本稿では、雌と雄の両方を含むいくつかの属の蚊における成功した低ノイズのエレクトロアンテノグラムのための段階的なプロトコルについて詳しく説明します。
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この記事について
サマリー
要約
雌の蚊は地球上で最も致命的な動物であり、血粉を獲得するときに感染する病原体のために、毎年100万人以上の命を奪っています。餌を与える宿主を見つけるために、蚊は視覚的、機械的、熱的、嗅覚を含む幅広い感覚的手がかりに依存しています。この研究では、研究者が蚊が濃度依存的に個々の化学物質と化学物質のブレンドを検出できるかどうかを評価できるようにする技術であるエレクトロアンテノグラフィー(EAG)について詳しく説明しています。ガスクロマトグラフィー(GC-EAG)と組み合わせると、この技術はアンテナを完全なヘッドスペース/複雑な混合物にさらすことを可能にし、目的のサンプルに存在するどの化学物質を蚊が検出できるかを決定することができます。これは、宿主の体臭だけでなく、植物の花束やその他の生態学的に関連する匂い(産卵場所の匂い物質など)にも適用できます。ここでは、長時間の準備応答時間を可能にし、 ネッタイシマカ、 アカイエカ、 ハマダラカ、ト キソリンカイト 蚊など、複数の属の雌と雄の両方の蚊に適用できるプロトコルについて説明しました。嗅覚は蚊と宿主の相互作用および蚊の生物学全般において主要な役割を果たすので、EAGおよびGC-EAGは、新しい疾患ベクター制御戦略(例えば、餌)の開発に関心のある化合物を明らかにすることができる。行動アッセイで補完して、各化学物質の価数(例えば、誘引剤、忌避剤)を決定することができる。
概要
蚊は地球上で最も致命的な生物であり、年間100万人以上の命を奪い、世界人口の半分以上を噛みながら、蚊が感染する病原体にさらされるリスクにさらしています1。これらの昆虫は、広範囲の手がかり(すなわち、熱的、視覚的、機械的、嗅覚的、聴覚的)に依存して、餌となる宿主(植物と動物の両方)を見つけ、交尾と産卵のために、そして幼虫と成虫の両方の段階で捕食者を避けます2,3。これらの感覚の中で、嗅覚は、特に匂い分子の中距離から長距離の検出において、上記の挙動において重要な役割を果たす2,3。宿主または産卵部位によって放出される匂いは、蚊の触側、足根、および触角2,3に位置する様々な特異的嗅覚受容体(例えば、GR、OR、IR)によって検出される。
嗅覚は宿主探索(植物および動物)、交尾および産卵行動の重要な要素であるため、蚊駆除のための新しいツールを開発するための研究の理想的なターゲットを構成します4。忌避剤(DEET、IR3535、ピカリジンなど)....
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プロトコル
1.生理食塩水の準備
- 事前に生理食塩水を準備し、冷蔵庫に保管してください。
- バイエンバッハとマシア26 に従って、溶液を準備します。
注:生理食塩水レシピ(mM):150.0 NaCl、25.0 HEPES、5.0グルコース、3.4 KCl、1.8 NaHCO3、1.7 CaCl 2、および1.0 MgCl2。pHは1 M NaOHで7.1に調整されます。棚の貯蔵量を増やすために、この時点でブドウ糖またはスクロースを調製物に加えないでください。EAGを実行する直前に、必要な量を生理食塩水に追加します(実験あたり約50 mL)。
2.臭気の準備と保管
- 匂い物質混合物または単一化合物希釈液を1.5 mLの琥珀色のバイアルで事前に調製し、化合物の分解を防ぐために-20°Cで保存します。
注意: 濃度は、実施するテストによって異なります。0.1%または1%は、化合物を検出できるかどうかを判断するために一般的に使用されます。用量反応曲線については、特定の化学物質の連続希釈を準備し、その濃度を最低濃度から最高濃度までテストします。 - 試験した化学物質の溶解度に応じて、水、エタノール、ヘキサン、パラフィン油、または鉱油で希釈液を調製します。
- 実験のために溶媒....
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結果
エレクトロアンテノグラフィは、化学物質または化学物質のブレンドが昆虫アンテナによって検出されたかどうかを判断するための強力なツールです。また、濃度の漸進的な増加を使用して、所与の化学物質の検出閾値を決定するためにも使用できます(すなわち、用量曲線応答、 図4B)。さらに、宿主関連臭気29に対する応答に対する忌避剤の効果を試験することは有用である。
ポジティブコントロールとネガティブコントロールは、EAGでは常に使用する必要があります。ここでは、陽性対照としてベンズアルデヒドを用いた(図3B、 3C、 4A)。この化合物は、これまでに試験されたすべての蚊種において触角応答を誘発することが見出されている24、25、<.......
