Summary
Le présent article détaille un protocole étape par étape pour des électroantennogrammes réussis et à faible bruit dans plusieurs genres de moustiques, y compris les femelles et les mâles.
Abstract
Les moustiques femelles sont les animaux les plus meurtriers sur terre, coûtant la vie à plus de 1 million de personnes chaque année en raison des agents pathogènes qu’ils transmettent lors de l’acquisition d’un repas de sang. Pour localiser un hôte dont se nourrir, les moustiques s’appuient sur un large éventail d’indices sensoriels, notamment visuels, mécaniques, thermiques et olfactifs. L’étude détaille une technique, l’électroantennenographie (EAG), qui permet aux chercheurs d’évaluer si les moustiques peuvent détecter des produits chimiques individuels et des mélanges de produits chimiques d’une manière dépendante de la concentration. Lorsqu’elle est associée à la chromatographie en phase gazeuse (GC-EAG), cette technique permet d’exposer les antennes à un mélange complet d’espace de tête / complexe et détermine quels produits chimiques présents dans l’échantillon d’intérêt le moustique peut détecter. Cela s’applique aux odeurs corporelles de l’hôte ainsi qu’aux bouquets floraux végétaux ou à d’autres odeurs pertinentes sur le plan écologique (p. ex. odeurs des sites de ponte). Ici, nous avons décrit un protocole qui permet de longues durées de temps de réactivité de préparation et qui est applicable aux moustiques femelles et mâles de plusieurs genres, y compris les moustiques Aedes, Culex, Anopheles et Toxorhynchites . Comme l’olfaction joue un rôle majeur dans les interactions moustique-hôte et la biologie des moustiques en général, les EAG et les GC-EAG peuvent révéler des composés d’intérêt pour le développement de nouvelles stratégies de lutte contre les vecteurs de maladies (par exemple, les appâts). Complété par des tests comportementaux, la valence (par exemple, attractif, répulsif) de chaque produit chimique peut être déterminée.
Introduction
Les moustiques sont les organismes les plus meurtriers sur terre, tuant plus d’un million de personnes par an et exposant plus de la moitié de la population mondiale au risque d’exposition aux agents pathogènes qu’ils transmettent, tout en piquant1. Ces insectes dépendent d’un large éventail d’indices (c.-à-d. thermiques, visuels, mécaniques, olfactifs, auditifs) pour localiser un hôte dont se nourrir (tant végétal qu’animal), pour l’accouplement et la ponte, ainsi que pour éviter les prédateurs aux stades larvaire et adulte 2,3. Parmi ces sens, l’olfaction joue un rôle essentiel dans les comportements mentionnés ci-dessus, en particulier pour la détection à moyenne et longue portée des molécules odorantes 2,3. Les odeurs émises par un hôte ou un site de ponte sont détectées par divers récepteurs olfactifs spécifiques (p. ex. GR, OR, IR) situés sur les palpes des moustiques proboscis, les tarses et les antennes 2,3.
L’olfaction étant un élément clé de leurs comportements de recherche d’hôtes (végétaux et animaux), d’accouplement et de ponte, elle constitue donc une cible idéale à étudier pour développer de nouveaux outils de lutte contre les moustiques4. La recherche sur les répulsifs (p. ex. DEET, IR3535, picaridine) et les appâts (p. ex. leurre humain sentinelle BG) est extrêmement prolifique5, mais en raison des défis actuels dans la lutte contre les moustiques (p. ex. résistance aux insecticides, espèces envahissantes), il est essentiel de mettre au point de nouvelles méthodes de lutte efficaces fondées sur la biologie des moustiques.
De nombreuses techniques (p. ex., olfactomètre, essais d’atterrissage, électrophysiologie) ont été utilisées pour évaluer la bioactivité de composés ou de mélanges de composés chez les moustiques. Parmi eux, l’électroantennographie (ou électroantennogrammes (EAG)) peut être utilisée pour déterminer si les odorants sont détectés par les antennes des moustiques. Cette technique a été initialement développée par Schneider6 et a été utilisée dans de nombreux genres d’insectes depuis lors, y compris les mites 7,8,9, les bourdons 10,11, les abeilles mellifères 12,13 et les mouches des fruits 14,15 pour n’en nommer que quelques-uns. L’électroantennenographie a également été utilisée en utilisant divers protocoles, y compris des antennes simples ou multiples chez les moustiques 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25.
Les moustiques sont des insectes relativement petits et délicats avec des antennes plutôt minces. Bien qu’il soit relativement facile d’effectuer des EAG sur des insectes plus gros tels que les mites ou les bourdons en raison de leur plus grande taille et de leurs antennes plus épaisses, la réalisation d’EAG chez les moustiques peut être difficile. En particulier, le maintien d’un bon rapport signal sur bruit et une préparation réactive durable sont deux exigences majeures pour la reproductibilité et la fiabilité des données.
