Summary
本稿では、雌と雄の両方を含むいくつかの属の蚊における成功した低ノイズのエレクトロアンテノグラムのための段階的なプロトコルについて詳しく説明します。
Abstract
雌の蚊は地球上で最も致命的な動物であり、血粉を獲得するときに感染する病原体のために、毎年100万人以上の命を奪っています。餌を与える宿主を見つけるために、蚊は視覚的、機械的、熱的、嗅覚を含む幅広い感覚的手がかりに依存しています。この研究では、研究者が蚊が濃度依存的に個々の化学物質と化学物質のブレンドを検出できるかどうかを評価できるようにする技術であるエレクトロアンテノグラフィー(EAG)について詳しく説明しています。ガスクロマトグラフィー(GC-EAG)と組み合わせると、この技術はアンテナを完全なヘッドスペース/複雑な混合物にさらすことを可能にし、目的のサンプルに存在するどの化学物質を蚊が検出できるかを決定することができます。これは、宿主の体臭だけでなく、植物の花束やその他の生態学的に関連する匂い(産卵場所の匂い物質など)にも適用できます。ここでは、長時間の準備応答時間を可能にし、 ネッタイシマカ、 アカイエカ、 ハマダラカ、ト キソリンカイト 蚊など、複数の属の雌と雄の両方の蚊に適用できるプロトコルについて説明しました。嗅覚は蚊と宿主の相互作用および蚊の生物学全般において主要な役割を果たすので、EAGおよびGC-EAGは、新しい疾患ベクター制御戦略(例えば、餌)の開発に関心のある化合物を明らかにすることができる。行動アッセイで補完して、各化学物質の価数(例えば、誘引剤、忌避剤)を決定することができる。
Introduction
蚊は地球上で最も致命的な生物であり、年間100万人以上の命を奪い、世界人口の半分以上を噛みながら、蚊が感染する病原体にさらされるリスクにさらしています1。これらの昆虫は、広範囲の手がかり(すなわち、熱的、視覚的、機械的、嗅覚的、聴覚的)に依存して、餌となる宿主(植物と動物の両方)を見つけ、交尾と産卵のために、そして幼虫と成虫の両方の段階で捕食者を避けます2,3。これらの感覚の中で、嗅覚は、特に匂い分子の中距離から長距離の検出において、上記の挙動において重要な役割を果たす2,3。宿主または産卵部位によって放出される匂いは、蚊の触側、足根、および触角2,3に位置する様々な特異的嗅覚受容体(例えば、GR、OR、IR)によって検出される。
嗅覚は宿主探索(植物および動物)、交尾および産卵行動の重要な要素であるため、蚊駆除のための新しいツールを開発するための研究の理想的なターゲットを構成します4。忌避剤(DEET、IR3535、ピカリジンなど)と餌(BGセンチネルヒトルアーなど)の研究は非常に多作ですが5、蚊の防除における現在の課題(殺虫剤耐性、侵入種など)のために、蚊の生物学に基づいた新しい効率的な防除方法の開発が不可欠です。
多くの技術(例えば、嗅覚計、着陸アッセイ、電気生理学)は、蚊の化合物または化合物の混合物の生物活性を評価するために使用されてきた。その中で、エレクトロアンテノグラム(またはエレクトロアンテノグラム(EAG))を使用して、匂い物質が蚊のアンテナによって検出されるかどうかを決定できます。この技術は当初シュナイダー6によって開発され、それ以来、蛾7,8,9、マルハナバチ10,11、ミツバチ12,13、ショウジョウバエ14,15など、さまざまな昆虫属で使用されてきました。エレクトロアンテノグラフィはまた、蚊16、17、18、19、20、21、22、23、24、25における単一または複数のアンテナを含む様々なプロトコルを用いて採用されている。
蚊は比較的小さくて繊細な昆虫で、アンテナはかなり細いです。蛾やマルハナバチなどの大きな昆虫にEAGを実行することは、サイズが大きく、アンテナが厚いため比較的簡単ですが、蚊でEAGを実施するのは難しい場合があります。特に、良好な信号対雑音比の維持と応答性の高い準備は、データの再現性と信頼性の2つの主要な要件です。
ここで提案されている低ノイズEAGのステップバイステップガイドは、これらの制限に対する解決策を直接提供し、このプロトコルを ネッタイシマカ、 ハマダラカ、 アカイエカ、ト キソリンカイトなどのさまざまな属のいくつかの蚊種に適用できるようにし、女性と男性の両方の技術について説明します。エレクトロアンテノグラフィーは、生物活性化合物をスクリーニングして測定するための迅速で信頼性の高い方法を提供し、行動アッセイで原子価が決定された後、餌の開発に活用できます。
