Summary
Bu makale, hem dişiler hem de erkekler de dahil olmak üzere çeşitli sivrisinek cinslerinde başarılı ve düşük gürültülü elektroantennogramlar için adım adım bir protokolü detaylandırmaktadır.
Abstract
Dişi sivrisinekler dünyadaki en ölümcül hayvanlardır ve bir kan unu alırken ilettikleri patojenler nedeniyle her yıl 1 milyondan fazla insanın hayatını iddia etmektedir. Beslenecek bir konakçı bulmak için, sivrisinekler görsel, mekanik, termal ve koku alma dahil olmak üzere çok çeşitli duyusal ipuçlarına güvenirler. Çalışma, araştırmacıların sivrisineklerin bireysel kimyasalları ve kimyasalların karışımlarını konsantrasyona bağlı bir şekilde tespit edip edemeyeceğini değerlendirmelerini sağlayan bir teknik olan elektroantennografiyi (EAG) detaylandırıyor. Gaz kromatografisi (GC-EAG) ile birleştiğinde, bu teknik antenleri tam bir kafa boşluğu / karmaşık karışıma maruz bırakmaya izin verir ve ilgili numunede hangi kimyasalların bulunduğunu sivrisineklerin tespit edebileceğini belirler. Bu, konakçı vücut kokularının yanı sıra bitki çiçek buketleri veya diğer ekolojik olarak ilgili kokular (örneğin, yumurtlama bölgeleri koku vericileri) için de geçerlidir. Burada, uzun süreli hazırlık duyarlılığı süresine izin veren ve Aedes, Culex, Anopheles ve Toxorhynchites sivrisinekleri de dahil olmak üzere birden fazla cinsten hem dişi hem de erkek sivrisineklere uygulanabilir bir protokol tanımladık. Koku alma, sivrisinek-konakçı etkileşimlerinde ve genel olarak sivrisinek biyolojisinde önemli bir rol oynadığından, EAG'ler ve GC-EAG, yeni hastalık vektör kontrol stratejilerinin (örneğin, yemler) geliştirilmesi için ilgi çekici bileşikleri ortaya çıkarabilir. Davranışsal analizlerle tamamlandığında, her kimyasalın değeri (örneğin, çekici, kovucu) belirlenebilir.
Introduction
Sivrisinekler, dünyadaki en ölümcül organizmalardır, yılda bir milyondan fazla insanın hayatını iddia eder ve dünya nüfusunun yarısından fazlasını,1'i ısırırken, ilettikleri patojenlere maruz kalma riskine sokarlar. Bu böcekler, beslenecek bir konakçı (hem bitki hem de hayvan) bulmak, çiftleşmek ve yumurtlamak ve hem larva hem de yetişkin aşamalarında avcılardan kaçınmak için çok çeşitli ipuçlarına (yani termal, görsel, mekanik, koku alma, işitsel) güvenir 2,3. Bu duyular arasında, koku alma yukarıda belirtilen davranışlarda, özellikle koku verici moleküllerin orta ila uzun menzilli tespiti için kritik bir rol oynar 2,3. Bir konakçı veya bir yumurtlama bölgesi tarafından yayılan kokular, sivrisinek palps hortumu, tarsi ve anten2,3 üzerinde bulunan çeşitli spesifik koku alma reseptörleri (örneğin, GR'ler, OR'lar, IR'ler) tarafından tespit edilir.
Koku alma, konakçı arama (bitki ve hayvan), çiftleşme ve yumurtlama davranışlarının önemli bir bileşeni olduğundan, sivrisinek kontrolü için yeni araçlar geliştirmek üzere çalışmak için ideal bir hedef oluşturur4. Kovucular (örneğin, DEET, IR3535, picaridin) ve yemler (örneğin, BG sentinel insan cazibesi) üzerine yapılan araştırmalar son derece üretkendir5, ancak sivrisinek kontrolündeki mevcut zorluklar nedeniyle (örneğin, böcek ilacı direnci, istilacı türler), sivrisinek biyolojisi tarafından bilgilendirilen yeni etkili kontrol yöntemleri geliştirmek esastır.
Sivrisineklerdeki bileşiklerin veya bileşik karışımlarının biyoaktivitesini değerlendirmek için birçok teknik (örneğin, olfaktometre, iniş tahlilleri, elektrofizyoloji) kullanılmıştır. Bunlar arasında, koku vericilerin sivrisinek antenleri tarafından tespit edilip edilmediğini belirlemek için elektroantennografi (veya elektroantennogramlar (EAG'ler)) kullanılabilir. Bu teknik başlangıçta Schneider6 tarafından geliştirilmiştir ve o zamandan beri güveler 7,8,9, bombus arıları 10,11, bal arıları 12,13 ve meyve sinekleri14,15 dahil olmak üzere birçok farklı böcek cinsinde kullanılmıştır. Elektroantennografi ayrıca sivrisineklerde tek veya çoklu antenler de dahil olmak üzere çeşitli protokoller kullanılarak kullanılmıştır 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25.
Sivrisinekler oldukça ince antenli nispeten küçük ve hassas böceklerdir. EAG'leri güveler veya bombus arıları gibi daha büyük böcekler üzerinde gerçekleştirmek, daha büyük boyutları ve daha kalın antenleri nedeniyle nispeten kolay olsa da, sivrisineklerde EAG'lerin iletilmesi zor olabilir. Özellikle, iyi bir sinyal-gürültü oranının korunması ve kalıcı bir yanıt hazırlığı, verilerin tekrarlanabilirliği ve güvenilirliği için iki ana gereksinimdir.
Burada önerilen düşük gürültülü EAG'ler için adım adım kılavuz, doğrudan bu sınırlamalara çözümler sunar ve bu protokolü Aedes, Anopheles, Culex ve Toxorhynchites dahil olmak üzere çeşitli cinslerden çeşitli sivrisinek türlerine uygulanabilir hale getirir ve hem dişiler hem de erkekler için tekniği açıklar. Elektroantennografi, davranışsal testlerle değerlik belirlendikten sonra yem gelişiminde kullanılabilecek biyoaktif bileşikleri taramak ve belirlemek için hızlı ama güvenilir bir yol sunar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Tuzlu su çözeltisi hazırlama
- Tuzlu suyu önceden hazırlayın ve buzdolabında saklayın.
