Summary
Il presente articolo descrive un protocollo passo-passo per elettroantennogrammi di successo e a basso rumore in diversi generi di zanzare, comprese sia femmine che maschi.
Abstract
Le zanzare femmine sono gli animali più letali sulla terra, rivendicando la vita di oltre 1 milione di persone ogni anno a causa di agenti patogeni che trasmettono quando acquisiscono un pasto di sangue. Per individuare un ospite di cui nutrirsi, le zanzare si affidano a una vasta gamma di segnali sensoriali, tra cui visivi, meccanici, termici e olfattivi. Lo studio descrive una tecnica, l'elettroantennography (EAG), che consente ai ricercatori di valutare se le zanzare possono rilevare singole sostanze chimiche e miscele di sostanze chimiche in modo dipendente dalla concentrazione. Se accoppiata con la gascromatografia (GC-EAG), questa tecnica consente di esporre le antenne a uno spazio di testa completo / miscela complessa e determina quali sostanze chimiche presenti nel campione di interesse, la zanzara può rilevare. Questo è applicabile agli odori del corpo ospite, nonché ai bouquet floreali delle piante o ad altri odori ecologicamente rilevanti (ad esempio, odori dei siti di ovideposizione). Qui, abbiamo descritto un protocollo che consente lunghe durate di tempo di risposta alla preparazione ed è applicabile sia alle zanzare femmine che ai maschi di più generi, tra cui le zanzare Aedes, Culex, Anopheles e Toxorhynchites . Poiché l'olfatto gioca un ruolo importante nelle interazioni zanzara-ospite e nella biologia delle zanzare in generale, EAG e GC-EAG possono rivelare composti di interesse per lo sviluppo di nuove strategie di controllo dei vettori di malattia (ad esempio, esche). Integrato con saggi comportamentali, è possibile determinare la valenza (ad esempio, attrattivo, repellente) di ciascuna sostanza chimica.
Introduction
Le zanzare sono gli organismi più letali sulla terra, reclamano la vita di oltre un milione di persone all'anno e mettono più della metà della popolazione mondiale a rischio di esposizione agli agenti patogeni che trasmettono, mentre mordono1. Questi insetti si basano su una vasta gamma di segnali (termici, visivi, meccanici, olfattivi, uditivi) per individuare un ospite di cui nutrirsi (sia vegetale che animale), per l'accoppiamento e l'ovideposizione, nonché per evitare i predatori sia allo stadio larvale che a quello adulto 2,3. Tra questi sensi, l'olfatto gioca un ruolo critico nei comportamenti sopra menzionati, in particolare per la rilevazione a medio-lungo raggio di molecole odoranti 2,3. Gli odori emessi da un ospite o da un sito di ovideposizione sono rilevati da vari recettori olfattivi specifici (ad esempio, GR, OR, IR) situati sulla proboscide dei palpi di zanzara, tarsi e antenne 2,3.
Poiché l'olfatto è una componente chiave dei loro comportamenti di ricerca dell'ospite (piante e animali), accoppiamento e ovideposizione, costituisce quindi un obiettivo ideale da studiare per sviluppare nuovi strumenti per il controllo delle zanzare4. La ricerca su repellenti (ad esempio, DEET, IR3535, picaridina) ed esche (ad esempio, BG sentinella human lesca) è estremamente prolifica5, ma a causa delle attuali sfide nel controllo delle zanzare (ad esempio, resistenza agli insetticidi, specie invasive), è essenziale sviluppare nuovi metodi di controllo efficienti informati dalla biologia delle zanzare.
Molte tecniche (ad esempio, olfattometro, saggi di atterraggio, elettrofisiologia) sono state utilizzate per valutare la bioattività di composti o miscele di composti nelle zanzare. Tra questi, l'elettroantennography (o elettroantennogrammi (EAG)) può essere utilizzata per determinare se gli odori vengono rilevati dalle antenne delle zanzare. Questa tecnica è stata inizialmente sviluppata da Schneider6 ed è stata utilizzata in molti generi di insetti diversi da allora, tra cui falene 7,8,9, bombi 10,11, api 12,13 e moscerini della frutta 14,15 per citarne alcuni. L'elettroantennography è stata anche impiegata utilizzando vari protocolli, tra cui antenne singole o multiple nelle zanzare 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25.
Le zanzare sono insetti relativamente piccoli e delicati con antenne piuttosto sottili. Mentre eseguire EAG su insetti più grandi come falene o bombi è relativamente facile a causa delle loro dimensioni maggiori e antenne più spesse, condurre EAG nelle zanzare può essere difficile. In particolare, il mantenimento di un buon rapporto segnale-rumore e una preparazione reattiva duratura sono due requisiti principali per la riproducibilità e l'affidabilità dei dati.
