Summary
Den här artikeln beskriver ett steg-för-steg-protokoll för framgångsrika och lågbrusiga elektroantennogram i flera myggsläkten, inklusive både kvinnor och män.
Abstract
Kvinnliga myggor är de dödligaste djuren på jorden och kräver livet för mer än 1 miljon människor varje år på grund av patogener som de överför när de förvärvar en blodmåltid. För att hitta en värd att mata på, är myggor beroende av ett brett spektrum av sensoriska signaler, inklusive visuella, mekaniska, termiska och olfaktoriska. Studien beskriver en teknik, elektroantennografi (EAG), som gör det möjligt för forskare att bedöma om myggorna kan upptäcka enskilda kemikalier och blandningar av kemikalier på ett koncentrationsberoende sätt. I kombination med gaskromatografi (GC-EAG) tillåter denna teknik att exponera antennerna för en full headspace / komplex blandning och bestämmer vilka kemikalier som finns i provet av intresse, myggan kan upptäcka. Detta är tillämpligt på värdkroppslukt såväl som växtblombuketter eller andra ekologiskt relevanta lukter (t.ex. luktmedel för äggplaceringsplatser). Här beskrev vi ett protokoll som tillåter långa varaktigheter av förberedelsens responstid och är tillämpligt på både kvinnliga och manliga myggor från flera släkten, inklusive Aedes, Culex, Anopheles och Toxorhynchites myggor. Eftersom luktsinnet spelar en viktig roll i mygg-värdinteraktioner och myggbiologi i allmänhet kan EAG och GC-EAG avslöja föreningar av intresse för utveckling av nya strategier för sjukdomsvektorkontroll (t.ex. beten). Kompletterat med beteendeanalyser kan valensen (t.ex. attraherande, repellent) för varje kemikalie bestämmas.
Introduction
Myggor är de dödligaste organismerna på jorden och kräver mer än en miljon människors liv per år och placerar mer än hälften av världens befolkning i riskzonen för exponering för de patogener de överför, medan de biter1. Dessa insekter förlitar sig på ett brett spektrum av signaler (dvs. termisk, visuell, mekanisk, olfaktorisk, auditiv) för att hitta en värd att mata på (både växt och djur), för parning och oviposition, samt för att undvika rovdjur i både larv- och vuxenstadiet 2,3. Bland dessa sinnen spelar luktsinnet en avgörande roll i ovan nämnda beteenden, särskilt för medel- till långdistansdetektion av luktmolekyler 2,3. Lukter som avges av en värd eller en ovipositionsplats detekteras av olika specifika luktreceptorer (t.ex. GR, OR, IR) belägna på myggpalperna proboscis, tarsi och antenner 2,3.
Eftersom luktsinnet är en nyckelkomponent i deras värdsökande (växt och djur), parnings- och ovipositionsbeteenden, utgör det således ett idealiskt mål att studera för att utveckla nya verktyg för myggkontroll4. Forskning om repellenter (t.ex. DEET, IR3535, picaridin) och beten (t.ex. BG sentinel human lure) är extremt produktiv5, men på grund av de nuvarande utmaningarna inom myggkontroll (t.ex. insekticidresistens, invasiva arter) är det viktigt att utveckla nya effektiva kontrollmetoder informerade av myggbiologin.
Många tekniker (t.ex. olfaktometer, landningsanalyser, elektrofysiologi) har använts för att bedöma bioaktiviteten hos föreningar eller blandningar av föreningar i myggor. Bland dem kan elektroantennografi (eller elektroantennogram (EAG)) användas för att avgöra om luktämnena detekteras av myggantennerna. Denna teknik utvecklades ursprungligen av Schneider6 och har använts i många olika insektssläkten sedan dess, inklusive malar 7,8,9, humlor 10,11, honungsbin 12,13 och fruktflugor 14,15 för att nämna några. Elektroantennografi har också använts med hjälp av olika protokoll, inklusive enstaka eller flera antenner i myggor 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25.
Myggor är relativt små och känsliga insekter med ganska tunna antenner. Medan det är relativt enkelt att utföra EAG på större insekter som malar eller humlor på grund av deras större storlek och tjockare antenner, kan det vara utmanande att leda EAG i myggor. I synnerhet är upprätthållandet av ett bra signal-brusförhållande och en varaktig responsiv förberedelse två viktiga krav på datareproducerbarhet och tillförlitlighet.
