Summary
Denne artikel beskriver en trin-for-trin protokol for vellykkede og støjsvage elektroantenogrammer i flere slægter af myg, herunder både kvinder og mænd.
Abstract
Kvindelige myg er de dødeligste dyr på jorden og hævder livet for mere end 1 million mennesker hvert år på grund af patogener, de sender, når de erhverver et blodmel. For at finde en vært at fodre på, er myg afhængige af en bred vifte af sensoriske signaler, herunder visuel, mekanisk, termisk og olfaktorisk. Undersøgelsen beskriver en teknik, elektroantenografi (EAG), der gør det muligt for forskere at vurdere, om myggene kan detektere individuelle kemikalier og blandinger af kemikalier på en koncentrationsafhængig måde. Når det kombineres med gaskromatografi (GC-EAG), gør denne teknik det muligt at udsætte antennerne for en fuld headspace / kompleks blanding og bestemmer, hvilke kemikalier der er til stede i prøven af interesse, myggen kan opdage. Dette gælder for værtskropslugt samt planteblomsterbuketter eller andre økologisk relevante lugte (f.eks. Ovipositionssteder lugtstoffer). Her beskrev vi en protokol, der tillader lang varighed af forberedelsesresponstid og gælder for både kvindelige og mandlige myg fra flere slægter, herunder Aedes, Culex, Anopheles og Toxorhynchites myg. Da olfaktion spiller en vigtig rolle i myg-vært interaktioner og mygbiologi generelt, kan EAG'er og GC-EAG afsløre forbindelser af interesse for udvikling af nye sygdomsvektorbekæmpelsesstrategier (f.eks. Lokkemad). Suppleret med adfærdsmæssige assays kan valensen (fx tiltrækningsmiddel, afstødningsmiddel) af hvert kemikalie bestemmes.
Introduction
Myg er de dødeligste organismer på jorden, der kræver livet for mere end en million mennesker om året og sætter mere end halvdelen af verdens befolkning i fare for eksponering for de patogener, de transmitterer, mens de bider1. Disse insekter er afhængige af en bred vifte af signaler (dvs. termiske, visuelle, mekaniske, olfaktoriske, auditive) for at finde en vært at fodre på (både plante og dyr), til parring og oviposition samt for at undgå rovdyr på både larvestadiet og voksenstadiet 2,3. Blandt disse sanser spiller olfaktion en kritisk rolle i ovennævnte adfærd, især til mellem- til langtrækkende detektion af lugtstofmolekyler 2,3. Lugte udsendt af en vært eller et ovipositionssted detekteres af forskellige specifikke olfaktoriske receptorer (fx GR'er, OR'er, IR'er) placeret på myggepalperne, proboscis, tarsi og antenner 2,3.
Da olfaktion er en nøglekomponent i deres værtssøgende (plante og dyr), parring og ovipositionsadfærd, udgør det således et ideelt mål at studere for at udvikle nye værktøjer til mygkontrol4. Forskning i afskrækningsmidler (f.eks. DEET, IR3535, picaridin) og lokkemad (f.eks. BG sentinel human lokke) er ekstremt produktiv5, men på grund af de nuværende udfordringer inden for mygkontrol (f.eks. Insekticidresistens, invasive arter) er det vigtigt at udvikle nye effektive kontrolmetoder informeret af mygbiologien.
Mange teknikker (f.eks. olfactometer, landingsanalyser, elektrofysiologi) er blevet brugt til at vurdere bioaktiviteten af forbindelser eller blandinger af forbindelser i myg. Blandt dem kan elektroantennografi (eller elektroantenogrammer (EAG'er)) bruges til at bestemme, om lugtstofferne detekteres af mygantennerne. Denne teknik blev oprindeligt udviklet af Schneider6 og er blevet brugt i mange forskellige insektslægter siden da, herunder møl 7,8,9, humlebier 10,11, honningbier 12,13 og bananfluer 14,15 for at nævne nogle få. Elektroantennografi er også blevet anvendt ved hjælp af forskellige protokoller, herunder enkelt eller flere antenner i myg 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25.
Myg er relativt små og sarte insekter med ret tynde antenner. Mens det er relativt let at udføre EAG'er på større insekter som møl eller humlebier på grund af deres større størrelse og tykkere antenner, kan det være udfordrende at udføre EAG'er i myg. Især opretholdelse af et godt signal-støj-forhold og en varig responsiv forberedelse er to vigtige krav til datareproducerbarhed og pålidelighed.
Den trinvise vejledning til støjsvage EAG'er, der foreslås her, tilbyder direkte løsninger på disse begrænsninger og gør denne protokol anvendelig på flere myggearter fra forskellige slægter, herunder Aedes, Anopheles, Culex og Toxorhynchites, og beskriver teknikken for både kvinder og mænd. Elektroantennografi tilbyder en hurtig, men pålidelig måde at screene og bestemme bioaktive forbindelser, der derefter kan udnyttes i agnudvikling, efter at valensen er blevet bestemt med adfærdsmæssige assays.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af saltopløsning
- Forbered saltvand på forhånd og opbevar i køleskabet.
- Følg Beyenbach og Masia26 for at forberede løsningen.
BEMÆRK: Saltvandsopskrift i mM: 150,0 NaCl, 25,0 HEPES, 5,0 glucose, 3,4 KCl, 1,8 NaHCO3, 1,7CaCl2 og 1,0 MgCl2. pH-værdien justeres til 7,1 med 1 M NaOH. Tilsæt ikke glukose eller saccharose til præparatet på dette tidspunkt for at øge hyldeopbevaringen. Tilsæt den nødvendige mængde til saltvand lige før du kører EAG'erne (ca. 50 ml pr. Eksperiment).
