Summary
Denne artikkelen beskriver en trinnvis protokoll for vellykkede og støysvake elektroantogrammer i flere myggslekter, inkludert både kvinner og menn.
Abstract
Kvinnelige mygg er de dødeligste dyrene på jorden, og hevder livet til mer enn 1 million mennesker hvert år på grunn av patogener de overfører når de kjøper et blodmåltid. For å finne en vert å mate på, er mygg avhengig av et bredt spekter av sensoriske tegn, inkludert visuell, mekanisk, termisk og olfaktorisk. Studien beskriver en teknikk, elektroantennografi (EAG), som gjør det mulig for forskere å vurdere om myggene kan oppdage individuelle kjemikalier og blandinger av kjemikalier på en konsentrasjonsavhengig måte. Når kombinert med gasskromatografi (GC-EAG), tillater denne teknikken å utsette antennene for en full headspace / kompleks blanding og bestemmer hvilke kjemikalier som er tilstede i prøven av interesse, myggen kan oppdage. Dette gjelder vertskroppslukt samt planteblomsterbuketter eller annen økologisk relevant lukt (f.eks. Her beskrev vi en protokoll som tillater lang varighet av forberedelsesresponstid og gjelder for både kvinnelige og mannlige mygg fra flere slekter, inkludert Aedes, Culex, Anopheles og Toxorhynchites mygg. Siden olfaction spiller en viktig rolle i mygg-vert-interaksjoner og myggbiologi generelt, kan EAG og GC-EAG avsløre forbindelser av interesse for utvikling av nye sykdomsvektorkontrollstrategier (f.eks. Agn). Supplert med atferdsanalyser kan valensen (f.eks. Attractant, repellent) av hvert kjemikalie bestemmes.
Introduction
Mygg er de dødeligste organismer på jorden, og krever livet til mer enn en million mennesker per år og plasserer mer enn halvparten av verdens befolkning i fare for eksponering for patogenene de overfører, mens de biter1. Disse insektene er avhengige av et bredt spekter av signaler (dvs. termisk, visuell, mekanisk, olfaktorisk, auditiv) for å finne en vert å mate på (både plante og dyr), for parring og oviposisjon, samt å unngå rovdyr i både larve- og voksenstadier 2,3. Blant disse sansene spiller olfaction en kritisk rolle i de ovennevnte atferdene, spesielt for middels til langdistanse deteksjon av luktmolekyler 2,3. Lukt som sendes ut av en vert eller et oviposisjonssted, oppdages av forskjellige spesifikke olfaktoriske reseptorer (f.eks. GR, OR, IR) som ligger på myggpalpene snabel, tarsi og antenne 2,3.
Siden olfaction er en nøkkelkomponent i deres vertssøkende (plante og dyr), parring og oviposisjonsatferd, utgjør det dermed et ideelt mål å studere for å utvikle nye verktøy for myggkontroll4. Forskning på repellenter (f.eks. DEET, IR3535, picaridin) og agn (f.eks. BG sentinel menneskelig lokkemiddel) er ekstremt produktiv5, men på grunn av dagens utfordringer i myggkontroll (f.eks. Insektmiddelresistens, invasive arter), er det viktig å utvikle nye effektive kontrollmetoder informert av myggbiologien.
Mange teknikker (f.eks. Olfactometer, landingsanalyser, elektrofysiologi) har blitt brukt til å vurdere bioaktiviteten til forbindelser eller blandinger av forbindelser i mygg. Blant dem kan elektroantennografi (eller elektroantennogrammer (EAGs)) brukes til å bestemme om luktene oppdages av myggantennene. Denne teknikken ble opprinnelig utviklet av Schneider6 og har blitt brukt i mange forskjellige insektslekter siden da, inkludert møll 7,8,9, humler 10,11, honningbier 12,13 og fruktfluer 14,15 for å nevne noen. Elektroantennografi har også blitt brukt ved hjelp av forskjellige protokoller, inkludert enkelt eller flere antenner i mygg 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25.
Mygg er relativt små og delikate insekter med ganske tynne antenner. Selv om det er relativt enkelt å utføre EAG på større insekter som møll eller humler på grunn av deres større størrelse og tykkere antenner, kan det være utfordrende å lede EAG i mygg. Spesielt opprettholdelse av et godt signal-støy-forhold og en varig responsiv forberedelse er to viktige krav til reproduserbarhet og pålitelighet.
Den trinnvise veiledningen til EAG-er med lite støy som er foreslått her, tilbyr direkte løsninger på disse begrensningene og gjør denne protokollen gjeldende for flere myggarter fra forskjellige slekter, inkludert Aedes, Anopheles, Culex og Toxorhynchites, og beskriver teknikken for både kvinner og menn. Electroantennography tilbyr en rask, men pålitelig måte å skjerme og bestemme bioaktive forbindelser som deretter kan utnyttes i agnutvikling etter at valens er bestemt med atferdsanalyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse av saltoppløsning
- Forbered saltvannet på forhånd og oppbevar i kjøleskapet.
- Følg Beyenbach og Masia26 for å klargjøre løsningen.
MERK: Saltvannsoppskrift i mM: 150,0 NaCl, 25,0 HEPES, 5,0 glukose, 3,4 KCl, 1,8 NaHCO3, 1,7 CaCl 2 og 1,0 MgCl2. pH justeres til 7,1 med 1 M NaOH. Ikke tilsett glukose eller sukrose til preparatet på dette tidspunktet for å øke hylleoppbevaringen. Legg den nødvendige mengden til saltvannet rett før du kjører EAGs (rundt 50 ml per eksperiment).
