Summary
В настоящей статье подробно описан пошаговый протокол успешных и малошумных электроантэннограмм у нескольких родов комаров, включая как самок, так и самцов.
Abstract
Самки комаров являются самыми смертоносными животными на земле, ежегодно унося жизни более 1 миллиона человек из-за патогенов, которые они передают при приобретении кровяной муки. Чтобы найти хозяина для питания, комары полагаются на широкий спектр сенсорных сигналов, включая визуальные, механические, тепловые и обонятельные. В исследовании подробно описывается метод, электроантеннография (EAG), который позволяет исследователям оценить, могут ли комары обнаруживать отдельные химические вещества и смеси химических веществ в зависимости от концентрации. В сочетании с газовой хроматографией (ГХ-ЭАГ) этот метод позволяет подвергать антенны воздействию полной смеси свободного пространства / сложного пространства и определяет, какие химические вещества, присутствующие в интересующем образце, комар может обнаружить. Это применимо к запахам тела хозяина, а также к цветочным букетам растений или другим экологически значимым запахам (например, одорантам для мест яйцекладки). Здесь мы описали протокол, который допускает длительные сроки реакции на приготовление и применим как к самкам, так и к самцам комаров из нескольких родов, включая комаров Aedes, Culex, Anopheles и Toxorhynchitis . Поскольку обоняние играет важную роль во взаимодействии комаров и хозяев и в биологии комаров в целом, ЕАГ и ГХ-ЕАГ могут выявлять соединения, представляющие интерес для разработки новых стратегий борьбы с переносчиками болезней (например, приманки). В дополнение к поведенческим анализам можно определить валентность (например, аттрактанта, репеллента) каждого химического вещества.
Introduction
Комары являются самыми смертоносными организмами на Земле, унося жизни более миллиона человек в год и подвергая более половины населения мира риску воздействия патогенов, которые они передают, при укусах1. Эти насекомые полагаются на широкий спектр сигналов (т. е. тепловых, визуальных, механических, обонятельных, слуховых), чтобы найти хозяина, которым можно питаться (как растение, так и животное), для спаривания и яйцекладки, а также избегать хищников как на личиночной, так и на взрослой стадиях 2,3. Среди этих чувств обоняние играет решающую роль в вышеупомянутом поведении, в частности, для обнаружения молекул одоранта на среднем и большом расстоянии 2,3. Запахи, испускаемые хозяином или местом яйцекладки, обнаруживаются различными специфическими обонятельными рецепторами (например, GR, OR, IR), расположенными на хоботке, лапках и антеннах 2,3 щупика комара.
Поскольку обоняние является ключевым компонентом их поведения по поиску хозяина (растений и животных), спаривания и яйцекладки, он, таким образом, представляет собой идеальную цель для изучения с целью разработки новых инструментов для борьбы с комарами4. Исследования репеллентов (например, DEET, IR3535, пикаридин) и приманок (например, человеческая приманка BG Sentinel) чрезвычайно плодотворны5, но из-за текущих проблем в борьбе с комарами (например, устойчивость к инсектицидам, инвазивные виды) важно разработать новые эффективные методы борьбы, основанные на биологии комаров.
Многие методы (например, ольфактометр, анализы посадки, электрофизиология) использовались для оценки биологической активности соединений или смесей соединений у комаров. Среди них электроантеннография (или электроантеннограммы (EAG)) может быть использована для определения того, обнаруживаются ли одоранты усиками комаров. Этот метод был первоначально разработан Schneider6 и с тех пор использовался во многих различных родах насекомых, включая мотыльков 7,8,9, шмелей 10,11, медоносных пчел 12,13 и плодовых мушек14,15, и это лишь некоторые из них. Электроантеннография также использовалась с использованием различных протоколов, включая одну или несколько антенн у комаров 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25.
Комары – относительно небольшие и нежные насекомые с довольно тонкими усиками. В то время как выполнение ЭАГ на более крупных насекомых, таких как мотыльки или шмели, относительно легко из-за их большего размера и более толстых усиков, проведение ЭАГ у комаров может быть сложной задачей. В частности, поддержание хорошего соотношения сигнал/шум и длительная оперативная подготовка являются двумя основными требованиями к воспроизводимости и надежности данных.
Предлагаемое здесь пошаговое руководство по малошумным EAG напрямую предлагает решения этих ограничений и делает этот протокол применимым к нескольким видам комаров из различных родов, включая Aedes, Anopheles, Culex и Toxorhynchites, и описывает технику как для самок, так и для самцов. Электроантеннография предлагает быстрый, но надежный способ скрининга и определения биологически активных соединений, которые затем могут быть использованы при разработке приманки после определения валентности с помощью поведенческих анализов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Приготовление солевого раствора
- Заранее подготовьте солевой раствор и храните в холодильнике.
- Следуйте за Beyenbach и Masia26 , чтобы приготовить раствор.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рецепт физиологического раствора в мМ: 150,0 NaCl, 25,0 HEPES, 5,0 глюкозы, 3,4 KCl, 1,8 NaHCO3, 1,7 CaCl 2 и 1,0 MgCl2. рН доводят до 7,1 с 1 М NaOH. Не добавляйте глюкозу или сахарозу в препарат в это время, чтобы увеличить срок хранения. Добавьте необходимое количество в физиологический раствор непосредственно перед запуском ЭАГ (около 50 мл на эксперимент).