Steg-för-steg-guiden till lågbrus EAG som föreslås här erbjuder direkt lösningar på dessa begränsningar och gör detta protokoll tillämpligt på flera myggarter från olika släkten, inklusive Aedes, Anopheles, Culex och Toxorhynchites, och beskriver tekniken för både kvinnor och män. Elektroantennografi erbjuder ett snabbt men tillförlitligt sätt att screena och bestämma bioaktiva föreningar som sedan kan utnyttjas i betesutveckling efter att valens har bestämts med beteendeanalyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av saltlösning
- Förbered saltlösningen i förväg och förvara i kylen.
- Följ Beyenbach och Masia26 för att förbereda lösningen.
OBS: Saltrecept i mM: 150,0 NaCl, 25,0 HEPES, 5,0 glukos, 3,4 KCl, 1,8 NaHCO3, 1,7 CaCl 2 och 1,0 MgCl2. PH-värdet justeras till 7,1 med 1 M NaOH. Tillsätt inte glukos eller sackaros till preparatet vid denna tidpunkt för att öka hylllagringen. Tillsätt den nödvändiga mängden till saltlösningen precis innan du kör EAG (cirka 50 ml per experiment).
2. Luktberedning och lagring
- Bered luktblandningarna eller spädningarna av enskilda föreningar i förväg i 1,5 ml bärnstensfärgade injektionsflaskor och förvara vid -20 °C för att förhindra nedbrytning av föreningar.
OBS: Koncentrationerna beror på vilket test som ska utföras. 0,1% eller 1% används vanligtvis för att avgöra om en förening kan detekteras eller inte. Bered serieutspädningar av en given kemikalie för en dos-responskurva och testa dem från den lägsta till den högsta koncentrationen. - Bered utspädningarna i vatten, etanol, hexan, paraffinolja eller mineralolja, beroende på lösligheten hos den testade kemikalien.
- Se till att förbereda en lösningsmedelskontroll (en injektionsflaska som endast innehåller vätskan) för experimentet.
- Ta bort luktämnena från frysen 30 minuter innan experimenten påbörjas så att de kan tina. Vortex varje injektionsflaska före användning för att blanda kemikalien och lösningsmedlet väl.
- Pipettera 10 μL lösning på en bit filterpapper (0,5 cm x 2 cm) som fyllts inuti en märkt glasspruta eller pasteurpipett.
- Ladda varje förening eller blandning i en specifik Pasteur-pipett eller spruta för att förhindra kontaminering.
OBS: Fyll 10 minuter innan experimentet påbörjas så att lukten kan diffundera i sprutan men inte längre för att förhindra nedbrytning. Låt Pasteurpipetten eller sprutan förbli täckt vid denna tidpunkt för att möjliggöra en god diffusion av kemikalien innan experimentet startar. - Efter varje EAG-körning, kassera biten av filterpapperet och byt ut det mot ett nytt för att förhindra att papperet blir överdränkt och riskerar nålblockering. Byt ut nålarna regelbundet (var 10: e körning).
3. Mygga separation
- Isolera myggorna på experimentdagen.
- Använd myggor som är minst 6 dagar gamla på experimentdagen för experimenten för att öka chansen att honorna paras för att förbättra deras svar på värdrelaterade luktmedel.
OBS: Justera myggåldern vid testtillfället beroende på projektet. Kontrollera och harmonisera den fysiologiska statusen (t.ex. blodmatad, utsvulten, aldrig tidigare matad, etc.). - Svälta myggorna upp till 12 timmar (dvs ingen tillgång till socker) för att öka deras motivation och känslighet.
- Placera myggbehållaren i kylen (4 ° C) tills de slutar flyga så att individer enkelt kan överföras försiktigt till enstaka koppar med pincett.
OBS: Arter med högre tolerans mot kyla kan avlivas med hjälp av en CO2 flugdyna. Se till att myggorna inte stannar kvar på det länge för att förhindra uttorkning, vilket skulle minska responsen hos myggans EAG-preparat. - Förvara kopparna som innehåller enstaka myggor vid rumstemperatur innan EAG utförs och kassera eventuella myggor som inte får användas under dagen.
