Summary
Het huidige artikel beschrijft een stap-voor-stap protocol voor succesvolle en geluidsarme elektroantennogrammen in verschillende geslachten van muggen, waaronder zowel vrouwtjes als mannetjes.
Abstract
Vrouwelijke muggen zijn de dodelijkste dieren op aarde en eisen elk jaar het leven van meer dan 1 miljoen mensen als gevolg van ziekteverwekkers die ze overbrengen bij het verkrijgen van een bloedmaaltijd. Om een gastheer te vinden om zich mee te voeden, vertrouwen muggen op een breed scala aan sensorische signalen, waaronder visuele, mechanische, thermische en olfactorische. De studie beschrijft een techniek, elektroantennografie (EAG), waarmee onderzoekers kunnen beoordelen of de muggen individuele chemicaliën en mengsels van chemicaliën op een concentratieafhankelijke manier kunnen detecteren. In combinatie met gaschromatografie (GC-EAG) maakt deze techniek het mogelijk om de antennes bloot te stellen aan een volledige headspace / complex mengsel en bepaalt welke chemicaliën aanwezig zijn in het monster van belang dat de mug kan detecteren. Dit is van toepassing op geuren van het gastheerlichaam, maar ook op bloemboeketten van planten of andere ecologisch relevante geuren (bijv. Geurstoffen van ovipositiesites). Hier hebben we een protocol beschreven dat een lange duur van de reactietijd van de voorbereiding mogelijk maakt en van toepassing is op zowel vrouwelijke als mannelijke muggen uit meerdere geslachten, waaronder Aedes, Culex, Anopheles en Toxorhynchites-muggen . Omdat reukzin een belangrijke rol speelt in interacties tussen muggen en gastheer en muggenbiologie in het algemeen, kunnen EAG's en GC-EAG verbindingen onthullen die van belang zijn voor de ontwikkeling van nieuwe strategieën voor de bestrijding van ziektevectoren (bijv. Aas ). Aangevuld met gedragstests kan de valentie (bijv. Lokstof, afweermiddel) van elke chemische stof worden bepaald.
Introduction
Muggen zijn de dodelijkste organismen op aarde, eisen het leven van meer dan een miljoen mensen per jaar en brengen meer dan de helft van de wereldbevolking in gevaar voor blootstelling aan de ziekteverwekkers die ze overbrengen, terwijl zebijten 1. Deze insecten vertrouwen op een breed scala aan signalen (d.w.z. thermisch, visueel, mechanisch, olfactorisch, auditief) om een gastheer te vinden om zich mee te voeden (zowel plant als dier), voor paring en ovipositie, en om roofdieren te vermijden in zowel de larvale als volwassen stadia 2,3. Onder deze zintuigen speelt reukzin een cruciale rol in de bovengenoemde gedragingen, met name voor detectie op middellange tot lange afstand van geurmoleculen 2,3. Geuren die worden uitgezonden door een gastheer of een ovipositieplaats worden gedetecteerd door verschillende specifieke reukreceptoren (bijv. GRs, OK's, IR's) op de muggenpalpen proboscis, tarsi en antennes 2,3.
Omdat reukzin een belangrijk onderdeel is van hun gastheerzoekende (plant en dier), parings- en ovipositiegedrag, vormt het dus een ideaal doelwit om te bestuderen om nieuwe hulpmiddelen voor muggenbestrijdingte ontwikkelen 4. Onderzoek naar insectenwerende middelen (bijv. DEET, IR3535, picaridin) en aas (bijv. BG sentinel menselijk kunstaas) is uiterst productief5, maar vanwege de huidige uitdagingen in muggenbestrijding (bijv. Insecticideresistentie, invasieve soorten), is het essentieel om nieuwe efficiënte bestrijdingsmethoden te ontwikkelen op basis van de muggenbiologie.
Veel technieken (bijv. olfactometer, landingstests, elektrofysiologie) zijn gebruikt om de bioactiviteit van verbindingen of mengsels van verbindingen in muggen te beoordelen. Onder hen kan elektroantennografie (of elektroantennogrammen (EAG's)) worden gebruikt om te bepalen of de geurstoffen worden gedetecteerd door de muggenantennes. Deze techniek werd oorspronkelijk ontwikkeld door Schneider6 en is sindsdien in veel verschillende insectengeslachten gebruikt, waaronder motten 7,8,9, hommels 10,11, honingbijen 12,13 en fruitvliegen 14,15 om er maar een paar te noemen. Elektroantennografie is ook gebruikt met behulp van verschillende protocollen, waaronder enkele of meerdere antennes bij muggen 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25.
Muggen zijn relatief kleine en delicate insecten met vrij dunne antennes. Hoewel het uitvoeren van EAG's op grotere insecten zoals motten of hommels relatief eenvoudig is vanwege hun grotere formaat en dikkere antennes, kan het uitvoeren van EAG's bij muggen een uitdaging zijn. Met name het handhaven van een goede signaal-ruisverhouding en een duurzame responsieve voorbereiding zijn twee belangrijke vereisten voor de reproduceerbaarheid en betrouwbaarheid van gegevens.
De stapsgewijze handleiding voor geluidsarme EAG's die hier wordt voorgesteld, biedt direct oplossingen voor deze beperkingen en maakt dit protocol van toepassing op verschillende muggensoorten uit verschillende geslachten, waaronder Aedes, Anopheles, Culex en Toxorhynchites, en beschrijft de techniek voor zowel vrouwtjes als mannetjes. Elektroantennografie biedt een snelle maar betrouwbare manier om bioactieve stoffen te screenen en te bepalen die vervolgens kunnen worden gebruikt bij de ontwikkeling van aas nadat de valentie is bepaald met gedragstests.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van zoutoplossing
- Bereid de zoutoplossing van tevoren en bewaar in de koelkast.
- Volg Beyenbach en Masia26 om de oplossing voor te bereiden.