La guida passo-passo agli EAG a basso rumore qui proposta offre direttamente soluzioni a queste limitazioni e rende questo protocollo applicabile a diverse specie di zanzare di vari generi, tra cui Aedes, Anopheles, Culex e Toxorhynchites, e descrive la tecnica sia per le femmine che per i maschi. L'elettroantennography offre un modo rapido ma affidabile per esaminare e determinare composti bioattivi che possono quindi essere sfruttati nello sviluppo di esche dopo che la valenza è stata determinata con saggi comportamentali.
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Protocol
1. Preparazione della soluzione salina
- Preparare la soluzione salina in anticipo e conservare in frigorifero.
- Seguire Beyenbach e Masia26 per preparare la soluzione.
NOTA: Ricetta salina in mM: 150,0 NaCl, 25,0 HEPES, 5,0 glucosio, 3,4 KCl, 1,8 NaHCO3, 1,7 CaCl 2 e 1,0 MgCl2. Il pH è regolato a 7,1 con 1 M NaOH. Non aggiungere glucosio o saccarosio alla preparazione in questo momento per aumentare la conservazione a scaffale. Aggiungere la quantità necessaria alla soluzione salina subito prima di eseguire gli EAG (circa 50 ml per esperimento).
2. Preparazione e conservazione degli odori
- Preparare in anticipo le miscele di odoranti o le diluizioni di composti singoli in flaconcini ambrati da 1,5 mL e conservare a -20 °C per prevenire la degradazione del composto.
NOTA: Le concentrazioni dipenderanno dal test da condurre. 0,1% o 1% sono comunemente usati per determinare se un composto può essere rilevato o meno. Per una curva dose-risposta, preparare diluizioni seriali di una data sostanza chimica e testarle dalle concentrazioni più basse a quelle più alte. - Preparare le diluizioni in acqua, etanolo, esano, olio di paraffina o olio minerale, a seconda della solubilità della sostanza chimica testata.
- Assicurarsi di preparare un controllo del solvente (un flaconcino contenente solo il solvente) per l'esperimento.
- Rimuovere gli odori dal congelatore 30 minuti prima di iniziare gli esperimenti per consentire loro di scongelare. Vortice ogni flaconcino prima dell'uso per mescolare bene la sostanza chimica e il solvente.
- Pipettare 10 μL di soluzione su un pezzo di carta da filtro (0,5 cm x 2 cm) caricato all'interno di una siringa di vetro etichettata o di una pipetta Pasteur.
- Caricare ogni composto o miscela in una pipetta o siringa Pasteur specifica per evitare la contaminazione.
NOTA: caricare 10 minuti prima di iniziare l'esperimento in modo che l'odore possa diffondersi nella siringa ma non più a lungo per evitare la degradazione. Lasciare che la pipetta o la siringa Pasteur rimangano chiuse in questo momento per consentire una buona diffusione della sostanza chimica prima dell'inizio dell'esperimento. - Dopo ogni corsa EAG, smaltire il pezzo di carta da filtro e sostituirlo con uno nuovo per evitare che la carta si impregni eccessivamente e rischi il blocco dell'ago. Sostituire regolarmente gli aghi (ogni 10 esecuzioni).
3. Separazione delle zanzare
- Isolare le zanzare il giorno degli esperimenti.
- Utilizzare zanzare che hanno almeno 6 giorni il giorno degli esperimenti per aumentare le possibilità che le femmine si accoppiano per migliorare la loro risposta agli odori legati all'ospite.
NOTA: Regolare l'età delle zanzare al momento del test a seconda del progetto. Controllare e armonizzare lo stato fisiologico (ad esempio, nutriti con sangue, affamati, mai nutriti in precedenza, ecc.). - Far morire di fame le zanzare fino a 12 ore (cioè nessun accesso allo zucchero) per aumentare la loro motivazione e sensibilità.
- Mettere il contenitore delle zanzare in frigorifero (4 °C) fino a quando non smettono di volare in modo che le persone possano essere facilmente trasferite delicatamente in tazze singole con una pinza.
NOTA: Le specie con una maggiore tolleranza al freddo possono essere abbattute utilizzando una piattaforma per mosche CO2 . Assicurarsi che le zanzare non rimangano a lungo su di esso per evitare l'essiccazione, che ridurrebbe la reattività della preparazione EAG della zanzara. - Conservare le tazze contenenti singole zanzare a temperatura ambiente prima che vengano eseguiti gli EAG e scartare eventuali zanzare che non possono essere utilizzate durante il giorno.
4. Supporto dell'elettrodo e preparazione capillare
- Trazione capillare, preparazione e conservazione
- Utilizzare capillari borosilicati con filamenti (I.D: 0,78 mm, O.D: 1 mm). Tirarli a seconda dell'attrezzatura27.
NOTA: Conservare i capillari tirati in una capsula di Petri. Posizionare la capsula di Petri su pezzi di cera o argilla da modellare non profumata per evitare che si muovano e si rompano. - Prima di eseguire l'esperimento EAG, rompere delicatamente la punta di 2 capillari con un paio di pinze al microscopio.