2. Forberedelse og opbevaring af lugt
- Forbered lugtstofblandingerne eller fortyndingerne af enkeltforbindelser på forhånd i 1,5 ml gule hætteglas og opbevar ved -20 °C for at forhindre nedbrydning af forbindelser.
BEMÆRK: Koncentrationerne afhænger af den test, der skal udføres. 0,1% eller 1% bruges almindeligvis til at bestemme, om en forbindelse kan detekteres eller ej. For en dosis-responskurve fremstilles serielle fortyndinger af et givet kemikalie, og de testes fra den laveste til den højeste koncentration. - Forbered fortyndingerne i vand, ethanol, hexan, paraffinolie eller mineralolie, afhængigt af opløseligheden af det testede kemikalie.
- Sørg for at forberede en solvenskontrol (et hætteglas, der kun indeholder solvensen) til eksperimentet.
- Fjern lugtstofferne fra fryseren 30 minutter før forsøgene påbegyndes, så de kan tø op. Vortex hvert hætteglas før brug for at blande kemikaliet og solvensen godt.
- Afpipetter 10 μL opløsning på et stykke filterpapir (0,5 cm x 2 cm), der er lagt i en mærket glassprøjte eller Pasteur-pipette.
- Læg hver forbindelse eller blanding i en bestemt Pasteur-pipette eller sprøjte for at forhindre kontaminering.
BEMÆRK: Fyld 10 minutter før forsøget påbegyndes, så lugten kan diffundere i sprøjten, men ikke længere for at forhindre nedbrydning. Lad Pasteur-pipetten eller sprøjten forblive lukket på dette tidspunkt for at muliggøre en god diffusion af kemikaliet, før forsøget starter. - Efter hver EAG-kørsel skal du bortskaffe filterpapiret og udskifte det med et nyt for at forhindre, at papiret bliver gennemblødt og risikerer nåleblokering. Udskift nålene regelmæssigt (hver 10. løb).
3. Myg adskillelse
- Isoler myggene på forsøgsdagen.
- Brug myg, der er mindst 6 dage gamle på forsøgsdagen for at øge chancerne for, at hunnerne parres for at forbedre deres reaktion på værtsrelaterede lugtstoffer.
BEMÆRK: Juster myggealderen på testtidspunktet afhængigt af projektet. Kontroller og harmoniser den fysiologiske status (f.eks. Blodfodret, sultet, aldrig tidligere fodret osv.). - Sult myggene op til 12 timer (dvs. ingen adgang til sukker) for at øge deres motivation og følsomhed.
- Sæt myggebeholderen i køleskabet (4 °C), indtil de holder op med at flyve, så enkeltpersoner let kan overføres forsigtigt til enkeltkopper med tang.
BEMÆRK: Arter med en højere tolerance over for kulde kan aflives ved hjælp af en CO2 fluepude. Sørg for, at myggene ikke forbliver på det i lang tid for at forhindre udtørring, hvilket ville mindske lydhørheden af myggens EAG-præparat. - Opbevar kopperne, der indeholder enkelte myg, ved stuetemperatur, før EAG'erne udføres, og kassér eventuelle myg, der ikke må bruges i løbet af dagen.
4. Elektrodeholder og kapillærpræparat
- Kapillær trækning, klargøring og opbevaring
- Brug borosilikatkapillærer med filamenter (ID: 0,78 mm, O.D: 1 mm). Træk dem afhængigt af udstyret27.
BEMÆRK: Opbevar de trukne kapillærer i en petriskål. Læg petriskålen på voksstykker eller uparfumeret modellervoks for at forhindre dem i at bevæge sig og gå i stykker. - Før du kører EAG-eksperimentet, skal du forsigtigt bryde spidsen af 2 kapillærer med et par tang under mikroskopet.
BEMÆRK: Sørg for, at den ene er lidt større end den anden, så den passer til enten halsen (større kapillær) eller antennespidserne (mindre kapillær). Sørg for, at snittet er rent uden revner på kapillærvæggen. Dette kræver tålmodighed og øvelse. - Hvis de stadig er intakte, skal du genbruge disse kapillærer efter skylning med deioniseret (DI) vand, når eksperimentet er afsluttet. Fjern overskydende vand ved forsigtigt at påføre en renseserviet mod spidsen. Sæt tilbage i opbevaring Petri skål. Hvis spidsen er skæv, kasseres kapillærrøret.
- Brug borosilikatkapillærer med filamenter (ID: 0,78 mm, O.D: 1 mm). Træk dem afhængigt af udstyret27.
- Elektrodeholder og kapillærmontering
- Mærk de to elektrodeholdere som "optagelse" og "reference" ved hjælp af stykker laboratorietape i forskellige farver. Dette vil hjælpe med at styre monteringen af myghovedet og elektroderne.
- Sørg for, at elektrodeholderne er klare indeni, og at der ikke er borosilikatrester til stede.
- Kloridisering: Blødgør sølvtrådene på elektrodeholderne i ren blegemiddel i ca. 5 min. Ledningerne skifter fra skinnende lysegrå til mat mørkegrå.
- Løsn gummiproppen og fyld indersiden af kapillærrøret med 10% saltopløsning med en 20 G nål.
- Fyld borosilikatkapillæret med saltopløsningen ved hjælp af en sprøjte. Sørg for, at der ikke er bobler til stede i hverken elektrodeholderen eller den trukne kapillær.