OPMERKING: Zoutoplossing recept in mM: 150,0 NaCl, 25,0 HEPES, 5,0 glucose, 3,4 KCl, 1,8 NaHCO3, 1,7 CaCl 2 en 1,0 MgCl2. De pH wordt met 1 M NaOH ingesteld op 7,1. Voeg op dit moment geen glucose of sucrose toe aan het preparaat om de opslag van de plank te vergroten. Voeg de benodigde hoeveelheid toe aan de zoutoplossing vlak voordat u de EAG's uitvoert (ongeveer 50 ml per experiment).
2. Geurvoorbereiding en -opslag
- Bereid de geurmengsels of enkelvoudige verdunningen van tevoren in amberkleurige injectieflacons van 1,5 ml en bewaar bij -20 °C om afbraak van de verbinding te voorkomen.
OPMERKING: De concentraties zijn afhankelijk van de uit te voeren test. 0,1% of 1% worden vaak gebruikt om te bepalen of een verbinding kan worden gedetecteerd of niet. Bereid voor een dosis-responscurve seriële verdunningen van een bepaalde chemische stof en test deze van de laagste tot de hoogste concentraties. - Bereid de verdunningen in water, ethanol, hexaan, paraffineolie of minerale olie, afhankelijk van de oplosbaarheid van de geteste chemische stof.
- Zorg ervoor dat u een oplosmiddelcontrole (een injectieflacon met alleen het oplosmiddel) voorbereidt voor het experiment.
- Haal de geurstoffen 30 minuten voor aanvang van de experimenten uit de vriezer om ze te laten ontdooien. Vortex elke injectieflacon vóór gebruik om de chemische stof en het oplosmiddel goed te mengen.
- Pipetteer 10 μL oplossing op een stuk filtreerpapier (0,5 cm x 2 cm) dat in een gelabelde glazen spuit of Pasteurpipet is geplaatst.
- Laad elke verbinding of elk mengsel in een specifieke Pasteur-pipet of -spuit om besmetting te voorkomen.
OPMERKING: Laad 10 minuten voordat u met het experiment begint, zodat de geur zich in de spuit kan verspreiden, maar niet langer om degradatie te voorkomen. Laat de Pasteur-pipet of -spuit op dit moment afgedekt blijven om een goede diffusie van de chemische stof mogelijk te maken voordat het experiment begint. - Gooi na elke EAG-run het stuk van het filterpapier weg en vervang het door een nieuw stuk om te voorkomen dat het papier overweekt raakt en het risico loopt op verstopping van de naald. Vervang de naalden regelmatig (elke 10 runs).
3. Muggenscheiding
- Isoleer de muggen op de dag van de experimenten.
- Gebruik muggen die minstens 6 dagen oud zijn op de dag van de experimenten om de kans te vergroten dat de vrouwtjes worden gepaard om hun reactie op gastheergerelateerde geurstoffen te verbeteren.
OPMERKING: Pas de leeftijd van de mug aan op het moment van de test, afhankelijk van het project. Controleer en harmoniseer de fysiologische status (bijv. Bloed gevoed, uitgehongerd, nooit eerder gevoed, enz.). - Honger de muggen uit tot 12 uur (d.w.z. geen toegang tot suiker) om hun motivatie en gevoeligheid te vergroten.
- Plaats de muggencontainer in de koelkast (4 °C) totdat ze stoppen met vliegen, zodat individuen gemakkelijk kunnen worden overgebracht naar enkele kopjes met een tang.
OPMERKING: Soorten met een hogere tolerantie voor kou kunnen worden neergezet met behulp van een CO2-vliegpad . Zorg ervoor dat de muggen er niet lang op blijven zitten om uitdroging te voorkomen, wat de responsiviteit van het EAG-preparaat van de mug zou verminderen. - Bewaar de bekers met enkele muggen bij kamertemperatuur voordat de EAG's worden uitgevoerd en gooi alle muggen weg die overdag niet mogen worden gebruikt.
4. Elektrodehouder en capillaire voorbereiding
- Capillair trekken, voorbereiden en opslaan
- Gebruik borosilicaatcapillairen met filamenten (I.D: 0,78 mm, O.D: 1 mm). Trek ze afhankelijk van de uitrusting27.
OPMERKING: Bewaar de getrokken haarvaten in een petrischaaltje. Plaats de petrischaal op stukjes was of ongeparfumeerde boetseerklei om te voorkomen dat ze bewegen en breken. - Voordat u het EAG-experiment uitvoert, breekt u voorzichtig de punt van 2 haarvaten met een tang onder de microscoop.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de ene iets groter is dan de andere om in de nek (groter capillair) of de uiteinden van de antennes (kleiner capillair) te passen. Zorg ervoor dat de snede schoon is zonder scheuren in de capillaire wand. Dit vereist geduld en oefening. - Indien nog intact, hergebruik deze haarvaten na het spoelen met gedeïoniseerd (DI) water nadat het experiment voorbij is. Verwijder het overtollige water door voorzichtig een reinigingsdoekje tegen de punt aan te brengen. Plaats de petrischaal terug in de bewaarbak. Als de punt scheef staat, gooi dan het capillair weg.
- Gebruik borosilicaatcapillairen met filamenten (I.D: 0,78 mm, O.D: 1 mm). Trek ze afhankelijk van de uitrusting27.
- Elektrodehouder en capillaire montage
- Label de twee elektrodehouders als "opname" en "referentie" door stukjes laboratoriumtape van verschillende kleuren te gebruiken. Dit zal helpen bij het begeleiden van de montage van de muggenkop en elektroden.
- Zorg ervoor dat de elektrodehouders van binnen vrij zijn en dat er geen borosilicaatvuil aanwezig is.
- Chloridisatie: Week de zilverdraden van de elektrodehouders ongeveer 5 minuten in zuiver bleekmiddel. De draden veranderen van glanzend lichtgrijs naar mat donkergrijs.
- Maak de rubberen stop los en vul de binnenkant van het capillair met 10% zoutoplossing met een naald van 20 G.
- Vul het borosilicaat capillair met de zoutoplossing met een spuit. Zorg ervoor dat er geen bellen aanwezig zijn in noch de elektrodehouder, noch het getrokken capillair.