- Çözümü hazırlamak için Beyenbach ve Masia26'yı takip edin.
NOT: mM'de salin tarifi: 150.0 NaCl, 25.0 HEPES, 5.0 glikoz, 3.4 KCl, 1.8 NaHCO3, 1.7 CaCl2 ve 1.0 MgCl2. PH, 1 M NaOH ile 7,1'e ayarlanır. Raf depolamasını arttırmak için şu anda preparasyona glikoz veya sakkaroz eklemeyin. EAG'leri çalıştırmadan hemen önce gerekli miktarı tuzlu suya ekleyin (deneme başına yaklaşık 50 mL).
2. Koku hazırlama ve depolama
- Koku verici karışımları veya tek bileşik seyreltmeleri önceden 1,5 mL kehribar şişelerde hazırlayın ve bileşik bozulmasını önlemek için -20 ° C'de saklayın.
NOT: Konsantrasyonlar, yapılacak teste bağlı olacaktır. % 0.1 veya% 1, bir bileşiğin tespit edilip edilemeyeceğini belirlemek için yaygın olarak kullanılır. Bir doz-yanıt eğrisi için, belirli bir kimyasalın seri seyreltilerini hazırlayın ve bunları en düşükten en yüksek konsantrasyonlara kadar test edin. - Test edilen kimyasalın çözünürlüğüne bağlı olarak seyreltmeleri su, etanol, hekzan, parafin yağı veya mineral yağda hazırlayın.
- Deney için bir çözücü kontrolü (yalnızca çözücü içeren bir şişe) hazırladığınızdan emin olun.
- Çözülmelerine izin vermek için deneylere başlamadan 30 dakika önce koku vericileri dondurucudan çıkarın. Kimyasal ve çözücüyü iyice karıştırmak için kullanmadan önce her şişeyi vorteks.
- Etiketli bir cam şırınga veya Pasteur pipet içine yüklenmiş bir filtre kağıdı parçasına (0,5 cm x 2 cm) 10 μL çözelti pipet.
- Kontaminasyonu önlemek için her bileşiği veya karışımı belirli bir Pasteur pipetine veya şırıngaya yükleyin.
NOT: Deneye başlamadan 10 dakika önce yükleyin, böylece koku şırıngada yayılabilir, ancak bozulmayı önlemek için daha uzun süre yayılamaz. Deney başlamadan önce kimyasalın iyi bir şekilde difüzyonuna izin vermek için Pasteur pipetinin veya şırınganın şu anda kapaklı kalmasına izin verin. - Her EAG çalışmasından sonra, filtre kağıdının parçasını atın ve kağıdın aşırı ıslanmasını ve iğne tıkanması riskini önlemek için yenisiyle değiştirin. İğneleri düzenli olarak değiştirin (her 10 seferde bir).
3. Sivrisinek ayırma
- Deneylerin yapıldığı gün sivrisinekleri izole edin.
- Konakçıyla ilgili koku vericilere tepkilerini arttırmak için dişilerin çiftleşme şansını artırmak için deneylerin yapıldığı gün en az 6 günlük sivrisinekler kullanın.
NOT: Projeye bağlı olarak test sırasında sivrisinek yaşını ayarlayın. Fizyolojik durumu kontrol edin ve uyumlu hale getirin (örneğin, kanla beslenen, açlıktan ölen, daha önce hiç beslenmemiş vb.). - Motivasyonlarını ve hassasiyetlerini artırmak için sivrisinekleri 12 saate kadar aç bırakın (yani, şekere erişim yok).
- Sivrisinek kabını uçmayı bırakana kadar buzdolabına (4 ° C) yerleştirin, böylece bireyler forsepsli tek bardaklara kolayca hassas bir şekilde aktarılabilir.
NOT: Soğuğa karşı toleransı daha yüksek olan türler CO2 sinek pedi kullanılarak azaltılabilir. Sivrisineklerin kurumayı önlemek için uzun süre üzerinde kalmamalarını sağlayın, bu da sivrisinek EAG preparatının tepkisini azaltacaktır. - EAG'ler yapılmadan önce tek sivrisinek içeren bardakları oda sıcaklığında saklayın ve gün boyunca kullanılamayacak sivrisinekleri atın.
4. Elektrot tutucu ve kılcal preparat
- Kılcal çekme, hazırlama ve depolama
- Filamentli borosilikat kılcal damarları kullanın (I.D: 0.78 mm, O.D: 1 mm). Ekipmana bağlı olarak bunları çekin27.
NOT: Çekilen kılcal damarları bir Petri kabında saklayın. Petri kabını, hareket etmelerini ve kırılmalarını önlemek için balmumu parçalarına veya kokusuz modelleme kiline yerleştirin. - EAG deneyini çalıştırmadan önce, mikroskop altında bir çift forseps ile 2 kılcal damarın ucunu yavaşça kırın.
NOT: Birinin boynuna (daha büyük kılcal damar) veya anten uçlarına (daha küçük kılcal damar) sığması için diğerinden biraz daha büyük olduğundan emin olun. Kılcal duvarda çatlak olmadan kesimin temiz olduğundan emin olun. Bu sabır ve pratik gerektirir. - Hala sağlamsa, deney bittikten sonra deiyonize (DI) su ile duruladıktan sonra bu kılcal damarları tekrar kullanın. Uca nazikçe bir temizleme mendili uygulayarak fazla suyu çıkarın. Petri kabını tekrar depoya koyun. Uç eğriyse, kılcal damarı atın.
- Filamentli borosilikat kılcal damarları kullanın (I.D: 0.78 mm, O.D: 1 mm). Ekipmana bağlı olarak bunları çekin27.
- Elektrot tutucu ve kılcal montaj
- Farklı renklerde laboratuvar bandı parçaları kullanarak iki elektrot tutucuyu "kayıt" ve "referans" olarak etiketleyin. Bu, sivrisinek kafasının ve elektrotların montajına rehberlik etmeye yardımcı olacaktır.
- Elektrot tutucuların içinin temiz olduğundan ve borosilikat kalıntılarının bulunmadığından emin olun.
- Kloridizasyon: Elektrot tutucuların gümüş tellerini yaklaşık 5 dakika boyunca saf ağartıcıya batırın. Teller parlak açık griden mat koyu griye döner.
- Kauçuk tıpayı gevşetin ve kılcal damarın içini 20 G'lik bir iğne kullanarak% 10 tuzlu su çözeltisi ile doldurun.