NOTA: Assicurarsi che uno sia leggermente più grande dell'altro per adattarsi al collo (capillare più grande) o alle punte delle antenne (capillare più piccolo). Assicurarsi che il taglio sia pulito senza crepe presenti sulla parete capillare. Ciò richiede pazienza e pratica. - Se ancora intatti, riutilizzare questi capillari dopo il risciacquo con acqua deionizzata (DI) al termine dell'esperimento. Rimuovere l'acqua in eccesso applicando delicatamente una salvietta detergente contro la punta. Riporre in magazzino la capsula di Petri. Se la punta è storta, scartare il capillare.
- Utilizzare capillari borosilicati con filamenti (I.D: 0,78 mm, O.D: 1 mm). Tirarli a seconda dell'attrezzatura27.
- Supporto per elettrodi e montaggio capillare
- Etichettare i due portaelettrodi come "registrazione" e "riferimento" utilizzando pezzi di nastro da laboratorio di colori diversi. Ciò contribuirà a guidare il montaggio della testa della zanzara e degli elettrodi.
- Assicurarsi che i supporti degli elettrodi siano liberi all'interno e che non siano presenti detriti di borosilicato.
- Cloridizzazione: immergere i fili d'argento dei portaelettrodi in candeggina pura per circa 5 minuti. I fili passano dal grigio chiaro lucido al grigio scuro opaco.
- Allentare il tappo di gomma e riempire l'interno del capillare con una soluzione salina al 10% utilizzando un ago da 20 G.
- Riempire il capillare borosilicato con la soluzione salina usando una siringa. Assicurarsi che non siano presenti bolle né nel supporto dell'elettrodo né nel capillare tirato.
NOTA: Per ridurre le possibilità di avere bolle nel capillare, continuare a spingere la soluzione salina nel capillare mentre si estrae delicatamente l'ago e utilizzare i capillari con un filamento. È possibile caricare i capillari con una soluzione composta da gel elettrodo 1:3 e soluzione salina. Questo può aiutare a prevenire l'evaporazione della soluzione salina e può essere particolarmente utile quando si impara e si praticano gli EAG, poiché lo sperimentatore avrà bisogno di più tempo per completare i diversi passaggi. - Dopo l'immersione, sciacquare i fili d'argento con acqua DI e inserirli nei due capillari. Assicurarsi che la punta del filo sia inferiore a 1 mm dalla punta del capillare. Assicurarsi che il capillare passi l'anello di gomma all'interno del supporto dell'elettrodo senza rompersi. Stringere delicatamente il tappo di gomma. Verificare che non siano presenti bolle d'aria.
- Utilizzare il capillare con l'apertura più ampia sul supporto dell'elettrodo di riferimento (collo) e l'apertura più piccola sul supporto dell'elettrodo di registrazione (antenne).
- Lasciare i due supporti per elettrodi montati su una salvietta per la pulizia a umido per evitare che la punta si asciughi fino al momento di montare la testa.
5. Preparazione del carro EAG (Figura 1)
- Assicurarsi che la tabella dell'aria sia alzata, che non vi siano blocchi nella compagnia aerea. Assicurarsi che il serbatoio dell'aria medica sia ancora pieno per evitare di cambiarlo nel bel mezzo dell'esperimento. Assicurati che ci siano bolle nell'umidificatore.
- Sistema di erogazione dell'aria e degli impulsi
- Accendere il serbatoio del gas medicale.
- Controllare il livello dei due misuratori di portata.
NOTA: Il flussometro che controlla la corrente d'aria principale che bagna la preparazione durante l'intero esperimento dovrebbe essere a 140 ml / min e l'altro relativo all'impulso di odore dovrebbe leggere 15 ml / min.
- Se si esegue GC-EAD, accendere la macchina, i serbatoi di gas e creare / caricare il file / metodo.
- Accendere i computer, le applicazioni software, l'alimentatore della valvola e verificare la connessione Internet affinché l'applicazione software funzioni.
- Applicazione software: è possibile scrivere un breve script per fornire l'impulso.
- Software EAG: utilizzare qualsiasi software di elettrofisiologia.
- Implementare i parametri nel software (ad esempio, amplificatore, durata della registrazione, durata degli impulsi, ecc.).
- Erogare un impulso di controllo per verificare che la valvola che eroga gli impulsi sia funzionante.
- Impostare l'alimentazione a 5,2 V. Verificare i parametri dell'amplificatore.
NOTA: I parametri utilizzati per i dati qui presentati sono: filtro a bassa chiusura di 0,1 Hz; filtro di taglio elevato di 500 Hz; Guadagno di x100.
6. Preparazione e montaggio della testa di zanzara (Figura 2)
- Posizionare una piastra di alluminio sul ghiaccio e posizionare un pezzo di salvietta per la pulizia umida su di esso.
- Metti una piccola cucchiaiata di gel per elettrodi in un angolo.