2. Приготовление и хранение запаха
- Заранее приготовьте смеси одорантов или разбавления отдельных соединений во флаконах янтарного цвета объемом 1,5 мл и храните при -20 ° C, чтобы предотвратить разложение соединения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрации будут зависеть от проводимого теста. 0,1% или 1% обычно используются для определения того, может ли соединение быть обнаружено или нет. Для кривой доза-реакция подготовьте последовательные разведения данного химического вещества и проверьте их от самых низких до самых высоких концентраций. - Приготовьте разбавления в воде, этаноле, гексане, парафиновом масле или минеральном масле, в зависимости от растворимости тестируемого химического вещества.
- Обязательно подготовьте для эксперимента контрольный растворитель (флакон, содержащий только растворитель).
- Удалите одоранты из морозильной камеры за 30 минут до начала экспериментов, чтобы они оттаяли. Перемешайте каждый флакон перед использованием, чтобы хорошо перемешать химическое вещество и растворитель.
- Пипетка 10 мкл раствора на лист фильтровальной бумаги (0,5 см х 2 см), загруженный внутрь маркированного стеклянного шприца или пастеровской пипетки.
- Загрузите каждое соединение или смесь в специальную пипетку или шприц Пастера, чтобы предотвратить загрязнение.
ПРИМЕЧАНИЕ: Загрузите шприц за 10 минут до начала эксперимента, чтобы запах мог рассеяться в шприце, но не дольше, чтобы предотвратить деградацию. Пусть пипетка или шприц Пастера остаются закрытыми в это время, чтобы обеспечить хорошую диффузию химического вещества до начала эксперимента. - После каждого прогона EAG утилизируйте кусок фильтровальной бумаги и замените его новым, чтобы бумага не переначивалась и не могла засорить иглу. Регулярно заменяйте иглы (каждые 10 заходов).
3. Отделение комаров
- Изолируйте комаров в день экспериментов.
- Используйте комаров, которым в день экспериментов не менее 6 дней, чтобы увеличить вероятность спаривания самок, чтобы усилить их реакцию на одоранты, связанные с хозяином.
ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте возраст комаров во время теста в зависимости от проекта. Проверьте и согласуйте физиологический статус (например, на кровяном вскармливании, голодали, никогда ранее не кормили и т. д.). - Морить комаров голодом до 12 часов (т.е. без доступа к сахару), чтобы повысить их мотивацию и чувствительность.
- Поместите контейнер с комарами в холодильник (4 ° C) до тех пор, пока они не перестанут летать, чтобы людей можно было легко аккуратно перенести в отдельные чашки с помощью щипцов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Виды с более высокой устойчивостью к холоду можно усыпить с помощью подушечки от мух CO2 . Следите за тем, чтобы комары не оставались на нем в течение длительного времени, чтобы предотвратить высыхание, которое снизит реакцию препарата EAG от комаров. - Храните чашки с отдельными комарами при комнатной температуре до проведения EAG и выбросьте всех комаров, которые нельзя использовать в течение дня.
4. Электрододержатель и капиллярная подготовка
- Вытягивание, подготовка и хранение капилляров
- Используйте боросиликатные капилляры с нитями (внутренний диаметр: 0,78 мм, наружный диаметр: 1 мм). Потяните их в зависимости от снаряжения27.
ПРИМЕЧАНИЕ: Храните вытянутые капилляры в чашке Петри. Поместите чашку Петри на кусочки воска или пластилина без запаха, чтобы они не двигались и не ломались. - Перед запуском эксперимента ЭАГ аккуратно разорвите кончик 2 капилляров парой щипцов под микроскопом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что один из них немного больше другого, чтобы соответствовать либо шее (больший капилляр), либо кончикам усиков (меньший капилляр). Убедитесь, что разрез чистый, на стенке капилляра нет трещин. Это требует терпения и практики. - Если они все еще не повреждены, повторно используйте эти капилляры после промывки деионизированной (DI) водой после завершения эксперимента. Удалите лишнюю воду, аккуратно приложив чистящую салфетку к наконечнику. Поместите обратно в хранилище чашку Петри. Если кончик искривлен, откажитесь от капилляра.
- Используйте боросиликатные капилляры с нитями (внутренний диаметр: 0,78 мм, наружный диаметр: 1 мм). Потяните их в зависимости от снаряжения27.
- Электрододержатель и капиллярный монтаж
- Пометьте два электрододержателя как «записывающий» и «эталонный», используя кусочки лабораторной ленты разных цветов. Это поможет установить голову комара и электроды.
- Убедитесь, что держатели электродов чисты внутри и на них нет боросиликатного мусора.
- Хлорирование: Замочите серебряные провода электрододержателей в чистом отбеливателе примерно на 5 минут. Провода превращаются из блестящих светло-серых в матовые темно-серые.
- Ослабьте резиновую пробку и заполните внутреннюю часть капилляра 10% физиологическим раствором с помощью иглы 20 г.