OPMERKING: Om de kans op bubbels in het capillair te verminderen, blijft u zoutoplossing in het capillair duwen terwijl u de naald voorzichtig uittrekt en haarvaten met een filament gebruikt. Het is mogelijk om de haarvaten te laden met een oplossing die bestaat uit 1:3 elektrodegel en zoutoplossing. Dit kan verdamping van de zoutoplossing helpen voorkomen en kan vooral nuttig zijn bij het leren en oefenen van EAG's, omdat de experimentator meer tijd nodig heeft om de verschillende stappen te voltooien. - Spoel na het weken de zilverdraden af met DI-water en steek ze in de twee haarvaten. Zorg ervoor dat de punt van de draad zich op minder dan 1 mm van de punt van het capillair bevindt. Zorg ervoor dat het capillair de rubberen ring in de elektrodehouder passeert zonder te breken. Draai de rubberen stop voorzichtig vast. Controleer of er geen luchtbellen aanwezig zijn.
- Gebruik het capillair met de bredere opening op de referentie-elektrodehouder (nek) en de kleinere opening op de opname-elektrodehouder (antennes).
- Laat de twee gemonteerde elektrodehouders op een nat reinigingsdoekje zitten om te voorkomen dat de punt uitdroogt totdat u klaar bent om de kop te monteren.
5. Voorbereiding van de EAG-installatie (figuur 1)
- Zorg ervoor dat de luchttafel omhoog is, dat er geen verstopping is in de luchtvaartmaatschappij. Zorg ervoor dat de tank met medische lucht nog steeds vol is om te voorkomen dat deze in het midden van het experiment wordt vervangen. Zorg ervoor dat er bubbels in de luchtbevochtiger zitten.
- Lucht- en pulsafgiftesysteem
- Zet de medische luchtgastank aan.
- Controleer het niveau van de twee debietmeters.
OPMERKING: De flowmeter die de hoofdluchtstroom regelt die het preparaat tijdens het hele experiment baadt, moet 140 ml / min zijn en de andere met betrekking tot de geurpuls moet 15 ml / min lezen.
- Als u GC-EAD uitvoert, schakelt u de machine en gastanks in en maakt / laadt u het bestand / de methode.
- Schakel de computers, de softwaretoepassingen, de voeding van de klep in en controleer of de internetverbinding werkt of de softwaretoepassing werkt.
- Softwaretoepassing: Er kan een kort script worden geschreven om de puls af te leveren.
- EAG-software: gebruik alle elektrofysiologische software.
- Implementeer de parameters in de software (bijv. versterker, opnameduur, duur van de pulsen, enz.).
- Geef een regelpuls om te controleren of de klep die de pulsen aflevert functioneel is.
- Stel de voeding in op 5,2 V. Controleer de versterkerparameters.
OPMERKING: De parameters die worden gebruikt voor de hier gepresenteerde gegevens zijn: laag afsnijfilter van 0,1 Hz; hoog afsnijfilter van 500 Hz; Winst van x100.
6. Voorbereiding en montage van de muggenkop (figuur 2)
- Leg een aluminium plaat op ijs en leg er een stuk nat reinigingsdoekje overheen.
- Leg een klein kloddertje elektrodegel in een hoekje.
- Plaats een muggenbeker op ijs en laat de mug een paar minuten afkoelen, of totdat hij stopt met vliegen.
OPMERKING: Sommige soorten zijn koudebestendig en vereisen mogelijk een snelle anesthesie over een CO2-vliegpad om naar beneden te gaan. Hoe minder de mug blijft zitten, hoe beter. - Plaats de mug op zijn rug en knip de punt van elke antenne (slechts een klein deel van het laatste segment) met een microschaar.
- Gebruik een tang om de mug naast de elektrodegel te slepen en dompel de punt van elke antenne voorzichtig in de gel. Vermijd het onderdompelen van meer dan alleen het allerlaatste segment in de elektrodegel.
- Trek met een tang de muggenantennes eruit terwijl je ze naast elkaar houdt. Laat ze samen uit de gel komen. Zorg ervoor dat de antennes het oppervlak van het reinigingsdoekje niet raken, anders kunnen ze losraken.
- Plaats de mug op zijn kant en hak de kop met een microschaar of een scheermesje.
OPMERKING: Zodra de kop is gehakt, gaat u snel verder met de volgende stappen en naar de EAG-rig om de opnames te starten. De voorbereiding moet ongeveer 30 minuten responsief blijven. - Neem de referentie-elektrode en diep de punt voorzichtig in de gel. Blijf in contact met nekweefsels en laat het hoofd erop plakken.
- Beweeg de elektrodehouders onder de EAG-microscoop en bekijk door de microscoop om de hoofdelektrode (d.w.z. referentie) op een micromanipulator te plaatsen. Zorg ervoor dat de antennes zich in het midden bevinden.
- Pak de opname-elektrode en plaats deze voor de uiteinden van de antennes. Beweeg en lijn het zo dicht mogelijk bij de uiteinden uit met behulp van de micromanipulator. Beweeg met behulp van de microscoop de punt van de opname-elektrode naar de antennes.
- Sluit beide elektrodehouders aan op de versterker voordat u de uiteinden plaatst om te voorkomen dat ze bewegen na het inbrengen.
- Plaats de antennepunten in de opname-elektrode. Zorg ervoor dat ze gewoon contact maken met de zoutoplossing en de elektrodegel en zichtbaar zijn door transparantie door het capillair. De antenne gaat naar binnen door het "zuigeffect".
- Pas de positie van het hoofd en de uiteinden aan met een tang onder de microscoop, indien nodig.
- Plaats de vliegtuigslang dicht bij het muggenkoppreparaat (afstand: 1 cm).