- Metti una tazza di zanzara sul ghiaccio e lascia raffreddare la zanzara per un paio di minuti, o fino a quando non smette di volare.
NOTA: Alcune specie sono resistenti al freddo e potrebbero richiedere una rapida anestesia su una piattaforma di mosca CO2 per scendere. Meno la zanzara rimane accesa, meglio è. - Posiziona la zanzara sul retro e aggancia la punta di ogni antenna (solo una piccola parte dell'ultimo segmento) con micro forbici.
- Utilizzare una pinza per trascinare la zanzara vicino all'elettrodo gel dollop e immergere delicatamente la punta di ciascuna antenna nel gel. Evitare di immergere più dell'ultimo segmento nel gel dell'elettrodo.
- Usando una pinza, estrai le antenne delle zanzare mantenendoli uno accanto all'altro. Lasciateli uscire insieme dal gel. Assicurarsi che le antenne non tocchino la superficie della salvietta detergente, altrimenti potrebbero separarsi.
- Posiziona la zanzara su un lato e taglia la testa usando micro forbici o una lama di rasoio.
NOTA: Una volta tagliata la testa, procedere rapidamente ai passaggi successivi e al rig EAG per avviare le registrazioni. La preparazione dovrebbe rimanere reattiva per circa 30 minuti. - Prendere l'elettrodo di riferimento e immergere delicatamente la punta nel gel. Tenere in contatto con i tessuti del collo e lasciare che la testa si attacchi su di esso.
- Spostare i supporti dell'elettrodo sotto il microscopio EAG e visualizzare attraverso il microscopio per posizionare l'elettrodo di testa (cioè di riferimento) su un micromanipolatore. Assicurarsi che le antenne siano al centro.
- Afferrare l'elettrodo di registrazione, posizionarlo davanti alle punte delle antenne. Spostalo e allinealo il più vicino possibile alle punte usando il micromanipolatore. Utilizzando il microscopio, spostare la punta dell'elettrodo di registrazione verso le antenne.
- Collegare entrambi i supporti degli elettrodi all'amplificatore prima di inserire le punte per evitare che si muovano dopo l'inserimento.
- Inserire le punte delle antenne nell'elettrodo di registrazione. Assicurarsi che entrino in contatto con la soluzione salina e il gel dell'elettrodo e siano visibili dalla trasparenza attraverso il capillare. L'antenna entra per "effetto aspirazione".
- Regolare la posizione della testa e delle punte con una pinza al microscopio, se necessario.
- Posizionare il tubo della compagnia aerea vicino alla preparazione della testa di zanzara (distanza: 1 cm).
NOTA: Se la testa cade, tornare alla stazione di dissezione e rimontare la testa o prepararne una nuova se è stata persa o se sono trascorsi più di 5 minuti da quando la testa è stata tagliata. Una buona connessione tra il capillare e il collo / antenne è essenziale per un basso rumore e una registrazione affidabile. Idealmente, le punte delle antenne si troveranno a meno di 1 mm dal filo dell'elettrodo di registrazione una volta inserite. - Spegnere la sorgente luminosa, se utilizzata.
- Posizionare la linea di aspirazione vicino alla preparazione della testa di zanzara (distanza: 20 cm) e allinearsi con la linea aerea principale.
NOTA: Il vuoto aiuterà a rimuovere le sostanze chimiche che circondano la preparazione della testa dopo lo stimolo, il che potrebbe portare a risposte EAG dopo l'applicazione degli impulsi.
7. Registrazioni
- Dopo aver inserito le punte delle antenne, accendere l'amplificatore e il riduttore di rumore. Osservare il segnale di base e assicurarsi che non sia rumoroso.
NOTA: osservare se sono presenti grandi oscillazioni nel segnale elettrico. Regolare la posizione della testa e delle punte delle antenne secondo necessità fino a quando il segnale non è pulito. Usa clip a coccodrillo per mettere a terra tutto ciò che introduce rumore nella gabbia di Faraday o nella tavola d'aria. Un segnale di base inferiore a 0,01 mV di ampiezza è ideale per rilevare e discriminare le risposte EAG minute. - Una volta che il livello di rumore è soddisfacente, inserire la prima siringa per l'odore da testare nel foro dell'aria.
- Chiudi la gabbia di Faraday. Non stare davanti alla preparazione, per ridurre il rumore.
- Fare clic su Registra sul software EAG.
- Erogare gli impulsi utilizzando l'applicazione software.
NOTA: Il numero e la durata degli impulsi varieranno a seconda degli esperimenti. Qui sono stati utilizzati singoli impulsi da 1 s. per odorante. Gli odori erano separati da 45 s. - Notare la risposta delle antenne delle zanzare nel quaderno di laboratorio.
NOTA: Se l'odorante viene rilevato dalle antenne delle zanzare, si osserva una chiara deflessione del segnale (vedere Figura 3A). - Procedere con l'odore o la concentrazione successiva. Non dimenticare di randomizzare la presentazione degli odori a meno che non venga eseguita una curva dose-risposta.