- Заполните боросиликатный капилляр физиологическим раствором с помощью шприца. Убедитесь, что ни в держателе электрода, ни в вытянутом капилляре нет пузырьков.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы уменьшить вероятность образования пузырьков в капилляре, продолжайте проталкивать физиологический раствор в капилляр, осторожно вытаскивая иглу, и используйте капилляры с нитью. Можно нагружать капилляры раствором, состоящим из электродного геля 1:3 и физиологического раствора. Это может помочь предотвратить испарение физиологического раствора и может быть особенно полезно при изучении и практике ЭАГ, так как экспериментатору потребуется больше времени для выполнения различных шагов. - После замачивания промойте серебряные провода деионизированной водой и вставьте их в два капилляра. Следите за тем, чтобы наконечник проволоки находился на расстоянии менее 1 мм от кончика капилляра. Убедитесь, что капилляр проходит через резиновое кольцо внутри держателя электрода, не сломавшись. Аккуратно затяните резиновую пробку. Убедитесь, что пузырьки воздуха отсутствуют.
- Используйте капилляр с более широким отверстием на держателе электрода сравнения (шейка) и меньшим отверстием на держателе записывающего электрода (антенны).
- Оставьте два установленных держателя электродов на влажной чистящей салфетке, чтобы предотвратить высыхание наконечника до тех пор, пока он не будет готов к установке головки.
5. Подготовка буровой установки ЕАГ (рис. 1)
- Убедитесь, что воздушный стол поднят, что в авиакомпании нет засоров. Убедитесь, что бак с медицинским воздухом все еще полон, чтобы не менять его в середине эксперимента. Убедитесь, что в увлажнителе есть пузырьки.
- Система подачи воздуха и импульсов
- Включите бензобак медицинского воздуха.
- Проверьте уровень двух расходомеров.
ПРИМЕЧАНИЕ: Расходомер, контролирующий основной поток воздуха, омывающий препарат в течение всего эксперимента, должен быть на уровне 140 мл / мин, а другой, связанный с пульсом запаха, должен показывать 15 мл / мин.
- Если вы выполняете GC-EAD, включите машину, бензобаки и создайте/загрузите файл/метод.
- Включите компьютеры, программные приложения, блок питания клапана и проверьте подключение к Интернету для работы программного приложения.
- Программное приложение: Короткий сценарий может быть написан для доставки импульса.
- Программное обеспечение EAG: используйте любое программное обеспечение для электрофизиологии.
- Реализуйте параметры в программном обеспечении (например, усилитель, продолжительность записи, длительность импульсов и т. д.).
- Подайте управляющий импульс, чтобы убедиться, что клапан, подающий импульсы, исправен.
- Установите блок питания на 5.2 В. Проверьте параметры усилителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для представленных здесь данных используются следующие параметры: фильтр низких среза 0,1 Гц; фильтр с высокой частотой среза 500 Гц; Усиление х100.
6. Подготовка и установка головы комара (рис. 2)
- Положите алюминиевую пластину на лед и положите на нее салфетку для влажной уборки.
- Положите небольшую ложку электродного геля в угол.
- Поставьте противомоскитную чашку на лед и дайте комару остыть в течение нескольких минут или пока он не перестанет летать.
ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые виды устойчивы к холоду, и для спуска может потребоваться быстрая анестезия над подушечкой CO2 . Чем меньше комар останется на них, тем лучше. - Положите комара на спину и обрежьте кончик каждой антенны (только небольшую часть последнего сегмента) микроножницами.
- Используйте щипцы, чтобы протащить комара рядом с ложкой электродного геля, и аккуратно окуните кончик каждой антенны в гель. Избегайте погружения в электродный гель больше, чем самый последний сегмент.
- С помощью щипцов вытащите усики комара, удерживая их рядом друг с другом. Пусть вместе выйдут из геля. Следите за тем, чтобы усики не касались поверхности чистящей салфетки, иначе они могут отделиться.
- Положите комара на бок и отрубите голову микроножницами или лезвием бритвы.
ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как голова отрублена, быстро переходите к следующим шагам и к установке EAG, чтобы начать запись. Препарат должен оставаться чувствительным в течение примерно 30 минут. - Возьмите электрод сравнения и осторожно погрузите наконечник в гель. Держите контакт с тканями шеи и дайте голове прилипнуть к ней.
- Переместите держатели электродов под микроскоп EAG и посмотрите через микроскоп, чтобы поместить головной (т.е. эталонный) электрод на микроманипулятор. Убедитесь, что усики находятся в центре.
- Возьмите записывающий электрод, поместите его перед кончиками усиков. Переместите и выровняйте его как можно ближе к кончикам с помощью микроманипулятора. С помощью микроскопа переместите кончик записывающего электрода в сторону усиков.
- Подсоедините оба электрододержателя к усилителю перед установкой наконечников, чтобы предотвратить их смещение после введения.
- Вставьте наконечники антенн в записывающий электрод. Убедитесь, что они просто контактируют с физиологическим раствором и электродным гелем и видны прозрачностью через капилляр. Антенна входит за счет «эффекта всасывания».
- При необходимости отрегулируйте положение головки и наконечников щипцами под микроскопом.
- Поместите трубку рядом с подготовкой головы комара (расстояние: 1 см).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если голова отваливается, вернитесь на станцию вскрытия и установите голову на место или приготовьте новую, если она была утеряна или если прошло более 5 минут с момента отрезания головы. Хорошее соединение между капилляром и шеей/антеннами имеет важное значение для низкого уровня шума и надежной записи. В идеале наконечники антенн должны находиться на расстоянии менее 1 мм от провода записывающего электрода после вставки. - Выключите источник света, если он используется.
- Расположите вакуумную линию рядом с подготовкой головы комара (расстояние: 20 см) и выровняйте с основной авиацией.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вакуум поможет удалить химические вещества, окружающие подготовку головы после стимула, что может привести к ответам ЭАГ после применения импульсов.
