출시키고 모기가 검출 할 수있는 관심있는 샘플에 존재하는 화학 물질을 결정합니다. 이것은 숙주의 체취뿐만 아니라 식물 꽃다발 또는 기타 생태학적으로 관련된 냄새(예: 산란 부위 냄새 물질)에 적용할 수 있습니다. 여기에서 우리는 긴 기간의 준비 반응 시간을 허용하고 Aedes, Culex, Anopheles 및 Toxorhynchites 모기를 포함한 여러 속의 암컷 및 수컷 모기 모두에 적용할 수 있는 프로토콜을 설명했습니다. 후각은 일반적으로 모기 숙주 상호 작용 및 모기 생물학에서 중요한 역할을하기 때문에 EAG 및 GC-EAG는 새로운 질병 벡터 제어 전략 (예 : 미끼)의 개발을위한 관심 화합물을 밝힐 수 있습니다. 행동 분석으로 보완하면 각 화학 물질의 원자가 (예 : 유인 물질, 기피제)를 결정할 수 있습니다.
Introduction
모기는 지구상에서 가장 치명적인 유기체로, 연간 백만 명 이상의 목숨을 앗아가고 세계 인구의 절반 이상을 그들이 전염시키는 병원체에 노출될 위험에 처하게합니다. 이 곤충들은 먹이를 먹을 숙주(식물과 동물 모두)를 찾고, 짝짓기와 산란을 하고, 애벌레와 성충 단계 모두에서 포식자를 피하기 위해 광범위한 단서(즉, 열, 시각, 기계, 후각, 청각)에 의존한다 2,3. 이러한 감각 중에서, 후각은 위에서 언급한 행동, 특히 냄새 분자 2,3의 중장거리 검출에 중요한 역할을 한다. 숙주 또는 산란 부위에서 방출되는 냄새는 모기, 족근 및 더듬이에 위치한 다양한 특정 후각 수용체(예: GR, OR, IR)에 의해 감지됩니다 2,3.
후각은 숙주 탐색(식물과 동물), 짝짓기 및 산란 행동의 핵심 구성 요소이기 때문에 모기 방제를 위한 새로운 도구를 개발하기 위한 이상적인 목표가 된다4. 모기 퇴치제(예: DEET, IR3535, 피카리딘)와 미끼(예: BG 센티넬 인간 미끼)에 대한 연구는 매우 풍부하지만5, 현재 모기 방제의 과제(예: 살충제저항성, 침입종)로 인해 모기 생물학에 입각한 새롭고 효율적인 방제 방법을 개발하는 것이 필수적이다.
많은 기술(예: 후각계, 착륙 분석, 전기생리학)이 모기에서 화합물 또는 화합물 혼합물의 생체 활성을 평가하는 데 사용되었습니다. 그 중에서도 electroantennography (또는 electroantennograms (EAG))를 사용하여 냄새 물질이 모기 안테나에 의해 감지되는지 여부를 결정할 수 있습니다. 이 기술은 Schneider6에 의해 처음 개발 되었으며 그 이후로 나방 7,8,9, 땅벌10,11, 꿀벌 12,13, 초파리14,15를 포함하여 다양한 곤충 속에서 사용되었습니다. Electroantennography는 또한 모기 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25의 단일 또는 다중 안테나를 포함하여 다양한 프로토콜을 사용하여 사용되었습니다.
모기는 비교적 작고 섬세한 곤충으로 다소 얇은 안테나를 가지고 있습니다. 나방이나 땅벌과 같은 더 큰 곤충에 대해 EAG를 수행하는 것은 크기가 크고 안테나가 두껍기 때문에 비교적 쉽지만 모기에서 EAG를 수행하는 것은 어려울 수 있습니다. 특히, 우수한 신호 대 잡음비를 유지하고 지속적인 응답 준비는 데이터 재현성과 신뢰성을 위한 두 가지 주요 요구 사항입니다.