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Protocol
1.生理食塩水の準備
- 事前に生理食塩水を準備し、冷蔵庫に保管してください。
- バイエンバッハとマシア26 に従って、溶液を準備します。
注:生理食塩水レシピ(mM):150.0 NaCl、25.0 HEPES、5.0グルコース、3.4 KCl、1.8 NaHCO3、1.7 CaCl 2、および1.0 MgCl2。pHは1 M NaOHで7.1に調整されます。棚の貯蔵量を増やすために、この時点でブドウ糖またはスクロースを調製物に加えないでください。EAGを実行する直前に、必要な量を生理食塩水に追加します(実験あたり約50 mL)。
2.臭気の準備と保管
- 匂い物質混合物または単一化合物希釈液を1.5 mLの琥珀色のバイアルで事前に調製し、化合物の分解を防ぐために-20°Cで保存します。
注意: 濃度は、実施するテストによって異なります。0.1%または1%は、化合物を検出できるかどうかを判断するために一般的に使用されます。用量反応曲線については、特定の化学物質の連続希釈を準備し、その濃度を最低濃度から最高濃度までテストします。 - 試験した化学物質の溶解度に応じて、水、エタノール、ヘキサン、パラフィン油、または鉱油で希釈液を調製します。
- 実験のために溶媒コントロール(溶媒のみを含むバイアル)を必ず準備してください。
- 実験開始の30分前に冷凍庫から匂い物質を取り除き、解凍します。使用前に各バイアルをボルテックスし、薬液と溶媒とをよく混合する。
- 10 μLの溶液を、ラベル付きガラスシリンジまたはパスツールピペット内に装填したろ紙(0.5 cm x 2 cm)にピペットで貼り付けます。
- 汚染を防ぐために、各化合物または混合物を特定のパスツールピペットまたはシリンジに入れます。
注意: 実験を開始する10分前に負荷をかけると、臭いがシリンジ内で拡散する可能性がありますが、劣化を防ぐために長くは拡散しません。この時点でパスツールピペットまたはシリンジをキャップしたままにして、実験を開始する前に化学物質を十分に拡散させます。 - EAGを実行するたびに、ろ紙を廃棄して新しいものと交換し、紙が浸すぎて針が詰まる危険がないようにします。定期的に(10回ごとに)針を交換してください。
3.蚊の分離
- 実験当日に蚊を隔離する。
- 実験当日に少なくとも6日齢の蚊を使用して、宿主関連の匂い物質に対する反応を高めるために雌が交尾する可能性を高めます。
注:プロジェクトに応じて、テスト時に蚊の年齢を調整します。生理学的状態を確認して調和させます(例:血液で育てられた、飢えている、以前に給餌されたことがないなど)。 - 蚊を最大12時間飢えさせ(つまり、砂糖にアクセスできない)、モチベーションと感度を高めます。
- 蚊帳が飛ぶのを止めるまで冷蔵庫(4°C)に入れて、個体を鉗子付きのシングルカップに繊細に移すことができるようにします。
注:耐寒性が高い種は、CO2 フライパッドを使用して倒すことができます。蚊のEAG製剤の応答性を低下させる乾燥を防ぐために、蚊が長時間その上にとどまらないようにしてください。 - EAGを実行する前に、単一の蚊が入ったカップを室温で保管し、日中使用しない可能性のある蚊は廃棄してください。
4.電極ホルダーとキャピラリーの準備
- キャピラリーの引っ張り、準備、保管
- フィラメント付きのホウケイ酸キャピラリーを使用します(内径:0.78 mm、外径:1 mm)。機器に応じてそれらを引っ張る27.
注意: 引っ張った毛細血管をペトリ皿に保管します。ペトリ皿をワックスまたは無香料のモデリング粘土の上に置き、それらが動いたり壊れたりしないようにします。 - EAG実験を実行する前に、顕微鏡下で2つの毛細血管の先端を一対の鉗子で静かに壊します。
注意: 首(大きな毛細管)またはアンテナの先端(小さい毛細管)のいずれかに合うように、一方が他方よりわずかに大きいことを確認してください。毛細管壁に亀裂がなく、切り込みがきれいであることを確認してください。これには忍耐と練習が必要です。 - それでも無傷の場合は、実験終了後に脱イオン(DI)水ですすいだ後、これらの毛細血管を再利用してください。先端にクリーニングワイプをそっと当てて、余分な水分を取り除きます。保管ペトリ皿に戻します。先端が曲がっている場合は、毛細管を廃棄してください。
- フィラメント付きのホウケイ酸キャピラリーを使用します(内径:0.78 mm、外径:1 mm)。機器に応じてそれらを引っ張る27.