7. Записи
- После вставки наконечников усиков включите усилитель и шумоподавление. Наблюдайте за базовым сигналом и следите за тем, чтобы он не был шумным.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обратите внимание на наличие больших колебаний в электрическом сигнале. При необходимости отрегулируйте положение головы и наконечников антенн до тех пор, пока сигнал не станет чистым. Используйте зажимы типа «крокодил», чтобы заземлить все, что вносит шум в клетку Фарадея или воздушный стол. Базовый сигнал с амплитудой менее 0,01 мВ идеально подходит для обнаружения и различения мельчайших откликов ЭАГ. - Как только уровень шума будет удовлетворительным, вставьте первый шприц для проверки запаха в отверстие авиакомпании.
- Закройте клетку Фарадея. Не оставайтесь перед препаратом, чтобы уменьшить шум.
- Нажмите «Запись» в программном обеспечении EAG.
- Доставьте импульс (импульсы) с помощью программного приложения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество и продолжительность импульсов будут варьироваться в зависимости от экспериментов. Здесь использовались однократные импульсы 1 с. на одорант. Одоранты были разделены на 45 с. - Обратите внимание на реакцию усиков комаров в лабораторной тетради.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если одорант обнаруживается усиками комара, наблюдается явное отклонение сигнала (см. рис. 3A). - Приступайте к следующему запаху или концентрации. Не забывайте рандомизировать представление одорантов, если не выполняется кривая доза-реакция.
ПРИМЕЧАНИЕ: В экспериментах следует использовать отрицательный контроль и положительный контроль. Это гарантирует, что наблюдаемые реакции действительно являются обонятельными реакциями, а не механическими или электрическими шумами. - В конце записи примените положительный элемент управления, чтобы убедиться, что антенны все еще реагируют.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 0,1% или 1% бензальдегида, так как все виды комаров, протестированные до сих пор, реагировали на это соединение. - Приступайте к следующему препарату от комаров.
8. Уборка
- Выключите усилитель, шумоподавший, авиакомпанию и компьютер.
- Верните отдушки в морозильную камеру.
- Снимите фильтровальную бумагу со стеклянных шприцев и очистите 100% этанолом, если на стенках видны остатки. Дайте высохнуть на чистящей салфетке на ночь.
- Очистите держатели электродов деионизированной водой, чтобы удалить любые возможные следы соли. Высушите, аккуратно нанеся на чистящую салфетку.
- Поместите остатки комаров в морозильную камеру и утилизируйте через 24 часа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы работаете с инфицированными комарами, соблюдайте требования безопасности в вашем учреждении.
9. Анализ данных
- Измеряйте ответы ЕАГ вручную или автоматически.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь измеряется амплитуда ЭАГ (-мВ). Усредненное, если для каждого соединения было применено несколько импульсов. В зависимости от используемого программного обеспечения EAG могут быть автоматически обнаружены и измерены. Тем не менее, важно проверять каждый ответ в отдельности, чтобы проверить форму ответа и оценить возможный перенос, отсроченный ответ и т. Д. Идеальная реакция ЭАГ совмещена с импульсом, показывает четкое отклонение и повторяется между препаратами от комаров (рис. 3). - Представьте необработанные данные, чтобы показать минимальную изменчивость, низкий уровень шума и четкие отклики (рис. 3B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Данные также могут быть нормализованы (например, Z-оценка). Отрицательное контрольное значение (например, минеральное масло) (т.е. базовый уровень) может быть вычтено из ответа, а если нет, то должно быть представлено на рисунках. Также должен быть представлен положительный контроль. - Выполняйте статистический анализ с помощью любого статистического программного обеспечения28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Электроантеннография является мощным инструментом для определения того, обнаруживается ли химическое вещество или смесь химических веществ антенной насекомого. Его также можно использовать для определения порога обнаружения данного химического вещества с использованием постепенного увеличения концентрации (т.е. реакции на кривую дозы, рис. 4B). Кроме того, полезно проверить влияние репеллента на реакцию на запахи, связанные с хозяином29.
В ЕАГ всегда должны использоваться положительные и отрицательные элементы управления. Здесь бензальдегид использовался в качестве положительного контроля (рис. 3B, 3C, 4A). Было обнаружено, что это соединение вызывает реакцию антенн у всех видов комаров, протестированных до сих пор24,25,29. Отрицательный контроль также должен использоваться и может состоять из растворителя, используемого для разбавления химических веществ (например, минеральных или парафиновых масел, гексана и т.д.), и не должен вызывать ответа (рис. 3B, 3C, 4A).
Ведь при проведении ЭАГ не следует отмечать прогиб при применении контроля (рис. 3Б, 3С, 4А). Если наблюдается реакция, то шприц, регулятор растворителя и/или линия запаха, вероятно, загрязнены. В этом случае следует приготовить новый раствор, очистить шприц 100% этанолом и высушить и/или обеззаразить авиакомпанию путем промывки 100% этанолом и высушить. Если выбранный контроль вызывает реакцию (например, этанол), значение, полученное в -мВ для контроля, следует вычесть из значения, полученного для этанола и испытуемого химического вещества, объединенного для оценки воздействия испытуемого химического вещества на антенны.