4. Elektrodhållare och kapillärberedning
- Kapillärdragning, förberedelse och lagring
- Använd borosilikatkapillärer med filament (I.D: 0,78 mm, OD: 1 mm). Dra dem beroende på utrustningen27.
OBS: Förvara de dragna kapillärerna i en petriskål. Lägg petriskålen på bitar av vax eller oparfymerad modelleringslera för att förhindra att de rör sig och går sönder. - Innan du kör EAG-experimentet, bryt försiktigt spetsen på 2 kapillärer med ett par pincett under mikroskopet.
OBS: Se till att den ena är något större än den andra för att passa antingen nacken (större kapillär) eller antennspetsarna (mindre kapillär). Se till att snittet är rent utan sprickor på kapillärväggen. Detta kräver tålamod och övning. - Om de fortfarande är intakta, återanvänd dessa kapillärer efter sköljning med avjoniserat (DI) vatten efter att experimentet är över. Ta bort överflödigt vatten genom att försiktigt applicera en rengöringsduk mot spetsen. Lägg tillbaka i förvaring Petriskål. Om spetsen är krokig, kassera kapillären.
- Använd borosilikatkapillärer med filament (I.D: 0,78 mm, OD: 1 mm). Dra dem beroende på utrustningen27.
- Elektrodhållare och kapillärmontering
- Märk de två elektrodhållarna som "inspelning" och "referens" genom att använda bitar av labbtejp i olika färger. Detta hjälper till att styra monteringen av mygghuvudet och elektroderna.
- Se till att elektrodhållarna är fria inuti och att det inte finns något borosilikatskräp.
- Kloridisering: Blötlägg elektrodhållarnas silvertrådar i rent blekmedel i ca 5 min. Trådarna förvandlas från glänsande ljusgrå till matt mörkgrå.
- Lossa gummiproppen och fyll kapillärens insida med 10% saltlösning med en 20 G nål.
- Fyll borosilikatkapillären med saltlösningen med en spruta. Se till att inga bubblor finns i varken elektrodhållaren eller den dragna kapillären.
OBS: För att minska risken för bubblor i kapillären, fortsätt att trycka saltlösning i kapillären medan du försiktigt drar ut nålen och använd kapillärer med ett filament. Det är möjligt att ladda kapillärerna med en lösning bestående av 1: 3 elektrodgel och saltlösning. Detta kan hjälpa till att förhindra avdunstning av saltlösningen och kan vara särskilt användbart när man lär sig och övar EAG, eftersom experimenten behöver mer tid för att slutföra de olika stegen. - Efter blötläggning, skölj silvertrådarna med DI-vatten och sätt in dem i de två kapillärerna. Se till att trådspetsen är mindre än 1 mm från kapillärspetsen. Se till att kapillären passerar gummiringen inuti elektrodhållaren utan att gå sönder. Dra försiktigt åt gummiproppen. Kontrollera att inga luftbubblor finns.
- Använd kapillären med den bredare öppningen på referenselektrodhållaren (halsen) och den mindre öppningen på inspelningselektrodhållaren (antenner).
- Lämna de två monterade elektrodhållarna på en våtrengöringsduk för att förhindra att spetsen torkar ut tills den är klar att montera huvudet.
5. Förberedelse av EAG-rigg (figur 1)
- Se till att luftbordet är uppe, att det inte finns någon blockering i flygbolaget. Se till att tanken med medicinsk luft fortfarande är full för att undvika att byta den mitt i experimentet. Se till att det finns bubblor i luftfuktaren.
- Luft- och pulsleveranssystem
- Slå på den medicinska luftgastanken.
- Kontrollera nivån på de två flödesmätarna.
OBS: Flödesmätaren som styr huvudluftströmmen som badar preparatet under hela experimentet bör vara 140 ml / min och den andra relaterade till luktpulsen bör läsa 15 ml / min.
- Om du gör GC-EAD, slå på maskinen, gastankarna och skapa/ladda filen/metoden.
- Slå på datorerna, programvaran, ventilströmförsörjningen och verifiera internetanslutningen för att programvaran ska fungera.
- Programvara: Ett kort skript kan skrivas för att leverera pulsen.
- EAG-programvara: använd vilken elektrofysiologisk programvara som helst.