BEMÆRK: For at reducere chancerne for at have bobler i kapillærrøret skal du fortsætte med at skubbe saltvand i kapillærrøret, mens du forsigtigt trækker nålen ud og bruger kapillærer med et filament. Det er muligt at indlæse kapillærerne med en opløsning sammensat af 1: 3 elektrodegel og saltopløsning. Dette kan hjælpe med at forhindre fordampning af saltvand og kan være særligt nyttigt, når man lærer og praktiserer EAG'er, da eksperimentatoren har brug for mere tid til at gennemføre de forskellige trin. - Efter iblødsætning skylles sølvtrådene med DI-vand og indsættes i de to kapillærer. Sørg for, at spidsen af ledningen er mindre end 1 mm fra spidsen af kapillærrøret. Sørg for, at kapillærrøret passerer gummiringen inde i elektrodeholderen uden at gå i stykker. Stram forsigtigt gummiproppen. Kontroller, at der ikke er luftbobler til stede.
- Brug kapillærrøret med den bredere åbning på referenceelektrodeholderen (halsen) og den mindre åbning på optageelektrodeholderen (antennerne).
- Lad de to monterede elektrodeholdere stå på en våd renseserviet for at forhindre, at spidsen tørrer ud, indtil den er klar til at montere hovedet.
5. Forberedelse af EAG-riggen (figur 1)
- Sørg for, at luftbordet er oppe, at der ikke er nogen blokering i flyselskabet. Sørg for, at tanken med medicinsk luft stadig er fuld for at undgå at ændre den midt i eksperimentet. Sørg for, at der er bobler i luftfugteren.
- Luft- og pulstilførselssystem
- Tænd for den medicinske luftgastank.
- Kontroller niveauet for de to flowmålere.
BEMÆRK: Flowmåleren, der styrer hovedluftstrømmen, der bader præparatet under hele eksperimentet, skal være på 140 ml / min, og den anden relateret til lugtpulsen skal læse 15 ml / min.
- Hvis du laver GC-EAD, skal du tænde for maskinen, gastankene og oprette/indlæse filen/metoden.
- Tænd computerne, softwareapplikationerne, ventilstrømforsyningen, og kontroller internetforbindelsen, så softwareapplikationen fungerer.
- Softwareapplikation: Et kort script kan skrives for at levere pulsen.
- EAG-software: Brug enhver elektrofysiologisoftware.
- Implementer parametrene i softwaren (f.eks. forstærker, optagelsens varighed, impulsernes varighed osv.).
- Lever en kontrolpuls for at kontrollere, at ventilen, der leverer impulserne, fungerer.
- Indstil strømforsyningen til 5,2 V. Kontroller forstærkerparametrene.
BEMÆRK: De parametre, der bruges til de data, der præsenteres her, er: lavt afskæringsfilter på 0,1 Hz; højt afskæringsfilter på 500 Hz; Forstærkning på x100.
6. Myggehovedforberedelse og montering (figur 2)
- Læg en aluminiumsplade på is og læg et stykke vådt renseserviet over det.
- Sæt en lille klat elektrodegel i et hjørne.
- Placer en mygkoppe på is og lad myggen køle af i et par minutter, eller indtil den holder op med at flyve.
BEMÆRK: Nogle arter er koldt resistente og kan kræve en hurtig bedøvelse over en CO2 fluepude for at gå ned. Jo mindst myggen forbliver på enten, jo bedre. - Placer myggen på ryggen og klip spidsen af hver antenne (kun en lille del af det sidste segment) med mikrosaks.
- Brug tang til at trække myggen ved siden af elektrodegelklappen og dypp hver antennes spids forsigtigt i gelen. Undgå at dyppe mere end blot det allersidste segment i elektrodegelen.
- Brug tang til at trække mygantennerne ud, mens du holder dem ved siden af hinanden. Lad dem komme sammen fra gelen. Sørg for, at antennerne ikke berører rengøringsserviettens overflade, da de ellers kan skilles.
- Placer myggen på sin side og hugg hovedet ved hjælp af mikrosaks eller et barberblad.
BEMÆRK: Når hovedet er hugget, skal du hurtigt fortsætte til de næste trin og til EAG-riggen for at starte optagelserne. Præparatet skal forblive lydhør i ca. 30 minutter. - Tag referenceelektroden og dyb forsigtigt spidsen i gelen. Hold kontakten med nakkevæv og lad hovedet holde fast på det.
- Flyt elektrodeholderne under EAG-mikroskopet og se gennem mikroskopet for at placere hovedelektroden (dvs. referenceelektroden på en mikromanipulator. Sørg for, at antennerne er i midten.
- Tag fat i optageelektroden, placer den foran antennespidserne. Flyt og juster det så tæt som muligt på spidserne ved hjælp af mikromanipulatoren. Brug mikroskopet til at flytte spidsen af optageelektroden mod antennerne.
- Tilslut begge elektrodeholdere til forstærkeren, før du sætter spidserne i for at forhindre dem i at bevæge sig efter isætning.
- Sæt antennespidserne i optageelektroden. Sørg for, at de bare kommer i kontakt med saltvand og elektrodegelen og er synlige ved gennemsigtighed gennem kapillærrøret. Antennen går ind ved "sugeeffekten".
- Juster hovedets position og spidser med tang under mikroskopet, hvis det er nødvendigt.
- Placer flyslangen tæt på myggehovedets forberedelse (afstand: 1 cm).
BEMÆRK: Hvis hovedet falder af, skal du vende tilbage til dissektionsstationen og montere hovedet igen eller forberede et nyt, hvis det er gået tabt, eller hvis det er mere end 5 minutter siden hovedet blev skåret af. En god forbindelse mellem kapillæren og halsen/antennerne er afgørende for støjsvag og pålidelig optagelse. Ideelt set vil antennespidserne være mindre end 1 mm fra ledningen til optageelektroden, når den er indsat. - Sluk for lyskilden, hvis den bruges.