2. Luktforberedelse og lagring
- Forbered luktblandingene eller enkeltcompounds fortynninger på forhånd i 1,5 ml gule hetteglass og oppbevar ved -20 °C for å forhindre nedbrytning av forbindelsen.
MERK: Konsentrasjoner vil avhenge av testen som skal utføres. 0,1% eller 1% brukes ofte til å avgjøre om en forbindelse kan oppdages eller ikke. For en dose-responskurve, forbered serielle fortynninger av et gitt kjemikalie og test dem fra det laveste til de høyeste konsentrasjonene. - Forbered fortynningene i vann, etanol, heksan, parafinolje eller mineralolje, avhengig av løseligheten av det testede kjemikaliet.
- Sørg for å klargjøre en væskekontroll (et hetteglass som bare inneholder oppløsningsvæsken) for eksperimentet.
- Fjern luktstoffene fra fryseren 30 min før du starter forsøkene for å la dem tine. Vortex hvert hetteglass før bruk for å blande kjemikaliet og oppløsningsvæsken godt.
- Pipett 10 mikrol oppløsning på et stykke filterpapir (0,5 cm x 2 cm) lagt inn i en merket glasssprøyte eller Pasteur-pipette.
- Legg hver forbindelse eller blanding i en bestemt Pasteur-pipette eller sprøyte for å forhindre forurensning.
MERK: Legg inn 10 minutter før du starter eksperimentet, slik at lukten kan diffundere i sprøyten, men ikke lenger for å forhindre nedbrytning. La Pasteur-pipetten eller sprøyten forbli avkortet på dette tidspunktet for å tillate en god diffusjon av kjemikaliet før eksperimentet starter. - Etter hver EAG-kjøring, kast stykket av filterpapiret og erstatt det med et nytt for å forhindre at papiret blir overgjennomvåt og risikerer nålblokkering. Bytt nålene regelmessig (hver 10. løp).
3. Mygg separasjon
- Isoler myggene på dagen for forsøkene.
- Bruk mygg som er minst 6 dager gamle på dagen for forsøkene for å øke sjansene for at hunnene er parret for å forbedre deres respons på vertsrelaterte luktstoffer.
MERK: Juster myggalderen på testtidspunktet avhengig av prosjektet. Kontroller og harmoniser den fysiologiske statusen (f.eks. blodmatet, sultet, aldri tidligere matet osv.). - Sult myggene opptil 12 timer (dvs. ingen tilgang til sukker) for å øke motivasjonen og følsomheten.
- Plasser myggbeholderen i kjøleskapet (4 °C) til de slutter å fly, slik at individer enkelt kan overføres til enkeltkopper med tang.
MERK: Arter med høyere toleranse for kulde kan avlives ved hjelp av en CO2 fluepute. Sørg for at myggene ikke holder seg på det lenge for å forhindre uttørking, noe som vil redusere responsen til mygg EAG-preparatet. - Oppbevar koppene som inneholder enkeltmygg ved romtemperatur før EAGene utføres, og kast bort mygg som ikke kan brukes i løpet av dagen.
4. Elektrodeholder og kapillærpreparat
- Kapillær trekking, forberedelse og lagring
- Bruk borosilikatkapillærer med filamenter (I.D: 0.78 mm, O.D: 1 mm). Trekk dem avhengig av utstyret27.
MERK: Oppbevar de trukne kapillærene i en petriskål. Legg petriskålen på biter av voks eller uparfymert modelleringsleire for å forhindre at de beveger seg og går i stykker. - Før du kjører EAG-eksperimentet, bryter du forsiktig spissen av 2 kapillærer med et par tang under mikroskopet.
MERK: Sørg for at den ene er litt større enn den andre for å passe enten nakken (større kapillær) eller tuppen av antennene (mindre kapillær). Sørg for at kuttet er rent uten sprekk på kapillærveggen. Dette krever tålmodighet og øvelse. - Hvis de fortsatt er intakte, gjenbruk disse kapillærene etter skylling med avionisert (DI) vann etter at forsøket er over. Fjern overflødig vann ved å forsiktig påføre en rengjøringsserviett mot spissen. Plasser tilbake i lagring petriskål. Hvis spissen er skrå, kast kapillæren.
- Bruk borosilikatkapillærer med filamenter (I.D: 0.78 mm, O.D: 1 mm). Trekk dem avhengig av utstyret27.
- Elektrodeholder og kapillærmontering
- Merk de to elektrodeholderne som "opptak" og "referanse" ved å bruke biter av laboratorietape i forskjellige farger. Dette vil bidra til å veilede monteringen av mygghodet og elektrodene.
- Forsikre deg om at elektrodeholderne er klare på innsiden og at det ikke finnes borosilikatrester.
- Kloridisering: Bløtlegg sølvtrådene til elektrodeholderne i rent blekemiddel i ca. 5 minutter. Ledningene går fra skinnende lysegrå til matt mørkegrå.
- Løsne gummiproppen og fyll innsiden av kapillæren med 10% saltoppløsning med en 20 G nål.
- Fyll borosilikatkapillæren med saltoppløsningen ved hjelp av en sprøyte. Forsikre deg om at det ikke er noen bobler i verken elektrodeholderen eller den trukne kapillæren.