NOTA: negli esperimenti devono essere utilizzati un controllo negativo e un controllo positivo. Ciò garantirà che le risposte osservate siano effettivamente risposte olfattive e non dovute a rumore meccanico o elettrico. - Al termine della registrazione, applicare un controllo positivo per verificare che le antenne siano ancora reattive.
NOTA: Utilizzare benzaldeide allo 0,1% o all'1% poiché tutte le specie di zanzare testate finora hanno risposto a questo composto. - Procedere con la prossima preparazione delle zanzare.
8. Pulizia
- Spegnere l'amplificatore, il riduttore di rumore, la compagnia aerea e il computer.
- Riportare gli odori nel congelatore.
- Rimuovere la carta da filtro dalle siringhe di vetro e pulire con etanolo al 100% se i residui sono visibili sulle pareti. Lasciare asciugare su una salvietta detergente per tutta la notte.
- Pulire i portaelettrodi con acqua DI per rimuovere ogni possibile traccia di sale. Asciugare applicando delicatamente contro un pezzo di salvietta detergente.
- Metti la zanzara nel congelatore e smaltisci 24 ore dopo.
NOTA: Se si lavora con zanzare infette, seguire i requisiti di sicurezza presso il proprio istituto.
9. Analisi dei dati
- Misurare manualmente o automaticamente le risposte EAG.
NOTA: qui viene misurata l'ampiezza EAG (-mV). Media se sono stati applicati più impulsi per ogni composto. A seconda del software utilizzato, gli EAG possono essere rilevati e misurati automaticamente. Tuttavia, è essenziale ispezionare ogni risposta individualmente per verificare la forma della risposta e valutare l'eventuale riporto, risposta ritardata, ecc. La risposta EAG ideale è allineata con l'impulso, mostra una chiara deflessione ed è ripetibile tra i preparati di zanzare (Figura 3). - Presentare i dati grezzi per mostrare una variabilità minima, un segnale a basso rumore e risposte chiare (Figura 3B).
NOTA: i dati possono anche essere normalizzati (ad esempio, Z-score). Il valore di controllo negativo (ad esempio, olio minerale) (cioè la linea di base) può essere sottratto dalla risposta e, in caso contrario, deve essere presentato nelle figure. Dovrebbe essere presentato anche un controllo positivo. - Eseguire analisi statistiche utilizzando qualsiasi software di statistica28.
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Representative Results
L'elettroantennography è un potente strumento per determinare se una sostanza chimica o una miscela di sostanze chimiche viene rilevata da un'antenna di insetti. Può anche essere utilizzato per determinare la soglia di rilevazione per una data sostanza chimica utilizzando un aumento graduale della concentrazione (cioè la risposta della curva di dose, Figura 4B). Inoltre, è utile testare gli effetti del repellente sulla risposta agli odori legati all'ospite29.
I controlli positivi e negativi dovrebbero sempre essere utilizzati negli EAG. Qui, la benzaldeide è stata utilizzata come controllo positivo (Figura 3B, 3C, 4A). Questo composto è stato trovato per suscitare una risposta antennale in tutte le specie di zanzare testate finora24,25,29. Deve essere utilizzato anche un controllo negativo che può consistere nel solvente utilizzato per diluire le sostanze chimiche (ad esempio, oli minerali o di paraffina, esano, ecc.) e non deve suscitare una risposta (Figura 3B, 3C, 4A).
Infatti, quando si eseguono EAG, non si dovrebbe notare una deflessione quando si applica il controllo (Figura 3B, 3C, 4A). Se si osserva una risposta, la siringa, il controllo del solvente e/o la linea dell'odore sono probabilmente contaminati. Se è il caso, deve essere preparata una nuova soluzione, la siringa pulita con etanolo al 100% e asciugata e / o la compagnia aerea decontaminata risciacquando con etanolo al 100% e asciugata. Se il controllo scelto suscita una risposta (ad esempio, etanolo), il valore ottenuto in -mV per il controllo deve essere sottratto dal valore ottenuto per l'etanolo e la sostanza chimica testata combinata per valutare l'impatto della sostanza chimica testata sulle antenne.
Le specie di zanzare variano nella loro capacità di rispondere a vari composti e nell'entità della loro risposta. Ad esempio, le zanzare Toxorhynchites producono EAG molto grandi rispetto a Ae. aegypti, An. Stephensi e Cx. quinquefasciatus (Figura 3C, Figura 4A).
Negli EAG, il secondo impulso e il successivo di solito portano a risposte EAG più piccole. La presentazione di un odorante può anche influenzare la risposta a quanto segue, quindi è importante randomizzare l'ordine degli odori e più saggi per testare in modo efficiente un pannello di odoranti (a meno che non venga eseguita una curva dose-risposta). Inoltre, separare gli impulsi (ad esempio, 5 s) e gli odori (ad esempio, 45 s) aiuterà a ottimizzare le risposte EAG.