- Borosilikat kılcal damarını bir şırınga kullanarak tuzlu su çözeltisi ile doldurun. Ne elektrot tutucusunda ne de çekilen kılcal damarda kabarcık bulunmadığından emin olun.
NOT: Kılcal damarda kabarcıklar oluşma olasılığını azaltmak için, iğneyi yavaşça dışarı çekerken kılcal damardaki salini itmeye devam edin ve kılcal damarları bir filamentle kullanın. Kılcal damarları 1:3 elektrot jeli ve tuzlu su çözeltisinden oluşan bir çözelti ile yüklemek mümkündür. Bu, salinin buharlaşmasını önlemeye yardımcı olabilir ve deneycinin farklı adımları tamamlamak için daha fazla zamana ihtiyacı olacağından, EAG'leri öğrenirken ve uygularken özellikle yararlı olabilir. - Islattıktan sonra, gümüş telleri DI suyla durulayın ve iki kılcal damara yerleştirin. Telin ucunun kılcal damarın ucundan 1 mm'den az olduğundan emin olun. Kılcal damarın elektrot tutucunun içindeki kauçuk halkayı kırılmadan geçirdiğinden emin olun. Kauçuk tıpayı yavaşça sıkın. Hava kabarcığı bulunmadığından emin olun.
- Kılcal damarı, referans elektrodu tutucusundaki (boyun) daha geniş açıklıkla ve kayıt elektrodu tutucusundaki (antenler) daha küçük açıklıkla kullanın.
- Kafayı monte etmeye hazır olana kadar ucun kurumasını önlemek için monte edilmiş iki elektrot tutucuyu ıslak temizleme mendili üzerinde bırakın.
5. EAG teçhizat hazırlığı (Şekil 1)
- Hava tablasının yukarıda olduğundan, havayolunda tıkanıklık olmadığından emin olun. Deneyin ortasında değiştirmekten kaçınmak için tıbbi hava deposunun hala dolu olduğundan emin olun. Nemlendiricide kabarcıklar olduğundan emin olun.
- Hava ve darbe dağıtım sistemi
- Tıbbi hava gazı tankını açın.
- İki debimetrenin seviyesini kontrol edin.
NOT: Tüm deney boyunca preparatı yıkayan ana hava akımını kontrol eden debimetre 140 mL / dak'da olmalı ve koku darbesi ile ilgili diğeri 15 mL / dak okumalıdır.
- GC-EAD yapıyorsanız, makineyi, gaz tanklarını açın ve dosyayı / yöntemi oluşturun / yükleyin.
- Yazılım uygulamasının çalışması için bilgisayarları, yazılım uygulamalarını, valf güç kaynağını açın ve internet bağlantısını doğrulayın.
- Yazılım uygulaması: Nabzı iletmek için kısa bir komut dosyası yazılabilir.
- EAG yazılımı: Herhangi bir elektrofizyoloji yazılımı kullanın.
- Yazılımdaki parametreleri uygulayın (örneğin, amplifikatör, kayıt süresi, darbelerin süresi, vb.).
- Darbeleri ileten valfin işlevsel olduğunu doğrulamak için bir kontrol darbesi iletin.
- Güç kaynağını 5,2 V'a ayarlayın. amplifikatör parametrelerini doğrulayın.
NOT: Burada sunulan veriler için kullanılan parametreler şunlardır: 0,1 Hz'lik düşük kesme filtresi; 500 Hz'lik yüksek kesme filtresi; x100 kazancı.
6. Sivrisinek kafası hazırlama ve montajı (Şekil 2)
- Buzun üzerine alüminyum bir plaka yerleştirin ve üzerine bir parça ıslak temizleme mendili yerleştirin.
- Bir köşeye küçük bir elektrot jeli koyun.
- Buzun üzerine bir sivrisinek kabı yerleştirin ve sivrisineğin birkaç dakika soğumasını sağlayın veya uçmayı bırakana kadar.
NOT: Bazı türler soğuğa dayanıklıdır ve aşağı inmek için CO2 sinek pedi üzerinde hızlı bir anestezi gerektirebilir. Sivrisinek ne kadar az kalırsa, o kadar iyidir. - Sivrisineği sırtına yerleştirin ve her antenin ucunu (son segmentin sadece küçük bir kısmını) mikro makasla klipsleyin.
- Elektrot jeli dollopunun yanındaki sivrisineği sürüklemek için forseps kullanın ve her antenin ucunu yavaşça jelin içine batırın. Elektrot jelindeki son segmentten daha fazlasını daldırmaktan kaçının.
- Forseps kullanarak, sivrisinek antenlerini yan yana tutarken dışarı çekin. Jelden birlikte çıkmalarına izin verin. Antenlerin temizleme mendilinin yüzeyine temas etmediğinden emin olun, aksi takdirde ayrılabilirler.
- Sivrisineği yanına yerleştirin ve mikro makas veya tıraş bıçağı kullanarak kafayı doğrayın.
NOT: Kafa doğrandıktan sonra, kayıtları başlatmak için bir sonraki adımlara ve EAG donanımına hızlıca ilerleyin. Hazırlık yaklaşık 30 dakika boyunca duyarlı kalmalıdır. - Referans elektrodunu alın ve ucu jelin içine hafifçe derinleştirin. Boyun dokularıyla temas halinde kalın ve başın üzerine yapışmasına izin verin.
- Elektrot tutucularını EAG mikroskobu altında hareket ettirin ve kafa (yani referans) elektrodunu bir mikromanipülatöre yerleştirmek için mikroskoptan görüntüleyin. Antenlerin merkezde olduğundan emin olun.
- Kayıt elektrotunu alın, anten uçlarının önüne yerleştirin. Mikromanipülatörü kullanarak uçlara mümkün olduğunca yakın hareket ettirin ve hizalayın. Mikroskobu kullanarak, kayıt elektrodunun ucunu antenlere doğru hareket ettirin.
- Yerleştirildikten sonra hareket etmelerini önlemek için uçları takmadan önce her iki elektrot tutucuyu amplifikatöre bağlayın.
- Anten uçlarını kayıt elektroduna yerleştirin. Sadece salin ve elektrot jeli ile temas ettiklerinden ve kılcal damardan şeffaflıkla görülebildiklerinden emin olun. Anten "emme etkisi" ile içeri girer.