Виды комаров различаются по своей способности реагировать на различные соединения, а также по величине их реакции. Например, комары Toxorhynchites производят очень большие EAG по сравнению с Ae. aegypti, An. Stephensi и Cx. quinquefasciatus (рис. 3C, рис. 4A).
В ЭАГ второй импульс и последующий обычно приводят к меньшим откликам ЭАГ. Представление одного одоранта также может повлиять на реакцию на следующий, поэтому важно рандомизировать порядок одорантов и несколько анализов для эффективного тестирования панели одорантов (если не выполняется кривая доза-реакция). Кроме того, разделение представления импульсов (например, 5 с) и одорантов (например, 45 с) поможет оптимизировать отклики ЕАГ.
Летучесть тестируемых химических веществ варьируется и может влиять на обонятельную реакцию и потенциально приводить к отсроченному ответу, если тестируемое химическое вещество имеет очень низкую летучесть. Химическая летучесть и растворимость должны быть известны перед проведением ЭАГ для оптимизации анализа. Растворитель, используемый для приготовления разведений, также должен быть тщательно отобран (например, этанол, гексан, минеральное или парафиновое масло). Кроме того, концентрации должны быть выбраны с умом и в идеале должны быть экологически значимыми. Часто используется концентрация 1% или 0,1%, но она относительно высока и не обязательно отражает то, что насекомые могут испытывать в природе. Тем не менее, в некоторых случаях полезно проводить скрининг соединений с относительно высокими концентрациями (например, для разработки приманок). Репелленты могут быть протестированы в их коммерчески доступной концентрации (например, ДЭТА обычно продается в концентрации 40%).
В сочетании с газовой хроматографией (т.е. ГХ-ЕАД)25 соединения, вызывающие реакцию, могут быть идентифицированы с помощью ГХ-МС, а затем испытаны индивидуально в различных концентрациях или в смесях с ЭАГ. Стоит отметить, что валентность тестируемых химических веществ не может быть определена с помощью ЭАГ. Только дополнительный поведенческий эксперимент (например, ольфактометр, анализ кормления) может оценить, является ли химическое вещество, обнаруженное антеннами, привлекательным, отталкивающим или нейтральным для комара. Наконец, эксперименты с ЭАГ показывают только реакцию периферической нервной системы.
Рисунок 1: Электроантенограмма, состоящая из: A) Микроскоп: используемый микроскоп должен позволять экспериментатору четко видеть препарат, чтобы можно было вставить кончики усиков комаров в записывающие электроды. B) Лампа холодного света: лампа должна быть выключена, когда начинается запись. C) Вакуумная линия: это снижает риск накопления одорантов вокруг заготовки головы комара, что может привести к тому, что реакции антенн будут отделены от фактической стимуляции. D) Микроманипуляторы (x2): они позволяют очень тонко перемещать держатели электродов, что необходимо для вставки усиков комаров в капилляр записывающего электрода. Д) Держатель регистрирующего электрода. F) Держатель электрода сравнения. G) Головная ступень: оба электрода вставляются в головной каскад, который затем подключается к усилителю. З) Главная авиакомпания: постоянный чистый поток воздуха омывал голову комара. Расход регулируется расходомером. I) Шприц для доставки запаха, соединенный с электромагнитным клапаном и расходомером; J) Воздушный стол: воздушный стол уменьшит шум. K) Клетка Фарадея: Клетка Фарадея предотвратит электрический шум. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Пошаговая подготовка головы комара Aedes albopictus для регистрации ЕАГ. А) Самка комара на спине на ледяной тарелке, чтобы убедиться, что обе антенны целы. Б) Иссечение последнего сегмента усиков микроножницами. В) Усики погружаются в электродный гель. Г) Усики слипаются после их вытаскивания. Только один сегмент каждой антенны должен находиться в электродном геле. Д) Иссечение головы комара. F) Головка, установленная на электроде сравнения. Он должен быть достаточно устойчивым, чтобы его можно было переместить на буровую установку ЕАГ. А'-Ф'. Те же шаги, что и описано выше для мужских ЭАГ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Схема ЕАГ комаров и необработанных следов ЕАГ. А ) Схема ЕАГ (слева) и характеристики отклика ЕАГ (справа). (Слева) Голова комара устанавливается между электродом сравнения и записывающим электродом, подключенным к усилителю. Усики купаются в постоянном воздушном потоке, в котором пульсируют одоранты. Обнаружение химического вещества приводит к отклонению (в мВ) сигнала. (справа) Химическое обнаружение приводит к деполяризации клеток (DPR) с последующей реполяризацией клеток (RPR) до возвращения к исходному уровню. Пульс одоранта представлен серым прямоугольником. Красной линией обозначена амплитуда отклика ЭАГ. Б) Скриншот программного обеспечения WinEDR, на котором выделена целая ЭАГ, регистрирующая след самки комара Culex quinquefasciatus . Вверху: нефильтрованный (т.е. необработанный) сигнал. Середина: 1 с Импульсы запаха обозначаются цифрами. Внизу: фильтрованный (т.