- 電極ホルダーとキャピラリー取り付け
- 異なる色のラボテープを使用して、2つの電極ホルダーに「記録」および「参照」というラベルを付けます。これは、蚊の頭と電極の取り付けをガイドするのに役立ちます。
- 電極ホルダーの内部が透明で、ホウケイ酸の破片がないことを確認してください。
- 塩素化:電極ホルダーの銀線を純粋な漂白剤に約5分間浸します。ワイヤーは光沢のあるライトグレーからマットなダークグレーに変わります。
- ゴム栓を緩め、20Gの針を使用してキャピラリーの内側を10%生理食塩水で満たします。
- シリンジを使用してホウケイ酸キャピラリーを生理食塩水で満たします。電極ホルダーにも引っ張られたキャピラリーにも気泡が存在しないことを確認してください。
注意: 毛細血管に気泡が発生する可能性を減らすために、針をそっと引き出しながら毛細血管内の生理食塩水を押し続け、フィラメント付きの毛細血管を使用します。キャピラリーに1:3電極ゲルと生理食塩水からなる溶液を装填することができる。これは生理食塩水の蒸発を防ぐのに役立ち、実験者がさまざまなステップを完了するのにより多くの時間を必要とするため、EAGを学習および練習するときに特に役立ちます。 - 浸した後、銀線をDI水ですすぎ、2つの毛細管に挿入します。ワイヤーの先端がキャピラリーの先端から1mm未満であることを確認してください。キャピラリーが壊れずに電極ホルダー内のゴムリングを通過することを確認してください。ゴム栓をそっと締めます。気泡がないことを確認します。
- 参照電極ホルダー(ネック)の開口部が広く、記録電極ホルダー(アンテナ)の開口部が小さいキャピラリーを使用します。
- ヘッドを取り付ける準備ができるまで先端が乾かないように、取り付けられた2つの電極ホルダーをウェットクリーニングワイプの上に置いておきます。
5. EAGリグの準備(図1)
- エアテーブルが上がっていること、航空会社に詰まりがないことを確認してください。実験の途中で交換しないように、医療用空気のタンクがまだいっぱいであることを確認してください。加湿器に気泡があることを確認してください。
- エアおよびパルスデリバリーシステム
- 医療用エアガスタンクの電源を入れます。
- 2つの流量計のレベルを確認してください。
注:実験全体を通して準備を入浴する主な気流を制御する流量計は140mL / minである必要があり、臭気パルスに関連する他の流量計は15mL / minを読み取る必要があります。
- GC-EADを実行する場合は、マシン、ガスタンクの電源を入れ、ファイル/メソッドを作成/ロードします。
- コンピューター、ソフトウェアアプリケーション、バルブ電源の電源を入れ、ソフトウェアアプリケーションが機能するようにインターネット接続を確認します。
- ソフトウェアアプリケーション:パルスを配信するための短いスクリプトを作成できます。
- EAGソフトウェア:任意の電気生理学ソフトウェアを使用します。
- ソフトウェアにパラメータ(アンプ、録音時間、パルスの持続時間など)を実装します。
- 制御パルスを配信して、パルスを配信するバルブが機能していることを確認します。
- 電源を5.2Vに設定します。 アンプのパラメータを確認します。
注:ここに示すデータに使用されるパラメータは次のとおりです:0.1Hzの低カットオフフィルター。500Hzの高カットオフフィルター。ゲインは100倍です。
6.蚊の頭の準備と取り付け(図2)
- アルミ板を氷の上に置き、その上にウェットクリーニングワイプを置きます。
- 隅に電極ゲルを少し入れます。
- 蚊のカップを氷の上に置き、蚊を数分間、または飛行が止まるまで冷まします。
注:一部の種は耐寒性があり、下降するにはCO2 フライパッド上で迅速な麻酔が必要になる場合があります。蚊がどちらかにとどまるのは少ないほど良いです。 - 蚊を背中に置き、各アンテナの先端(最後のセグメントのごく一部)をマイクロハサミでクリップします。
- 鉗子を使用して、電極ゲルのドロップの横にある蚊をドラッグし、各アンテナの先端をゲルにそっと浸します。電極ゲルの最後のセグメント以上のものを浸すことは避けてください。
- 鉗子を使用して、蚊のアンテナを隣り合わせに保ちながら引き出します。それらをゲルから一緒に出させてください。アンテナがクリーニングワイプの表面に触れないようにしないと、アンテナが分離する可能性があることを確認してください。
- 蚊を横に置き、マイクロハサミまたはかみそりの刃を使って頭を切り刻みます。
注意: ヘッドが切り刻まれたら、すぐに次のステップに進み、EAGリグに進んで録音を開始します。準備は約30分間反応し続ける必要があります。 - 参照電極を取り、ゲルの先端をそっと深くします。首のティッシュと接触させ、頭をそれに貼り付けます。
- 電極ホルダーをEAG顕微鏡の下に移動し、顕微鏡を通して見て、ヘッド(つまり、参照)電極をマイクロマニピュレーターに配置します。アンテナが中央にあることを確認します。
- 記録電極をつかみ、アンテナ先端の前に置きます。マイクロマニピュレーターを使用して、先端にできるだけ近づけて位置合わせします。顕微鏡を使用して、記録電極の先端をアンテナに向かって動かします。
- 両方の電極ホルダーを接続します amp挿入後にチップが動かないように、チップを挿入する前に。
- アンテナチップを記録電極に挿入します。生理食塩水と電極ゲルに接触するだけで、毛細管を通して透明に見えることを確認してください。アンテナは「吸引効果」によって入ります。
- 必要に応じて、顕微鏡下で鉗子で頭と先端の位置を調整します。
- エアラインチューブを蚊の頭の準備の近くに置きます(距離:1 cm)。
注意: 頭が落ちた場合は、解剖ステーションに戻って頭を取り付け直すか、頭を紛失した場合、または頭が切断されてから5分以上経過している場合は、新しい頭を準備します。キャピラリーとネック/アンテナの間の良好な接続は、低ノイズと信頼性の高い録音に不可欠です。理想的には、アンテナの先端は、一度挿入された記録電極のワイヤから1mm未満になります。 - 光源を使用する場合は、オフにします。
- 蚊帳の準備(距離:20 cm)の近くに真空ラインを配置し、メインエアラインに合わせます。
注:真空は、刺激後のヘッドの準備を取り巻く化学物質を除去するのに役立ち、パルスが適用された後にEAG応答につながる可能性があります。
7. 録音
- アンテナの先端を挿入した後、電源を入れます ampリファイアとノイズリデューサー。ベースライン信号を観察し、ノイズが多くないことを確認します。
注意: 電気信号に大きな振動が存在するかどうかを観察してください。信号がきれいになるまで、必要に応じてヘッドとアンテナの先端の位置を調整します。ワニ口クリップを使用して、ファラデーケージまたはエアテーブルにノイズをもたらすものをすべて接地します。振幅が0.01mV未満のベースライン信号は、微小なEAG応答を検出して識別するのに理想的です。 - 騒音レベルが満たされたら、最初の臭気シリンジを挿入してエアラインの穴にテストします。
- ファラデーケージを閉じます。騒音を減らすために、準備の前にとどまらないでください。
- EAGソフトウェアの記録をクリックします。
- ソフトウェアアプリケーションを使用してパルスを配信します。
注:パルスの数と持続時間は、実験によって異なります。ここでは、匂い物質あたり単一の1秒パルスが使用されています。匂い物質は45秒分離された。 - ラボノートの蚊触角の応答に注意してください。
注意: 蚊のアンテナによって匂い物質が検出されると、信号の明らかな偏向が観察されます( 図3Aを参照)。 - 次の臭いまたは濃度に進みます。用量反応曲線が実行されない限り、匂い物質の提示をランダム化することを忘れないでください。.