OPMERKING: Als het hoofd eraf valt, keer dan terug naar het snijstation en monteer het hoofd opnieuw of bereid een nieuwe voor als het verloren is gegaan of als het meer dan 5 minuten geleden is dat het hoofd werd afgesneden. Een goede verbinding tussen het capillair en de hals/antennes is essentieel voor weinig ruis en betrouwbare opname. Idealiter bevinden de antennepunten zich op minder dan 1 mm van de draad van de opname-elektrode zodra deze is geplaatst. - Schakel de lichtbron uit, indien gebruikt.
- Plaats de vacuümlijn in de buurt van de muggenkopvoorbereiding (afstand: 20 cm) en lijn uit met de hoofdluchtvaartmaatschappij.
OPMERKING: Het vacuüm helpt bij het verwijderen van chemicaliën rond de hoofdvoorbereiding na de stimulus, wat kan leiden tot EAG-reacties nadat de pulsen zijn aangebracht.
7. Opnames
- Schakel na het plaatsen van de uiteinden van de antennes de versterker en de ruisregelaar in. Observeer het basislijnsignaal en zorg ervoor dat het niet luidruchtig is.
OPMERKING: Observeer of er grote oscillaties in het elektrische signaal aanwezig zijn. Pas de positie van de kop en de antennepunten indien nodig aan totdat het signaal schoon is. Gebruik krokodillenklemmen om alles te aarden dat geluid introduceert in de kooi of luchttafel van Faraday. Een basislijnsignaal van minder dan 0,01 mV in amplitude is ideaal voor het detecteren en onderscheiden van minieme EAG-reacties. - Zodra het geluidsniveau bevredigend is, plaatst u de eerste geurspuit om te testen in het gat van de luchtvaartmaatschappij.
- Sluit de kooi van Faraday. Blijf niet voor het preparaat, om het geluid te verminderen.
- Klik op Opnemen op EAG-software.
- Lever de puls(en) af met behulp van de softwaretoepassing.
OPMERKING: Het aantal en de duur van de pulsen variëren afhankelijk van de experimenten. Hier zijn enkele 1 s. pulsen per geurstof gebruikt. Geurstoffen werden gescheiden door 45 s. - Let op de reactie van de muggenantennes in het labnotitieboek.
OPMERKING: Als de geurstof wordt gedetecteerd door de muggenantennes, wordt een duidelijke afbuiging in het signaal waargenomen (zie figuur 3A). - Ga verder met de volgende geur of concentratie. Vergeet niet om de presentatie van geurstoffen willekeurig te maken, tenzij een dosis-responscurve wordt uitgevoerd.
OPMERKING: Een negatieve controle en een positieve controle moeten worden gebruikt in de experimenten. Dit zal ervoor zorgen dat de waargenomen reacties inderdaad olfactorische reacties zijn en niet te wijten zijn aan mechanische of elektrische ruis. - Pas aan het einde van de opname een positieve controle toe om te controleren of de antennes nog steeds reageren.
OPMERKING: Gebruik 0,1% of 1% benzaldehyde omdat alle muggensoorten die tot nu toe zijn getest, reageren op deze verbinding. - Ga verder met de volgende muggenvoorbereiding.
8. Reiniging
- Schakel de versterker, de ruisregelaar, de luchtvaartmaatschappij en de computer uit.
- Breng de geurstoffen terug naar de vriezer.
- Verwijder het filterpapier van de glazen spuiten en reinig met 100% ethanol als er residu op de wanden zichtbaar is. Laat een nacht drogen op een reinigingsdoekje.
- Reinig de elektrodehouders met DI-water om eventuele sporen van zout te verwijderen. Droog door zachtjes aan te brengen tegen een stuk schoonmaakdoekje.
- Plaats muggenresten in de vriezer en gooi ze 24 uur later weg.
OPMERKING: Als u met geïnfecteerde muggen werkt, volg dan de veiligheidseisen in uw instelling.
9. Data-analyses
- Meet handmatig of automatisch de EAG-reacties.
OPMERKING: De EAG-amplitude (-mV) wordt hier gemeten. Gemiddeld als er meerdere pulsen zijn toegepast voor elke verbinding. Afhankelijk van de gebruikte software kunnen EAG's automatisch worden gedetecteerd en gemeten. Het is echter van essentieel belang om elke reactie afzonderlijk te inspecteren om de vorm van de respons te verifiëren en de mogelijke overdracht, vertraagde respons, enz. Te beoordelen. De ideale EAG-respons is afgestemd op de puls, vertoont een duidelijke afbuiging en is herhaalbaar tussen muggenpreparaten (figuur 3). - Presenteer de onbewerkte gegevens om minimale variabiliteit, een laag ruissignaal en duidelijke reacties weer te geven (figuur 3B).
OPMERKING: De gegevens kunnen ook worden genormaliseerd (bijv. Z-score). De negatieve controlewaarde (bijv. minerale olie) (d.w.z. de uitgangswaarde) kan van de respons worden afgetrokken en, zo niet, moet in de cijfers worden weergegeven. Er moet ook een positieve controle worden gepresenteerd. - Voer statistische analyses uit met behulp van statistische software28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Elektroantennografie is een krachtig hulpmiddel om te bepalen of een chemische stof of een mengsel van chemicaliën wordt gedetecteerd door een insectenantenne. Het kan ook worden gebruikt om de detectiedrempel voor een bepaalde chemische stof te bepalen met behulp van een geleidelijke toename van de concentratie (d.w.z. dosiscurverespons, figuur 4B). Bovendien is het nuttig om de effecten van afweermiddel op de reactie op gastheergerelateerde geuren te testen29.
Positieve en negatieve controles moeten altijd worden gebruikt in EAG's. Hier werd benzaldehyde gebruikt als positieve controle (figuur 3B, 3C, 4A). Deze verbinding blijkt een antennerespons uit te lokken bij alle muggensoorten die tot nu toe zijn getest24,25,29. Een negatieve controle moet ook worden gebruikt en kan bestaan uit het oplosmiddel dat wordt gebruikt voor het verdunnen van de chemicaliën (bijv. minerale of paraffineoliën, hexaan, enz.) en mag geen reactie uitlokken (figuur 3B, 3C, 4A).