La volatilità delle sostanze chimiche testate varia e può influenzare la risposta olfattiva e potenzialmente portare a una risposta ritardata se la sostanza chimica testata ha una volatilità molto bassa. La volatilità chimica e la solubilità dovrebbero essere note prima di condurre EAG per ottimizzare il test. Anche il solvente utilizzato per preparare le diluizioni deve essere accuratamente selezionato (ad esempio, etanolo, esano, minerale o olio di paraffina). Inoltre, le concentrazioni dovrebbero essere scelte con saggezza e dovrebbero idealmente essere ecologicamente rilevanti. Una concentrazione dell'1% o dello 0,1% è spesso utilizzata, ma è relativamente alta e non necessariamente rappresentativa di ciò che gli insetti possono sperimentare in natura. Tuttavia, è utile selezionare composti con concentrazioni relativamente elevate in alcuni casi (ad esempio, per lo sviluppo di esche). I repellenti possono essere testati alla loro concentrazione disponibile in commercio (ad esempio, il DEET è tipicamente venduto a una concentrazione del 40%).
Se accoppiati con gascromatografia (cioè GC-EADs)25, i composti che suscitano una risposta possono essere identificati con un GC-MS e quindi testati individualmente a varie concentrazioni o in miscele con EAG. Vale la pena ricordare che la valenza delle sostanze chimiche testate non può essere determinata con EAG. Solo un esperimento comportamentale complementare (ad esempio, olfattometro, saggio di alimentazione) può valutare se la sostanza chimica rilevata dalle antenne è attraente, repellente o neutra per la zanzara. Infine, gli esperimenti EAG mostrano solo risposte del sistema nervoso periferico.
Figura 1: Configurazione dell'elettroantennogramma comprendente: A) Microscopio: il microscopio utilizzato dovrebbe consentire allo sperimentatore di vedere chiaramente la preparazione per consentire l'inserimento delle punte delle antenne delle zanzare negli elettrodi di registrazione. B) Lampada a luce fredda: la lampada deve essere spenta quando iniziano le registrazioni. C) Linea sottovuoto: riduce il rischio di accumulo degli odori intorno alla preparazione della testa di zanzara, che potrebbe comportare risposte antennali disaccoppiate dalla stimolazione effettiva. D) Micromanipolatori (x2): consentono movimenti molto fini dei portaelettrodi, necessari per l'inserimento delle antenne antizanzare nel capillare dell'elettrodo di registrazione. E) Portaelettrodi di registrazione. F) Portaelettrodi di riferimento. G) Stadio di testa: entrambi gli elettrodi sono collegati allo stadio di testa che viene quindi collegato all'amplificatore. H) Compagnia aerea principale: un flusso d'aria pulito costante bagnava la testa della zanzara. La portata è regolata da un flussometro. I) Siringa per l'erogazione degli odori collegata all'elettrovalvola e al flussometro; J) Tavolo dell'aria: la tavola dell'aria ridurrà il rumore. K) Gabbia di Faraday: La gabbia di Faraday impedirà il rumore elettrico. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Preparazione passo-passo della testa di zanzara Aedes albopictus per le registrazioni EAG. A) Zanzara femmina sul dorso su una piastra ghiacciata per verificare che entrambe le antenne siano intatte. B) Ultimo segmento dell'escissione delle antenne con micro forbici. C) Le antenne sono immerse nel gel dell'elettrodo. D) Le antenne si attaccano insieme dopo averle estratte. Solo un segmento di ciascuna antenna dovrebbe essere nel gel dell'elettrodo. E) Escissione della testa di zanzara. F) Testa montata sull'elettrodo di riferimento. Dovrebbe essere abbastanza stabile da essere spostato sul carro EAG. A'-F'. Stessi passaggi presentati sopra per gli EAG maschili. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Schema dell'EAG della zanzara e delle tracce grezze di EAG. A ) Schema EAG (a sinistra) e caratteristiche della risposta EAG (a destra). (Sinistra) La testa della zanzara è montata tra un elettrodo di riferimento e un elettrodo di registrazione collegato a un amplificatore. Le antenne sono immerse in un flusso d'aria costante in cui vengono pulsati stimoli odoranti. Il rilevamento di una sostanza chimica porta a una deflessione (in mV) nel segnale. (destra) La rilevazione chimica porta alla depolarizzazione cellulare (DPR) seguita dalla ripolarizzazione cellulare (RPR) fino al ritorno al basale. L'impulso odorante è rappresentato dal rettangolo grigio. La linea rossa indica l'ampiezza della risposta EAG. B) Screenshot del software WinEDR che evidenzia un'intera traccia di registrazione EAG di una zanzara femmina di Culex quinquefasciatus . In alto: segnale non filtrato (cioè