注:実験では、ネガティブコントロールとポジティブコントロールを使用する必要があります。これにより、観察された応答が実際に嗅覚応答であり、機械的または電気的ノイズによるものではないことが保証されます。 - 記録の最後に、ポジティブコントロールを適用して、アンテナがまだ応答していることを確認します。
注:これまでにテストされたすべての蚊種がこの化合物に反応したため、0.1%または1%のベンズアルデヒドを使用してください。 - 次の蚊の準備を進めます。
8.クリーニング
- 電源を切ります ampリファイア、ノイズリデューサー、航空会社、およびコンピューター。
- 匂い物質を冷凍庫に戻します。
- ガラスシリンジからろ紙を取り除き、壁に残留物が見える場合は100%エタノールで洗浄します。クリーニングワイプで一晩乾かします。
- 電極ホルダーをDI水で洗浄して、塩の痕跡を取り除きます。クリーニングワイプにそっと当てて乾かします。
- 蚊の残りを冷凍庫に入れ、24時間後に処分します。
注:感染した蚊を扱う場合は、施設の安全要件に従ってください。
9. データ分析
- EAGの応答を手動または自動で測定します。
注:EAG振幅(-mV)はここで測定されます。各化合物に複数のパルスが適用されている場合の平均。使用するソフトウェアに応じて、EAGを自動的に検出および測定できます。ただし、各応答を個別に検査して応答の形状を確認し、キャリーオーバー、応答の遅延などを評価することが不可欠です。理想的なEAG応答は脈拍と一致し、明確なたわみを示し、蚊の準備間で再現可能です(図3)。 - 生データを提示して、変動を最小限に抑え、ノイズ信号が少なく、応答が明確であることを示します(図3B)。
注:データは正規化することもできます(Zスコアなど)。陰性管理値(例えば、鉱油)(すなわち、ベースライン)は、応答から差し引くことができ、そうでない場合は、図に提示する必要があります。ポジティブコントロールも提示する必要があります。 - 任意の統計ソフトウェア28を用いて統計分析を行う。
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Representative Results
エレクトロアンテノグラフィは、化学物質または化学物質のブレンドが昆虫アンテナによって検出されたかどうかを判断するための強力なツールです。また、濃度の漸進的な増加を使用して、所与の化学物質の検出閾値を決定するためにも使用できます(すなわち、用量曲線応答、 図4B)。さらに、宿主関連臭気29に対する応答に対する忌避剤の効果を試験することは有用である。
ポジティブコントロールとネガティブコントロールは、EAGでは常に使用する必要があります。ここでは、陽性対照としてベンズアルデヒドを用いた(図3B、 3C、 4A)。この化合物は、これまでに試験されたすべての蚊種において触角応答を誘発することが見出されている24、25、29。ネガティブコントロールも使用する必要があり、化学物質の希釈に使用される溶媒(鉱物油またはパラフィン油、ヘキサンなど)で構成され、応答を誘発してはなりません(図3B、 3C、 4A)。
実際、EAGを実施する場合、制御を適用するときにたわみに注意するべきではありません(図3B、 3C、 4A)。応答が観察された場合、シリンジ、溶媒コントロール、および/または臭気ラインのいずれかが汚染されている可能性があります。その場合は、新しい溶液を調製し、シリンジを100%エタノールで洗浄して乾燥させるか、航空会社を100%エタノールですすぎ、乾燥させる必要があります。選択されたコントロールが応答(エタノールなど)を誘発する場合、コントロールの-mVで得られた値を、エタノールと試験された化学物質の組み合わせについて得られた値から差し引いて、試験された化学物質がアンテナに与える影響を評価する必要があります。
蚊の種は、さまざまな化合物に反応する能力と、その反応の大きさが異なります。例えば、 トキソリンカイトの 蚊は、 Ae. aegypti、 An. Stephensi および Cx. quinquefasciatus と比較して非常に大きなEAGを産生する(図3C、 図4A)。
EAGでは、2番目のパルスとそれに続くパルスは通常、EAG応答が小さくなります。1つの匂い物質の提示は、以下に対する反応にも影響を与える可能性があるため、匂い物質のパネルを効率的にテストするには、匂い物質の順序と複数のアッセイをランダム化することが重要です(用量反応曲線が実行されない限り)。さらに、パルス(例えば、5秒)と匂い物質(例えば、45秒)の提示を分離することは、EAG応答を最適化するのに役立つであろう。
試験された化学物質の揮発性はさまざまであり、嗅覚応答に影響を与える可能性があり、試験された化学物質の揮発性が非常に低い場合、応答の遅延につながる可能性があります。アッセイを最適化するためにEAGを実施する前に、化学物質の揮発性と溶解度を知る必要があります。希釈液の調製に使用する溶媒も慎重に選択する必要があります(エタノール、ヘキサン、ミネラル、パラフィンオイルなど)。さらに、濃度は賢明に選択されるべきであり、理想的には生態学的に関連しているべきです。1%または0.1%の濃度がよく使用されますが、比較的高く、必ずしも昆虫が自然界で経験できることを表すものではありません。それでも、場合によっては比較的高濃度の化合物をスクリーニングすることが有用です(例えば、餌の開発のため)。忌避剤は、市販の濃度で試験することができる(例えば、DEETは通常、40%の濃度で販売されている)。
ガスクロマトグラフィー(すなわち、GC-EADs)25と組み合わせると、応答を誘発する化合物をGC-MSで同定し、様々な濃度で、またはEAGとの混合物で個別に試験することができる。テストされた化学物質の価数はEAGでは決定できないことは言及する価値があります。補完的な行動実験(例えば、嗅覚計、摂食アッセイ)のみが、アンテナによって検出された化学物質が蚊にとって魅力的、忌避性、または中性であるかどうかを評価できる。最後に、EAG実験は末梢神経系の反応のみを示しています。