Bij het uitvoeren van EAG's mag inderdaad geen doorbuiging worden opgemerkt bij het toepassen van de regeling (figuur 3B, 3C, 4A). Als een reactie wordt waargenomen, is de spuit, de oplosmiddelcontrole en/of de geurleiding waarschijnlijk verontreinigd. Als dit het geval is, moet een nieuwe oplossing worden bereid, de spuit worden gereinigd met 100% ethanol en gedroogd en/of de luchtvaartmaatschappij worden ontsmet door spoelen met 100% ethanol en gedroogd. Als het gekozen besturingselement een reactie oproept (bv. ethanol), moet de waarde verkregen in -mV voor de controle worden afgetrokken van de waarde die wordt verkregen voor ethanol en geteste chemische stof gecombineerd om het effect van de geteste chemische stof op de antennes te beoordelen.
Muggensoorten variëren in hun vermogen om te reageren op verschillende verbindingen en in de grootte van hun reactie. Toxorhynchitesmuggen produceren bijvoorbeeld zeer grote EAG's in vergelijking met Ae. aegypti, An. Stephensi en Cx. quinquefasciatus (figuur 3C, figuur 4A).
In EAG's leiden de tweede puls en de volgende meestal tot kleinere EAG-responsen. De presentatie van één geurstof kan ook de respons op het volgende beïnvloeden, dus het is belangrijk om de geurvolgorde en meerdere testen te randomiseren om een panel van geurstoffen efficiënt te testen (tenzij een dosis-responscurve wordt uitgevoerd). Bovendien zal het scheiden van pulsen (bijv. 5 s) en geurstoffen (bijv. 45 s) presentatie helpen om de EAG-responsen te optimaliseren.
De vluchtigheid van de geteste chemicaliën varieert en kan de olfactorische respons beïnvloeden en mogelijk leiden tot een vertraagde reactie als de geteste chemische stof een zeer lage vluchtigheid heeft. De chemische vluchtigheid en oplosbaarheid moeten bekend zijn voordat EAG's worden uitgevoerd om de test te optimaliseren. Het oplosmiddel dat wordt gebruikt om de verdunningen te bereiden, moet ook zorgvuldig worden geselecteerd (bijv. ethanol, hexaan, minerale of paraffineolie). Bovendien moeten concentraties verstandig worden gekozen en idealiter ecologisch relevant zijn. Een concentratie van 1% of 0,1% wordt vaak gebruikt, maar is relatief hoog en niet noodzakelijkerwijs representatief voor wat de insecten in de natuur kunnen ervaren. Toch is het nuttig om verbindingen met relatief hoge concentraties in sommige gevallen te screenen (bijvoorbeeld voor de ontwikkeling van aas). Insectenwerende middelen kunnen worden getest in hun commercieel beschikbare concentratie (DEET wordt bijvoorbeeld meestal verkocht in een concentratie van 40%).
In combinatie met gaschromatografie (d.w.z. GC-EAD's)25 kunnen de verbindingen die een respons uitlokken worden geïdentificeerd met een GC-MS en vervolgens afzonderlijk worden getest in verschillende concentraties of in mengsels met EAG's. Het is vermeldenswaard dat de valentie van de geteste chemicaliën niet kan worden bepaald met EAG's. Alleen een aanvullend gedragsexperiment (bijv. Olfactometer, voedingstest) kan beoordelen of de chemische stof die door de antennes wordt gedetecteerd aantrekkelijk, afstotend of neutraal is voor de mug. Ten slotte tonen EAG-experimenten alleen reacties van het perifere zenuwstelsel.
Figuur 1: Elektroantennogramopstelling bestaande uit: A) Microscoop: de gebruikte microscoop moet de experimentator in staat stellen om duidelijk het preparaat te zien zodat de uiteinden van de muggenantennes in de opname-elektroden kunnen worden ingebracht. B) Koud licht lamp: de lamp moet worden uitgeschakeld wanneer de opnames beginnen. C) Vacuümleiding: dit vermindert het risico op ophoping van de geurstoffen rond het muggenkoppreparaat, wat kan resulteren in antennereacties die worden losgekoppeld van de werkelijke stimulatie. D) Micromanipulatoren (x2): deze maken zeer fijne bewegingen van elektrodehouders mogelijk, die nodig zijn voor het inbrengen van de muggenantennes in het capillair van de opname-elektrode. E) Opname-elektrodehouder. F) Referentie-elektrodehouder. G) Head stage: beide elektroden worden aangesloten op de head stage die vervolgens wordt aangesloten op de versterker. H) Belangrijkste luchtvaartmaatschappij: een constante schone luchtstroom baadde de muggenkop. Het debiet wordt geregeld door een debietmeter. I) Spuit voor geurafgifte aangesloten op de magneetklep en de flowmeter; J) Luchttafel: de luchttafel vermindert het geluid. K) kooi van Faraday: De kooi van Faraday voorkomt elektrisch geluid. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Stap-voor-stap Aedes albopictus muggenkop voorbereiding voor EAG opnames. A) Vrouwelijke mug op zijn rug op een ijzige plaat om te controleren of beide antennes intact zijn. B) Laatste segment van de antenne-excisie met microschaar. C) Antennes worden gedompeld in elektrodegel. D) De antennes plakken aan elkaar nadat ze eruit zijn getrokken. Slechts één segment van elke antenne mag zich in de elektrodegel bevinden. E) Uitsnijding van de muggenkop. F) Kop gemonteerd op de referentie-elektrode. Het moet stabiel genoeg zijn om naar de EAG-rig te worden verplaatst. A'-F'. Dezelfde stappen als hierboven weergegeven voor mannelijke EAG's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Schema van de mug EAG en ruwe EAG sporen. A ) EAG-schema (links) en kenmerken van de EAG-respons (rechts). (Links) De muggenkop is gemonteerd tussen een referentie-elektrode en een opname-elektrode die is aangesloten op een versterker. De antennes baden in een constante luchtstroom waarin geurprikkels worden gepulseerd. Detectie van een chemische stof leidt tot een afbuiging (in mV) in het signaal. (rechts) De