- Placer vakuumledningen nær myggehovedets forberedelse (afstand: 20 cm) og juster med hovedflyselskabet.
BEMÆRK: Vakuumet hjælper med at fjerne kemikalier omkring hovedforberedelsen efter stimulus, hvilket kan føre til EAG-responser, efter at impulserne blev påført.
7. Optagelser
- Efter indsættelse af antennernes spidser skal du tænde forstærkeren og støjreduktionen. Overhold basissignalet, og sørg for, at det ikke støjer.
BEMÆRK: Vær opmærksom på, om der er store svingninger i det elektriske signal. Juster placeringen af hoved- og antennespidserne efter behov, indtil signalet er rent. Brug alligatorclips til at jorde alt, hvad der introducerer støj til Faraday-buret eller luftbordet. Et basissignal på mindre end 0,01 mV i amplitude er ideelt til at detektere og skelne små EAG-responser. - Når støjniveauet er tilfredsstillende, skal du indsætte den første lugtsprøjte for at teste i flyhullet.
- Luk Faraday-buret. Bliv ikke foran præparatet for at reducere støj.
- Klik på Optag på EAG-software.
- Lever pulsen (e) ved hjælp af softwareapplikationen.
BEMÆRK: Antallet og varigheden af impulserne varierer afhængigt af eksperimenterne. Her er der anvendt enkelte 1 s. bælgfrugter pr. lugtstof. Lugtstoffer blev adskilt af 45 s. - Bemærk mygantennernes reaktion i laboratoriebogen.
BEMÆRK: Hvis lugtstoffet detekteres af myggeantennerne, observeres en klar afbøjning i signalet (se figur 3A). - Fortsæt med den næste lugt eller koncentration. Glem ikke at randomisere præsentationen af lugtstoffer, medmindre der udføres en dosis-responskurve.
BEMÆRK: Der bør anvendes en negativ kontrol og en positiv kontrol i forsøgene. Dette vil sikre, at de observerede reaktioner faktisk er olfaktoriske reaktioner og ikke skyldes mekanisk eller elektrisk støj. - Ved afslutningen af optagelsen skal du anvende en positiv kontrol for at kontrollere, at antennerne stadig reagerer.
BEMÆRK: Brug 0,1% eller 1% benzaldehyd, da alle myggearter, der hidtil er testet, har været lydhøre over for denne forbindelse. - Fortsæt med det næste mygpræparat.
8. Rengøring
- Sluk for forstærkeren, støjreduktionen, flyselskabet og computeren.
- Sæt lugtstofferne tilbage i fryseren.
- Fjern filterpapiret fra glassprøjterne og rengør med 100% ethanol, hvis rester er synlige på væggene. Lad tørre på en rengøringsserviet natten over.
- Rengør elektrodeholderne med DI-vand for at fjerne eventuelle spor af salt. Tør ved forsigtigt at påføre mod et stykke rengøringsserviet.
- Placer mygrester i fryseren og bortskaf 24 timer senere.
BEMÆRK: Hvis du arbejder med inficerede myg, skal du følge sikkerhedskravene på din institution.
9. Dataanalyser
- Mål enten manuelt eller automatisk EAG-svarene.
BEMÆRK: EAG-amplituden (-mV) måles her. Gennemsnit, hvis der er anvendt flere impulser for hver forbindelse. Afhængigt af den anvendte software kan EAG'er automatisk registreres og måles. Det er imidlertid vigtigt at inspicere hvert svar individuelt for at kontrollere svarets form og vurdere den mulige overførsel, forsinkede respons osv. Det ideelle EAG-respons er justeret med pulsen, viser en klar afbøjning og kan gentages mellem myggepræparater (figur 3). - Præsenter rådataene for at vise minimal variabilitet, lavt støjsignal og klare svar (figur 3B).
BEMÆRK: Dataene kan også normaliseres (f.eks. Z-score). Den negative kontrolværdi (f.eks. mineralolie) (dvs. basislinjen) kan trækkes fra responsen og skal i modsat fald angives i tallene. En positiv kontrol bør også præsenteres. - Udfør statistisk analyse ved hjælp af enhver statistiksoftware28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Elektroantenografi er et kraftfuldt værktøj til at bestemme, om et kemikalie eller en blanding af kemikalier detekteres af en insektantenne. Det kan også bruges til at bestemme detektionstærsklen for et givet kemikalie ved hjælp af en gradvis stigning i koncentrationen (dvs. dosiskurverespons, figur 4B). Desuden er det nyttigt at teste virkningerne af afskrækningsmiddel på responsen på værtsrelaterede lugte29.
Der bør altid anvendes positive og negative kontroller i miljøretningslinjerne. Her blev benzaldehyd anvendt som en positiv kontrol (figur 3B, 3C, 4A). Denne forbindelse har vist sig at fremkalde et antennerespons i alle myggearter, der hidtil er testet24,25,29. Der bør også anvendes en negativ kontrol, som kan bestå af det opløsningsmiddel, der anvendes til fortynding af kemikalierne (f.eks. mineral- eller paraffinolier, hexan osv.), og bør ikke fremkalde et respons (figur 3B, 3C, 4A).