MERK: For å redusere sjansene for å ha bobler i kapillæren, fortsett å skyve saltvann i kapillæren mens du forsiktig trekker nålen ut og bruk kapillærene med et filament. Det er mulig å laste kapillærene med en løsning sammensatt av 1: 3 elektrodegel og saltoppløsning. Dette kan bidra til å forhindre fordampning av saltvannet og kan være spesielt nyttig når du lærer og praktiserer EAG, da eksperimentøren vil trenge mer tid til å fullføre de forskjellige trinnene. - Etter bløtlegging, skyll sølvtrådene med DI-vann og sett dem inn i de to kapillærene. Forsikre deg om at spissen av ledningen er mindre enn 1 mm fra spissen av kapillæren. Forsikre deg om at kapillæren passerer gummiringen inne i elektrodeholderen uten å bryte. Stram gummiproppen forsiktig. Kontroller at det ikke finnes luftbobler.
- Bruk kapillæren med den bredere åpningen på referanseelektrodeholderen (nakken), og den mindre åpningen på opptakselektrodeholderen (antennene).
- La de to monterte elektrodeholderne stå på en våtserviett for å forhindre at spissen tørker ut før den er klar til å montere hodet.
5. Klargjøring av EAG-rigg (figur 1)
- Sørg for at luftbordet er oppe, at det ikke er blokkering i flyselskapet. Sørg for at tanken med medisinsk luft fortsatt er full for å unngå å endre den midt i forsøket. Pass på at det er bobler i fukteren.
- Luft- og pulsleveringssystem
- Slå på den medisinske luftgasstanken.
- Kontroller nivået på de to mengdemålerne.
MERK: Strømningsmåleren som styrer hovedluftstrømmen som bader preparatet under hele forsøket, skal være på 140 ml / min og den andre relatert til luktpulsen skal lese 15 ml / min.
- Hvis du gjør GC-EAD, slå på maskinen, bensintankene og opprett/last filen/metoden.
- Slå på datamaskinene, programvarene, ventilstrømforsyningen, og kontroller Internett-tilkoblingen for at programvaren skal fungere.
- Programvare: Et kort skript kan skrives for å levere pulsen.
- EAG-programvare: bruk hvilken som helst elektrofysiologiprogramvare.
- Implementere parametrene i programvaren (f.eks. forsterker, varighet av opptak, varighet av pulser, etc.).
- Lever en kontrollpuls for å verifisere at ventilen som leverer pulsene er funksjonell.
- Sett strømforsyningen på 5,2 V. Kontroller forsterkerparametrene.
MERK: Parametrene som brukes for dataene som presenteres her er: lavt avskjæringsfilter på 0,1 Hz; høyt avskjæringsfilter på 500 Hz; Forsterkning på x100.
6. Klargjøring og montering av mygghode (figur 2)
- Legg en aluminiumsplate på is og legg et stykke våtrengjøringsserviett over den.
- Sett en liten klatt elektrodegel i et hjørne.
- Legg en myggkopp på is og la myggen kjøle seg ned i et par minutter, eller til den slutter å fly.
MERK: Noen arter er kaldt motstandsdyktige og kan kreve en rask anestesi over en CO2 fluepute for å gå ned. Jo minst myggen holder seg på heller, jo bedre. - Plasser myggen på ryggen og klipp spissen av hver antenne (bare en liten del av det siste segmentet) med mikrosaks.
- Bruk tang til å dra myggen ved siden av elektrodegelen og dypp tuppen av hver antenne forsiktig i gelen. Unngå å dyppe mer enn bare det aller siste segmentet i elektrodegelen.
- Bruk tang til å trekke myggantennene ut mens du holder dem ved siden av hverandre. La dem komme ut sammen fra gelen. Pass på at antennene ikke berører overflaten på rengjøringsservietten, ellers kan de skille seg.
- Plasser myggen på siden og hakk hodet ved hjelp av mikrosaks eller et barberblad.
MERK: Når hodet er hakket, fortsett raskt til de neste trinnene og til EAG-riggen for å starte opptakene. Preparatet skal være responsivt i ca. 30 minutter. - Ta referanseelektroden og dyp spissen forsiktig i gelen. Hold kontakt med nakkevev og la hodet stikke på det.
- Flytt elektrodeholderne under EAG-mikroskopet og se gjennom mikroskopet for å plassere hodeelektroden (dvs. referanse) på en mikromanipulator. Sørg for at antennene er i midten.
- Ta tak i opptakselektroden, plasser den foran antennespissene. Flytt og juster den så nært som mulig til tipsene ved hjelp av mikromanipulatoren. Bruk mikroskopet til å flytte spissen av opptakselektroden mot antennene.
- Koble begge elektrodeholderne til forsterkeren før du setter inn spissene for å forhindre at de beveger seg etter innsetting.
- Sett antennespissene inn i opptakselektroden. Sørg for at de bare kommer i kontakt med saltvannet og elektrodegelen og er synlige ved gjennomsiktighet gjennom kapillæren. Antennen går inn av "sugeeffekten".
- Juster posisjonen til hodet og tipsene med tang under mikroskopet, om nødvendig.
- Plasser flyslangen nær klargjøring av mygghodet (avstand: 1 cm).
MERK: Hvis hodet faller av, gå tilbake til disseksjonsstasjonen og monter hodet på nytt eller klargjør et nytt hvis det har gått tapt eller hvis det har gått mer enn 5 minutter siden hodet ble kuttet av. En god forbindelse mellom kapillæren og nakken/antennene er avgjørende for lite støy og pålitelig registrering. Ideelt sett vil antennespissene være mindre enn 1 mm fra ledningen til opptakselektroden når den er satt inn. - Slå av lyskilden, hvis den brukes.