図1:以下で構成されるエレクトロアンテノグラムのセットアップ: A)顕微鏡:使用する顕微鏡は、蚊のアンテナの先端を記録電極に挿入できるように、実験者が準備をはっきりと見ることができるようにする必要があります。 B)コールドライトランプ:録音が開始されたらランプをオフにする必要があります。 C)真空ライン:これにより、蚊の頭の準備の周りに匂い物質が蓄積するリスクが軽減され、実際の刺激から切り離された触角応答が発生する可能性があります。 D)マイクロマニピュレーター(x2):これらは、記録電極の毛細管に蚊触角を挿入するために必要な非常に微細な電極ホルダーの動きを可能にするであろう。 E)記録電極ホルダー。 F)参照電極ホルダー。 G)ヘッドステージ:両方の電極がヘッドステージに差し込まれ、ヘッドステージがアンプに接続されます。 H)主要航空会社:一定のきれいな気流が蚊の頭を浴びた。流量は流量計によって調整されます。 I)電磁弁および流量計に接続された臭気送達用の注射器。 J)エアテーブル:エアテーブルは騒音を低減します。 K)ファラデーケージ:ファラデーケージは電気ノイズを防ぎます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:EAG記録のためのネッタイシマカ蚊の頭の準備を段階的に進めます。 A)両方のアンテナが無傷であることを確認するために、氷のプレートの上の背中の雌の蚊。B)マイクロハサミによるアンテナ切除の最後のセグメント。C)アンテナを電極ゲルに浸す。D)アンテナを引き抜いた後、アンテナがくっつきます。各アンテナの1つのセグメントのみが電極ゲル内にある必要があります。E)蚊の頭の切除。F)参照電極に取り付けられたヘッド。EAGリグに移動するのに十分安定している必要があります。A'-F'。男性のEAGについて上記で提示したのと同じ手順。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:蚊のEAGと生のEAGトレースの概略図。A )EAG回路図(左)とEAG応答の特性(右)。(写真左)蚊の頭は、参照電極と増幅器に接続された記録電極の間に取り付けられています。アンテナは、匂い刺激がパルスされる一定の気流に浸されます。化学物質を検出すると、信号のたわみ(mV単位)が発生します。(右)化学的検出は、ベースラインに戻るまで細胞脱分極(DPR)に続いて細胞再分極(RPR)につながります。匂いパルスは灰色の長方形で表されます。赤い線はEAG応答の振幅を示します。B) アカイエカ の雌蚊のEAG記録痕跡全体を強調するWinEDRソフトウェアのスクリーンショット。上:フィルタリングされていない(つまり、生の)信号。中央:1秒の臭気パルスは数字で示されます。下:3つの匂い物質および対照(鉱油)に対する濾過された(すなわち、1.5Hzローパス)信号。1%の1-ヘキサノール(1)、1%のベンズアルデヒド(2)、および1%の酪酸(3)に応答するたわみに注意してください。ネガティブコントロール、鉱油(4)に対する応答がないことに留意されたい。 C) 左から右へ:雌の ネッタイシマカ、 ハマダラカ、アカイエカ、および トキソリンチテス・ルチラス・セプテントリオナリスの1%ベンズアルデヒド(上)および鉱油対照(下)に対する代表的なEAG応答(mV)。1秒のパルスは、EAGトレースの上にある色付きの長方形で表されます。ベンズアルデヒドに対する大きなたわみと鉱物油に対する反応の欠如に注意してください。また、 トキソリンチテス・ルチラス・セプテントリオナリスの異なるスケールに注意してください。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:EAGの結果とその統計分析の表現例。 A.いいえ。アカイエカ(N = 8)、ハマダラカ(N = 10)、ネッタイシマカ(N = 8)、およびトキソリンチテス・ルチルス・セプテントリオナリス(N = 7)の雌の平均EAG反応は、1%1-ヘキサノール(緑)、1%酪酸(オレンジ)、1%ベンズアルデヒド(黄色)および鉱油(青)。B.アカイエカの雌の1-ヘキサノール(左)(N = 9)とベンズアルデヒド(右)(N = 8)のEAG用量反応曲線。バーは平均の標準誤差を表します。エラーバーの上の文字は、統計的差を示します(ボンフェローニ補正を使用したペアワイズウィルコクソン順位和検定)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
嗅覚を介した行動は、生理学的(年齢、時刻など)や環境(温度、相対湿度など)など、多くの要因の影響を受けます30。したがって、EAGを実施する際には、同じ生理学的状態にある昆虫(すなわち、年齢、飢餓、交尾のモニタリング)31 を使用し、乾燥を避けるために準備の周囲に暖かく湿気の多い環境を維持することが不可欠です。25°C前後の温度が理想的で、主要航空会社の湿度は60%から80%です。これは、主要な航空会社の回路にバブラーを配置することで簡単に実現できます。
さらに、昆虫の生物学に関連する結果を得るために、各種の生態を考慮することが重要です。たとえば、夜行性の種を使用する場合は、主観的な夜間の反応をテストするために、光のサイクルを逆にすることを検討してください。一日の特定の瞬間(すなわち、昆虫が活動しているとき)にEAGを実施することを選択することも重要です。たとえば、 Ae. ae. aegypti 蚊を使用する場合は、この種の活動のピーク時(つまり、一日の早い時間から午後遅く)に実験を行うことを検討してください。ここでも、ライトサイクルは、プログラム可能なタイマ32を使用する反転ライトプログラムを備えた気候チャンバまたはライトボックスを使用して便宜上容易にシフトすることができる。Eilertsら33 およびKrishnanら34は、特定の匂い物質に対する感受性が一日を通して変化することを示している。したがって、昆虫の生態と生物学に関する十分な知識は、より正確な結果を保証します。