- Implementera parametrarna i programvaran (t.ex. förstärkare, inspelningstid, pulsernas varaktighet etc.).
- Leverera en styrpuls för att verifiera att ventilen som levererar pulserna fungerar.
- Ställ in strömförsörjningen på 5,2 V. Kontrollera förstärkarparametrarna.
OBS: De parametrar som används för de data som presenteras här är: lågt avstängningsfilter på 0,1 Hz; högt avstängningsfilter på 500 Hz; Förstärkning på x100.
6. Förberedelse och montering av mygghuvud (figur 2)
- Lägg en aluminiumplatta på is och lägg en bit våtrengöringsduk över den.
- Lägg en liten klick elektrodgel i ett hörn.
- Lägg en myggkopp på is och låt myggan svalna i ett par minuter, eller tills den slutar flyga.
OBS: Vissa arter är kalltåliga och kan kräva en snabbbedövning över en CO2-flugplatta för att gå ner. Ju minst myggan stannar på heller, desto bättre. - Placera myggan på ryggen och klipp spetsen på varje antenn (endast en liten del av det sista segmentet) med mikrosax.
- Använd pincett för att dra myggan bredvid elektrodgeldockan och doppa varje antenns spets försiktigt i gelén. Undvik att doppa mer än bara det allra sista segmentet i elektrodgelen.
- Dra ut myggantennerna med pincett medan du håller dem bredvid varandra. Låt dem komma ut tillsammans från gelén. Se till att antennerna inte vidrör rengöringsservettens yta, annars kan de separera.
- Placera myggan på sidan och hugga huvudet med mikrosax eller ett rakblad.
OBS: När huvudet har huggits, fortsätt snabbt till nästa steg och till EAG-riggen för att starta inspelningarna. Beredningen ska vara lyhörd i cirka 30 minuter. - Ta referenselektroden och djupt försiktigt spetsen i gelén. Håll kontakten med nackvävnaderna och låt huvudet fastna på det.
- Flytta elektrodhållarna under EAG-mikroskopet och titta genom mikroskopet för att placera huvudet (dvs referens) elektroden på en mikromanipulator. Se till att antennerna är i mitten.
- Ta tag i inspelningselektroden, placera den framför antennspetsarna. Flytta och justera den så nära spetsarna som möjligt med hjälp av mikromanipulatorn. Använd mikroskopet och flytta spetsen på inspelningselektroden mot antennerna.
- Anslut båda elektrodhållarna till förstärkaren innan du sätter i spetsarna för att förhindra att de rör sig efter insättningen.
- Sätt i antennspetsarna i inspelningselektroden. Se till att de bara kommer i kontakt med saltlösningen och elektrodgelen och är synliga genom transparens genom kapillären. Antennen går in genom "sugeffekten".
- Justera huvudets och spetsarnas position med pincett under mikroskopet, om det behövs.
- Placera luftslangen nära mygghuvudets förberedelse (avstånd: 1 cm).
OBS: Om huvudet faller av, gå tillbaka till dissektionsstationen och sätt tillbaka huvudet eller förbered ett nytt om det har gått förlorat eller om det har gått mer än 5 minuter sedan huvudet skars av. En bra anslutning mellan kapillären och nacken/antennerna är avgörande för låg ljudnivå och tillförlitlig inspelning. Helst kommer antennspetsarna att vara mindre än 1 mm från inspelningselektrodens tråd när den har satts in. - Stäng av ljuskällan, om den används.
- Placera vakuumledningen nära mygghuvudets förberedelse (avstånd: 20 cm) och justera med huvudflygbolaget.
OBS: Vakuumet hjälper till att avlägsna kemikalier som omger huvudberedningen efter stimulansen, vilket kan leda till EAG-svar efter att pulserna applicerades.
7. Inspelningar
- När du har satt in antennens spetsar, slå på förstärkaren och brusreduceraren. Observera baslinjesignalen och se till att den inte är bullrig.
OBS: Observera om stora svängningar i den elektriska signalen är närvarande. Justera huvudets och antennspetsarnas position efter behov tills signalen är ren. Använd alligatorklämmor för att jorda allt som introducerar buller till Faraday-buren eller luftbordet. En baslinjesignal med mindre än 0,01 mV i amplitud är idealisk för att upptäcka och urskilja små EAG-svar. - När ljudnivån är tillfredsställande, sätt in den första luktsprutan för att testa i lufthålet.