grezzo). Medio: gli impulsi di odore di 1 s sono indicati da numeri. In basso: segnale filtrato (cioè passa basso a 1,5 Hz) a 3 odori e un controllo (olio minerale). Si notino le deflessioni in risposta all'1% di 1-esanolo (1), all'1% di benzaldeide (2) e all'1% di acido butirrico (3). Si noti l'assenza di risposta al controllo negativo, olio minerale (4). C ) Da sinistra a destra: risposte EAG rappresentative (in mV) all'1% di benzaldeide (in alto) e un controllo dell'olio minerale (in basso) nelle femmine Aedes aegypti, Anopheles stephensi, Culex quinquefasciatus e Toxorhynchites rutilus septentrionalis. L'impulso di un secondo è rappresentato dal rettangolo colorato sopra la traccia EAG. Si noti la grande deflessione in risposta alla benzaldeide e la mancanza di risposta all'olio minerale. Inoltre, si noti la diversa scala in Toxorhynchites rutilus septentrionalis. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Esempio di rappresentazione dei risultati dell'EAG e delle loro analisi statistiche. Risposte EAG medie delle femmine Culex quinquefasciatus (N = 8), Anopheles stephensi (N = 10), Aedes aegypti (N = 8) e Toxorhynchites rutilus septentrionalis (N = 7) all'1% di 1-esanolo (verde), all'1% di acido butirrico (arancione), all'1% di benzaldeide (giallo) e di olio minerale (blu). B. Culex quinquefasciatus femmine EAG curva dose-risposta per 1-esanolo (a sinistra) (N = 9) e benzaldeide (a destra) (N = 8). Le barre rappresentano l'errore standard della media. Le lettere sopra le barre di errore indicano differenze statistiche (test della somma dei ranghi di Wilcoxon a coppie con correzione di Bonferroni). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
I comportamenti mediati dall'olfatto sono influenzati da molti fattori, tra cui fisiologici (ad esempio, età, ora del giorno) e ambientali (ad esempio, temperatura, umidità relativa)30. Pertanto, quando si eseguono EAG, è essenziale utilizzare insetti che si trovano nello stesso stato fisiologico (ad esempio, monitoraggio dell'età, fame, accoppiamento)31 e mantenere anche un ambiente caldo e umido intorno alla preparazione per evitare l'essiccazione. Una temperatura intorno ai 25 °C è ideale e dal 60% all'80% di umidità per la compagnia aerea principale. Questo può essere facilmente ottenuto posizionando un gorgogliatore sul circuito principale della compagnia aerea.
Inoltre, è importante considerare l'ecologia di ogni specie per ottenere risultati rilevanti per la biologia dell'insetto. Ad esempio, se si utilizza una specie notturna, considerare di invertire il loro ciclo di luce per testare la loro risposta durante la loro notte soggettiva. Anche la scelta di condurre EAG in momenti specifici della giornata (cioè quando l'insetto è attivo) è importante. Ad esempio, se si utilizzano zanzare Ae. aegypti, considerare di fare gli esperimenti durante i picchi di attività di questa specie (cioè nelle prime ore del giorno e nel tardo pomeriggio). Anche in questo caso, il ciclo di luce può essere facilmente spostato per comodità utilizzando camere climatiche o scatole luminose con un programma a luce inversa utilizzando un timer programmabile32. Eilerts et al.33 e Krishnan et al.34, hanno dimostrato che la sensibilità a specifici odori varia durante il giorno. Pertanto, una buona conoscenza dell'ecologia e della biologia dell'insetto garantirà risultati più accurati.
Il rumore (elettrico o meccanico) può essere facilmente introdotto negli EAG. Ad esempio, le perturbazioni meccaniche possono essere create da un sistema AC che soffia aria verso una preparazione EAG. Il rumore elettrico può essere ridotto con l'Humbug, ma, se persiste, può essere rintracciato collegando gli elementi e collegandoli alla gabbia di Faraday usando clip a coccodrillo (Figura 3B). Questo vale per tutti gli elementi presenti intorno alla preparazione (cioè microscopio, lampada, micromanipolatori). Alcune apparecchiature nella gabbia di Faraday devono essere scollegate prima della registrazione in quanto potrebbero ancora produrre rumore elettrico (ad esempio, fonte di luce fredda) o collocate all'esterno della gabbia. Un altro tipo di "rumore" è di natura olfattiva. Lo sperimentatore dovrebbe evitare di indossare profumi o usare shampoo o detergenti fortemente profumati. In effetti, molti composti trovati in questi possono essere rilevati dalle zanzare (ad esempio, linalolo, citronellolo, geraniolo, eugenolo) e possono interferire e influenzare i risultati degli esperimenti. Indossare un camice da laboratorio e guanti è anche essenziale per limitare la contaminazione indesiderata della compagnia aerea, delle siringhe e degli elettrodi.