- Plasser vakuumlinjen nær mygghodets klargjøring (avstand: 20 cm) og juster deg etter hovedflyselskapet.
MERK: Vakuumet vil bidra til å fjerne kjemikalier rundt hodepreparasjonen etter stimulansen, noe som kan føre til EAG-responser etter at pulsene ble påført.
7. Innspillinger
- Etter innsetting av antennespissene, slå på forsterkeren og støyreduksjonen. Følg grunnlinjesignalet og sørg for at det ikke er støyende.
MERK: Vær oppmerksom på om store svingninger i det elektriske signalet er til stede. Juster posisjonen til hodet og antennespissene etter behov til signalet er rent. Bruk alligatorklips til å jorde alt som introduserer støy til Faraday-buret eller luftbordet. Et baselinesignal på mindre enn 0,01 mV i amplitude er ideelt for å oppdage og diskriminere små EAG-responser. - Når støynivået er tilfredsstillende, stikk inn den første luktsprøyten som skal testes i flyhullet.
- Lukk Faraday-buret. Ikke vær foran preparatet, for å redusere støy.
- Klikk på Record på EAG-programvare.
- Lever pulsen(e) ved hjelp av programvaren.
MERK: Antallet og varigheten av pulsene vil variere avhengig av eksperimentene. Her er det brukt enkle 1 s. pulser per luktstoff. Odoranter ble skilt med 45 s. - Legg merke til responsen til myggantennene i laboratorienotatboken.
MERK: Hvis luktestoffet oppdages av myggantennene, observeres en tydelig avbøyning i signalet (se figur 3A). - Fortsett med neste lukt eller konsentrasjon. Ikke glem å randomisere presentasjonen av luktstoffer med mindre en dose-responskurve utføres.
MERK: En negativ kontroll og en positiv kontroll bør brukes i forsøkene. Dette vil sikre at de observerte svarene faktisk er olfaktoriske responser og ikke på grunn av mekanisk eller elektrisk støy. - På slutten av opptaket bruker du en positiv kontroll for å kontrollere at antennene fortsatt reagerer.
MERK: Bruk 0,1% eller 1% benzaldehyd som alle myggarter testet så langt har vært lydhør overfor denne forbindelsen. - Fortsett med neste myggpreparasjon.
8. Rengjøring
- Slå av forsterkeren, støyreduseren, flyselskapet og datamaskinen.
- Sett luktstoffene tilbake i fryseren.
- Fjern filterpapirene fra glasssprøytene og rengjør med 100% etanol hvis rester er synlige på veggene. La tørke på en rengjøringsserviett over natten.
- Rengjør elektrodeholderne med DI-vann for å fjerne eventuelle spor av salt. Tørk ved å påføre forsiktig mot et stykke rengjøringsserviett.
- Plasser myggrester i fryseren og kast 24 timer senere.
MERK: Hvis du arbeider med infiserte mygg, følg sikkerhetskravene ved institusjonen din.
9. Dataanalyser
- Mål enten manuelt eller automatisk EAG-svarene.
MERK: EAG-amplituden (-mV) måles her. Gjennomsnitt hvis flere pulser er brukt for hver forbindelse. Avhengig av programvaren som brukes, kan EAG-er oppdages og måles automatisk. Det er imidlertid viktig å inspisere hver respons individuelt for å verifisere formen på responsen og vurdere mulig overføring, forsinket respons osv. Den ideelle EAG-responsen er på linje med pulsen, viser en klar avbøyning og kan repeteres mellom myggpreparater (figur 3). - Presenter rådataene for å vise minimal variasjon, signal med lite støy og tydelige svar (figur 3B).
MERK: Dataene kan også normaliseres (f.eks. Z-score). Den negative kontrollverdien (f.eks. mineralolje) (dvs. baseline) kan trekkes fra responsen og skal hvis ikke presenteres i figurene. En positiv kontroll bør også presenteres. - Utfør statistisk analyse ved hjelp av hvilken som helst statistikkprogramvare28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Electroantennography er et kraftig verktøy for å avgjøre om et kjemikalie eller blanding av kjemikalier oppdages av et insekt antenne. Det kan også brukes til å bestemme deteksjonsterskelen for et gitt kjemikalie ved hjelp av en gradvis økning av konsentrasjonen (dvs. dosekurverespons, figur 4B). Videre er det nyttig å teste effekten av avstøtende middel på responsen på vertsrelatert lukt29.
Positive og negative kontroller bør alltid brukes i EAG-er. Her ble benzaldehyd brukt som positiv kontroll (figur 3B, 3C, 4A). Denne forbindelsen har vist seg å fremkalle en antennerespons i alle myggarter testet så langt24,25,29. En negativ kontroll bør også brukes og kan bestå av løsningsmidlet som brukes til å fortynne kjemikaliene (f.eks. mineral- eller parafinoljer, heksan osv.) og bør ikke fremkalle en respons (figur 3B, 3C, 4A).
Faktisk, når du utfører EAG, bør det ikke noteres en avbøyning ved bruk av kontrollen (figur 3B, 3C, 4A). Hvis en respons observeres, er det sannsynlig at sprøyten, væskekontrollen og/eller luktslangen er kontaminert. Hvis det er tilfelle, skal en ny oppløsning tilberedes, sprøyten rengjøres med 100% etanol og tørkes og/eller flyselskapet dekontamineres ved skylling med 100% etanol og tørkes. Hvis den valgte kontrollen fremkaller en respons (f.eks. etanol), skal verdien oppnådd i -mV for kontrollen trekkes fra verdien oppnådd for etanol og testet kjemikalie kombinert for å vurdere virkningen av det testede kjemikaliet på antennene.