Ved udførelse af EGFL bør der faktisk ikke noteres en afbøjning ved anvendelse af kontrollen (figur 3B, 3C, 4A). Hvis der observeres en reaktion, er enten sprøjten, opløsningsmiddelkontrollen og / eller lugtledningen sandsynligvis forurenet. Hvis det er tilfældet, skal der fremstilles en ny opløsning, sprøjten rengøres med 100% ethanol og tørres og/eller flyselskabet dekontamineres ved skylning med 100% ethanol og tørres. Hvis den valgte kontrol fremkalder en reaktion (f.eks. ethanol), skal værdien i -mV for kontrollen trækkes fra værdien opnået for ethanol og testet kemikalie kombineret for at vurdere det testede kemikalies indvirkning på antennerne.
Mygarter varierer i deres evne til at reagere på forskellige forbindelser såvel som i størrelsen af deres respons. For eksempel producerer Toxorhynchites myg meget store EAG'er sammenlignet med Ae. aegypti, An. Stephensi og Cx. quinquefasciatus (figur 3C, figur 4A).
I EAG'er fører den anden puls og det følgende normalt til mindre EAG-reaktioner. Præsentationen af et lugtstof kan også påvirke svaret på følgende, så det er vigtigt at randomisere lugtordren og flere analyser for effektivt at teste et panel af lugtstoffer (medmindre der udføres en dosis-responskurve). Desuden vil adskillelse af impulser (f.eks. 5 s) og lugtstoffer (f.eks. 45 s) præsentation bidrage til at optimere EAG-responserne.
Volatiliteten af de testede kemikalier varierer og kan påvirke det olfaktoriske respons og potentielt føre til et forsinket respons, hvis det testede kemikalie har meget lav flygtighed. Kemisk volatilitet og opløselighed bør være kendt, før EAG'er udføres for at optimere assayet. Det opløsningsmiddel, der anvendes til fremstilling af fortyndingerne, skal også vælges omhyggeligt (f.eks. ethanol, hexan, mineral eller paraffinolie). Desuden bør fusioner vælges klogt og ideelt set være økologisk relevante. En koncentration på 1% eller 0,1% bruges ofte, men er relativt høj og ikke nødvendigvis repræsentativ for, hvad insekterne kan opleve i naturen. Alligevel er det nyttigt at screene forbindelser med relativt høje koncentrationer i nogle tilfælde (f.eks. Til agnudvikling). Afskrækningsmidler kan testes ved deres kommercielt tilgængelige koncentration (f.eks. DEET sælges typisk ved en koncentration på 40%).
Hvis de kombineres med gaskromatografi (dvs. GC-EAD'er)25, kan de forbindelser, der fremkalder en respons, identificeres med en GC-MS og derefter testes individuelt i forskellige koncentrationer eller i blandinger med EAG'er. Det er værd at nævne, at valensen af de testede kemikalier ikke kan bestemmes med EAG'er. Kun et komplementært adfærdseksperiment (f.eks. Olfactometer, fodringsanalyse) kan vurdere, om kemikaliet, der detekteres af antennerne, er attraktivt, frastødende eller neutralt for myggen. Endelig viser EAG-eksperimenter kun reaktioner fra det perifere nervesystem.
Figur 1: Elektroantennogramopsætning bestående af: A) Mikroskop: det anvendte mikroskop skal gøre det muligt for eksperimentatoren klart at se præparatet, så myggeantennespidserne kan indsættes i optageelektroderne. B) Lampe med koldt lys: lampen skal slukkes, når optagelserne begynder. C) Vakuumledning: Dette reducerer risikoen for ophobning af lugtstoffer omkring myggehovedpræparatet, hvilket kan resultere i antenneresponser, der er afkoblet fra den faktiske stimulering. D) Mikromanipulatorer (x2): disse giver mulighed for meget fine elektrodeholderbevægelser, hvilket er nødvendigt for at indsætte myggeantennerne i optageelektrodens kapillær. E) Optagelse af elektrodeholder. F) Holder til referenceelektrode. G) Hovedtrin: begge elektroder er tilsluttet hovedtrinnet, som derefter tilsluttes forstærkeren. H) Hovedflyselskab: en konstant ren luftstrøm badede myghovedet. Strømningshastigheden reguleres af en flowmåler. I) Sprøjte til lugttilførsel forbundet til magnetventilen og flowmåleren; J) Luftbord: luftbordet reducerer støj. K) Faraday-bur: Faraday-buret forhindrer elektrisk støj. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Trin for trin Aedes albopictus myggehovedforberedelse til EAG-optagelser. A) Hunmyg på ryggen på en iskold plade for at kontrollere, at begge antenner er intakte. B) Sidste segment af antenneudskæringen med mikrosaks. C) Antenner dyppes i elektrodegel. D) Antennerne klæber sammen efter at have trukket dem ud. Kun et segment af hver antenne skal være i elektrodegelen. E) Myggehoved udskæring. F) Hoved monteret på referenceelektroden. Det skal være stabilt nok til at blive flyttet til EAG-riggen. A'-F«. Samme trin som præsenteret ovenfor for mandlige EAG'er. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Skematisk oversigt over myggens EAG og rå EAG-spor. A ) EAG-skematisk (venstre) og karakteristika for EAG-svaret (højre). (Venstre) Myggehovedet er monteret mellem en referenceelektrode og en optageelektrode forbundet til en forstærker. Antennerne bades i en konstant luftstrøm, hvor lugtstimuli pulseres. Detektion af et kemikalie fører til en afbøjning (i mV) i signalet. (højre) Den kemiske detektion fører til celledepolarisering (DPR) efterfulgt af cellerepolarisering (RPR), indtil de vender tilbage til baseline. Lugtpulsen er repræsenteret af det grå rektangel. Den røde linje angiver amplituden af EAG-responsen. B) Skærmbillede af WinEDR-softwaren, der fremhæver et helt EAG-optagelsesspor af en Culex quinquefasciatus kvindelig myg. Top: ufiltreret (dvs. råt) signal. Midt: 1 s lugtimpulser er angivet med tal. Nederst: filtreret (dvs. 1,5 Hz lavpas) signal til 3 lugtstoffer og en kontrol (mineralolie). Bemærk afbøjningerne som reaktion på 1% 1-hexanol (1), 1% benzaldehyd (2) og 1% smørsyre (3). Bemærk fraværet af respons på den negative kontrol, mineralolie (4). C ) Fra venstre mod højre: Repræsentative EAG-svar (i mV) på 1% benzaldehyd (øverst) og en mineraloliekontrol (nederst) hos hunner Aedes aegypti, Anopheles stephensi, Culex quinquefasciatus og Toxorhynchites rutilus septentrionalis. Pulsen på et sekund er repræsenteret af det farvede rektangel over EAG-sporet. Bemærk den store afbøjning som reaktion på benzaldehyd og manglen på respons på mineralolien. Bemærk også den forskellige skala i Toxorhynchites rutilus septentrionalis. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Eksempel på gengivelse af EAG-resultater og deres statistiske analyser. A. Gennemsnitlig EAG-respons af Culex quinquefasciatus (N = 8), Anopheles stephensi (N = 10), Aedes aegypti (N = 8) og Toxorhynchites rutilus septentrionalis (N = 7) kvinder til 1% 1-hexanol (grøn), 1% smørsyre (orange), 1% benzaldehyd (gul) og mineralolie (blå). B. Culex quinquefasciatus hunner EAG dosis-responskurve for 1-hexanol (venstre) (N = 9) og benzaldehyd (højre) (N = 8). Søjler repræsenterer standardfejl i middelværdien. Bogstaver over fejlbjælker angiver statistiske forskelle (parvis Wilcoxon rangsumtest med en Bonferroni-korrektion). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Olfaktorisk medieret adfærd påvirkes af mange faktorer, herunder fysiologiske (f.eks. alder, tidspunkt på dagen) og miljømæssige (f.eks. temperatur, relativ luftfugtighed)30. Når der udføres miljøvurderingsplaner, er det derfor vigtigt at anvende insekter, der har samme fysiologiske status (dvs. overvågning af alder, sult, parring)31 og også at opretholde et varmt og fugtigt miljø omkring præparatet for at undgå udtørring. En temperatur omkring 25 °C er ideel og 60% til 80% fugtighed for hovedflyselskabet. Dette kan let opnås ved at placere en bobler på hovedflyets kredsløb.
Desuden er det vigtigt at overveje hver arts økologi for at opnå resultater, der er relevante for insektets biologi. For eksempel, hvis du bruger en natlig art, kan du overveje at vende deres lyscyklus for at teste deres respons i løbet af deres subjektive nat. Det er også vigtigt at vælge at udføre EAG'er på bestemte tidspunkter af dagen (dvs. når insektet er aktivt). For eksempel, hvis du bruger Ae. aegypti myg, overveje at gøre eksperimenterne under toppen af aktiviteten af denne art (dvs. tidligt på dagen og senere eftermiddag). Igen kan lyscyklussen let skiftes for nemheds skyld ved hjælp af klimakamre eller lysbokse med et omvendt lysprogram ved hjælp af en programmerbar timer32. Eilerts et al.33 og Krishnan et al.34 har vist, at følsomheden over for specifikke lugtstoffer varierer i løbet af dagen. Således vil et godt kendskab til insektets økologi og biologi garantere mere præcise resultater.
Støj (enten elektrisk eller mekanisk) kan let indføres i miljøretningslinjerne. For eksempel kan mekaniske forstyrrelser skabes af et vekselstrømssystem, der blæser luft mod et EAG-præparat. Elektrisk støj kan reduceres med Humbug, men hvis den vedvarer, kan den spores ved at tilslutte elementer og jordforbinde dem til Faraday-buret ved hjælp af alligatorklip (figur 3B). Dette gælder for alle de elementer, der er til stede omkring præparatet (dvs. mikroskop, lampe, mikromanipulatorer). Nogle stykker udstyr i Faraday-buret skal frakobles før optagelse, da de stadig kan producere elektrisk støj (f.eks. Kold lyskilde) eller placeres uden for buret. En anden type "støj" er af olfaktorisk karakter. Eksperimentatoren bør undgå at bære parfume eller bruge stærkt duftende shampoo eller vaskemiddel. Faktisk kan mange forbindelser, der findes i disse, påvises af myg (f.eks. linalool, citronellol, geraniol, eugenol) og kan forstyrre og påvirke resultaterne af forsøgene. Brug af laboratoriefrakke og handsker er også vigtigt for at begrænse uønsket forurening af flyselskabet, sprøjter og elektroder.
Den præsenterede protokol har den fordel, at den er let anvendelig på alle mygarter, både hos mænd og kvinder, samtidig med at præparatets levetid forlænges (> 30 min) og med begrænset variation mellem præparater. Denne metode fører til meget minimal støj i EAG-signalet, hvilket gør det muligt at teste kemikalier ved meget lave koncentrationer. Når dissektions- og monteringstrinnene er mestret, kan denne teknik producere pålidelige data på relativt kort tid og enkle dataanalyser.
Elektroantennografi tillader kun eksperimentatoren at vurdere, om myggen kan detektere et kemikalie eller ej. For at bestemme valensen af dette kemikalie er komplementære adfærdsmæssige assays, såsom olfactometer-assays, imidlertid afgørende for at bestemme, om et specifikt lugtstof eller en blanding er attraktiv, afvisende eller neutral for at udvikle effektive værktøjer til mygkontrol35.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren har intet at afsløre.