- Stäng Faraday-buret. Stanna inte framför förberedelsen för att minska buller.
- Klicka på Spela in på EAG-programvaran.
- Leverera pulsen (erna) med hjälp av programvaran.
OBS: Antalet och varaktigheten av pulserna varierar beroende på experimenten. Här har enstaka 1 s. pulser per luktämne använts. Luktmedel separerades med 45 s. - Notera svaret från myggantennerna i labbanteckningsboken.
OBS: Om luktämnet detekteras av myggantennerna observeras en tydlig avböjning i signalen (se figur 3A). - Fortsätt med nästa lukt eller koncentration. Glöm inte att randomisera presentationen av luktämnen om inte en dos-responskurva utförs.
OBS: En negativ kontroll och en positiv kontroll bör användas i experimenten. Detta kommer att säkerställa att de observerade svaren verkligen är luktrespons och inte beror på mekaniskt eller elektriskt brus. - I slutet av inspelningen använder du en positiv kontroll för att verifiera att antennerna fortfarande svarar.
OBS: Använd 0,1% eller 1% bensaldehyd eftersom alla myggarter som testats hittills har varit mottagliga för denna förening. - Fortsätt med nästa myggberedning.
8. Rengöring
- Stäng av förstärkaren, brusreduceraren, flygbolaget och datorn.
- Sätt tillbaka luktämnena i frysen.
- Ta bort filterpapperen från glassprutorna och rengör med 100% etanol om rester syns på väggarna. Låt torka på en rengöringsduk över natten.
- Rengör elektrodhållarna med DI-vatten för att ta bort eventuella spår av salt. Torka genom att försiktigt applicera mot en rengöringsservett.
- Placera myggrester i frysen och kassera 24 timmar senare.
OBS: Om du arbetar med infekterade myggor, följ säkerhetskraven på din institution.
9. Analys av data
- Mät EAG-svaren antingen manuellt eller automatiskt.
OBS: EAG-amplituden (-mV) mäts här. Genomsnitt om flera pulser har applicerats för varje förening. Beroende på vilken programvara som används kan EAG automatiskt detekteras och mätas. Det är dock viktigt att inspektera varje svar individuellt för att verifiera svarets form och bedöma eventuell överföring, fördröjd respons etc. Det ideala EAG-svaret är i linje med pulsen, visar en tydlig avböjning och är repeterbart mellan myggpreparat (figur 3). - Presentera rådata för att visa minimal variabilitet, låg brussignal och tydliga svar (figur 3B).
OBS: Data kan också normaliseras (t.ex. Z-poäng). Det negativa kontrollvärdet (t.ex. mineralolja) (dvs. baslinjen) kan subtraheras från responsen och, om inte, bör presenteras i figurerna. En positiv kontroll bör också presenteras. - Utför statistisk analys med hjälp av någon statistikprogramvara28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Elektroantennografi är ett kraftfullt verktyg för att avgöra om en kemikalie eller blandning av kemikalier detekteras av en insektsantenn. Det kan också användas för att bestämma detektionströskeln för en given kemikalie med hjälp av en gradvis ökning av koncentrationen (dvs. doskurvrespons, figur 4B). Dessutom är det användbart att testa effekterna av repellent på svaret på värdrelaterade lukter29.
Positiva och negativa kontroller bör alltid användas i EAG. Här användes bensaldehyd som en positiv kontroll (figur 3B, 3C, 4A). Denna förening har visat sig framkalla ett antennsvar i alla myggarter som hittills testats24,25,29. En negativ kontroll bör också användas och kan bestå av det lösningsmedel som används för att späda kemikalierna (t.ex. mineral- eller paraffinoljor, hexan etc.) och bör inte framkalla någon reaktion (figur 3B, 3C, 4A).
Vid utförande av EAG bör en avböjning inte noteras vid tillämpning av kontrollen (figur 3B, 3C, 4A). Om ett svar observeras är antingen sprutan, lösningsmedelskontrollen och/eller luktlinjen sannolikt förorenad. Om så är fallet ska en ny lösning beredas, sprutan rengöras med 100% etanol och torkas och/eller luftledningen dekontamineras genom sköljning med 100% etanol och torkas. Om den valda kontrollen framkallar en respons (t.ex. etanol) bör det värde som erhålls i -mV för kontrollen subtraheras från det värde som erhållits för etanol och testkemikalien kombineras för att bedöma den testade kemikaliens inverkan på antennerna.