ノイズ(電気的または機械的)はEAGに簡単に導入できます。例えば、機械的摂動は、EAG調製物に向かって空気を吹き付けるACシステムによって作り出すことができる。電気的ノイズはHumbugで低減できますが、持続する場合は、要素を差し込み、ワニ口クリップを使用してファラデーケージに接地することで追跡できます(図3B)。これは、調製物の周囲に存在するすべての要素(すなわち、顕微鏡、ランプ、マイクロマニピュレーター)に適用される。ファラデーケージ内の一部の機器は、電気ノイズ(冷光源など)を生成したり、ケージの外に配置したりする可能性があるため、録音する前にプラグを抜く必要があります。別のタイプの「ノイズ」は嗅覚の性質のものです。実験者は香水の着用を避けるか、香りの強いシャンプーまたは洗剤を使用する必要があります。実際、これらに見られる多くの化合物(例えば、リナロール、シトロネロール、ゲラニオール、オイゲノール)は蚊によって検出することができ、実験結果を妨害し、影響を与える可能性がある。白衣と手袋の着用も、航空会社、注射器、電極の不要な汚染を制限するために不可欠です。
提示されたプロトコルは、調製物の寿命を延ばし(>30分)、調製物間の変動を制限しながら、雄および雌の両方のすべての蚊種に容易に適用できるという利点を有する。この方法では、EAG信号のノイズが非常に最小限に抑えられるため、非常に低濃度の化学物質をテストできます。解剖と取り付けの手順を習得すると、この手法は比較的短時間で信頼性の高いデータを生成し、簡単なデータ分析を行うことができます。
エレクトロアンテノグラフィーでは、実験者は蚊が化学物質を検出できるかどうかを評価することしかできません。しかしながら、この化学物質の価数を決定するために、嗅覚計アッセイなどの相補的な行動アッセイは、蚊駆除のための効率的なツールを開発するために、特定の匂い物質または混合物が魅力的、忌避剤、または中性であるかどうかを決定するために重要である35。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
有益な議論をしてくれたクレマン・ヴィノーガー博士とジェフリー・リッフェル博士に感謝します。以下の試薬は、BEI Resources、NIAID、NIHを通じて入手しました: Anopheles stephensi、Strain STE2、MRA-128、Mark Q. Benedictが寄稿。 ネッタイシマカ、ストレインロック、MRA-734、デビッドW.セバーソンによる寄稿。 アカイエカ、JHB株、卵、NR-43025。著者は、 アカイエカ と ハマ ダラカの蚊の卵を提供してくれたジェイク・トゥ博士、ニシャ・ダガル博士、ジェームズ・ウェガー博士、ジェフリー・マラノに感謝します。 ネッタイシマカ と トキソリンチテス・ルチルス・セプテントリオナリス は、著者がニューリバーバレー地域(米国バージニア州)で収集した野蚊に由来します。この研究は、生化学部門とフラリン生命科学研究所の支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air table Clean Bench | TMC | https://www.techmfg.com/products/labtables/cleanbench63series/accessoriess | Noise reducer |
| Analog-to-digital board | National Instruments | BNC-2090A | |
| Benchtop Flowbuddy Complete | Genesee Scientific | 59-122BC | To anesthesize mosquitoes |
| Borosillicate glass capillary | Sutter Instrument | B100-78-10 | To make the recording and references capillaries |
| Chemicals | Sigma Aldrich | Benzaldehyde: 418099-100 mL; Butyric acid: B103500-100mL; 1-Hexanol: 471402-100mL; Mineral oil: M8410-1L | Chemicals used for the experiments presented here |
| CO2 | Airgas or Praxair | N/A | To anesthesize mosquitoes |
| Cold Light Source | Volpi | NCL-150 | |
| Disposable syringes | BD | 1 mL (309628) / 3 mL (309657) | |
| Electrode cables | World Precision Instruments | 5371 | |
| Electrode gel salt free | Parkerlabs | 12-08-Spectra-360 | |
| Faraday cage | TMC | https://www.techmfg.com/products/electric-and-magnetic-field-cancellation/faradaycages | Noise reducer |
| Flowmeters | Bel-art | 65 mm (H40406-0010) / 150 mm (H40407-0075) | One of each |
| GCMS vials and caps | Thermo-fisher scientific | 2-SVWKA8-CPK | To prepare odorant dilutions |
| Glass syringes (Fortuna) | Sigma Aldrich | Z314307 | For odor delivery to the EAG prep |
| Humbug | Quest Scientific | http://www.quest-sci.com/ | Noise reducer |
| 2 mm Jack Holder, Narrow, 90 deg., With Wire | A-M Systems | 675748 | Electrode holder |
| Magnetic bases | Kanetec | MB-FX | x 2 |
| MATLAB + Toolboxes | Mathworks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | For delivering the pulses |