е. 1,5 Гц нижние частоты) сигнал на 3 одоранта и регулятор (минеральное масло). Обратите внимание на отклонения в ответ на 1% 1-гексанола (1), 1% бензальдегида (2) и 1% масляной кислоты (3). Обратите внимание на отсутствие реакции на отрицательный контроль, минеральное масло (4). C) Слева направо: репрезентативные ответы ЭАГ (в мВ) на 1% бензальдегида (вверху) и контроль минерального масла (внизу ) у самок Aedes aegypti, Anopheles stephensi, Culex quinquefasciatus и Toxorhynchites rutilus septentrionalis. Односекундный импульс представлен цветным прямоугольником над трассой ЭАГ. Обратите внимание на большой прогиб в ответ на бензальдегид и отсутствие реакции на минеральное масло. Кроме того, обратите внимание на различную чешуйку у Toxorhynchites rutilus septentrionalis. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Пример представления результатов ЕАГ и их статистического анализа. Ответ. Средние ответы ЭАГ самок Culex quinquefasciatus (N = 8), Anopheles stephensi (N = 10), Aedes aegypti (N = 8) и Toxorhynchites rutilus septentrionalis (N = 7) на 1% 1-гексанола (зеленый), 1% масляную кислоту (оранжевый), 1% бензальдегид (желтый) и минеральное масло (синий). B. Кривая доза-реакция самок Culex quinquefasciatus EAG для 1-гексанола (слева) (N = 9) и бензальдегида (справа) (N = 8). Столбцы представляют собой стандартную погрешность среднего значения. Буквы над полосами погрешностей указывают на статистические различия (тест попарной суммы рангов Уилкоксона с поправкой Бонферрони). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
На обонятельное опосредованное поведение влияет множество факторов, включая физиологические (например, возраст, время суток) и экологические (например, температура, относительная влажность)30. Таким образом, при проведении ЭАГ важно использовать насекомых, находящихся в одинаковом физиологическом состоянии (т.е. наблюдение за возрастом, голодание, спаривание)31 , а также поддерживать теплую и влажную среду вокруг препарата, чтобы избежать высыхания. Температура около 25 ° C является идеальной и влажностью от 60% до 80% для основной авиакомпании. Этого можно легко добиться, разместив барботер на основной цепи авиакомпании.
Кроме того, важно учитывать экологию каждого вида, чтобы получить результаты, имеющие отношение к биологии насекомого. Например, если вы используете ночные виды, подумайте о том, чтобы изменить их световой цикл, чтобы проверить их реакцию во время субъективной ночи. Выбор проведения ЭАГ в определенные моменты дня (т.е. когда насекомое активно) также важен. Например, если вы используете комаров Ae. aegypti, рассмотрите возможность проведения экспериментов во время пиков активности этого вида (т.е. в начале дня и ближе к вечеру). Опять же, световой цикл может быть легко смещен для удобства с помощью климатических камер или световых коробов с инверсированной световой программой с использованием программируемого таймера32. Eilerts et al.33 и Krishnan et al.34 показали, что чувствительность к определенным одорантам меняется в течение дня. Таким образом, хорошее знание экологии и биологии насекомого гарантирует более точные результаты.
Шум (как электрический, так и механический) может быть легко введен в EAG. Например, механические возмущения могут создаваться системой переменного тока, нагнетающей воздух к препарату ЭАГ. Электрический шум можно уменьшить с помощью Humbug, но, если он сохраняется, его можно отследить, подключив элементы и заземлив их на клетке Фарадея с помощью зажимов типа «крокодил» (рис. 3B). Это относится ко всем элементам, присутствующим вокруг препарата (т.е. микроскопу, лампе, микроманипуляторам). Некоторые элементы оборудования в клетке Фарадея должны быть отключены от сети перед записью, так как они могут по-прежнему создавать электрические помехи (например, источник холодного света) или размещаться вне клетки. Другой вид «шума» имеет обонятельную природу. Экспериментатор должен избегать использования духов или сильно пахнущего шампуня или моющего средства. Действительно, многие соединения, обнаруженные в них, могут быть обнаружены комарами (например, линалоол, цитронеллол, гераниол, эвгенол) и могут мешать и влиять на результаты экспериментов. Ношение лабораторного халата и перчаток также необходимо для ограничения нежелательного загрязнения авиакомпании, шприцев и электродов.
Преимущество представленного протокола заключается в том, что он легко применим ко всем видам комаров, как у самцов, так и у самок, при этом продлевает срок действия препарата (> 30 мин) и с ограниченной вариабельностью между препаратами. Этот метод приводит к минимальному шуму в сигнале EAG, что позволяет тестировать химические вещества при очень низких концентрациях. После того, как этапы вскрытия и монтажа будут освоены, этот метод может дать надежные данные за относительно короткий промежуток времени и простой анализ данных.
Электроантеннография позволяет экспериментатору только оценить, может ли комар обнаружить химическое вещество или нет. Однако для определения валентности этого химического вещества дополнительные поведенческие анализы, такие как ольфактометрические анализы, имеют решающее значение для определения того, является ли конкретный одорант или смесь привлекательными, отталкивающими или нейтральными, чтобы разработать эффективные инструменты для борьбы с комарами35.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Автору раскрывать нечего.