chemische detectie leidt tot celdepolarisatie (DPR) gevolgd door celrepolarisatie (RPR) tot terugkeer naar baseline. De geurpuls wordt weergegeven door de grijze rechthoek. De rode lijn geeft de amplitude van de EAG-respons aan. B) Screenshot van de WinEDR-software met een heel EAG-opnamespoor van een Culex quinquefasciatus vrouwelijke mug. Boven: ongefilterd (d.w.z. ruw) signaal. Midden: 1 s geurpulsen worden aangegeven met getallen. Onder: gefilterd (d.w.z. 1,5 Hz laagdoorlaat) signaal naar 3 geurstoffen en een controle (minerale olie). Let op de afbuigingen als reactie op 1% 1-hexanol (1), 1% benzaldehyde (2) en 1% boterzuur (3). Let op de afwezigheid van reactie op de negatieve controle, minerale olie (4). C ) Van links naar rechts: Representatieve EAG-responsen (in mV) tot 1% benzaldehyde (boven) en een minerale oliecontrole (onder) bij vrouwtjes Aedes aegypti, Anopheles stephensi, Culex quinquefasciatus en Toxorhynchites rutilus septentrionalis. De puls van één seconde wordt weergegeven door de gekleurde rechthoek boven het EAG-spoor. Let op de grote afbuiging als reactie op benzaldehyde en het gebrek aan reactie op de minerale olie. Let ook op de verschillende schaal in Toxorhynchites rutilus septentrionalis. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Voorbeeldweergave van EAG-resultaten en hun statistische analyses. A. Gemiddelde EAG-responsen van Culex quinquefasciatus (N = 8), Anopheles stephensi (N = 10), Aedes aegypti (N = 8) en Toxorhynchites rutilus septentrionalis (N = 7) vrouwtjes tot 1% 1-hexanol (groen), 1% boterzuur (oranje), 1% benzaldehyde (geel) en minerale olie (blauw). B. Culex quinquefasciatus vrouwtjes EAG dosis-responscurve voor 1-hexanol (links) (N = 9) en benzaldehyde (rechts) (N = 8). Staven vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde. Letters boven foutbalken geven statistische verschillen aan (Pairwise Wilcoxon rank sum test met een Bonferroni correctie). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Olfactorisch gemedieerd gedrag wordt beïnvloed door vele factoren, waaronder fysiologisch (bijv. Leeftijd, tijdstip van de dag) en omgeving (bijv. Temperatuur, relatieve vochtigheid)30. Bij het uitvoeren van EAG's is het dus essentieel om insecten te gebruiken die zich in dezelfde fysiologische status bevinden (d.w.z. monitoring op leeftijd, verhongering, paring)31 en om ook een warme en vochtige omgeving rond het preparaat te behouden om uitdroging te voorkomen. Een temperatuur rond de 25 °C is ideaal en 60% tot 80% luchtvochtigheid voor de belangrijkste luchtvaartmaatschappij. Dit kan eenvoudig worden bereikt door een bubbler op het hoofdcircuit van de luchtvaartmaatschappij te plaatsen.
Bovendien is het belangrijk om rekening te houden met de ecologie van elke soort om resultaten te verkrijgen die relevant zijn voor de biologie van het insect. Als u bijvoorbeeld een nachtelijke soort gebruikt, overweeg dan om hun lichtcyclus om te keren om hun reactie tijdens hun subjectieve nacht te testen. Het kiezen om EAG's uit te voeren op specifieke momenten van de dag (d.w.z. wanneer het insect actief is) is ook belangrijk. Als u bijvoorbeeld Ae. aegypti-muggen gebruikt, overweeg dan om de experimenten uit te voeren tijdens de pieken van activiteit van deze soort (d.w.z. vroeg op de dag en later in de middag). Nogmaals, de lichtcyclus kan gemakkelijk worden verschoven voor het gemak met behulp van klimaatkamers of lichtbakken met een omgekeerd lichtprogramma met behulp van een programmeerbare timer32. Eilerts et al.33 en Krishnan et al.34, hebben aangetoond dat de gevoeligheid voor specifieke geurstoffen varieert gedurende de dag. Een goede kennis van de ecologie en biologie van het insect garandeert dus nauwkeurigere resultaten.
Ruis (elektrisch of mechanisch) kan eenvoudig worden geïntroduceerd in EAG's. Mechanische verstoringen kunnen bijvoorbeeld worden veroorzaakt door een AC-systeem dat lucht naar een EAG-preparaat blaast. Elektrische ruis kan worden verminderd met de Humbug, maar kan, indien aanhoudend, worden opgespoord door elementen aan te sluiten en ze met behulp van krokodillenklemmen op de kooi van Faraday te aarden (figuur 3B). Dit geldt voor alle elementen die aanwezig zijn rond het preparaat (d.w.z. microscoop, lamp, micromanipulatoren). Sommige apparaten in de kooi van Faraday moeten worden losgekoppeld voordat ze worden opgenomen, omdat ze nog steeds elektrische ruis kunnen produceren (bijvoorbeeld een koude lichtbron) of buiten de kooi kunnen worden geplaatst. Een ander type "ruis" is van olfactorische aard. De experimentator moet het dragen van parfum vermijden of sterk geurende shampoo of wasmiddel gebruiken. Inderdaad, veel verbindingen die hierin worden aangetroffen, kunnen door muggen worden gedetecteerd (bijv. Linalool, citronellol, geraniol, eugenol) en kunnen de resultaten van de experimenten verstoren en beïnvloeden. Het dragen van een laboratoriumjas en handschoenen is ook essentieel om ongewenste besmetting van de luchtvaartmaatschappij, spuiten en elektroden te beperken.
Het gepresenteerde protocol heeft het voordeel dat het gemakkelijk toepasbaar is op alle muggensoorten, zowel bij mannetjes als bij vrouwen, terwijl de levensduur van het preparaat wordt verlengd (> 30 min) en met beperkte variabiliteit tussen preparaten. Deze methode leidt tot zeer minimale ruis in het EAG-signaal, waardoor chemicaliën in zeer lage concentraties kunnen worden getest. Zodra de dissectie- en montagestappen onder de knie zijn, kan deze techniek in relatief korte tijd betrouwbare gegevens en eenvoudige gegevensanalyses produceren.