Myggarter varierer i deres evne til å reagere på ulike forbindelser, så vel som i størrelsen på deres respons. For eksempel produserer Toxorhynchites-mygg svært store EAGer i forhold til Ae. aegypti, An. Stephensi og Cx. quinquefasciatus (figur 3C, figur 4A).
I EAG-er fører den andre pulsen og følgende vanligvis til mindre EAG-responser. Presentasjonen av en odorant kan også påvirke responsen på følgende, så det er viktig å randomisere luktrekkefølgen og flere analyser for effektivt å teste et panel av luktstoffer (med mindre en dose-responskurve utføres). Videre vil separering av pulser (f.eks. 5 s) og luktstoffer (f.eks. 45 s) presentasjon bidra til å optimalisere EAG-responsene.
Volatiliteten til de testede kjemikaliene varierer og kan påvirke luktresponsen og potensielt føre til forsinket respons hvis det testede kjemikaliet har svært lav volatilitet. Kjemisk volatilitet og løselighet bør være kjent før EAG utføres for å optimalisere analysen. Løsningsmidlet som brukes til å tilberede fortynningene bør også velges nøye (f.eks. etanol, heksan, mineral eller parafinolje). Videre bør konsentrasjoner velges med omhu og bør ideelt sett være økologisk relevante. En konsentrasjon på 1% eller 0,1% brukes ofte, men er relativt høy og ikke nødvendigvis representativ for hva insektene kan oppleve i naturen. Likevel er det nyttig å skjerme forbindelser med relativt høye konsentrasjoner i noen tilfeller (for eksempel for agnutvikling). Repellenter kan testes ved sin kommersielt tilgjengelige konsentrasjon (f.eks. DEET selges vanligvis i en 40% konsentrasjon).
Hvis kombinert med gasskromatografi (dvs. GC-EADs)25, kan forbindelsene som fremkaller en respons identifiseres med en GC-MS og deretter testes individuelt ved forskjellige konsentrasjoner eller i blandinger med EAGs. Det er verdt å nevne at valensen av de testede kjemikaliene ikke kan bestemmes med EAG. Bare et komplementært atferdseksperiment (f.eks. Olfactometer, fôringsanalyse) kan vurdere om kjemikaliet oppdaget av antennene er attraktivt, frastøtende eller nøytralt for myggen. Endelig viser EAG-eksperimenter bare responser fra det perifere nervesystemet.
Figur 1: Elektroantennogramoppsett bestående av: A) Mikroskop: mikroskopet som brukes, skal tillate eksperimentøren å tydelig se preparatet slik at myggantennespissene kan settes inn i opptakselektrodene. B) Kaldlyslampe: lampen skal slås av når opptakene begynner. C) Vakuumlinje: Dette reduserer risikoen for akkumulering av luktstoffene rundt mygghodeprepareringen, noe som kan resultere i antenneresponser frakoblet fra faktisk stimulering. D) Mikromanipulatorer (x2): Disse vil tillate svært fine elektrodeholderbevegelser, noe som er nødvendig for å sette myggantennene inn i kapillæren til opptakselektroden. E) Opptakselektrodeholder. F) Referanseelektrodeholder. G) Hovedtrinn: begge elektrodene er plugget i hodetrinnet som deretter kobles til forsterkeren. H) Hovedflyselskap: en konstant ren luftstrøm badet mygghodet. Strømningshastigheten reguleres av en strømningsmåler. I) Sprøyte for luktlevering koblet til magnetventilen og mengdemåleren; J) Luftbord: luftbordet vil redusere støy. K) Faraday bur: Faraday buret vil forhindre elektrisk støy. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Trinnvis forberedelse av Aedes albopictus mygghode for EAG-opptak. A) Hunnmygg på ryggen på en isete plate for å verifisere at begge antennene er intakte. B) Siste segment av antenneeksisjonen med mikrosaks. C) Antennene dyppes i elektrodegel. D) Antennene fester seg sammen etter å ha trukket dem ut. Bare ett segment av hver antenne skal være i elektrodegelen. E) Mygghodeeksisjon. F) Hode montert på referanseelektroden. Den skal være stabil nok til å flyttes til EAG-riggen. A'-F'. Samme trinn som presentert ovenfor for mannlige EAGs. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Skjematisk fremstilling av mygg-EAG og rå EAG-spor. A ) EAG-skjematisk (venstre) og karakteristikker av EAG-responsen (høyre). (Venstre) Mygghodet er montert mellom en referanseelektrode og en opptakselektrode koblet til en forsterker. Antennene er badet i en konstant luftstrøm der luktstimuli pulserer. Deteksjon av et kjemikalie fører til en avbøyning (i mV) i signalet. (høyre) Den kjemiske deteksjonen fører til celledepolarisering (DPR) etterfulgt av cellerepolarisering (RPR) til retur til baseline. Luktpulsen er representert av det grå rektangelet. Den røde linjen indikerer amplituden til EAG-responsen. B) Skjermbilde av WinEDR-programvaren som fremhever et helt EAG-opptaksspor av en Culex quinquefasciatus hunnmygg. Øverst: ufiltrert (dvs. rått) signal. Midten: 1 s luktpulser er indikert med tall. Nederst: filtrert (dvs. 1,5 Hz lavpass) signal til 3 luktstoffer og en kontroll (mineralolje). Legg merke til avbøyningene som respons på 1% 1-heksanol (1), 1% benzaldehyd (2) og 1% smørsyre (3). Legg merke til fraværet av respons på den negative kontrollen, mineralolje (4). C ) Fra venstre mot høyre: Representativ EAG-respons (i mV) på 1 % benzaldehyd (øverst) og en mineraloljekontroll (nederst) hos hunnene Aedes aegypti, Anopheles stephensi, Culex quinquefasciatus og Toxorhynchites rutilus septentrionalis. Ett sekunds puls er representert av det fargede rektangelet over EAG-sporet. Legg merke til den store nedbøyningen som respons på benzaldehyd og mangelen på respons på mineraloljen. Legg også merke til den forskjellige skalaen i Toxorhynchites rutilus septentrionalis. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Eksempel på representasjon av EAG-resultater og deres statistiske analyser. A. Gjennomsnittlig EAG-respons av Culex quinquefasciatus (N = 8), Anopheles stephensi (N = 10), Aedes aegypti (N = 8) og Toxorhynchites rutilus septentrionalis (N = 7) hunner til 1% 1-heksanol (grønn), 1% smørsyre (oransje), 1% benzaldehyd (gul) og mineralolje (blå). B. Culex quinquefasciatus hunner EAG dose-responskurve for 1-heksanol (venstre) (N = 9) og benzaldehyd (høyre) (N = 8). Barer representerer standardfeil av gjennomsnittet. Bokstaver over feilfelt indikerer statistiske forskjeller (Parvis Wilcoxon rangsumtest med en Bonferroni-korreksjon). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Luktmediert atferd påvirkes av mange faktorer, inkludert fysiologisk (f.eks. alder, tid på dagen) og miljø (f.eks. temperatur, relativ fuktighet)30. Når du utfører EAG, er det derfor viktig å bruke insekter som har samme fysiologiske status (dvs. overvåking av alder, sult, parring)31 og også å opprettholde et varmt og fuktig miljø rundt preparatet for å unngå uttørking. En temperatur rundt 25 °C er ideelt og 60 % til 80 % luftfuktighet for hovedflyselskapet. Dette kan enkelt oppnås ved å plassere en bubbler på hovedflykretsen.
Videre er det viktig å vurdere økologien til hver art for å oppnå resultater som er relevante for insektets biologi. For eksempel, hvis du bruker en nattlig art, bør du vurdere å inversere lyssyklusen for å teste deres respons under deres subjektive natt. Å velge å gjennomføre EAGs på bestemte øyeblikk av dagen (dvs. når insektet er aktivt) er også viktig. For eksempel, hvis du bruker Ae. aegypti mygg, bør du vurdere å gjøre forsøkene under toppene av aktiviteten til denne arten (dvs. tidlig på dagen og senere ettermiddag). Igjen kan lyssyklusen enkelt skiftes for enkelhets skyld ved hjelp av klimakamre eller lysbokser med et inverst lysprogram ved hjelp av en programmerbar timer32. Eilerts et al.33 og Krishnan et al.34, har vist at følsomheten for spesifikke luktstoffer varierer gjennom døgnet. Dermed vil god kunnskap om insektets økologi og biologi garantere mer nøyaktige resultater.
Støy (enten elektrisk eller mekanisk) kan enkelt introduseres i EAG. For eksempel kan mekaniske forstyrrelser skapes av et vekselstrømssystem som blåser luft mot et EAG-preparat. Elektrisk støy kan reduseres med Humbug, men hvis den vedvarer, kan den spores opp ved å plugge elementer og jorde dem til Faraday-buret ved hjelp av alligatorklips (figur 3B). Dette gjelder alle elementene som er tilstede rundt preparatet (dvs. mikroskop, lampe, mikromanipulatorer). Noen utstyrsdeler i Faraday-buret bør kobles fra før opptak, da de fortsatt kan produsere elektrisk støy (f.eks. Kald lyskilde) eller plasseres utenfor buret. En annen type "støy" er av olfaktorisk natur. Eksperimentøren bør unngå å bruke parfyme eller bruke sterkt duftende sjampo eller vaskemiddel. Faktisk kan mange forbindelser som finnes i disse detekteres av mygg (f.eks. Linalool, citronellol, geraniol, eugenol) og kan forstyrre og påvirke resultatene av forsøkene. Bruk av laboratoriefrakk og hansker er også viktig for å begrense uønsket forurensning av flyselskapet, sprøyter og elektroder.
Den presenterte protokollen har fordelen av å være lett anvendelig for alle myggarter, både hos menn og kvinner, samtidig som preparatets levetid forlenges (> 30 minutter) og med begrenset variasjon mellom preparatene. Denne metoden fører til svært minimal støy i EAG-signalet, noe som gjør det mulig å teste kjemikalier ved svært lave konsentrasjoner. Når disseksjons- og monteringstrinnene er mestret, kan denne teknikken produsere pålitelige data på relativt kort tid, og enkle dataanalyser.