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ディスカッション
嗅覚を介した行動は、生理学的(年齢、時刻など)や環境(温度、相対湿度など)など、多くの要因の影響を受けます30。したがって、EAGを実施する際には、同じ生理学的状態にある昆虫(すなわち、年齢、飢餓、交尾のモニタリング)31 を使用し、乾燥を避けるために準備の周囲に暖かく湿気の多い環境を維持することが不可欠です。25°C前後の温度が理想的で、主要航空会社の湿度は60%から80%です。これは、主要な航空会社の回路にバブラーを配置することで簡単に実現できます。
さらに、昆虫の生物学に関連する結果を得るために、各種の生態を考慮することが重要です。たとえば、夜行性の種を使用する場合は、主観的な夜間の反応をテストするために、光のサイクルを逆にすることを検討してください。一日の特定の瞬間(すなわち、昆虫が活動しているとき)にEAGを実施することを選択することも重要です。たとえば、 Ae. ae. aegypti 蚊を使用する場合は、この種の活動のピーク時(つまり、一日の早い時間から.......
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開示事項
著者は開示するものは何もありません。
謝辞
有益な議論をしてくれたクレマン・ヴィノーガー博士とジェフリー・リッフェル博士に感謝します。以下の試薬は、BEI Resources、NIAID、NIHを通じて入手しました: Anopheles stephensi、Strain STE2、MRA-128、Mark Q. Benedictが寄稿。 ネッタイシマカ、ストレインロック、MRA-734、デビッドW.セバーソンによる寄稿。 アカイエカ、JHB株、卵、NR-43025。著者は、 アカイエカ と ハマ ダラカの蚊の卵を提供してくれたジェイク・トゥ博士、ニシャ・ダガル博士、ジェームズ・ウェガー博士、ジェフリー・マラノに感謝します。 ネッタイシマカ と トキソリンチテス・ルチルス・セプテントリオナリス は、著者がニューリバーバレー地域(米国バージニア州)で収集した野蚊に由来します。この研究は、生化学部門とフラリン生命科学研究所の支援を受けました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| エアテーブル クリーンベンチ | TMC | https://www.techmfg.com/products/labtables/cleanbench63series/accessoriess | ノイズリデューサー |
| アナログ-デジタルボード | ナショナルインスツルメンツ | BNC-2090A | |
| ベンチトップ Flowbuddy コンプリート | ジェネシー サイエンティフィック | 59-122BC | 蚊を麻酔するには |
| ホウケイ酸ガラス キャピラリー | サッター機器 | B100-78-10 | と参照毛細血管を作るには |
| 、化学物質Sigma | Aldrich | ベンズアルデヒド:418099-100 mL;酪酸:B103500-100mL;1-ヘキサノール:471402-100mL;鉱油:M8410-1L | ここで紹介する実験に使用した化学薬品 |
| CO2 | AirgasまたはPraxair | N/A | 蚊の麻酔に |
| 冷光源 | Volpi | NCL-150 | |
| 使い捨て注射器 | BD | 1 mL (309628) / 3 mL (309657) | |
| 電極ケーブル | World Precision Instruments | 5371 | |
| 電極ゲル無塩 | Parkerlabs | 12-08-Spectra-360 | |
| ファラデーケージ | TMC | https://www.techmfg.com/products/electric-and-magnetic-field-cancellation/faradaycages | 騒音低減 |
| 流量計 | Bel-art | 65 mm (H40406-0010) / 150 mm (H40407-0075) | |
| GCMSバイアルとキャップ | サーモフィッシャー科学 | 2-SVWKA8-CPK | 臭気剤希釈液を調製するため |
| ガラスシリンジ(Fortuna) | Sigma Aldrich | Z314307 | EAG準備への臭気供給用 |
| Humbug | Quest Scientific | http://www.quest-sci.com/ | ノイズリデューサー |
| 2mmジャックホルダー ナロー 90度 ワイヤー付 | A-Mシステム | 675748 | 電極ホルダー |
| マグネットベース | Kanetec | MB-FX | x 2 |
| MATLAB + Toolboxes | Mathworks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | パルスの送達用 |
| 医療用エア | ガスまたはプラクスエア | N/A | 主要航空会社用 |
| 顕微鏡 | ニッコン | SMZ-800N | |
| マイクロマニピュレーター 3軸 粗・細 コンパクトマイクロマニピュレーター | 成重 | MHW-3 | ×2 |
| ヘッドステージA-Mシステム付マイクロ電極アンプ | モデル1800 | ||
| 蚊飼育用品 | Bioquip | https://www.bioquip.com/Search/WebCatalog.asp | |
| 針 | BD | 25G(305127)/21G(305165) | |
| パスツールピペットフィ | ッシャーサイエンティフィック | 13-678-6AEAG | への臭気配信用PTFE |
| 異なる直径のチューブMC | マスター | カーN / A | ソレノイドバルブを接続するには、流量計、航空会社など。 |
| 30V/5A DC電源 | Dr.メータ | PS-305DM | |
| R version 3.5.1 | Rプロジェクト | https://www.r-project.org/ | データ分析用 |
| 電磁弁用リレー | N/A | オーダーメイド | |
| 銀線 0.01」 | AMシステム | 782500 | |
| 電磁弁(3方向) | Lee Company | LHDA0533115H | |
| WinEDRソフトウェア | Strathclyde 電気生理学ソフトウェア | WinEDR V3.9.1 | EAG記録用 |
| Whatman紙 | コールパー | マーUX-06648-03 | ガラスシリンジ/パスツールピペットに化学物質をロードする |
参考文献
- World Health Organization. World health statistics 2019: monitoring health for the SDGs, sustainable development goals. World Health Organization. , Geneva. (2019).
- Takken, W. The role of olfaction in host-seeking of mosquitoes....
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