- Gerekirse başın ve uçların konumunu mikroskop altında forseps ile ayarlayın.
- Havayolu borusunu sivrisinek kafası preparasyonuna yakın bir yere yerleştirin (mesafe: 1 cm).
NOT: Kafa düşerse, diseksiyon istasyonuna geri dönün ve kafayı yeniden monte edin veya kaybolmuşsa veya başın kesilmesinden bu yana 5 dakikadan fazla zaman geçtiyse yenisini hazırlayın. Düşük gürültü ve güvenilir kayıt için kılcal damar ve boyun/anten arasında iyi bir bağlantı şarttır. İdeal olarak, anten uçları yerleştirildikten sonra kayıt elektrodunun telinden 1 mm'den daha az olacaktır. - Kullanılıyorsa ışık kaynağını kapatın.
- Vakum hattını sivrisinek kafası preparasyonunun yanına yerleştirin (mesafe: 20 cm) ve ana havayolu ile hizalayın.
NOT: Vakum, uyarandan sonra kafa hazırlığını çevreleyen kimyasalların uzaklaştırılmasına yardımcı olacaktır, bu da darbeler uygulandıktan sonra EAG tepkilerine yol açabilir.
7. Kayıtlar
- Anten uçlarının yerleştirilmesinden sonra, amplifikatörü ve gürültü azaltıcıyı açın. Taban çizgisi sinyalini gözlemleyin ve gürültülü olmadığından emin olun.
NOT: Elektrik sinyalinde büyük salınımların olup olmadığını gözlemleyin. Sinyal temiz olana kadar kafa ve anten uçlarının konumunu gerektiği gibi ayarlayın. Faraday kafesine veya hava tablasına gürültü getiren her şeyi topraklamak için timsah klipsleri kullanın. Genlikte 0,01 mV'den daha düşük bir taban çizgisi sinyali, dakika EAG yanıtlarını algılamak ve ayırt etmek için idealdir. - Gürültü seviyesi tatmin edici olduğunda, havayolu deliğinde test etmek için ilk koku şırıngasını yerleştirin.
- Faraday kafesini kapatın. Gürültüyü azaltmak için preparatın önünde durmayın.
- EAG yazılımında Kaydet'e tıklayın.
- Yazılım uygulamasını kullanarak nabız (lar) ı iletin.
NOT: Darbelerin sayısı ve süresi deneylere bağlı olarak değişecektir. Burada, koku verici başına tek 1 s. bakliyat kullanılmıştır. Koku vericiler 45 s ile ayrıldı. - Laboratuvar not defterindeki sivrisinek antenlerinin tepkisine dikkat edin.
NOT: Koku verici sivrisinek antenleri tarafından algılanırsa, sinyalde net bir sapma gözlenir (bkz. Şekil 3A). - Bir sonraki koku veya konsantrasyonla devam edin. Bir doz-yanıt eğrisi yapılmadıkça koku vericilerin sunumunu rastgele hale getirmeyi unutmayın.
NOT: Deneylerde negatif kontrol ve pozitif kontrol kullanılmalıdır. Bu, gözlemlenen tepkilerin gerçekten koku alma tepkileri olmasını ve mekanik veya elektrik gürültüsünden kaynaklanmamasını sağlayacaktır. - Kaydın sonunda, antenlerin hala yanıt verdiğini doğrulamak için pozitif bir kontrol uygulayın.
NOT: Şimdiye kadar test edilen tüm sivrisinek türleri bu bileşiğe yanıt verdiğinden% 0.1 veya% 1 benzaldehit kullanın. - Bir sonraki sivrisinek hazırlığı ile devam edin.
8. Temizlik
- Amplifikatörü, gürültü azaltıcıyı, havayolu şirketini ve bilgisayarı kapatın.
- Koku vericileri dondurucuya geri koyun.
- Filtre kağıtlarını cam şırıngalardan çıkarın ve duvarlarda kalıntı varsa% 100 etanol ile temizleyin. Gece boyunca temizlik mendiliyle kurumaya bırakın.
- Olası tuz izlerini gidermek için elektrot tutucuları DI suyuyla temizleyin. Bir parça temizleme mendiline nazikçe uygulayarak kurulayın.
- Sivrisinek kalıntılarını dondurucuya koyun ve 24 saat sonra atın.
NOT: Enfekte sivrisineklerle çalışıyorsanız, kurumunuzdaki güvenlik gereksinimlerine uyun.
9. Veri analizleri
- EAG yanıtlarını manuel veya otomatik olarak ölçün.
NOT: EAG genliği (-mV) burada ölçülür. Her bileşik için birden fazla darbe uygulanmışsa ortalama. Kullanılan yazılıma bağlı olarak, EAG'ler otomatik olarak algılanabilir ve ölçülebilir. Bununla birlikte, yanıtın şeklini doğrulamak ve olası taşıma, gecikmeli yanıt vb. Değerlendirmek için her yanıtı ayrı ayrı incelemek önemlidir. İdeal EAG yanıtı nabız ile hizalanır, net bir sapma gösterir ve sivrisinek preparatları arasında tekrarlanabilir (Şekil 3). - Ham verileri minimum değişkenlik, düşük gürültü sinyali ve net yanıtlar gösterecek şekilde sunun (Şekil 3B).
NOT: Veriler normalleştirilebilir (örneğin, Z-skoru). Negatif kontrol değeri (örneğin, mineral yağ) (yani, taban çizgisi) yanıttan çıkarılabilir ve değilse, şekillerde sunulmalıdır. Pozitif bir kontrol de sunulmalıdır. - Herhangi bir istatistik yazılımını kullanarak istatistiksel analiz yapmak28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Elektroantennografi, bir kimyasal veya kimyasal karışımın bir böcek anteni tarafından tespit edilip edilmediğini belirlemek için güçlü bir araçtır. Ayrıca, kademeli bir konsantrasyon artışı kullanarak belirli bir kimyasalın tespit eşiğini belirlemek için de kullanılabilir (yani, doz eğrisi yanıtı, Şekil 4B). Ayrıca, kovucunun konakçı ile ilgili kokulara verilen yanıt üzerindeki etkilerini test etmek yararlıdır29.