Le guide étape par étape des EAG à faible bruit proposé ici offre directement des solutions à ces limitations et rend ce protocole applicable à plusieurs espèces de moustiques de différents genres, y compris Aedes, Anopheles, Culex et Toxorhynchites, et décrit la technique pour les femelles et les mâles. L’électroantennenographie offre un moyen rapide mais fiable de dépister et de déterminer les composés bioactifs qui peuvent ensuite être exploités dans le développement d’appâts après que la valence a été déterminée avec des tests comportementaux.
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Protocol
1. Préparation de la solution saline
- Préparez la solution saline à l’avance et conservez-la au réfrigérateur.
- Suivre Beyenbach et Masia26 pour préparer la solution.
REMARQUE: Recette saline en mM: 150,0 NaCl, 25,0 HEPES, 5,0 glucose, 3,4 KCl, 1,8 NaHCO3, 1,7 CaCl 2 et 1,0 MgCl2. Le pH est ajusté à 7,1 avec 1 M NaOH. N’ajoutez pas de glucose ou de saccharose à la préparation à ce moment-là pour augmenter le stockage en rayon. Ajouter la quantité nécessaire à la solution saline juste avant d’exécuter les EAG (environ 50 ml par expérience).
2. Préparation et stockage des odeurs
- Préparer à l’avance les mélanges odorants ou les dilutions de composés simples dans des flacons ambrés de 1,5 mL et les conserver à -20 °C pour éviter la dégradation du composé.
REMARQUE : Les concentrations dépendent de l’essai à effectuer. 0,1% ou 1% sont couramment utilisés pour déterminer si un composé peut être détecté ou non. Pour une courbe dose-réponse, préparer des dilutions en série d’un produit chimique donné et les tester de la plus faible à la concentration la plus élevée. - Préparer les dilutions dans de l’eau, de l’éthanol, de l’hexane, de l’huile de paraffine ou de l’huile minérale, selon la solubilité du produit chimique testé.
- Assurez-vous de préparer un témoin de solvant (un flacon contenant uniquement le solvant) pour l’expérience.
- Sortez les odorants du congélateur 30 minutes avant le début des expériences pour les laisser décongeler. Vortex chaque flacon avant utilisation pour bien mélanger le produit chimique et le solvant.
- Pipeter 10 μL de solution sur une feuille de papier filtre (0,5 cm x 2 cm) chargée à l’intérieur d’une seringue en verre étiquetée ou d’une pipette Pasteur.
- Chargez chaque composé ou mélange dans une pipette ou une seringue Pasteur spécifique pour éviter toute contamination.
REMARQUE: Charger 10 minutes avant de commencer l’expérience afin que l’odeur puisse se diffuser dans la seringue, mais pas plus longtemps pour éviter la dégradation. Laissez la pipette ou la seringue Pasteur rester bouchée, à ce moment-là, pour permettre une bonne diffusion du produit chimique avant le début de l’expérience. - Après chaque passage EAG, jetez le morceau de papier filtre et remplacez-le par un nouveau pour éviter que le papier ne soit trop trempé et ne risque de bloquer l’aiguille. Remplacez les aiguilles régulièrement (toutes les 10 passages).
3. Séparation des moustiques
- Isolez les moustiques le jour des expériences.
- Utilisez des moustiques âgés d’au moins 6 jours le jour des expériences pour augmenter les chances que les femelles soient accouplées afin d’améliorer leur réponse aux odeurs liées à l’hôte.
REMARQUE: Ajustez l’âge des moustiques au moment du test en fonction du projet. Vérifier et harmoniser l’état physiologique (p. ex., nourri au sang, affamé, jamais nourri auparavant, etc.). - Affamer les moustiques jusqu’à 12 heures (c’est-à-dire sans accès au sucre) pour augmenter leur motivation et leur sensibilité.
- Placez le contenant anti-moustiques au réfrigérateur (4 °C) jusqu’à ce qu’il cesse de voler afin que les individus puissent facilement être délicatement transférés dans des tasses individuelles avec forceps.
NOTE: Les espèces ayant une plus grande tolérance au froid peuvent être abattues à l’aide d’une plate-forme anti-mouche CO2 . Assurez-vous que les moustiques ne restent pas longtemps dessus pour éviter la dessiccation, ce qui diminuerait la réactivité de la préparation de l’EAG des moustiques. - Conservez les tasses contenant des moustiques uniques à température ambiante avant que les EAG ne soient effectués et jetez tous les moustiques qui ne peuvent pas être utilisés pendant la journée.
4. Support d’électrode et préparation capillaire
- Tirage, préparation et stockage capillaires
- Utiliser des capillaires borosilicatés avec des filaments (D.I.: 0,78 mm, O.D: 1 mm). Tirez-les en fonction de l’équipement27.
REMARQUE: Conservez les capillaires tirés dans une boîte de Pétri. Placez la boîte de Petri sur des morceaux de cire ou de pâte à modeler non parfumée pour les empêcher de bouger et de se briser. - Avant de lancer l’expérience EAG, cassez doucement l’extrémité de 2 capillaires avec une paire de pinces au microscope.