여기에 제안 된 저소음 EAG에 대한 단계별 가이드는 이러한 한계에 대한 솔루션을 직접 제공하고이 프로토콜을 Aedes, Anopheles, Culex 및 Toxorhynchites를 포함한 다양한 속의 여러 모기 종에 적용 할 수 있도록하고 여성과 남성 모두를위한 기술을 설명합니다. Electroantennography는 행동 분석을 통해 원자가를 결정한 후 미끼 개발에 활용할 수 있는 생리 활성 화합물을 스크리닝하고 결정하는 빠르고 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
후각 매개 행동은 생리적(예: 연령, 시간) 및 환경(예: 온도, 상대 습도)을 포함한 많은 요인의 영향을 받습니다30. 따라서 EAG를 수행 할 때 동일한 생리적 상태 (즉, 연령 모니터링, 굶주림, 짝짓기)에있는 곤충을 사용하는 것이 필수적입니다 31 건조를 피하기 위해 준비 주변에 따뜻하고 습한 환경을 유지하는 것이 필수적입니다. 약 25 °C의 온도가 이상적이며 주?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
도움이 되는 토론을 해주신 클레망 비나거(Clément Vinauger) 박사와 제프리 리프펠(Jeffrey Riffell) 박사에게 감사드립니다. 다음의 시약은 BEI Resources, NIAID, NIH를 통해 입수하였다: Anopheles stephensi, 균주 STE2, MRA-128, Mark Q. Benedict에 의해 기여됨; Aedes aegypti, Strain ROCK, MRA-734, David W. Severson 제공; Culex quinquefasciatus, 균주 JHB, 계란, NR-43025. 저자는 Culex quinquefasciatus 및 Anopheles stephensi (균주 : Liston) 모기 알을 제공 한 Jake Tu 박사, Nisha Duggal 박사, James Weger 박사 및 Jeffrey Marano에게 감사드립니다. Aedes albopictus 와 Toxorhynchites rutilus septentrionalis 는 저자가 New River Valley 지역 (VA, USA)에서 수집 한 들판 모기에서 파생됩니다. 이 연구는 생화학과와 Fralin Life Science Institute의 지원을 받았습니다.
Materials
| Air table Clean Bench | TMC | https://www.techmfg.com/products/labtables/cleanbench63series/accessoriess | Noise reducer |
| Analog-to-digital board | National Instruments | BNC-2090A | |
| Benchtop Flowbuddy Complete | Genesee Scientific | 59-122BC | To anesthesize mosquitoes |
| Borosillicate glass capillary | Sutter Instrument | B100-78-10 | To make the recording and references capillaries |
| Chemicals | Sigma Aldrich | Benzaldehyde: 418099-100 mL; Butyric acid: B103500-100mL; 1-Hexanol: 471402-100mL; Mineral oil: M8410-1L | Chemicals used for the experiments presented here |
| CO2 | Airgas or Praxair | N/A | To anesthesize mosquitoes |
| Cold Light Source | Volpi | NCL-150 | |
| Disposable syringes | BD | 1 mL (309628) / 3 mL (309657) | |
| Electrode cables | World Precision Instruments | 5371 | |
| Electrode gel salt free | Parkerlabs | 12-08-Spectra-360 | |
| Faraday cage | TMC | https://www.techmfg.com/products/electric-and-magnetic-field-cancellation/faradaycages | Noise reducer |
| Flowmeters | Bel-art | 65 mm (H40406-0010) / 150 mm (H40407-0075) | One of each |
| GCMS vials and caps | Thermo-fisher scientific | 2-SVWKA8-CPK | To prepare odorant dilutions |
| Glass syringes (Fortuna) | Sigma Aldrich | Z314307 | For odor delivery to the EAG prep |
| Humbug | Quest Scientific | http://www.quest-sci.com/ | Noise reducer |
| 2 mm Jack Holder, Narrow, 90 deg., With Wire | A-M Systems | 675748 | Electrode holder |
| Magnetic bases | Kanetec | MB-FX | x 2 |
| MATLAB + Toolboxes | Mathworks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | For delivering the pulses |
| Medical air | Airgas or Praxair | N/A | For main airline |
| Microscope | Nikkon | SMZ-800N | |
| Micromanipulators Three-Axis Coarse/Fine Compact Micromanipulator | Narishige | MHW-3 | x 2 |
| Microelectrode amplifier with headstage | A-M Systems | Model 1800 | |
| Mosquito rearing supplies | Bioquip | https://www.bioquip.com/Search/WebCatalog.asp | |
| Needles | BD | 25G (305127) / 21G (305165) | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-6A | For odor delivery to the EAG prep |
| PTFE Tubing of different diameters | Mc Master Carr | N/A | To connect solenoid valve, flowmeter, airline ect. |
| 30V/5A DC Power Supply | Dr. Meter | PS-305DM | |
| R version 3.5.1 | R project | https://www.r-project.org/ | For data analyses |
| Relay for solenoid valve | N/A | Custom made | |
| Silver wire 0.01” | A-M Systems | 782500 | |
| Solenoid valve (3-way) | The Lee Company | LHDA0533115H | |
| WinEDR software | Strathclyde Electrophysiology Software | WinEDR V3.9.1 | For EAG recording |
| Whatman paper | Cole Parmer | UX-06648-03 | To load chemical in glass syringe / Pasteur pipette |
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