Elektroantennografie stelt de experimentator alleen in staat om te beoordelen of de mug een chemische stof kan detecteren of niet. Om de valentie van deze chemische stof te bepalen, zijn aanvullende gedragstests, zoals olfactometer-assays, echter van cruciaal belang om te bepalen of een specifiek geurmiddel of mengsel aantrekkelijk, afstotend of neutraal is om efficiënte hulpmiddelen voor muggenbestrijding te ontwikkelen35.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteur heeft niets te onthullen.
Acknowledgments
Ik ben Dr. Clément Vinauger en Dr. Jeffrey Riffell dankbaar voor de nuttige discussies. De volgende reagentia werden verkregen via BEI Resources, NIAID, NIH: Anopheles stephensi, Strain STE2, MRA-128, bijgedragen door Mark Q. Benedict; Aedes aegypti, Strain ROCK, MRA-734, bijgedragen door David W. Severson; Culex quinquefasciatus, Stam JHB, Eieren, NR-43025. De auteur bedankt Dr. Jake Tu, Dr. Nisha Duggal, Dr. James Weger en Jeffrey Marano voor het verstrekken van Culex quinquefasciatus en Anopheles stephensi (stam: Liston) muggeneieren. Aedes albopictus en Toxorhynchites rutilus septentrionalis zijn afgeleid van veldmuggen verzameld door de auteur in het New River Valley-gebied (VA, VS). Dit werk werd ondersteund door de afdeling Biochemie en het Fralin Life Science Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air table Clean Bench | TMC | https://www.techmfg.com/products/labtables/cleanbench63series/accessoriess | Noise reducer |
| Analog-to-digital board | National Instruments | BNC-2090A | |
| Benchtop Flowbuddy Complete | Genesee Scientific | 59-122BC | To anesthesize mosquitoes |
| Borosillicate glass capillary | Sutter Instrument | B100-78-10 | To make the recording and references capillaries |
| Chemicals | Sigma Aldrich | Benzaldehyde: 418099-100 mL; Butyric acid: B103500-100mL; 1-Hexanol: 471402-100mL; Mineral oil: M8410-1L | Chemicals used for the experiments presented here |
| CO2 | Airgas or Praxair | N/A | To anesthesize mosquitoes |
| Cold Light Source | Volpi | NCL-150 | |
| Disposable syringes | BD | 1 mL (309628) / 3 mL (309657) | |
| Electrode cables | World Precision Instruments | 5371 | |
| Electrode gel salt free | Parkerlabs | 12-08-Spectra-360 | |
| Faraday cage | TMC | https://www.techmfg.com/products/electric-and-magnetic-field-cancellation/faradaycages | Noise reducer |
| Flowmeters | Bel-art | 65 mm (H40406-0010) / 150 mm (H40407-0075) | One of each |
| GCMS vials and caps | Thermo-fisher scientific | 2-SVWKA8-CPK | To prepare odorant dilutions |
| Glass syringes (Fortuna) | Sigma Aldrich | Z314307 | For odor delivery to the EAG prep |
| Humbug | Quest Scientific | http://www.quest-sci.com/ | Noise reducer |
| 2 mm Jack Holder, Narrow, 90 deg., With Wire | A-M Systems | 675748 | Electrode holder |
| Magnetic bases | Kanetec | MB-FX | x 2 |
| MATLAB + Toolboxes | Mathworks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | For delivering the pulses |
| Medical air | Airgas or Praxair | N/A | For main airline |
| Microscope | Nikkon | SMZ-800N | |
| Micromanipulators Three-Axis Coarse/Fine Compact Micromanipulator | Narishige | MHW-3 | x 2 |
| Microelectrode amplifier with headstage | A-M Systems | Model 1800 | |
| Mosquito rearing supplies | Bioquip | https://www.bioquip.com/Search/WebCatalog.asp | |
| Needles | BD | 25G (305127) / 21G (305165) | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-6A | For odor delivery to the EAG prep |
| PTFE Tubing of different diameters | Mc Master Carr | N/A | To connect solenoid valve, flowmeter, airline ect. |
| 30V/5A DC Power Supply | Dr. Meter | PS-305DM | |
| R version 3.5.1 | R project | https://www.r-project.org/ | For data analyses |
| Relay for solenoid valve | N/A | Custom made | |
| Silver wire 0.01” | A-M Systems | 782500 | |
| Solenoid valve (3-way) | The Lee Company | LHDA0533115H | |
| WinEDR software | Strathclyde Electrophysiology Software | WinEDR V3.9.1 | For EAG recording |
| Whatman paper | Cole Parmer | UX-06648-03 | To load chemical in glass syringe / Pasteur pipette |
References
- World Health Organization. World health statistics 2019: monitoring health for the SDGs, sustainable development goals. World Health Organization. , Geneva. (2019).
- Takken, W. The role of olfaction in host-seeking of mosquitoes: a review. International Journal of Tropical Insect Science. 12 (1-2-3), 287-295 (1991).
- Zwiebel, L. J., Takken, W.
- Potter, C. J. Stop the biting: targeting a mosquito's sense of smell. Cell. 156 (5), 878-881 (2014).
- Paluch, G., Bartholomay, L., Coats, J. Mosquito repellents: a review of chemical structure diversity and olfaction. Pest Management Science. 66 (9), 925-935 (2010).
- Schneider, D. Electrophysiological investigation on the antennal receptors of the silk moth during chemical and mechanical stimulation. Experientia. 13 (2), 89-91 (1957).
- Raguso, R. A., Light, D. M., Pickersky, E. Electroantennogram responses of Hyles lineata (Sphingidae: Lepidoptera) to volatile compounds from Clarkia breweri (Onagraceae) and other moth-pollinated flowers. Journal of Chemical Ecology. 22 (10), 1735-1766 (1996).