Myggarter varierar i deras förmåga att reagera på olika föreningar, liksom i storleken på deras svar. Till exempel producerar Toxorhynchites myggor mycket stora EAG i jämförelse med Ae. aegypti, An. Stephensi och Cx. quinquefasciatus (figur 3C, figur 4A).
I EAG leder den andra pulsen och följande vanligtvis till mindre EAG-svar. Presentationen av ett luktämne kan också påverka svaret på följande, så det är viktigt att randomisera luktordningen och flera analyser för att effektivt testa en panel av luktmedel (såvida inte en dos-responskurva utförs). Dessutom kommer separering av pulser (t.ex. 5 s) och luktämnen (t.ex. 45 s) presentation att bidra till att optimera EAG-svaren.
Flyktigheten hos de testade kemikalierna varierar och kan påverka luktresponsen och potentiellt leda till ett fördröjt svar om den testade kemikalien har mycket låg flyktighet. Kemisk flyktighet och löslighet bör vara kända innan EAG utförs för att optimera analysen. Lösningsmedlet som används för att bereda spädningarna bör också väljas noggrant (t.ex. etanol-, hexan-, mineral- eller paraffinolja). Dessutom bör koncentrationer väljas klokt och helst vara ekologiskt relevanta. En koncentration på 1% eller 0,1% används ofta men är relativt hög och inte nödvändigtvis representativ för vad insekterna kan uppleva i naturen. Ändå är det användbart att screena föreningar med relativt höga koncentrationer i vissa fall (t.ex. för betesutveckling). Repellenter kan testas vid sin kommersiellt tillgängliga koncentration (t.ex. säljs DEET vanligtvis i en koncentration på 40%).
Om de kombineras med gaskromatografi (dvs. GC-EAD)25 kan de föreningar som framkallar en reaktion identifieras med en GC-MS och sedan testas individuellt vid olika koncentrationer eller i blandningar med EAG. Det är värt att nämna att valensen av de testade kemikalierna inte kan bestämmas med EAG. Endast ett kompletterande beteendeexperiment (t.ex. olfaktometer, matningsanalys) kan bedöma om kemikalien som detekteras av antennerna är attraktiv, avvisande eller neutral för myggan. Slutligen visar EAG-experiment endast svar från det perifera nervsystemet.
Figur 1: Elektroantennograminställning bestående av: A) Mikroskop: det använda mikroskopet bör göra det möjligt för experimentet att tydligt se preparatet så att myggantennspetsarna kan sättas in i inspelningselektroderna. B) Kall ljuslampa: lampan ska stängas av när inspelningarna börjar. C) Vakuumledning: detta minskar risken för ansamling av luktmedel runt mygghuvudets förberedelse, vilket kan resultera i antennsvar frikopplade från faktisk stimulering. D) Mikromanipulatorer (x2): dessa möjliggör mycket fina elektrodhållarrörelser, vilket krävs för att sätta in myggantennerna i inspelningselektrodens kapillär. E) Registrerande elektrodhållare. F) Referenselektrodhållare. G) Huvudsteg: båda elektroderna är anslutna i huvudsteget som sedan ansluts till förstärkaren. H) Huvudflygbolag: ett konstant rent luftflöde badade mygghuvudet. Flödeshastigheten regleras av en flödesmätare. I) Spruta för luktleverans ansluten till magnetventilen och flödesmätaren; J) Luftbord: luftbordet minskar bullret. K) Faraday-bur: Faraday-buret förhindrar elektriskt brus. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Steg-för-steg Aedes albopictus mygghuvudförberedelse för EAG-inspelningar. A) Kvinnlig mygga på ryggen på en isig platta för att verifiera att båda antennerna är intakta. B) Sista segmentet av antennexcisionen med mikrosax. C) Antenner doppas i elektrodgel. D) Antennerna håller ihop efter att ha dragit ut dem. Endast ett segment av varje antenn ska vara i elektrodgelen. E) Mygghuvud excision. F) Huvudmonterad på referenselektroden. Den ska vara tillräckligt stabil för att flyttas till EAG-riggen. A'-F'. Samma steg som presenteras ovan för manliga EAG. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Schematisk bild av myggans EAG och råa EAG-spår. A ) EAG-schemat (vänster) och egenskaperna hos EAG-svaret (höger). (Vänster) Mygghuvudet är monterat mellan en referenselektrod och en inspelningselektrod ansluten till en förstärkare. Antennerna badas i ett konstant luftflöde där luktstimuli pulseras. Detektion av en kemikalie leder till en avböjning (i mV) i signalen. (höger) Den kemiska detektionen leder till celldepolarisering (DPR) följt av cellrepolarisering (RPR) tills återgång till baslinjen. Luktpulsen representeras av den grå rektangeln. Den röda linjen anger amplituden för EAG-svaret. B) Skärmdump av WinEDR-programvaran som markerar ett helt EAG-inspelningsspår av en Culex quinquefasciatus kvinnlig mygga. Överst: ofiltrerad (dvs rå) signal. Mitten: 1 s luktpulser indikeras med siffror. Botten: filtrerad (dvs 1,5 Hz lågpass) signal till 3 luktämnen och en kontroll (mineralolja). Observera avböjningarna som svar på 1% 1-hexanol (1), 1% bensaldehyd (2) och 1% smörsyra (3). Observera frånvaron av svar på den negativa kontrollen, mineralolja (4). C ) Från vänster till höger: Representativa EAG-svar (i mV) till 1% bensaldehyd (överst) och en mineraloljekontroll (botten) hos honor Aedes aegypti, Anopheles stephensi, Culex quinquefasciatus och Toxorhynchites rutilus septentrionalis. Sekundpulsen representeras av den färgade rektangeln ovanför EAG-spåret. Observera den stora avböjningen som svar på bensaldehyd och bristen på respons på mineraloljan. Observera också den olika skalan i Toxorhynchites rutilus septentrionalis. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Exempel på representation av EAG-resultat och deras statistiska analyser. A. Genomsnittliga EAG-svar av Culex quinquefasciatus (N = 8), Anopheles stephensi (N = 10), Aedes aegypti (N = 8) och Toxorhynchites rutilus septentrionalis (N = 7) honor till 1% 1-hexanol (grön), 1% smörsyra (orange), 1% bensaldehyd (gul) och mineralolja (blå). B. Culex quinquefasciatus honor EAG dos-responskurva för 1-hexanol (vänster) (N = 9) och bensaldehyd (höger) (N = 8). Staplar representerar medelfel. Bokstäver ovanför felstaplar indikerar statistiska skillnader (parvis Wilcoxon-rangsummatest med en Bonferroni-korrigering). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Olfaktoriska medierade beteenden påverkas av många faktorer, inklusive fysiologiska (t.ex. ålder, tid på dagen) och miljö (t.ex. temperatur, relativ fuktighet)30. Vid utförande av EAG är det därför viktigt att använda insekter som har samma fysiologiska status (dvs. övervakning av ålder, svält, parning)31 och att också upprätthålla en varm och fuktig miljö runt preparatet för att undvika uttorkning. En temperatur runt 25 °C är idealisk och 60% till 80% luftfuktighet för huvudflygbolaget. Detta kan enkelt uppnås genom att placera en bubblare på huvudflygkretsen.
Dessutom är det viktigt att överväga ekologin hos varje art för att få resultat som är relevanta för insektens biologi. Om du till exempel använder en nattlig art, överväg att invertera deras ljuscykel för att testa deras svar under deras subjektiva natt. Att välja att genomföra EAG vid specifika tidpunkter på dagen (dvs. när insekten är aktiv) är också viktigt. Till exempel, om du använder Ae. aegypti myggor, överväga att göra experimenten under topparna av aktiviteten hos denna art (dvs tidigt på dagen och senare eftermiddag). Återigen kan ljuscykeln enkelt flyttas för bekvämlighet med hjälp av klimatkammare eller ljuslådor med ett inverterat ljusprogram med en programmerbar timer32. Eilerts et al.33 och Krishnan et al.34, har visat att känsligheten för specifika luktämnen varierar under dagen. Således kommer en god kunskap om insektens ekologi och biologi att garantera mer exakta resultat.