EAG'lerde pozitif ve negatif kontroller her zaman kullanılmalıdır. Burada pozitif kontrol olarak benzaldehit kullanılmıştır (Şekil 3B, 3C, 4A). Bu bileşiğin, şimdiye kadar test edilen tüm sivrisinek türlerinde anten tepkisi ortaya çıkardığı bulunmuştur24,25,29. Negatif bir kontrol de kullanılmalı ve kimyasalların seyreltilmesinde kullanılan çözücüden (örneğin, mineral veya parafin yağları, hekzan, vb.) oluşmalı ve bir yanıt ortaya çıkarmamalıdır (Şekil 3B, 3C, 4A).
Gerçekten de, EAG'leri yürütürken, kontrolü uygularken bir sapmaya dikkat edilmemelidir (Şekil 3B, 3C, 4A). Bir yanıt gözlenirse, şırınga, çözücü kontrolü ve / veya koku hattı muhtemelen kirlenmiştir. Bu durumda, yeni bir çözelti hazırlanmalı, şırınga% 100 etanol ile temizlenmeli ve kurutulmalı ve / veya havayolu% 100 etanol ile durulanarak dekontamine edilmeli ve kurutulmalıdır. Seçilen kontrol bir yanıt (örneğin, etanol) ortaya çıkarırsa, kontrol için -mV cinsinden elde edilen değer, etanol için elde edilen değerden çıkarılmalı ve test edilen kimyasalın antenler üzerindeki etkisini değerlendirmek için test edilen kimyasal birleştirilmelidir.
Sivrisinek türleri, çeşitli bileşiklere cevap verme yeteneklerinde ve tepkilerinin büyüklüğünde farklılık gösterir. Örneğin, Toxorhynchites sivrisinekleri, Ae. aegypti, An. Stephensi ve Cx. quinquefasciatus ile karşılaştırıldığında çok büyük EAG'ler üretir (Şekil 3C, Şekil 4A).
EAG'lerde, ikinci nabız ve aşağıdakiler genellikle daha küçük EAG yanıtlarına yol açar. Bir koku vericinin sunumu da aşağıdakilere verilen cevabı etkileyebilir, bu nedenle bir koku verici panelini verimli bir şekilde test etmek için koku verici sırasını ve çoklu tahlilleri randomize etmek önemlidir (bir doz-yanıt eğrisi yapılmadığı sürece). Ayrıca, darbeleri (örneğin, 5 s) ve koku verici maddeleri (örneğin, 45 s) ayırma sunumu, EAG yanıtlarını optimize etmeye yardımcı olacaktır.
Test edilen kimyasalların uçuculuğu değişir ve koku alma tepkisini etkileyebilir ve test edilen kimyasalın çok düşük uçuculuğa sahip olması durumunda potansiyel olarak gecikmiş bir tepkiye yol açabilir. Testi optimize etmek için EAG'leri yapmadan önce kimyasal uçuculuk ve çözünürlük bilinmelidir. Seyreltmeleri hazırlamak için kullanılan çözücü de dikkatlice seçilmelidir (örneğin, etanol, hekzan, mineral veya parafin yağı). Ayrıca, konsantrasyonlar akıllıca seçilmeli ve ideal olarak ekolojik olarak alakalı olmalıdır. % 1 veya% 0.1'lik bir konsantrasyon sıklıkla kullanılır, ancak nispeten yüksektir ve böceklerin doğada neler yaşayabileceğini temsil etmek zorunda değildir. Bununla birlikte, bazı durumlarda nispeten yüksek konsantrasyonlara sahip bileşikleri taramak yararlıdır (örneğin, yem gelişimi için). Kovucular ticari olarak temin edilebilen konsantrasyonlarında test edilebilir (örneğin, DEET tipik olarak% 40'lık bir konsantrasyonda satılır).
Gaz kromatografisi (yani, GC-EAD'ler)25 ile birleştirilirse, bir yanıt ortaya çıkaran bileşikler bir GC-MS ile tanımlanabilir ve daha sonra çeşitli konsantrasyonlarda veya EAG'lerle karışımlarda ayrı ayrı test edilebilir. Test edilen kimyasalların değerinin EAG'lerle belirlenemediğini belirtmekte fayda var. Sadece tamamlayıcı bir davranışsal deney (örneğin, olfaktometre, beslenme testi), antenler tarafından tespit edilen kimyasalın sivrisinek için çekici, itici veya nötr olup olmadığını değerlendirebilir. Son olarak, EAG deneyleri sadece periferik sinir sisteminin tepkilerini göstermektedir.
Şekil 1: Elektroantennogram kurulumu şunlardan oluşur: A) Mikroskop: Kullanılan mikroskop, deneycinin sivrisinek anten uçlarının kayıt elektrotlarına yerleştirilmesine izin vermek için hazırlığı açıkça görmesini sağlamalıdır. B) Soğuk ışık lambası: Kayıtlar başladığında lamba kapatılmalıdır. C) Vakum hattı: Bu, koku vericilerin sivrisinek kafası preparatı etrafında birikme riskini azaltır, bu da anten tepkilerinin gerçek stimülasyondan ayrılmasına neden olabilir. D) Mikromanipülatörler (x2): Bunlar, sivrisinek antenlerini kayıt elektrodunun kılcal damarına yerleştirmek için gerekli olan çok ince elektrot tutucu hareketlerine izin verecektir. e) Kayıt elektrot tutucusu. f) Referans elektrot tutucu. G) Kafa aşaması: Her iki elektrot da daha sonra amplifikatöre bağlanan kafa aşamasına takılır. H) Ana havayolu: sürekli temiz bir hava akımı sivrisinek kafasını yıkadı. Akış hızı bir debimetre ile düzenlenir. I) Solenoid valf ve debimetreye bağlı koku iletimi için şırınga; J) Hava masası: Hava tablası gürültüyü azaltacaktır. K) Faraday kafesi: Faraday kafesi elektrik gürültüsünü önleyecektir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: EAG kayıtları için adım adım Aedes albopictus sivrisinek kafası hazırlığı. A) Her iki antenin de sağlam olduğunu doğrulamak için buzlu bir plaka üzerinde sırtında dişi sivrisinek. B) Mikro makasla anten eksizyonunun son bölümü. C) Antenler elektrot jeline batırılır. D) Antenler çekildikten sonra birbirine yapışır. Her antenin sadece bir segmenti elektrot jelinde olmalıdır. E) Sivrisinek kafası eksizyonu. f) Referans elektroduna monte edilmiş kafa. EAG donanımına taşınabilecek kadar kararlı olmalıdır. A'-F'. Erkek EAG'ler için yukarıda sunulanlarla aynı adımlar. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Sivrisinek EAG şeması ve ham EAG izleri. A ) EAG şeması (solda) ve EAG yanıtının özellikleri (sağda). (Solda) Sivrisinek kafası, bir referans elektrodu ile bir amplifikatöre bağlı bir kayıt elektrodu arasına monte edilir. Antenler, koku verici uyaranların darbelendiği sabit bir hava akışında yıkanır. Bir kimyasalın algılanması, sinyalde bir sapmaya (mV cinsinden) yol açar. (sağda) Kimyasal tespit, hücre depolarizasyonuna (DPR) ve ardından taban çizgisine dönene kadar hücre repolarizasyonuna (RPR) yol açar. Koku verici darbe gri dikdörtgen ile temsil edilir. Kırmızı çizgi, EAG yanıtının genliğini gösterir. B) Bir Culex quinquefasciatus dişi sivrisineğinin tüm EAG kayıt izini vurgulayan WinEDR yazılımının ekran görüntüsü. Üst: filtrelenmemiş (yani ham) sinyal. Orta: 1 s koku darbeleri sayılarla gösterilir. Alt: 3 koku vericiye filtrelenmiş (yani 1,5 Hz düşük geçişli) sinyal ve bir kontrol (mineral yağ). % 1 1-hekzanol (1),% 1 benzaldehit (2) ve% 1 bütirik aside (3) yanıt olarak sapmalara dikkat edin. Negatif kontrole, mineral yağa yanıt verilmemesine dikkat edin (4). C ) Soldan sağa: Aedes aegypti, Anopheles stephensi, Culex quinquefasciatus ve Toxorhynchites rutilus septentrionalis'te %1 benzaldehit (üstte) ve mineral yağ kontrolüne (altta) temsili EAG yanıtları (mV cinsinden). Bir saniyelik darbe, EAG izinin üzerindeki renkli dikdörtgenle temsil edilir. Benzaldehit'e yanıt olarak büyük sapmaya ve mineral yağa tepki eksikliğine dikkat edin. Ayrıca, Toxorhynchites rutilus septentrionalis'teki farklı ölçeğe dikkat edin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: EAG sonuçlarının örnek gösterimi ve istatistiksel analizleri. Bir. Culex quinquefasciatus (N = 8), Anopheles stephensi (N = 10), Aedes aegypti (N = 8) ve Toxorhynchites rutilus septentrionalis (N = 7) kadınlarının ortalama EAG yanıtları% 1 1-hekzanol (yeşil),% 1 bütirik asit (turuncu),% 1 benzaldehit (sarı) ve mineral yağa (mavi). B. Culex quinquefasciatus dişileri 1-hekzanol (solda) (N = 9) ve benzaldehit (sağda) (N = 8) için EAG doz-yanıt eğrisi. Çubuklar, ortalamanın standart hatasını temsil eder. Hata çubuklarının üzerindeki harfler istatistiksel farklılıkları gösterir (Bonferroni düzeltmeli çift Wilcoxon rütbe toplamı testi). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Koku alma aracılı davranışlar, fizyolojik (örneğin, yaş, günün saati) ve çevresel (örneğin, sıcaklık, bağıl nem) dahil olmak üzere birçok faktörden etkilenir30. Bu nedenle, EAG'leri yürütürken, aynı fizyolojik durumda olan böceklerin kullanılması (yani, yaşın izlenmesi, açlık, çiftleşme)31 ve ayrıca kurumayı önlemek için preparatın etrafında sıcak ve nemli bir ortam sağlamak esastır. 25 °C civarında bir sıcaklık idealdir ve ana havayolu için% 60 ila% 80 nem oranıdır. Bu, ana havayolu devresine bir baloncuk yerleştirerek kolayca elde edilebilir.
Ayrıca, böceğin biyolojisiyle ilgili sonuçlar elde etmek için her türün ekolojisini dikkate almak önemlidir. Örneğin, gece türü kullanıyorsanız, öznel geceleri boyunca tepkilerini test etmek için ışık döngülerini tersine çevirmeyi düşünün. EAG'leri günün belirli anlarında (yani, böcek aktif olduğunda) yapmayı seçmek de önemlidir. Örneğin, Ae. aegypti sivrisinekleri kullanıyorsanız, deneyleri bu türün aktivitesinin zirvelerinde (yani, günün erken saatlerinde ve öğleden sonra) yapmayı düşünün. Yine, ışık döngüsü, programlanabilir bir zamanlayıcı32 kullanılarak ters ışık programına sahip iklim odaları veya ışık kutuları kullanılarak kolaylık sağlamak için kolayca değiştirilebilir. Eilerts ve ark.33 ve Krishnan ve ark.34, belirli koku vericilere duyarlılığın gün boyunca değiştiğini göstermiştir. Böylece, böceğin ekolojisi ve biyolojisi hakkında iyi bir bilgi, daha doğru sonuçları garanti edecektir.
Gürültü (elektriksel veya mekanik) EAG'lere kolayca dahil edilebilir. Örneğin, mekanik pertürbasyonlar, bir EAG preparatına doğru hava üfleyen bir AC sistemi tarafından oluşturulabilir. Humbug ile elektriksel gürültü azaltılabilir, ancak devam ederse, elemanları takarak ve timsah klipsleri kullanılarak Faraday kafesine topraklayarak izlenebilir (Şekil 3B). Bu, preparatın etrafında bulunan tüm elementler için geçerlidir (yani, mikroskop, lamba, mikromanipülatörler). Faraday kafesindeki bazı ekipman parçaları, hala elektriksel gürültü (örneğin, soğuk ışık kaynağı) üretebileceğinden veya kafesin dışına yerleştirilebileceğinden, kayıttan önce fişten çekilmelidir. Başka bir "gürültü" türü koku alma niteliğindedir. Deneyci parfüm giymekten kaçınmalı veya güçlü kokulu şampuan veya deterjan kullanmalıdır. Gerçekten de, bunlarda bulunan birçok bileşik sivrisinekler (örneğin, linalool, sitronellol, geraniol, öjenol) tarafından tespit edilebilir ve deneylerin sonuçlarına müdahale edebilir ve etkileyebilir. Bir laboratuvar önlüğü ve eldiven giymek, havayolunun, şırıngaların ve elektrotların istenmeyen kontaminasyonunu sınırlamak için de gereklidir.