Electroantennography tillater bare eksperimentøren å vurdere om mygga kan oppdage et kjemikalie eller ikke. For å bestemme valensen av dette kjemiske, er imidlertid komplementære atferdsanalyser, for eksempel olfactometer-analyser, avgjørende for å avgjøre om en bestemt luktant eller blanding er attraktiv, frastøtende eller nøytral for å utvikle effektive verktøy for myggkontroll35.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Jeg er takknemlig for Dr. Clément Vinauger og Dr. Jeffrey Riffell for nyttige diskusjoner. Følgende reagenser ble oppnådd gjennom BEI Resources, NIAID, NIH: Anopheles stephensi, stamme STE2, MRA-128, bidratt av Q. Benedict; Aedes aegypti, Strain ROCK, MRA-734, bidratt av David W. Severson; Culex quinquefasciatus, stamme JHB, egg, NR-43025. Forfatteren takker Dr. Jake Tu, Dr. Nisha Duggal, Dr. James Weger og Jeffrey Marano for å gi Culex quinquefasciatus og Anopheles stephensi (stamme: Liston) myggegg. Aedes albopictus og Toxorhynchites rutilus septentrionalis er avledet fra feltmygg samlet av forfatteren i New Valley-området (VA, USA). Dette arbeidet ble støttet av Institutt for biokjemi og The Fralin Life Science Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air table Clean Bench | TMC | https://www.techmfg.com/products/labtables/cleanbench63series/accessoriess | Noise reducer |
| Analog-to-digital board | National Instruments | BNC-2090A | |
| Benchtop Flowbuddy Complete | Genesee Scientific | 59-122BC | To anesthesize mosquitoes |
| Borosillicate glass capillary | Sutter Instrument | B100-78-10 | To make the recording and references capillaries |
| Chemicals | Sigma Aldrich | Benzaldehyde: 418099-100 mL; Butyric acid: B103500-100mL; 1-Hexanol: 471402-100mL; Mineral oil: M8410-1L | Chemicals used for the experiments presented here |
| CO2 | Airgas or Praxair | N/A | To anesthesize mosquitoes |
| Cold Light Source | Volpi | NCL-150 | |
| Disposable syringes | BD | 1 mL (309628) / 3 mL (309657) | |
| Electrode cables | World Precision Instruments | 5371 | |
| Electrode gel salt free | Parkerlabs | 12-08-Spectra-360 | |
| Faraday cage | TMC | https://www.techmfg.com/products/electric-and-magnetic-field-cancellation/faradaycages | Noise reducer |
| Flowmeters | Bel-art | 65 mm (H40406-0010) / 150 mm (H40407-0075) | One of each |
| GCMS vials and caps | Thermo-fisher scientific | 2-SVWKA8-CPK | To prepare odorant dilutions |
| Glass syringes (Fortuna) | Sigma Aldrich | Z314307 | For odor delivery to the EAG prep |
| Humbug | Quest Scientific | http://www.quest-sci.com/ | Noise reducer |
| 2 mm Jack Holder, Narrow, 90 deg., With Wire | A-M Systems | 675748 | Electrode holder |
| Magnetic bases | Kanetec | MB-FX | x 2 |
| MATLAB + Toolboxes | Mathworks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | For delivering the pulses |
| Medical air | Airgas or Praxair | N/A | For main airline |
| Microscope | Nikkon | SMZ-800N | |
| Micromanipulators Three-Axis Coarse/Fine Compact Micromanipulator | Narishige | MHW-3 | x 2 |
| Microelectrode amplifier with headstage | A-M Systems | Model 1800 | |
| Mosquito rearing supplies | Bioquip | https://www.bioquip.com/Search/WebCatalog.asp | |
| Needles | BD | 25G (305127) / 21G (305165) | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-6A | For odor delivery to the EAG prep |
| PTFE Tubing of different diameters | Mc Master Carr | N/A | To connect solenoid valve, flowmeter, airline ect. |
| 30V/5A DC Power Supply | Dr. Meter | PS-305DM | |
| R version 3.5.1 | R project | https://www.r-project.org/ | For data analyses |
| Relay for solenoid valve | N/A | Custom made | |
| Silver wire 0.01” | A-M Systems | 782500 | |
| Solenoid valve (3-way) | The Lee Company | LHDA0533115H | |
| WinEDR software | Strathclyde Electrophysiology Software | WinEDR V3.9.1 | For EAG recording |
| Whatman paper | Cole Parmer | UX-06648-03 | To load chemical in glass syringe / Pasteur pipette |
References
- World Health Organization. World health statistics 2019: monitoring health for the SDGs, sustainable development goals. World Health Organization. , Geneva. (2019).
- Takken, W. The role of olfaction in host-seeking of mosquitoes: a review. International Journal of Tropical Insect Science. 12 (1-2-3), 287-295 (1991).
- Zwiebel, L. J., Takken, W.
- Potter, C. J. Stop the biting: targeting a mosquito's sense of smell. Cell. 156 (5), 878-881 (2014).
- Paluch, G., Bartholomay, L., Coats, J. Mosquito repellents: a review of chemical structure diversity and olfaction. Pest Management Science. 66 (9), 925-935 (2010).
- Schneider, D. Electrophysiological investigation on the antennal receptors of the silk moth during chemical and mechanical stimulation. Experientia. 13 (2), 89-91 (1957).
- Raguso, R. A., Light, D. M., Pickersky, E. Electroantennogram responses of Hyles lineata (Sphingidae: Lepidoptera) to volatile compounds from Clarkia breweri (Onagraceae) and other moth-pollinated flowers. Journal of Chemical Ecology. 22 (10), 1735-1766 (1996).
- Schweitzer, E. S., Sanes, J. R., Hildebrand, J. G. Ontogeny of electroantennogram responses in the moth, Manduca sexta. Journal of Insect Physiology. 22 (7), 955-960 (1976).
- Martel, V., Anderson, P., Hansson, B. S., Schlyter, F. Peripheral modulation of olfaction by physiological state in the Egyptian leaf worm Spodoptera littoralis (Lepidoptera: Noctuidae). Journal of Insect Physiology. 55 (9), 793-797 (2009).