REMARQUE: Assurez-vous que l’un est légèrement plus grand que l’autre pour s’adapter au cou (capillaire plus grand) ou à l’extrémité des antennes (capillaire plus petit). Assurez-vous que la coupure est propre et qu’aucune fissure n’est présente sur la paroi capillaire. Cela demande de la patience et de la pratique. - S’ils sont encore intacts, réutilisez ces capillaires après le rinçage à l’eau désionisée (DI) une fois l’expérience terminée. Retirez l’excès d’eau en appliquant doucement une lingette nettoyante contre l’embout. Remettre dans la boîte de Petri stockée. Si la pointe est tordue, jetez le capillaire.
- Utiliser des capillaires borosilicatés avec des filaments (D.I.: 0,78 mm, O.D: 1 mm). Tirez-les en fonction de l’équipement27.
- Support d’électrode et montage capillaire
- Étiquetez les deux porte-électrodes comme « enregistrement » et « référence » en utilisant des morceaux de ruban de laboratoire de différentes couleurs. Cela aidera à guider le montage de la tête et des électrodes du moustique.
- Assurez-vous que les porte-électrodes sont dégagés à l’intérieur et qu’aucun débris borosilicaté n’est présent.
- Chloration: Faire tremper les fils d’argent des porte-électrodes dans de l’eau de Javel pure pendant environ 5 min. Les fils passent du gris clair brillant au gris foncé mat.
- Desserrez le bouchon en caoutchouc et remplissez l’intérieur du capillaire avec une solution saline à 10% à l’aide d’une aiguille de 20 G.
- Remplir le capillaire borosilicaté avec la solution saline à l’aide d’une seringue. Assurez-vous qu’aucune bulle n’est présente dans le porte-électrode ni dans le capillaire tiré.
REMARQUE: Pour réduire les risques d’avoir des bulles dans le capillaire, continuez à pousser la solution saline dans le capillaire tout en tirant doucement l’aiguille et utilisez des capillaires avec un filament. Il est possible de charger les capillaires avec une solution composée de gel d’électrode 1:3 et de solution saline. Cela peut aider à prévenir l’évaporation de la solution saline et peut être particulièrement utile lors de l’apprentissage et de la pratique des EAG, car l’expérimentateur aura besoin de plus de temps pour effectuer les différentes étapes. - Après trempage, rincez les fils d’argent avec de l’eau DI et insérez-les dans les deux capillaires. Assurez-vous que la pointe du fil est à moins de 1 mm de l’extrémité du capillaire. Assurez-vous que le capillaire passe l’anneau en caoutchouc à l’intérieur du porte-électrode sans se rompre. Serrez doucement le bouchon en caoutchouc. Vérifiez qu’aucune bulle d’air n’est présente.
- Utilisez le capillaire avec l’ouverture la plus large sur le porte-électrode de référence (cou) et l’ouverture plus petite sur le porte-électrode d’enregistrement (antennes).
- Laissez les deux porte-électrodes montés sur une lingette de nettoyage humide pour empêcher l’embout de sécher jusqu’à ce qu’il soit prêt à monter la tête.
5. Préparation de la plate-forme EAG (Figure 1)
- Assurez-vous que la table d’air est relevée, qu’il n’y a pas de blocage dans la compagnie aérienne. Assurez-vous que le réservoir d’air médical est toujours plein pour éviter de le changer au milieu de l’expérience. Assurez-vous qu’il y a des bulles dans l’humidificateur.
- Système de distribution d’air et d’impulsions
- Allumez le réservoir d’air à gaz médical.
- Vérifiez le niveau des deux débitmètres.
REMARQUE : Le débitmètre contrôlant le courant d’air principal baignant la préparation pendant toute l’expérience doit être à 140 mL/min et l’autre lié à l’impulsion olfactive doit indiquer 15 mL/min.
- Si vous faites GC-EAD, allumez la machine, les réservoirs de gaz et créez/chargez le fichier/la méthode.
- Allumez les ordinateurs, les applications logicielles, l’alimentation de la vanne et vérifiez la connexion Internet pour que l’application logicielle fonctionne.
- Application logicielle: Un court script peut être écrit pour donner le pouls.
- Logiciel EAG : utilisez n’importe quel logiciel d’électrophysiologie.
- Implémenter les paramètres dans le logiciel (par exemple, amplificateur, durée d’enregistrement, durée des impulsions, etc.).
- Délivrez une impulsion de commande pour vérifier que la vanne délivrant les impulsions est fonctionnelle.
- Réglez l’alimentation à 5,2 V. Vérifiez les paramètres de l’amplificateur.
NOTE: Les paramètres utilisés pour les données présentées ici sont les suivants: filtre de coupure basse de 0,1 Hz; filtre de coupure élevé de 500 Hz; Gain de x100.
6. Préparation et montage de la tête de moustique (Figure 2)
- Placez une plaque d’aluminium sur de la glace et placez un morceau de lingette de nettoyage humide dessus.