Sunulan protokol, hem erkeklerde hem de dişilerde tüm sivrisinek türlerine kolayca uygulanabilir olma avantajına sahipken, preparatın ömrünü uzatır (> 30 dakika) ve preparatlar arasında sınırlı değişkenlik gösterir. Bu yöntem, EAG sinyalinde çok az gürültüye yol açar ve bu da kimyasalların çok düşük konsantrasyonlarda test edilmesine izin verir. Diseksiyon ve montaj adımlarına hakim olduktan sonra, bu teknik nispeten kısa sürede güvenilir veriler ve basit veri analizleri üretebilir.
Elektroantennografi sadece deneycinin sivrisineğin bir kimyasalı tespit edip edemeyeceğini değerlendirmesine izin verir. Bununla birlikte, bu kimyasalın değerini belirlemek için, olfaktometre testleri gibi tamamlayıcı davranışsal testler, sivrisinek kontrolü için etkili araçlar geliştirmek amacıyla belirli bir koku verici veya karışımın çekici, itici veya nötr olup olmadığını belirlemek için kritik öneme sahiptir35.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarın açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Dr. Clément Vinauger ve Dr. Jeffrey Riffell'e yararlı tartışmalar için minnettarım. Aşağıdaki reaktifler BEI Resources, NIAID, NIH aracılığıyla elde edilmiştir: Mark Q. Benedict'in katkıda bulunduğu Anopheles stephensi, Strain STE2, MRA-128; Aedes aegypti, Strain ROCK, MRA-734, David W. Severson'ın katkılarıyla; Culex quinquefasciatus, Suş JHB, Yumurtalar, NR-43025. Yazar, Culex quinquefasciatus ve Anopheles stephensi (suş: Liston) sivrisinek yumurtaları sağladıkları için Dr. Jake Tu, Dr. Nisha Duggal, Dr. James Weger ve Jeffrey Marano'ya teşekkür eder. Aedes albopictus ve Toxorhynchites rutilus septentrionalis , yazar tarafından New River Valley bölgesinde (VA, ABD) toplanan tarla sivrisineklerinden türetilmiştir. Bu çalışma Biyokimya Bölümü ve Fralin Yaşam Bilimleri Enstitüsü tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air table Clean Bench | TMC | https://www.techmfg.com/products/labtables/cleanbench63series/accessoriess | Noise reducer |
| Analog-to-digital board | National Instruments | BNC-2090A | |
| Benchtop Flowbuddy Complete | Genesee Scientific | 59-122BC | To anesthesize mosquitoes |
| Borosillicate glass capillary | Sutter Instrument | B100-78-10 | To make the recording and references capillaries |
| Chemicals | Sigma Aldrich | Benzaldehyde: 418099-100 mL; Butyric acid: B103500-100mL; 1-Hexanol: 471402-100mL; Mineral oil: M8410-1L | Chemicals used for the experiments presented here |
| CO2 | Airgas or Praxair | N/A | To anesthesize mosquitoes |
| Cold Light Source | Volpi | NCL-150 | |
| Disposable syringes | BD | 1 mL (309628) / 3 mL (309657) | |
| Electrode cables | World Precision Instruments | 5371 | |
| Electrode gel salt free | Parkerlabs | 12-08-Spectra-360 | |
| Faraday cage | TMC | https://www.techmfg.com/products/electric-and-magnetic-field-cancellation/faradaycages | Noise reducer |
| Flowmeters | Bel-art | 65 mm (H40406-0010) / 150 mm (H40407-0075) | One of each |
| GCMS vials and caps | Thermo-fisher scientific | 2-SVWKA8-CPK | To prepare odorant dilutions |
| Glass syringes (Fortuna) | Sigma Aldrich | Z314307 | For odor delivery to the EAG prep |
| Humbug | Quest Scientific | http://www.quest-sci.com/ | Noise reducer |
| 2 mm Jack Holder, Narrow, 90 deg., With Wire | A-M Systems | 675748 | Electrode holder |
| Magnetic bases | Kanetec | MB-FX | x 2 |
| MATLAB + Toolboxes | Mathworks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | For delivering the pulses |
| Medical air | Airgas or Praxair | N/A | For main airline |
| Microscope | Nikkon | SMZ-800N | |
| Micromanipulators Three-Axis Coarse/Fine Compact Micromanipulator | Narishige | MHW-3 | x 2 |
| Microelectrode amplifier with headstage | A-M Systems | Model 1800 | |
| Mosquito rearing supplies | Bioquip | https://www.bioquip.com/Search/WebCatalog.asp | |
| Needles | BD | 25G (305127) / 21G (305165) | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-6A | For odor delivery to the EAG prep |
| PTFE Tubing of different diameters | Mc Master Carr | N/A | To connect solenoid valve, flowmeter, airline ect. |
| 30V/5A DC Power Supply | Dr. Meter | PS-305DM | |
| R version 3.5.1 | R project | https://www.r-project.org/ | For data analyses |
| Relay for solenoid valve | N/A | Custom made | |
| Silver wire 0.01” | A-M Systems | 782500 | |
| Solenoid valve (3-way) | The Lee Company | LHDA0533115H | |
| WinEDR software | Strathclyde Electrophysiology Software | WinEDR V3.9.1 | For EAG recording |
| Whatman paper | Cole Parmer | UX-06648-03 | To load chemical in glass syringe / Pasteur pipette |
References
- World Health Organization. World health statistics 2019: monitoring health for the SDGs, sustainable development goals. World Health Organization. , Geneva. (2019).
- Takken, W. The role of olfaction in host-seeking of mosquitoes: a review. International Journal of Tropical Insect Science. 12 (1-2-3), 287-295 (1991).
- Zwiebel, L. J., Takken, W.
- Potter, C. J. Stop the biting: targeting a mosquito's sense of smell. Cell. 156 (5), 878-881 (2014).
- Paluch, G., Bartholomay, L., Coats, J. Mosquito repellents: a review of chemical structure diversity and olfaction. Pest Management Science. 66 (9), 925-935 (2010).
- Schneider, D. Electrophysiological investigation on the antennal receptors of the silk moth during chemical and mechanical stimulation. Experientia. 13 (2), 89-91 (1957).