- Spaethe, J., Brockmann, A., Halbig, C., Tautz, J. Size determines antennal sensitivity and behavioral threshold to odors in bumblebee workers. Naturwissenschaften. 94 (9), 733-739 (2007).
- Suchet, C., et al. Floral scent variation in two Antirrhinum majus subspecies influences the choice of naïve bumblebees. Behavioral Ecology and Sociobiology. 65 (5), 1015-1027 (2011).
- De Jong, R., Pham-Delègue, M. H. Electroantennogram responses related to olfactory conditioning in the honeybee (Apis mellifera ligustica). Journal of Insect Physiology. 37 (4), 319-324 (1991).
- Patte, F., Etcheto, M., Marfaing, P., Laffort, P. Electroantennogram stimulus-response curves for 59 odourants in the honeybee, Apis mellifica. Journal of Insect Physiology. 35 (9), 667-675 (1989).
- Alcorta, E. Characterization of the electroantennogram in Drosophila melanogaster and its use for identifying olfactory capture and transduction mutants. Journal of Neurophysiology. 65 (3), 702-714 (1991).
- Park, K. C., Ochieng, S. A., Zhu, J., Baker, T. C. Odor discrimination using insect electroantennogram responses from an insect antennal array. Chemical Senses. 27 (4), 343-352 (2002).
- Du, Y. J., Millar, J. G. Electroantennogram and oviposition bioassay responses of Culex quinquefasciatus and Culex tarsalis (Diptera: Culicidae) to chemicals in odors from Bermuda grass infusions. Journal of Medical Entomology. 36 (2), 158-166 (1999).
- Costantini, C., et al. Electroantennogram and behavioural responses of the malaria vector Anopheles gambiae to human-specific sweat components. Medical and Veterinary Entomology. 15 (3), 259-266 (2001).
- Collins, L. E., Blackwell, A. Electroantennogram studies of potential oviposition attractants for Toxorhynchites moctezuma and T. amboinensis mosquitoes. Physiological Entomology. 23 (3), 214-219 (1998).
- Seenivasagan, T., Sharma, K. R., Sekhar, K., Ganesan, K., Prakash, S., Vijayaraghavan, R. Electroantennogram, flight orientation, and oviposition responses of Aedes aegypti to the oviposition pheromone n-heneicosane. Parasitology Research. 104 (4), 827-833 (2009).
- Puri, S. N., Mendki, M. J., Sukumaran, D., Ganesan, K., Prakash, S., Sekhar, K. Electroantennogram and behavioral responses of Culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae) females to chemicals found in human skin emanations. Journal of Medical Entomology. 43 (2), 207-213 (2014).
- Cooperband, M. F., McElfresh, J. S., Millar, J. G., Carde, R. T. Attraction of female Culex quinquefasciatus Say (Diptera: Culicidae) to odors from chicken feces. Journal of Insect Physiology. 54 (7), 1184-1192 (2008).
- Dekker, T., Ignell, R., Ghebru, M., Glinwood, R., Hopkins, R. Identification of mosquito repellent odours from Ocimum forskolei. Parasites & Vectors. 4 (1), 183 (2011).
- Choo, Y. M., et al. Reverse chemical ecology approach for the identification of an oviposition attractant for Culex quinquefasciatus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), 714-719 (2018).
- Wolff, G. H., Lahondère, C., Vinauger, C., Riffell, J. A. Neuromodulation and differential learning across mosquito species. bioRxiv. , 755017 (2019).
- Lahondère, C., et al. The olfactory basis of orchid pollination by mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (1), 708-716 (2020).
- Beyenbach, K., Masia, R. Membrane conductances of principal cells in Malpighian tubules of Aedes aegypti. Journal of Insect Physiology. 48, 375-386 (2002).
- Oesterle, A. The Pipette Cookbook. , (2018).
- R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. (2018).
- Afify, A., Betz, J. F., Riabinina, O., Lahondère, C., Potter, C. J. Commonly used insect repellents hide human odors from Anopheles mosquitoes. Current Biology. 29 (21), 3669-3680 (2019).
- Martin, F., Riveron, J., Alcorta, E. Environmental temperature modulates olfactory reception in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 57 (12), 1631-1642 (2011).
- Qiu, Y. T., Gort, G., Torricelli, R., Takken, W., van Loon, J. J. Effects of blood-feeding on olfactory sensitivity of the malaria mosquito Anopheles gambiae: application of mixed linear models to account for repeated measurements. Journal of Insect Physiology. 59 (11), 1111-1118 (2013).
- Taylor, B., Jones, M. D. R. The circadian rhythm of flight activity in the mosquito Aedes aegypti (L.): the phase-setting effects of light-on and light off. Journal of Experimental Biology. 51 (1), 59-70 (1969).
- Eilerts, D. F., VanderGiessen, M., Bose, E. A., Broxton, K., Vinauger, C. Odor-specific daily rhythms in the olfactory sensitivity and behavior of Aedes aegypti mosquitoes. Insects. 9 (4), 147 (2018).
- Krishnan, B., Dryer, S. E., Hardin, P. E. Circadian rhythms in olfactory responses of Drosophila melanogaster. Nature. 400 (6742), 375-378 (1999).
- Pelletier, J., Guidolin, A., Syed, Z., Cornel, A. J., Leal, W. S. Knockdown of a mosquito odorant-binding protein involved in the sensitive detection of oviposition attractants. Journal of Chemical Ecology. 36 (3), 245-248 (2010).