- Mettez une petite cuillerée de gel d’électrode dans un coin.
- Placez une tasse anti-moustiques sur de la glace et laissez le moustique refroidir pendant quelques minutes ou jusqu’à ce qu’il cesse de voler.
REMARQUE: Certaines espèces sont résistantes au froid et peuvent nécessiter une anesthésie rapide sur une plate-forme de mouche CO2 pour descendre. Moins le moustique reste allumé, mieux c’est. - Placez le moustique sur son dos et coupez la pointe de chaque antenne (seulement une petite partie du dernier segment) avec des micro-ciseaux.
- Utilisez une pince pour faire glisser le moustique à côté de la cuillerée de gel d’électrode et trempez doucement l’extrémité de chaque antenne dans le gel. Évitez de tremper plus que le tout dernier segment dans le gel d’électrode.
- À l’aide de forceps, retirez les antennes des moustiques tout en les maintenant les unes à côté des autres. Laissez-les sortir ensemble du gel. Assurez-vous que les antennes ne touchent pas la surface de la lingette de nettoyage, sinon elles pourraient se séparer.
- Placez le moustique sur le côté et coupez la tête à l’aide de micro-ciseaux ou d’une lame de rasoir.
REMARQUE: Une fois la tête coupée, passez rapidement aux étapes suivantes et à la plate-forme EAG pour démarrer les enregistrements. La préparation doit rester réactive pendant environ 30 minutes. - Prenez l’électrode de référence et enfoncez doucement l’embout dans le gel. Restez en contact avec les tissus du cou et laissez la tête coller dessus.
- Déplacez les porte-électrodes sous le microscope EAG et visualisez à travers le microscope pour placer l’électrode de tête (c.-à-d. de référence) sur un micromanipulateur. Assurez-vous que les antennes sont au centre.
- Prenez l’électrode d’enregistrement, placez-la devant les extrémités des antennes. Déplacez-le et alignez-le le plus près possible des pointes à l’aide du micromanipulateur. À l’aide du microscope, déplacez la pointe de l’électrode d’enregistrement vers les antennes.
- Connectez les deux porte-électrodes à l’amplificateur avant d’insérer les pointes pour les empêcher de bouger après l’insertion.
- Insérez les extrémités des antennes dans l’électrode d’enregistrement. Assurez-vous qu’ils entrent simplement en contact avec la solution saline et le gel d’électrode et qu’ils sont visibles par transparence à travers le capillaire. L’antenne entre par « l’effet d’aspiration ».
- Ajustez la position de la tête et des pointes avec une pince au microscope, si nécessaire.
- Placez le tube de la compagnie aérienne près de la préparation de la tête du moustique (distance: 1 cm).
REMARQUE : Si la tête tombe, retourner à la station de dissection et remonter la tête ou en préparer une nouvelle si elle a été perdue ou si plus de 5 minutes se sont écoulées depuis que la tête a été coupée. Une bonne connexion entre le capillaire et le cou/antennes est essentielle pour un enregistrement à faible bruit et fiable. Idéalement, les extrémités des antennes seront à moins de 1 mm du fil de l’électrode d’enregistrement une fois insérées. - Éteignez la source lumineuse, le cas échéant.
- Placez la conduite d’aspiration près de la préparation de la tête de moustique (distance: 20 cm) et alignez-la avec la compagnie aérienne principale.
REMARQUE: Le vide aidera à éliminer les produits chimiques entourant la préparation de la tête après le stimulus, ce qui pourrait entraîner des réponses EAG après l’application des impulsions.
7. Enregistrements
- Après l’insertion des extrémités des antennes, allumez l’amplificateur et le réducteur de bruit. Observez le signal de base et assurez-vous qu’il n’est pas bruyant.
REMARQUE: Observez si de grandes oscillations dans le signal électrique sont présentes. Ajustez la position de la tête et des extrémités des antennes au besoin jusqu’à ce que le signal soit propre. Utilisez des pinces crocodiles pour mettre à la terre tout ce qui introduit du bruit dans la cage ou la table d’air de Faraday. Un signal de base d’une amplitude inférieure à 0,01 mV est idéal pour détecter et discriminer les réponses EAG minuscules. - Une fois que le niveau de bruit est satisfaisant, insérez la première seringue odorante à tester dans le trou de la compagnie aérienne.
- Fermez la cage de Faraday. Ne restez pas devant la préparation, pour réduire le bruit.
- Cliquez sur Enregistrer sur le logiciel EAG.
- Délivrez la ou les impulsions à l’aide de l’application logicielle.
REMARQUE: Le nombre et la durée des impulsions varient en fonction des expériences. Ici, des légumineuses uniques de 1 s. par odorant ont été utilisées. Les odorants ont été séparés par 45 s. - Notez la réponse des antennes de moustiques dans le cahier de laboratoire.