Acknowledgments
Jeg er taknemmelig over for Dr. Clément Vinauger og Dr. Jeffrey Riffell for nyttige drøftelser. Følgende reagenser blev opnået gennem BEI Resources, NIAID, NIH: Anopheles stephensi, Strain STE2, MRA-128, bidraget af Mark Q. Benedict; Aedes aegypti, Strain ROCK, MRA-734, bidraget af David W. Severson; Culex quinquefasciatus, stamme JHB, æg, NR-43025. Forfatteren takker Dr. Jake Tu, Dr. Nisha Duggal, Dr. James Weger og Jeffrey Marano for at give Culex quinquefasciatus og Anopheles stephensi (stamme: Liston) myggeæg. Aedes albopictus og Toxorhynchites rutilus septentrionalis stammer fra feltmyg indsamlet af forfatteren i New River Valley-området (VA, USA). Dette arbejde blev støttet af Institut for Biokemi og Fralin Life Science Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air table Clean Bench | TMC | https://www.techmfg.com/products/labtables/cleanbench63series/accessoriess | Noise reducer |
| Analog-to-digital board | National Instruments | BNC-2090A | |
| Benchtop Flowbuddy Complete | Genesee Scientific | 59-122BC | To anesthesize mosquitoes |
| Borosillicate glass capillary | Sutter Instrument | B100-78-10 | To make the recording and references capillaries |
| Chemicals | Sigma Aldrich | Benzaldehyde: 418099-100 mL; Butyric acid: B103500-100mL; 1-Hexanol: 471402-100mL; Mineral oil: M8410-1L | Chemicals used for the experiments presented here |
| CO2 | Airgas or Praxair | N/A | To anesthesize mosquitoes |
| Cold Light Source | Volpi | NCL-150 | |
| Disposable syringes | BD | 1 mL (309628) / 3 mL (309657) | |
| Electrode cables | World Precision Instruments | 5371 | |
| Electrode gel salt free | Parkerlabs | 12-08-Spectra-360 | |
| Faraday cage | TMC | https://www.techmfg.com/products/electric-and-magnetic-field-cancellation/faradaycages | Noise reducer |
| Flowmeters | Bel-art | 65 mm (H40406-0010) / 150 mm (H40407-0075) | One of each |
| GCMS vials and caps | Thermo-fisher scientific | 2-SVWKA8-CPK | To prepare odorant dilutions |
| Glass syringes (Fortuna) | Sigma Aldrich | Z314307 | For odor delivery to the EAG prep |
| Humbug | Quest Scientific | http://www.quest-sci.com/ | Noise reducer |
| 2 mm Jack Holder, Narrow, 90 deg., With Wire | A-M Systems | 675748 | Electrode holder |
| Magnetic bases | Kanetec | MB-FX | x 2 |
| MATLAB + Toolboxes | Mathworks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | For delivering the pulses |
| Medical air | Airgas or Praxair | N/A | For main airline |
| Microscope | Nikkon | SMZ-800N | |
| Micromanipulators Three-Axis Coarse/Fine Compact Micromanipulator | Narishige | MHW-3 | x 2 |
| Microelectrode amplifier with headstage | A-M Systems | Model 1800 | |
| Mosquito rearing supplies | Bioquip | https://www.bioquip.com/Search/WebCatalog.asp | |
| Needles | BD | 25G (305127) / 21G (305165) | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-6A | For odor delivery to the EAG prep |
| PTFE Tubing of different diameters | Mc Master Carr | N/A | To connect solenoid valve, flowmeter, airline ect. |
| 30V/5A DC Power Supply | Dr. Meter | PS-305DM | |
| R version 3.5.1 | R project | https://www.r-project.org/ | For data analyses |
| Relay for solenoid valve | N/A | Custom made | |
| Silver wire 0.01” | A-M Systems | 782500 | |
| Solenoid valve (3-way) | The Lee Company | LHDA0533115H | |
| WinEDR software | Strathclyde Electrophysiology Software | WinEDR V3.9.1 | For EAG recording |
| Whatman paper | Cole Parmer | UX-06648-03 | To load chemical in glass syringe / Pasteur pipette |
References
- World Health Organization. World health statistics 2019: monitoring health for the SDGs, sustainable development goals. World Health Organization. , Geneva. (2019).
- Takken, W. The role of olfaction in host-seeking of mosquitoes: a review. International Journal of Tropical Insect Science. 12 (1-2-3), 287-295 (1991).
- Zwiebel, L. J., Takken, W.
- Potter, C. J. Stop the biting: targeting a mosquito's sense of smell. Cell. 156 (5), 878-881 (2014).
- Paluch, G., Bartholomay, L., Coats, J. Mosquito repellents: a review of chemical structure diversity and olfaction. Pest Management Science. 66 (9), 925-935 (2010).
- Schneider, D. Electrophysiological investigation on the antennal receptors of the silk moth during chemical and mechanical stimulation. Experientia. 13 (2), 89-91 (1957).
- Raguso, R. A., Light, D. M., Pickersky, E. Electroantennogram responses of Hyles lineata (Sphingidae: Lepidoptera) to volatile compounds from Clarkia breweri (Onagraceae) and other moth-pollinated flowers. Journal of Chemical Ecology. 22 (10), 1735-1766 (1996).
- Schweitzer, E. S., Sanes, J. R., Hildebrand, J. G. Ontogeny of electroantennogram responses in the moth, Manduca sexta. Journal of Insect Physiology. 22 (7), 955-960 (1976).