Acknowledgments
Я благодарен д-ру Клеману Виногеру и д-ру Джеффри Риффеллу за полезные дискуссии. Следующие реагенты были получены через BEI Resources, NIAID, NIH: Anopheles stephensi, штамм STE2, MRA-128, предоставленный Марком К. Бенедиктом; Aedes aegypti, Strain ROCK, MRA-734, предоставлено Дэвидом В. Северсоном; Culex quinquefasciatus, штамм JHB, яйца, NR-43025. Автор благодарит доктора Джейка Ту, доктора Нишу Дуггал, доктора Джеймса Вегера и Джеффри Марано за предоставление яиц комаров Culex quinquefasciatus и Anopheles stephensi (штамм: Liston). Aedes albopictus и Toxorhynchites rutilus septentrionalis получены от полевых комаров, собранных автором в районе долины Нью-Ривер (Вирджиния, США). Эта работа была поддержана Департаментом биохимии и Институтом наук о жизни Фралина.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air table Clean Bench | TMC | https://www.techmfg.com/products/labtables/cleanbench63series/accessoriess | Noise reducer |
| Analog-to-digital board | National Instruments | BNC-2090A | |
| Benchtop Flowbuddy Complete | Genesee Scientific | 59-122BC | To anesthesize mosquitoes |
| Borosillicate glass capillary | Sutter Instrument | B100-78-10 | To make the recording and references capillaries |
| Chemicals | Sigma Aldrich | Benzaldehyde: 418099-100 mL; Butyric acid: B103500-100mL; 1-Hexanol: 471402-100mL; Mineral oil: M8410-1L | Chemicals used for the experiments presented here |
| CO2 | Airgas or Praxair | N/A | To anesthesize mosquitoes |
| Cold Light Source | Volpi | NCL-150 | |
| Disposable syringes | BD | 1 mL (309628) / 3 mL (309657) | |
| Electrode cables | World Precision Instruments | 5371 | |
| Electrode gel salt free | Parkerlabs | 12-08-Spectra-360 | |
| Faraday cage | TMC | https://www.techmfg.com/products/electric-and-magnetic-field-cancellation/faradaycages | Noise reducer |
| Flowmeters | Bel-art | 65 mm (H40406-0010) / 150 mm (H40407-0075) | One of each |
| GCMS vials and caps | Thermo-fisher scientific | 2-SVWKA8-CPK | To prepare odorant dilutions |
| Glass syringes (Fortuna) | Sigma Aldrich | Z314307 | For odor delivery to the EAG prep |
| Humbug | Quest Scientific | http://www.quest-sci.com/ | Noise reducer |
| 2 mm Jack Holder, Narrow, 90 deg., With Wire | A-M Systems | 675748 | Electrode holder |
| Magnetic bases | Kanetec | MB-FX | x 2 |
| MATLAB + Toolboxes | Mathworks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | For delivering the pulses |
| Medical air | Airgas or Praxair | N/A | For main airline |
| Microscope | Nikkon | SMZ-800N | |
| Micromanipulators Three-Axis Coarse/Fine Compact Micromanipulator | Narishige | MHW-3 | x 2 |
| Microelectrode amplifier with headstage | A-M Systems | Model 1800 | |
| Mosquito rearing supplies | Bioquip | https://www.bioquip.com/Search/WebCatalog.asp | |
| Needles | BD | 25G (305127) / 21G (305165) | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-6A | For odor delivery to the EAG prep |
| PTFE Tubing of different diameters | Mc Master Carr | N/A | To connect solenoid valve, flowmeter, airline ect. |
| 30V/5A DC Power Supply | Dr. Meter | PS-305DM | |
| R version 3.5.1 | R project | https://www.r-project.org/ | For data analyses |
| Relay for solenoid valve | N/A | Custom made | |
| Silver wire 0.01” | A-M Systems | 782500 | |
| Solenoid valve (3-way) | The Lee Company | LHDA0533115H | |
| WinEDR software | Strathclyde Electrophysiology Software | WinEDR V3.9.1 | For EAG recording |
| Whatman paper | Cole Parmer | UX-06648-03 | To load chemical in glass syringe / Pasteur pipette |
References
- World Health Organization. World health statistics 2019: monitoring health for the SDGs, sustainable development goals. World Health Organization. , Geneva. (2019).
- Takken, W. The role of olfaction in host-seeking of mosquitoes: a review. International Journal of Tropical Insect Science. 12 (1-2-3), 287-295 (1991).
- Zwiebel, L. J., Takken, W.
- Potter, C. J. Stop the biting: targeting a mosquito's sense of smell. Cell. 156 (5), 878-881 (2014).
- Paluch, G., Bartholomay, L., Coats, J. Mosquito repellents: a review of chemical structure diversity and olfaction. Pest Management Science. 66 (9), 925-935 (2010).
- Schneider, D. Electrophysiological investigation on the antennal receptors of the silk moth during chemical and mechanical stimulation. Experientia. 13 (2), 89-91 (1957).
- Raguso, R. A., Light, D. M., Pickersky, E. Electroantennogram responses of Hyles lineata (Sphingidae: Lepidoptera) to volatile compounds from Clarkia breweri (Onagraceae) and other moth-pollinated flowers. Journal of Chemical Ecology. 22 (10), 1735-1766 (1996).
- Schweitzer, E. S., Sanes, J. R., Hildebrand, J. G. Ontogeny of electroantennogram responses in the moth, Manduca sexta. Journal of Insect Physiology. 22 (7), 955-960 (1976).
- Martel, V., Anderson, P., Hansson, B. S., Schlyter, F. Peripheral modulation of olfaction by physiological state in the Egyptian leaf worm Spodoptera littoralis (Lepidoptera: Noctuidae). Journal of Insect Physiology. 55 (9), 793-797 (2009).