REMARQUE: Si l’odorant est détecté par les antennes du moustique, une déviation claire du signal est observée (voir Figure 3A). - Passez à l’odeur ou à la concentration suivante. N’oubliez pas de randomiser la présentation des odorants à moins qu’une courbe dose-réponse ne soit effectuée.
NOTE: Un contrôle négatif et un contrôle positif doivent être utilisés dans les expériences. Cela permettra de s’assurer que les réponses observées sont bien des réponses olfactives et non dues à des bruits mécaniques ou électriques. - À la fin de l’enregistrement, appliquez un contrôle positif pour vérifier que les antennes sont toujours réactives.
REMARQUE: Utilisez 0,1% ou 1% de benzaldéhyde car toutes les espèces de moustiques testées jusqu’à présent ont été sensibles à ce composé. - Procédez à la préparation suivante du moustique.
8. Nettoyage
- Éteignez l’amplificateur, le réducteur de bruit, la compagnie aérienne et l’ordinateur.
- Remettez les substances odorantes au congélateur.
- Retirez les papiers filtres des seringues en verre et nettoyez-les à 100% d’éthanol si des résidus sont visibles sur les parois. Laisser sécher sur une lingette nettoyante pendant la nuit.
- Nettoyez les porte-électrodes avec de l’eau DI pour éliminer toute trace possible de sel. Sécher en appliquant doucement contre un morceau de lingette nettoyante.
- Placez les restes de moustiques dans le congélateur et jetez-les 24 h plus tard.
REMARQUE: Si vous travaillez avec des moustiques infectés, suivez les exigences de sécurité de votre établissement.
9. Analyses des données
- Mesurez manuellement ou automatiquement les réponses EAG.
REMARQUE: L’amplitude EAG (-mV) est mesurée ici. Moyenne si plusieurs impulsions ont été appliquées pour chaque composé. Selon le logiciel utilisé, les EAG peuvent être automatiquement détectés et mesurés. Cependant, il est essentiel d’inspecter chaque réponse individuellement pour vérifier la forme de la réponse et évaluer le report possible, la réponse retardée, etc. La réponse EAG idéale est alignée sur le pouls, montre une déviation claire et peut être répétée entre les préparations contre les moustiques (Figure 3). - Présentez les données brutes pour montrer une variabilité minimale, un signal à faible bruit et des réponses claires (Figure 3B).
REMARQUE: Les données peuvent également être normalisées (par exemple, Z-score). La valeur de contrôle négative (p. ex., huile minérale) (c.-à-d. la valeur de référence) peut être soustraite de la réponse et, si ce n’est pas le cas, doit être présentée dans les figures. Un contrôle positif doit également être présenté. - Effectuer des analyses statistiques à l’aide de n’importe quel logiciel de statistiques28.
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Representative Results
L’électroantennenographie est un outil puissant pour déterminer si un produit chimique ou un mélange de produits chimiques est détecté par une antenne d’insecte. Il peut également être utilisé pour déterminer le seuil de détection d’un produit chimique donné en utilisant une augmentation graduelle de la concentration (c.-à-d. réponse de la courbe de dose, figure 4B). De plus, il est utile de tester les effets du répulsif sur la réponse aux odeurs liées à l’hôte29.
Les contrôles positifs et négatifs doivent toujours être utilisés dans les EAG. Ici, le benzaldéhyde a été utilisé comme témoin positif (Figure 3B, 3C, 4A). Ce composé s’est avéré provoquer une réponse antennaire chez toutes les espèces de moustiques testées jusqu’à présent24,25,29. Un témoin négatif doit également être utilisé et peut consister en le solvant utilisé pour diluer les produits chimiques (p. ex. huiles minérales ou de paraffine, hexane, etc.) et ne devrait pas provoquer de réponse (figures 3B, 3C, 4A).
En effet, lors de la réalisation d’EAG, aucune déviation ne doit être notée lors de l’application de la commande (Figure 3B, 3C, 4A). Si une réponse est observée, la seringue, le témoin de solvant et/ou la ligne d’odeur sont probablement contaminés. Si tel est le cas, une nouvelle solution doit être préparée, la seringue nettoyée à 100% éthanol et séchée et/ou la compagnie aérienne décontaminée par rinçage à 100% éthanol et séchée. Si le témoin choisi provoque une réponse (p. ex., éthanol), la valeur obtenue en -mV pour le témoin doit être soustraite de la valeur obtenue pour l’éthanol et le produit chimique testé combinés pour évaluer l’impact du produit chimique testé sur les antennes.
Les espèces de moustiques varient dans leur capacité à répondre à divers composés ainsi que dans l’ampleur de leur réponse. Par exemple, les moustiques Toxorhynchites produisent de très gros EAG par rapport à Ae. aegypti, An. Stephensi et Cx. quinquefasciatus (Figure 3C, Figure 4A).
Dans les EAG, la deuxième impulsion et les suivantes conduisent généralement à des réponses EAG plus petites. La présentation d’un odorant peut également affecter la réponse aux éléments suivants, il est donc important de randomiser l’ordre des odorants et plusieurs tests pour tester efficacement un panel d’odorants (à moins qu’une courbe dose-réponse ne soit effectuée). De plus, la séparation de la présentation des légumineuses (par exemple, 5 s) et des odorants (par exemple, 45 s) aidera à optimiser les réponses EAG.