- Martel, V., Anderson, P., Hansson, B. S., Schlyter, F. Peripheral modulation of olfaction by physiological state in the Egyptian leaf worm Spodoptera littoralis (Lepidoptera: Noctuidae). Journal of Insect Physiology. 55 (9), 793-797 (2009).
- Spaethe, J., Brockmann, A., Halbig, C., Tautz, J. Size determines antennal sensitivity and behavioral threshold to odors in bumblebee workers. Naturwissenschaften. 94 (9), 733-739 (2007).
- Suchet, C., et al. Floral scent variation in two Antirrhinum majus subspecies influences the choice of naïve bumblebees. Behavioral Ecology and Sociobiology. 65 (5), 1015-1027 (2011).
- De Jong, R., Pham-Delègue, M. H. Electroantennogram responses related to olfactory conditioning in the honeybee (Apis mellifera ligustica). Journal of Insect Physiology. 37 (4), 319-324 (1991).
- Patte, F., Etcheto, M., Marfaing, P., Laffort, P. Electroantennogram stimulus-response curves for 59 odourants in the honeybee, Apis mellifica. Journal of Insect Physiology. 35 (9), 667-675 (1989).
- Alcorta, E. Characterization of the electroantennogram in Drosophila melanogaster and its use for identifying olfactory capture and transduction mutants. Journal of Neurophysiology. 65 (3), 702-714 (1991).
- Park, K. C., Ochieng, S. A., Zhu, J., Baker, T. C. Odor discrimination using insect electroantennogram responses from an insect antennal array. Chemical Senses. 27 (4), 343-352 (2002).
- Du, Y. J., Millar, J. G. Electroantennogram and oviposition bioassay responses of Culex quinquefasciatus and Culex tarsalis (Diptera: Culicidae) to chemicals in odors from Bermuda grass infusions. Journal of Medical Entomology. 36 (2), 158-166 (1999).
- Costantini, C., et al. Electroantennogram and behavioural responses of the malaria vector Anopheles gambiae to human-specific sweat components. Medical and Veterinary Entomology. 15 (3), 259-266 (2001).
- Collins, L. E., Blackwell, A. Electroantennogram studies of potential oviposition attractants for Toxorhynchites moctezuma and T. amboinensis mosquitoes. Physiological Entomology. 23 (3), 214-219 (1998).
- Seenivasagan, T., Sharma, K. R., Sekhar, K., Ganesan, K., Prakash, S., Vijayaraghavan, R. Electroantennogram, flight orientation, and oviposition responses of Aedes aegypti to the oviposition pheromone n-heneicosane. Parasitology Research. 104 (4), 827-833 (2009).
- Puri, S. N., Mendki, M. J., Sukumaran, D., Ganesan, K., Prakash, S., Sekhar, K. Electroantennogram and behavioral responses of Culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae) females to chemicals found in human skin emanations. Journal of Medical Entomology. 43 (2), 207-213 (2014).
- Cooperband, M. F., McElfresh, J. S., Millar, J. G., Carde, R. T. Attraction of female Culex quinquefasciatus Say (Diptera: Culicidae) to odors from chicken feces. Journal of Insect Physiology. 54 (7), 1184-1192 (2008).
- Dekker, T., Ignell, R., Ghebru, M., Glinwood, R., Hopkins, R. Identification of mosquito repellent odours from Ocimum forskolei. Parasites & Vectors. 4 (1), 183 (2011).
- Choo, Y. M., et al. Reverse chemical ecology approach for the identification of an oviposition attractant for Culex quinquefasciatus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), 714-719 (2018).
- Wolff, G. H., Lahondère, C., Vinauger, C., Riffell, J. A. Neuromodulation and differential learning across mosquito species. bioRxiv. , 755017 (2019).
- Lahondère, C., et al. The olfactory basis of orchid pollination by mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (1), 708-716 (2020).
- Beyenbach, K., Masia, R. Membrane conductances of principal cells in Malpighian tubules of Aedes aegypti. Journal of Insect Physiology. 48, 375-386 (2002).
- Oesterle, A. The Pipette Cookbook. , (2018).
- R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. (2018).
- Afify, A., Betz, J. F., Riabinina, O., Lahondère, C., Potter, C. J. Commonly used insect repellents hide human odors from Anopheles mosquitoes. Current Biology. 29 (21), 3669-3680 (2019).
- Martin, F., Riveron, J., Alcorta, E. Environmental temperature modulates olfactory reception in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 57 (12), 1631-1642 (2011).
- Qiu, Y. T., Gort, G., Torricelli, R., Takken, W., van Loon, J. J. Effects of blood-feeding on olfactory sensitivity of the malaria mosquito Anopheles gambiae: application of mixed linear models to account for repeated measurements. Journal of Insect Physiology. 59 (11), 1111-1118 (2013).
- Taylor, B., Jones, M. D. R. The circadian rhythm of flight activity in the mosquito Aedes aegypti (L.): the phase-setting effects of light-on and light off. Journal of Experimental Biology. 51 (1), 59-70 (1969).
- Eilerts, D. F., VanderGiessen, M., Bose, E. A., Broxton, K., Vinauger, C. Odor-specific daily rhythms in the olfactory sensitivity and behavior of Aedes aegypti mosquitoes. Insects. 9 (4), 147 (2018).
- Krishnan, B., Dryer, S. E., Hardin, P. E. Circadian rhythms in olfactory responses of Drosophila melanogaster. Nature. 400 (6742), 375-378 (1999).
- Pelletier, J., Guidolin, A., Syed, Z., Cornel, A. J., Leal, W. S. Knockdown of a mosquito odorant-binding protein involved in the sensitive detection of oviposition attractants. Journal of Chemical Ecology. 36 (3), 245-248 (2010).