| Medical air | Airgas or Praxair | N/A | For main airline |
| Microscope | Nikkon | SMZ-800N | |
| Micromanipulators Three-Axis Coarse/Fine Compact Micromanipulator | Narishige | MHW-3 | x 2 |
| Microelectrode amplifier with headstage | A-M Systems | Model 1800 | |
| Mosquito rearing supplies | Bioquip | https://www.bioquip.com/Search/WebCatalog.asp | |
| Needles | BD | 25G (305127) / 21G (305165) | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-6A | For odor delivery to the EAG prep |
| PTFE Tubing of different diameters | Mc Master Carr | N/A | To connect solenoid valve, flowmeter, airline ect. |
| 30V/5A DC Power Supply | Dr. Meter | PS-305DM | |
| R version 3.5.1 | R project | https://www.r-project.org/ | For data analyses |
| Relay for solenoid valve | N/A | Custom made | |
| Silver wire 0.01” | A-M Systems | 782500 | |
| Solenoid valve (3-way) | The Lee Company | LHDA0533115H | |
| WinEDR software | Strathclyde Electrophysiology Software | WinEDR V3.9.1 | For EAG recording |
| Whatman paper | Cole Parmer | UX-06648-03 | To load chemical in glass syringe / Pasteur pipette |
References
- World Health Organization. World health statistics 2019: monitoring health for the SDGs, sustainable development goals. World Health Organization. , Geneva. (2019).
- Takken, W. The role of olfaction in host-seeking of mosquitoes: a review. International Journal of Tropical Insect Science. 12 (1-2-3), 287-295 (1991).
- Zwiebel, L. J., Takken, W.
- Potter, C. J. Stop the biting: targeting a mosquito's sense of smell. Cell. 156 (5), 878-881 (2014).
- Paluch, G., Bartholomay, L., Coats, J. Mosquito repellents: a review of chemical structure diversity and olfaction. Pest Management Science. 66 (9), 925-935 (2010).
- Schneider, D. Electrophysiological investigation on the antennal receptors of the silk moth during chemical and mechanical stimulation. Experientia. 13 (2), 89-91 (1957).
- Raguso, R. A., Light, D. M., Pickersky, E. Electroantennogram responses of Hyles lineata (Sphingidae: Lepidoptera) to volatile compounds from Clarkia breweri (Onagraceae) and other moth-pollinated flowers. Journal of Chemical Ecology. 22 (10), 1735-1766 (1996).
- Schweitzer, E. S., Sanes, J. R., Hildebrand, J. G. Ontogeny of electroantennogram responses in the moth, Manduca sexta. Journal of Insect Physiology. 22 (7), 955-960 (1976).
- Martel, V., Anderson, P., Hansson, B. S., Schlyter, F. Peripheral modulation of olfaction by physiological state in the Egyptian leaf worm Spodoptera littoralis (Lepidoptera: Noctuidae). Journal of Insect Physiology. 55 (9), 793-797 (2009).
- Spaethe, J., Brockmann, A., Halbig, C., Tautz, J. Size determines antennal sensitivity and behavioral threshold to odors in bumblebee workers. Naturwissenschaften. 94 (9), 733-739 (2007).