La volatilité des produits chimiques testés varie et peut affecter la réponse olfactive et potentiellement conduire à une réponse retardée si le produit chimique testé a une très faible volatilité. La volatilité et la solubilité des produits chimiques doivent être connues avant de procéder à des EAG afin d’optimiser l’essai. Le solvant utilisé pour préparer les dilutions doit également être choisi avec soin (p. ex. éthanol, hexane, huile minérale ou huile de paraffine). En outre, les concentrations devraient être choisies judicieusement et devraient idéalement être pertinentes sur le plan écologique. Une concentration de 1 % ou 0,1 % est souvent utilisée, mais elle est relativement élevée et pas nécessairement représentative de ce que les insectes peuvent vivre dans la nature. Pourtant, il est utile de cribler des composés ayant des concentrations relativement élevées dans certains cas (par exemple, pour le développement d’appâts). Les répulsifs peuvent être testés à leur concentration disponible sur le marché (p. ex., le DEET est généralement vendu à une concentration de 40 %).
S’ils sont associés à la chromatographie en phase gazeuse (c.-à-d. GC-EAD)25, les composés provoquant une réponse peuvent être identifiés avec une GC-MS, puis testés individuellement à diverses concentrations ou en mélange avec des EAG. Il convient de mentionner que la valence des produits chimiques testés ne peut pas être déterminée avec des EAG. Seule une expérience comportementale complémentaire (par exemple, olfactomètre, test d’alimentation) peut évaluer si le produit chimique détecté par les antennes est attrayant, répulsif ou neutre pour le moustique. Enfin, les expériences EAG ne montrent que les réponses du système nerveux périphérique.
Figure 1 : Installation de l’électroantennogramme comprenant : A) Microscope : le microscope utilisé doit permettre à l’expérimentateur de voir clairement la préparation pour permettre l’insertion des extrémités des antennes des moustiques dans les électrodes d’enregistrement. B) Lampe à lumière froide: la lampe doit être éteinte lorsque les enregistrements commencent. C) Ligne sous vide: cela réduit le risque d’accumulation des odeurs autour de la préparation de la tête de moustique, ce qui pourrait entraîner des réponses antennaires découplées de la stimulation réelle. D) Micromanipulateurs (x2): ils permettront des mouvements très fins des porte-électrodes, ce qui est nécessaire pour insérer les antennes moustiques dans le capillaire de l’électrode d’enregistrement. E) Support d’électrode d’enregistrement. F) Porte-électrode de référence. G) Étage tête : les deux électrodes sont branchées dans l’étage de tête qui est ensuite connecté à l’amplificateur. H) Compagnie aérienne principale: un flux d’air propre et constant baignait la tête du moustique. Le débit est régulé par un débitmètre. I) Seringue pour la transmission des odeurs connectée à l’électrovanne et au débitmètre; J) Table d’air: la table d’air réduira le bruit. K) Cage de Faraday: La cage de Faraday empêchera le bruit électrique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Préparation étape par étape de la tête de moustique Aedes albopictus pour les enregistrements EAG. A) Moustique femelle sur le dos sur une plaque glacée pour vérifier que les deux antennes sont intactes. B) Dernier segment de l’excision des antennes avec des micro-ciseaux. C) Les antennes sont trempées dans du gel d’électrode. D) Les antennes collent ensemble après les avoir retirées. Un seul segment de chaque antenne doit être dans le gel d’électrode. E) Excision de la tête de moustique. F) Tête montée sur l’électrode de référence. Il devrait être suffisamment stable pour être déplacé vers la plate-forme EAG. A'-F'. Mêmes étapes que celles présentées ci-dessus pour les EAG masculins. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3: Schéma des traces de moustiques EAG et EAG brutes. A ) Schéma EAG (à gauche) et caractéristiques de la réponse EAG (à droite). (Gauche) La tête de moustique est montée entre une électrode de référence et une électrode d’enregistrement connectée à un amplificateur. Les antennes sont baignées dans un flux d’air constant dans lequel les stimuli odorants sont pulsés. La détection d’un produit chimique entraîne une déviation (en mV) du signal. (à droite) La détection chimique conduit à la dépolarisation cellulaire (DPR) suivie de la repolarisation cellulaire (RPR) jusqu’au retour à la ligne de base. Le pouls odorant est représenté par le rectangle gris. La ligne rouge indique l’amplitude de la réponse EAG. B) Capture d’écran du logiciel WinEDR mettant en évidence toute une trace d’enregistrement EAG d’un moustique femelle Culex quinquefasciatus . En haut : signal non filtré (c.