Il protocollo presentato ha il vantaggio di essere facilmente applicabile a tutte le specie di zanzare, sia nei maschi che nelle femmine, estendendo la longevità del preparato (> 30 min) e con una variabilità limitata tra i preparati. Questo metodo porta a un rumore molto minimo nel segnale EAG, che consente di testare sostanze chimiche a concentrazioni molto basse. Una volta che le fasi di dissezione e montaggio sono state padroneggiate, questa tecnica può produrre dati affidabili in un lasso di tempo relativamente breve e analisi dei dati semplici.
L'elettroantennography consente solo allo sperimentatore di valutare se la zanzara può rilevare una sostanza chimica o meno. Tuttavia, per determinare la valenza di questa sostanza chimica, i saggi comportamentali complementari, come i saggi olfattometrici, sono fondamentali per determinare se un odorante o una miscela specifica è attraente, repellente o neutra al fine di sviluppare strumenti efficienti per il controllo delle zanzare35.
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Disclosures
L'autore non ha nulla da rivelare.
Acknowledgments
Sono grato al Dr. Clément Vinauger e al Dr. Jeffrey Riffell per le utili discussioni. I seguenti reagenti sono stati ottenuti tramite BEI Resources, NIAID, NIH: Anopheles stephensi, Ceppo STE2, MRA-128, contributo di Mark Q. Benedict; Aedes aegypti, Strain ROCK, MRA-734, contributo di David W. Severson; Culex quinquefasciatus, Ceppo JHB, Uova, NR-43025. L'autore ringrazia il Dr. Jake Tu, il Dr. Nisha Duggal, il Dr. James Weger e Jeffrey Marano per aver fornito uova di zanzara Culex quinquefasciatus e Anopheles stephensi (ceppo: Liston). Aedes albopictus e Toxorhynchites rutilus septentrionalis derivano da zanzare campestri raccolte dall'autore nell'area di New River Valley (VA, USA). Questo lavoro è stato sostenuto dal Dipartimento di Biochimica e dal Fralin Life Science Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air table Clean Bench | TMC | https://www.techmfg.com/products/labtables/cleanbench63series/accessoriess | Noise reducer |
| Analog-to-digital board | National Instruments | BNC-2090A | |
| Benchtop Flowbuddy Complete | Genesee Scientific | 59-122BC | To anesthesize mosquitoes |
| Borosillicate glass capillary | Sutter Instrument | B100-78-10 | To make the recording and references capillaries |
| Chemicals | Sigma Aldrich | Benzaldehyde: 418099-100 mL; Butyric acid: B103500-100mL; 1-Hexanol: 471402-100mL; Mineral oil: M8410-1L | Chemicals used for the experiments presented here |
| CO2 | Airgas or Praxair | N/A | To anesthesize mosquitoes |
| Cold Light Source | Volpi | NCL-150 | |
| Disposable syringes | BD | 1 mL (309628) / 3 mL (309657) | |
| Electrode cables | World Precision Instruments | 5371 | |
| Electrode gel salt free | Parkerlabs | 12-08-Spectra-360 | |
| Faraday cage | TMC | https://www.techmfg.com/products/electric-and-magnetic-field-cancellation/faradaycages | Noise reducer |
| Flowmeters | Bel-art | 65 mm (H40406-0010) / 150 mm (H40407-0075) | One of each |
| GCMS vials and caps | Thermo-fisher scientific | 2-SVWKA8-CPK | To prepare odorant dilutions |
| Glass syringes (Fortuna) | Sigma Aldrich | Z314307 | For odor delivery to the EAG prep |
| Humbug | Quest Scientific | http://www.quest-sci.com/ | Noise reducer |
| 2 mm Jack Holder, Narrow, 90 deg., With Wire | A-M Systems | 675748 | Electrode holder |
| Magnetic bases | Kanetec | MB-FX | x 2 |
| MATLAB + Toolboxes | Mathworks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | For delivering the pulses |
| Medical air | Airgas or Praxair | N/A | For main airline |
| Microscope | Nikkon | SMZ-800N | |
| Micromanipulators Three-Axis Coarse/Fine Compact Micromanipulator | Narishige | MHW-3 | x 2 |
| Microelectrode amplifier with headstage | A-M Systems | Model 1800 | |
| Mosquito rearing supplies | Bioquip | https://www.bioquip.com/Search/WebCatalog.asp | |
| Needles | BD | 25G (305127) / 21G (305165) | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-6A | For odor delivery to the EAG prep |
| PTFE Tubing of different diameters | Mc Master Carr | N/A | To connect solenoid valve, flowmeter, airline ect. |
| 30V/5A DC Power Supply | Dr. Meter | PS-305DM | |
| R version 3.5.1 | R project | https://www.r-project.org/ | For data analyses |
| Relay for solenoid valve | N/A | Custom made | |
| Silver wire 0.01” | A-M Systems | 782500 | |
| Solenoid valve (3-way) | The Lee Company | LHDA0533115H | |
| WinEDR software | Strathclyde Electrophysiology Software | WinEDR V3.9.1 | For EAG recording |
| Whatman paper | Cole Parmer | UX-06648-03 | To load chemical in glass syringe / Pasteur pipette |
References
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