- Schweitzer, E. S., Sanes, J. R., Hildebrand, J. G. Ontogeny of electroantennogram responses in the moth, Manduca sexta. Journal of Insect Physiology. 22 (7), 955-960 (1976).
- Martel, V., Anderson, P., Hansson, B. S., Schlyter, F. Peripheral modulation of olfaction by physiological state in the Egyptian leaf worm Spodoptera littoralis (Lepidoptera: Noctuidae). Journal of Insect Physiology. 55 (9), 793-797 (2009).
- Spaethe, J., Brockmann, A., Halbig, C., Tautz, J. Size determines antennal sensitivity and behavioral threshold to odors in bumblebee workers. Naturwissenschaften. 94 (9), 733-739 (2007).
- Suchet, C., et al. Floral scent variation in two Antirrhinum majus subspecies influences the choice of naïve bumblebees. Behavioral Ecology and Sociobiology. 65 (5), 1015-1027 (2011).
- De Jong, R., Pham-Delègue, M. H. Electroantennogram responses related to olfactory conditioning in the honeybee (Apis mellifera ligustica). Journal of Insect Physiology. 37 (4), 319-324 (1991).
- Patte, F., Etcheto, M., Marfaing, P., Laffort, P. Electroantennogram stimulus-response curves for 59 odourants in the honeybee, Apis mellifica. Journal of Insect Physiology. 35 (9), 667-675 (1989).
- Alcorta, E. Characterization of the electroantennogram in Drosophila melanogaster and its use for identifying olfactory capture and transduction mutants. Journal of Neurophysiology. 65 (3), 702-714 (1991).
- Park, K. C., Ochieng, S. A., Zhu, J., Baker, T. C. Odor discrimination using insect electroantennogram responses from an insect antennal array. Chemical Senses. 27 (4), 343-352 (2002).
- Du, Y. J., Millar, J. G. Electroantennogram and oviposition bioassay responses of Culex quinquefasciatus and Culex tarsalis (Diptera: Culicidae) to chemicals in odors from Bermuda grass infusions. Journal of Medical Entomology. 36 (2), 158-166 (1999).
- Costantini, C., et al. Electroantennogram and behavioural responses of the malaria vector Anopheles gambiae to human-specific sweat components. Medical and Veterinary Entomology. 15 (3), 259-266 (2001).
- Collins, L. E., Blackwell, A. Electroantennogram studies of potential oviposition attractants for Toxorhynchites moctezuma and T. amboinensis mosquitoes. Physiological Entomology. 23 (3), 214-219 (1998).
- Seenivasagan, T., Sharma, K. R., Sekhar, K., Ganesan, K., Prakash, S., Vijayaraghavan, R. Electroantennogram, flight orientation, and oviposition responses of Aedes aegypti to the oviposition pheromone n-heneicosane. Parasitology Research. 104 (4), 827-833 (2009).
- Puri, S. N., Mendki, M. J., Sukumaran, D., Ganesan, K., Prakash, S., Sekhar, K. Electroantennogram and behavioral responses of Culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae) females to chemicals found in human skin emanations. Journal of Medical Entomology. 43 (2), 207-213 (2014).
- Cooperband, M. F., McElfresh, J. S., Millar, J. G., Carde, R. T. Attraction of female Culex quinquefasciatus Say (Diptera: Culicidae) to odors from chicken feces. Journal of Insect Physiology. 54 (7), 1184-1192 (2008).
- Dekker, T., Ignell, R., Ghebru, M., Glinwood, R., Hopkins, R. Identification of mosquito repellent odours from Ocimum forskolei. Parasites & Vectors. 4 (1), 183 (2011).
- Choo, Y. M., et al. Reverse chemical ecology approach for the identification of an oviposition attractant for Culex quinquefasciatus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), 714-719 (2018).
- Wolff, G. H., Lahondère, C., Vinauger, C., Riffell, J. A. Neuromodulation and differential learning across mosquito species. bioRxiv. , 755017 (2019).
- Lahondère, C., et al. The olfactory basis of orchid pollination by mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (1), 708-716 (2020).
- Beyenbach, K., Masia, R. Membrane conductances of principal cells in Malpighian tubules of Aedes aegypti. Journal of Insect Physiology. 48, 375-386 (2002).
- Oesterle, A. The Pipette Cookbook. , (2018).
- R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. (2018).
- Afify, A., Betz, J. F., Riabinina, O., Lahondère, C., Potter, C. J. Commonly used insect repellents hide human odors from Anopheles mosquitoes. Current Biology. 29 (21), 3669-3680 (2019).
- Martin, F., Riveron, J., Alcorta, E. Environmental temperature modulates olfactory reception in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 57 (12), 1631-1642 (2011).
- Qiu, Y. T., Gort, G., Torricelli, R., Takken, W., van Loon, J. J. Effects of blood-feeding on olfactory sensitivity of the malaria mosquito Anopheles gambiae: application of mixed linear models to account for repeated measurements. Journal of Insect Physiology. 59 (11), 1111-1118 (2013).
- Taylor, B., Jones, M. D. R. The circadian rhythm of flight activity in the mosquito Aedes aegypti (L.): the phase-setting effects of light-on and light off. Journal of Experimental Biology. 51 (1), 59-70 (1969).
- Eilerts, D. F., VanderGiessen, M., Bose, E. A., Broxton, K., Vinauger, C. Odor-specific daily rhythms in the olfactory sensitivity and behavior of Aedes aegypti mosquitoes. Insects. 9 (4), 147 (2018).
- Krishnan, B., Dryer, S. E., Hardin, P. E. Circadian rhythms in olfactory responses of Drosophila melanogaster. Nature. 400 (6742), 375-378 (1999).
- Pelletier, J., Guidolin, A., Syed, Z., Cornel, A. J., Leal, W. S. Knockdown of a mosquito odorant-binding protein involved in the sensitive detection of oviposition attractants. Journal of Chemical Ecology. 36 (3), 245-248 (2010).