- Raguso, R. A., Light, D. M., Pickersky, E. Electroantennogram responses of Hyles lineata (Sphingidae: Lepidoptera) to volatile compounds from Clarkia breweri (Onagraceae) and other moth-pollinated flowers. Journal of Chemical Ecology. 22 (10), 1735-1766 (1996).
- Schweitzer, E. S., Sanes, J. R., Hildebrand, J. G. Ontogeny of electroantennogram responses in the moth, Manduca sexta. Journal of Insect Physiology. 22 (7), 955-960 (1976).
- Martel, V., Anderson, P., Hansson, B. S., Schlyter, F. Peripheral modulation of olfaction by physiological state in the Egyptian leaf worm Spodoptera littoralis (Lepidoptera: Noctuidae). Journal of Insect Physiology. 55 (9), 793-797 (2009).
- Spaethe, J., Brockmann, A., Halbig, C., Tautz, J. Size determines antennal sensitivity and behavioral threshold to odors in bumblebee workers. Naturwissenschaften. 94 (9), 733-739 (2007).
- Suchet, C., et al. Floral scent variation in two Antirrhinum majus subspecies influences the choice of naïve bumblebees. Behavioral Ecology and Sociobiology. 65 (5), 1015-1027 (2011).
- De Jong, R., Pham-Delègue, M. H. Electroantennogram responses related to olfactory conditioning in the honeybee (Apis mellifera ligustica). Journal of Insect Physiology. 37 (4), 319-324 (1991).
- Patte, F., Etcheto, M., Marfaing, P., Laffort, P. Electroantennogram stimulus-response curves for 59 odourants in the honeybee, Apis mellifica. Journal of Insect Physiology. 35 (9), 667-675 (1989).
- Alcorta, E. Characterization of the electroantennogram in Drosophila melanogaster and its use for identifying olfactory capture and transduction mutants. Journal of Neurophysiology. 65 (3), 702-714 (1991).
- Park, K. C., Ochieng, S. A., Zhu, J., Baker, T. C. Odor discrimination using insect electroantennogram responses from an insect antennal array. Chemical Senses. 27 (4), 343-352 (2002).
- Du, Y. J., Millar, J. G. Electroantennogram and oviposition bioassay responses of Culex quinquefasciatus and Culex tarsalis (Diptera: Culicidae) to chemicals in odors from Bermuda grass infusions. Journal of Medical Entomology. 36 (2), 158-166 (1999).
- Costantini, C., et al. Electroantennogram and behavioural responses of the malaria vector Anopheles gambiae to human-specific sweat components. Medical and Veterinary Entomology. 15 (3), 259-266 (2001).
- Collins, L. E., Blackwell, A. Electroantennogram studies of potential oviposition attractants for Toxorhynchites moctezuma and T. amboinensis mosquitoes. Physiological Entomology. 23 (3), 214-219 (1998).
- Seenivasagan, T., Sharma, K. R., Sekhar, K., Ganesan, K., Prakash, S., Vijayaraghavan, R. Electroantennogram, flight orientation, and oviposition responses of Aedes aegypti to the oviposition pheromone n-heneicosane. Parasitology Research. 104 (4), 827-833 (2009).
- Puri, S. N., Mendki, M. J., Sukumaran, D., Ganesan, K., Prakash, S., Sekhar, K. Electroantennogram and behavioral responses of Culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae) females to chemicals found in human skin emanations. Journal of Medical Entomology. 43 (2), 207-213 (2014).
- Cooperband, M. F., McElfresh, J. S., Millar, J. G., Carde, R. T. Attraction of female Culex quinquefasciatus Say (Diptera: Culicidae) to odors from chicken feces. Journal of Insect Physiology. 54 (7), 1184-1192 (2008).
- Dekker, T., Ignell, R., Ghebru, M., Glinwood, R., Hopkins, R. Identification of mosquito repellent odours from Ocimum forskolei. Parasites & Vectors. 4 (1), 183 (2011).
- Choo, Y. M., et al. Reverse chemical ecology approach for the identification of an oviposition attractant for Culex quinquefasciatus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), 714-719 (2018).
- Wolff, G. H., Lahondère, C., Vinauger, C., Riffell, J. A. Neuromodulation and differential learning across mosquito species. bioRxiv. , 755017 (2019).
- Lahondère, C., et al. The olfactory basis of orchid pollination by mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (1), 708-716 (2020).
- Beyenbach, K., Masia, R. Membrane conductances of principal cells in Malpighian tubules of Aedes aegypti. Journal of Insect Physiology. 48, 375-386 (2002).
- Oesterle, A. The Pipette Cookbook. , (2018).
- R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. (2018).
- Afify, A., Betz, J. F., Riabinina, O., Lahondère, C., Potter, C. J. Commonly used insect repellents hide human odors from Anopheles mosquitoes. Current Biology. 29 (21), 3669-3680 (2019).
- Martin, F., Riveron, J., Alcorta, E. Environmental temperature modulates olfactory reception in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 57 (12), 1631-1642 (2011).
- Qiu, Y. T., Gort, G., Torricelli, R., Takken, W., van Loon, J. J. Effects of blood-feeding on olfactory sensitivity of the malaria mosquito Anopheles gambiae: application of mixed linear models to account for repeated measurements. Journal of Insect Physiology. 59 (11), 1111-1118 (2013).
- Taylor, B., Jones, M. D. R. The circadian rhythm of flight activity in the mosquito Aedes aegypti (L.): the phase-setting effects of light-on and light off. Journal of Experimental Biology. 51 (1), 59-70 (1969).
- Eilerts, D. F., VanderGiessen, M., Bose, E. A., Broxton, K., Vinauger, C. Odor-specific daily rhythms in the olfactory sensitivity and behavior of Aedes aegypti mosquitoes. Insects. 9 (4), 147 (2018).
- Krishnan, B., Dryer, S. E., Hardin, P. E. Circadian rhythms in olfactory responses of Drosophila melanogaster. Nature. 400 (6742), 375-378 (1999).
- Pelletier, J., Guidolin, A., Syed, Z., Cornel, A. J., Leal, W. S. Knockdown of a mosquito odorant-binding protein involved in the sensitive detection of oviposition attractants. Journal of Chemical Ecology. 36 (3), 245-248 (2010).