- Suchet, C., et al. Floral scent variation in two Antirrhinum majus subspecies influences the choice of naïve bumblebees. Behavioral Ecology and Sociobiology. 65 (5), 1015-1027 (2011).
- De Jong, R., Pham-Delègue, M. H. Electroantennogram responses related to olfactory conditioning in the honeybee (Apis mellifera ligustica). Journal of Insect Physiology. 37 (4), 319-324 (1991).
- Patte, F., Etcheto, M., Marfaing, P., Laffort, P. Electroantennogram stimulus-response curves for 59 odourants in the honeybee, Apis mellifica. Journal of Insect Physiology. 35 (9), 667-675 (1989).
- Alcorta, E. Characterization of the electroantennogram in Drosophila melanogaster and its use for identifying olfactory capture and transduction mutants. Journal of Neurophysiology. 65 (3), 702-714 (1991).
- Park, K. C., Ochieng, S. A., Zhu, J., Baker, T. C. Odor discrimination using insect electroantennogram responses from an insect antennal array. Chemical Senses. 27 (4), 343-352 (2002).
- Du, Y. J., Millar, J. G. Electroantennogram and oviposition bioassay responses of Culex quinquefasciatus and Culex tarsalis (Diptera: Culicidae) to chemicals in odors from Bermuda grass infusions. Journal of Medical Entomology. 36 (2), 158-166 (1999).
- Costantini, C., et al. Electroantennogram and behavioural responses of the malaria vector Anopheles gambiae to human-specific sweat components. Medical and Veterinary Entomology. 15 (3), 259-266 (2001).
- Collins, L. E., Blackwell, A. Electroantennogram studies of potential oviposition attractants for Toxorhynchites moctezuma and T. amboinensis mosquitoes. Physiological Entomology. 23 (3), 214-219 (1998).
- Seenivasagan, T., Sharma, K. R., Sekhar, K., Ganesan, K., Prakash, S., Vijayaraghavan, R. Electroantennogram, flight orientation, and oviposition responses of Aedes aegypti to the oviposition pheromone n-heneicosane. Parasitology Research. 104 (4), 827-833 (2009).
- Puri, S. N., Mendki, M. J., Sukumaran, D., Ganesan, K., Prakash, S., Sekhar, K. Electroantennogram and behavioral responses of Culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae) females to chemicals found in human skin emanations. Journal of Medical Entomology. 43 (2), 207-213 (2014).
- Cooperband, M. F., McElfresh, J. S., Millar, J. G., Carde, R. T. Attraction of female Culex quinquefasciatus Say (Diptera: Culicidae) to odors from chicken feces. Journal of Insect Physiology. 54 (7), 1184-1192 (2008).
- Dekker, T., Ignell, R., Ghebru, M., Glinwood, R., Hopkins, R. Identification of mosquito repellent odours from Ocimum forskolei. Parasites & Vectors. 4 (1), 183 (2011).
- Choo, Y. M., et al. Reverse chemical ecology approach for the identification of an oviposition attractant for Culex quinquefasciatus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), 714-719 (2018).
- Wolff, G. H., Lahondère, C., Vinauger, C., Riffell, J. A. Neuromodulation and differential learning across mosquito species. bioRxiv. , 755017 (2019).
- Lahondère, C., et al. The olfactory basis of orchid pollination by mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (1), 708-716 (2020).
- Beyenbach, K., Masia, R. Membrane conductances of principal cells in Malpighian tubules of Aedes aegypti. Journal of Insect Physiology. 48, 375-386 (2002).
- Oesterle, A. The Pipette Cookbook. , (2018).
- R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. (2018).
- Afify, A., Betz, J. F., Riabinina, O., Lahondère, C., Potter, C. J. Commonly used insect repellents hide human odors from Anopheles mosquitoes. Current Biology. 29 (21), 3669-3680 (2019).
- Martin, F., Riveron, J., Alcorta, E. Environmental temperature modulates olfactory reception in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 57 (12), 1631-1642 (2011).
- Qiu, Y. T., Gort, G., Torricelli, R., Takken, W., van Loon, J. J. Effects of blood-feeding on olfactory sensitivity of the malaria mosquito Anopheles gambiae: application of mixed linear models to account for repeated measurements. Journal of Insect Physiology. 59 (11), 1111-1118 (2013).
- Taylor, B., Jones, M. D. R. The circadian rhythm of flight activity in the mosquito Aedes aegypti (L.): the phase-setting effects of light-on and light off. Journal of Experimental Biology. 51 (1), 59-70 (1969).
- Eilerts, D. F., VanderGiessen, M., Bose, E. A., Broxton, K., Vinauger, C. Odor-specific daily rhythms in the olfactory sensitivity and behavior of Aedes aegypti mosquitoes. Insects. 9 (4), 147 (2018).
- Krishnan, B., Dryer, S. E., Hardin, P. E. Circadian rhythms in olfactory responses of Drosophila melanogaster. Nature. 400 (6742), 375-378 (1999).
- Pelletier, J., Guidolin, A., Syed, Z., Cornel, A. J., Leal, W. S. Knockdown of a mosquito odorant-binding protein involved in the sensitive detection of oviposition attractants. Journal of Chemical Ecology. 36 (3), 245-248 (2010).