-à-d. brut). Milieu: 1 s les impulsions d’odeur sont indiquées par des chiffres. En bas : signal filtré (c.-à-d. passe-bas de 1,5 Hz) à 3 odorants et un témoin (huile minérale). Notez les déviations en réponse à 1 % de 1-hexanol (1), 1 % de benzaldéhyde (2) et 1 % d’acide butyrique (3). Notez l’absence de réponse au témoin négatif, l’huile minérale (4). C ) De gauche à droite : réponses représentatives de l’EAG (en mV) à 1 % de benzaldéhyde (en haut) et contrôle de l’huile minérale (en bas) chez les femelles Aedes aegypti, Anopheles stephensi, Culex quinquefasciatus et Toxorhynchites rutilus septentrionalis. L’impulsion d’une seconde est représentée par le rectangle coloré au-dessus de la trace EAG. Notez la grande déviation en réponse au benzaldéhyde et l’absence de réponse à l’huile minérale. Notez également l’échelle différente chez Toxorhynchites rutilus septentrionalis. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4: Exemple de représentation des résultats EAG et de leurs analyses statistiques. Réponses EAG moyennes de Culex quinquefasciatus (N = 8), Anopheles stephensi (N = 10), Aedes aegypti (N = 8) et Toxorhynchites rutilus septentrionalis (N = 7) femelles à 1% 1-hexanol (vert), 1% acide butyrique (orange), 1% benzaldéhyde (jaune) et huile minérale (bleu). B. Culex quinquefasciatus femelles Courbe dose-réponse EAG pour le 1-hexanol (à gauche) (N = 9) et le benzaldéhyde (à droite) (N = 8). Les barres représentent l’erreur-type de la moyenne. Les lettres au-dessus des barres d’erreur indiquent des différences statistiques (test de somme de rang de Wilcoxon par paires avec une correction de Bonferroni). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Les comportements à médiation olfactive sont influencés par de nombreux facteurs, notamment physiologiques (par exemple, l’âge, l’heure de la journée) et environnementaux (par exemple, la température, l’humidité relative)30. Ainsi, lors de la réalisation d’EAG, il est essentiel d’utiliser des insectes qui sont dans le même état physiologique (c.-à-d. surveillance de l’âge, famine, accouplement)31 et de maintenir un environnement chaud et humide autour de la préparation pour éviter la dessiccation. Une température autour de 25 °C est idéale et 60% à 80% d’humidité pour la compagnie aérienne principale. Cela peut être facilement réalisé en plaçant un bulleur sur le circuit principal de la compagnie aérienne.
De plus, il est important de tenir compte de l’écologie de chaque espèce pour obtenir des résultats pertinents pour la biologie de l’insecte. Par exemple, si vous utilisez une espèce nocturne, envisagez d’inverser leur cycle de lumière pour tester leur réponse pendant leur nuit subjective. Il est également important de choisir de mener des EAG à des moments précis de la journée (c.-à-d. lorsque l’insecte est actif). Par exemple, si vous utilisez des moustiques Ae. aegypti, envisagez de faire les expériences pendant les pics d’activité de cette espèce (c.-à-d. en début de journée et plus tard dans l’après-midi). Encore une fois, le cycle d’éclairage peut être facilement déplacé pour plus de commodité à l’aide de chambres climatiques ou de boîtes lumineuses avec un programme d’éclairage inversé utilisant une minuterie programmable32. Eilerts et al.33 et Krishnan et al.34, ont montré que la sensibilité à des odorants spécifiques varie tout au long de la journée. Ainsi, une bonne connaissance de l’écologie et de la biologie de l’insecte garantira des résultats plus précis.
Le bruit (électrique ou mécanique) peut être facilement introduit dans les EAG. Par exemple, des perturbations mécaniques peuvent être créées par un système de climatisation soufflant de l’air vers une préparation EAG. Le bruit électrique peut être réduit avec le Humbug, mais, s’il persiste, il peut être traqué en branchant des éléments et en les mettant à la terre dans la cage de Faraday à l’aide de pinces crocodiles (Figure 3B). Cela s’applique à tous les éléments présents autour de la préparation (microscope, lampe, micromanipulateurs). Certaines pièces d’équipement dans la cage de Faraday doivent être débranchées avant l’enregistrement, car elles peuvent encore produire du bruit électrique (par exemple, source de lumière froide) ou placées à l’extérieur de la cage. Un autre type de « bruit » est de nature olfactive. L’expérimentateur doit éviter de porter du parfum ou utiliser un shampooing ou un détergent fortement parfumé. En effet, de nombreux composés présents dans ceux-ci peuvent être détectés par les moustiques (par exemple, le linalol, le citronellol, le géraniol, l’eugénol) et peuvent interférer et affecter les résultats des expériences. Le port d’une blouse de laboratoire et de gants est également essentiel pour limiter la contamination indésirable de la compagnie aérienne, des seringues et des électrodes.