- Spaethe, J., Brockmann, A., Halbig, C., Tautz, J. Size determines antennal sensitivity and behavioral threshold to odors in bumblebee workers. Naturwissenschaften. 94 (9), 733-739 (2007).
- Suchet, C., et al. Floral scent variation in two Antirrhinum majus subspecies influences the choice of naïve bumblebees. Behavioral Ecology and Sociobiology. 65 (5), 1015-1027 (2011).
- De Jong, R., Pham-Delègue, M. H. Electroantennogram responses related to olfactory conditioning in the honeybee (Apis mellifera ligustica). Journal of Insect Physiology. 37 (4), 319-324 (1991).
- Patte, F., Etcheto, M., Marfaing, P., Laffort, P. Electroantennogram stimulus-response curves for 59 odourants in the honeybee, Apis mellifica. Journal of Insect Physiology. 35 (9), 667-675 (1989).
- Alcorta, E. Characterization of the electroantennogram in Drosophila melanogaster and its use for identifying olfactory capture and transduction mutants. Journal of Neurophysiology. 65 (3), 702-714 (1991).
- Park, K. C., Ochieng, S. A., Zhu, J., Baker, T. C. Odor discrimination using insect electroantennogram responses from an insect antennal array. Chemical Senses. 27 (4), 343-352 (2002).
- Du, Y. J., Millar, J. G. Electroantennogram and oviposition bioassay responses of Culex quinquefasciatus and Culex tarsalis (Diptera: Culicidae) to chemicals in odors from Bermuda grass infusions. Journal of Medical Entomology. 36 (2), 158-166 (1999).
- Costantini, C., et al. Electroantennogram and behavioural responses of the malaria vector Anopheles gambiae to human-specific sweat components. Medical and Veterinary Entomology. 15 (3), 259-266 (2001).
- Collins, L. E., Blackwell, A. Electroantennogram studies of potential oviposition attractants for Toxorhynchites moctezuma and T. amboinensis mosquitoes. Physiological Entomology. 23 (3), 214-219 (1998).
- Seenivasagan, T., Sharma, K. R., Sekhar, K., Ganesan, K., Prakash, S., Vijayaraghavan, R. Electroantennogram, flight orientation, and oviposition responses of Aedes aegypti to the oviposition pheromone n-heneicosane. Parasitology Research. 104 (4), 827-833 (2009).
- Puri, S. N., Mendki, M. J., Sukumaran, D., Ganesan, K., Prakash, S., Sekhar, K. Electroantennogram and behavioral responses of Culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae) females to chemicals found in human skin emanations. Journal of Medical Entomology. 43 (2), 207-213 (2014).
- Cooperband, M. F., McElfresh, J. S., Millar, J. G., Carde, R. T. Attraction of female Culex quinquefasciatus Say (Diptera: Culicidae) to odors from chicken feces. Journal of Insect Physiology. 54 (7), 1184-1192 (2008).
- Dekker, T., Ignell, R., Ghebru, M., Glinwood, R., Hopkins, R. Identification of mosquito repellent odours from Ocimum forskolei. Parasites & Vectors. 4 (1), 183 (2011).
- Choo, Y. M., et al. Reverse chemical ecology approach for the identification of an oviposition attractant for Culex quinquefasciatus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), 714-719 (2018).
- Wolff, G. H., Lahondère, C., Vinauger, C., Riffell, J. A. Neuromodulation and differential learning across mosquito species. bioRxiv. , 755017 (2019).
- Lahondère, C., et al. The olfactory basis of orchid pollination by mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (1), 708-716 (2020).
- Beyenbach, K., Masia, R. Membrane conductances of principal cells in Malpighian tubules of Aedes aegypti. Journal of Insect Physiology. 48, 375-386 (2002).
- Oesterle, A. The Pipette Cookbook. , (2018).
- R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. (2018).
- Afify, A., Betz, J. F., Riabinina, O., Lahondère, C., Potter, C. J. Commonly used insect repellents hide human odors from Anopheles mosquitoes. Current Biology. 29 (21), 3669-3680 (2019).
- Martin, F., Riveron, J., Alcorta, E. Environmental temperature modulates olfactory reception in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 57 (12), 1631-1642 (2011).
- Qiu, Y. T., Gort, G., Torricelli, R., Takken, W., van Loon, J. J. Effects of blood-feeding on olfactory sensitivity of the malaria mosquito Anopheles gambiae: application of mixed linear models to account for repeated measurements. Journal of Insect Physiology. 59 (11), 1111-1118 (2013).
- Taylor, B., Jones, M. D. R. The circadian rhythm of flight activity in the mosquito Aedes aegypti (L.): the phase-setting effects of light-on and light off. Journal of Experimental Biology. 51 (1), 59-70 (1969).
- Eilerts, D. F., VanderGiessen, M., Bose, E. A., Broxton, K., Vinauger, C. Odor-specific daily rhythms in the olfactory sensitivity and behavior of Aedes aegypti mosquitoes. Insects. 9 (4), 147 (2018).
- Krishnan, B., Dryer, S. E., Hardin, P. E. Circadian rhythms in olfactory responses of Drosophila melanogaster. Nature. 400 (6742), 375-378 (1999).
- Pelletier, J., Guidolin, A., Syed, Z., Cornel, A. J., Leal, W. S. Knockdown of a mosquito odorant-binding protein involved in the sensitive detection of oviposition attractants. Journal of Chemical Ecology. 36 (3), 245-248 (2010).