Le protocole présenté a l’avantage d’être facilement applicable à toutes les espèces de moustiques, tant chez les mâles que chez les femelles, tout en prolongeant la longévité de la préparation (> 30 min) et avec une variabilité limitée entre les préparations. Cette méthode conduit à un bruit très minimal dans le signal EAG, ce qui permet de tester des produits chimiques à de très faibles concentrations. Une fois que les étapes de dissection et de montage ont été maîtrisées, cette technique peut produire des données fiables dans un laps de temps relativement court et des analyses de données simples.
L’électroantennenographie permet uniquement à l’expérimentateur d’évaluer si le moustique peut détecter un produit chimique ou non. Cependant, pour déterminer la valence de ce produit chimique, des tests comportementaux complémentaires, tels que les tests olfactométriques, sont essentiels pour déterminer si un odorant ou un mélange spécifique est attrayant, répulsif ou neutre afin de développer des outils efficaces pour la lutte contre les moustiques35.
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Disclosures
L’auteur n’a rien à divulguer.
Acknowledgments
Je remercie le Dr Clément Vinauger et le Dr Jeffrey Riffell pour leurs discussions utiles. Les réactifs suivants ont été obtenus par l’intermédiaire de BEI Resources, NIAID, NIH : Anopheles stephensi, souche STE2, MRA-128, contribution de Mark Q. Benedict; Aedes aegypti, Strain ROCK, MRA-734, contribution de David W. Severson; Culex quinquefasciatus, souche JHB, Oeufs, NR-43025. L’auteur remercie le Dr Jake Tu, la Dre Nisha Duggal, le Dr James Weger et Jeffrey Marano d’avoir fourni des œufs de moustiques Culex quinquefasciatus et Anopheles stephensi (souche : Liston). Aedes albopictus et Toxorhynchites rutilus septentrionalis sont dérivés de moustiques de terrain collectés par l’auteur dans la région de New River Valley (VA, États-Unis). Ce travail a été soutenu par le Département de biochimie et l’Institut des sciences de la vie Fralin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air table Clean Bench | TMC | https://www.techmfg.com/products/labtables/cleanbench63series/accessoriess | Noise reducer |
| Analog-to-digital board | National Instruments | BNC-2090A | |
| Benchtop Flowbuddy Complete | Genesee Scientific | 59-122BC | To anesthesize mosquitoes |
| Borosillicate glass capillary | Sutter Instrument | B100-78-10 | To make the recording and references capillaries |
| Chemicals | Sigma Aldrich | Benzaldehyde: 418099-100 mL; Butyric acid: B103500-100mL; 1-Hexanol: 471402-100mL; Mineral oil: M8410-1L | Chemicals used for the experiments presented here |
| CO2 | Airgas or Praxair | N/A | To anesthesize mosquitoes |
| Cold Light Source | Volpi | NCL-150 | |
| Disposable syringes | BD | 1 mL (309628) / 3 mL (309657) | |
| Electrode cables | World Precision Instruments | 5371 | |
| Electrode gel salt free | Parkerlabs | 12-08-Spectra-360 | |
| Faraday cage | TMC | https://www.techmfg.com/products/electric-and-magnetic-field-cancellation/faradaycages | Noise reducer |
| Flowmeters | Bel-art | 65 mm (H40406-0010) / 150 mm (H40407-0075) | One of each |
| GCMS vials and caps | Thermo-fisher scientific | 2-SVWKA8-CPK | To prepare odorant dilutions |
| Glass syringes (Fortuna) | Sigma Aldrich | Z314307 | For odor delivery to the EAG prep |
| Humbug | Quest Scientific | http://www.quest-sci.com/ | Noise reducer |
| 2 mm Jack Holder, Narrow, 90 deg., With Wire | A-M Systems | 675748 | Electrode holder |
| Magnetic bases | Kanetec | MB-FX | x 2 |
| MATLAB + Toolboxes | Mathworks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | For delivering the pulses |
| Medical air | Airgas or Praxair | N/A | For main airline |
| Microscope | Nikkon | SMZ-800N | |
| Micromanipulators Three-Axis Coarse/Fine Compact Micromanipulator | Narishige | MHW-3 | x 2 |
| Microelectrode amplifier with headstage | A-M Systems | Model 1800 | |
| Mosquito rearing supplies | Bioquip | https://www.bioquip.com/Search/WebCatalog.asp | |
| Needles | BD | 25G (305127) / 21G (305165) | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-6A | For odor delivery to the EAG prep |
| PTFE Tubing of different diameters | Mc Master Carr | N/A | To connect solenoid valve, flowmeter, airline ect. |
| 30V/5A DC Power Supply | Dr. Meter | PS-305DM | |
| R version 3.5.1 | R project | https://www.r-project.org/ | For data analyses |
| Relay for solenoid valve | N/A | Custom made | |
| Silver wire 0.01” | A-M Systems | 782500 | |
| Solenoid valve (3-way) | The Lee Company | LHDA0533115H | |
| WinEDR software | Strathclyde Electrophysiology Software | WinEDR V3.9.1 | For EAG recording |
| Whatman paper | Cole Parmer | UX-06648-03 | To load chemical in glass syringe / Pasteur pipette |
References
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