Buller (antingen elektriska eller mekaniska) kan enkelt introduceras i EAG. Till exempel kan mekaniska störningar skapas genom att ett AC-system blåser luft mot ett EAG-preparat. Elektriskt brus kan minskas med Humbug, men om det kvarstår kan det spåras genom att ansluta element och jorda dem till Faraday-buret med hjälp av alligatorklämmor (figur 3B). Detta gäller alla element som finns runt preparatet (dvs mikroskop, lampa, mikromanipulatorer). Vissa delar av utrustningen i Faraday-buren bör kopplas ur före inspelning eftersom de fortfarande kan producera elektriskt brus (t.ex. kall ljuskälla) eller placeras utanför buren. En annan typ av "buller" är av olfaktorisk natur. Experimenten bör undvika att bära parfym eller använda starkt doftande schampo eller tvättmedel. Faktum är att många föreningar som finns i dessa kan detekteras av myggor (t.ex. linalool, citronellol, geraniol, eugenol) och kan störa och påverka resultaten av experimenten. Att bära en labbrock och handskar är också viktigt för att begränsa oönskad kontaminering av flygbolaget, sprutor och elektroder.
Det presenterade protokollet har fördelen att det är lätt att tillämpa på alla myggarter, både hos män och kvinnor, samtidigt som preparatets livslängd förlängs (> 30 min) och med begränsad variation mellan preparaten. Denna metod leder till mycket minimalt brus i EAG-signalen, vilket möjliggör testning av kemikalier vid mycket låga koncentrationer. När dissektions- och monteringsstegen har bemästrats kan denna teknik producera tillförlitliga data på relativt kort tid och enkla dataanalyser.
Elektroantennografi tillåter endast experimenten att bedöma om myggan kan upptäcka en kemikalie eller inte. För att bestämma valensen av denna kemikalie är emellertid komplementära beteendeanalyser, såsom olfaktometeranalyser, avgörande för att bestämma om ett specifikt luktmedel eller blandning är attraktivt, avvisande eller neutralt för att utveckla effektiva verktyg för myggkontroll35.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författaren har inget att avslöja.
Acknowledgments
Jag är tacksam mot Dr. Clément Vinauger och Dr. Jeffrey Riffell för hjälpsamma diskussioner. Följande reagenser erhölls genom BEI Resources, NIAID, NIH: Anopheles stephensi, Strain STE2, MRA-128, bidragit av Mark Q. Benedict; Aedes aegypti, Strain ROCK, MRA-734, bidrag av David W. Severson; Culex quinquefasciatus, stam JHB, ägg, NR-43025. Författaren tackar Dr. Jake Tu, Dr. Nisha Duggal, Dr. James Weger och Jeffrey Marano för att tillhandahålla Culex quinquefasciatus och Anopheles stephensi (stam: Liston) myggägg. Aedes albopictus och Toxorhynchites rutilus septentrionalis härrör från fältmyggor som samlats in av författaren i New River Valley -området (VA, USA). Detta arbete stöddes av Institutionen för biokemi och The Fralin Life Science Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air table Clean Bench | TMC | https://www.techmfg.com/products/labtables/cleanbench63series/accessoriess | Noise reducer |
| Analog-to-digital board | National Instruments | BNC-2090A | |
| Benchtop Flowbuddy Complete | Genesee Scientific | 59-122BC | To anesthesize mosquitoes |
| Borosillicate glass capillary | Sutter Instrument | B100-78-10 | To make the recording and references capillaries |
| Chemicals | Sigma Aldrich | Benzaldehyde: 418099-100 mL; Butyric acid: B103500-100mL; 1-Hexanol: 471402-100mL; Mineral oil: M8410-1L | Chemicals used for the experiments presented here |
| CO2 | Airgas or Praxair | N/A | To anesthesize mosquitoes |
| Cold Light Source | Volpi | NCL-150 | |
| Disposable syringes | BD | 1 mL (309628) / 3 mL (309657) | |
| Electrode cables | World Precision Instruments | 5371 | |
| Electrode gel salt free | Parkerlabs | 12-08-Spectra-360 | |
| Faraday cage | TMC | https://www.techmfg.com/products/electric-and-magnetic-field-cancellation/faradaycages | Noise reducer |
| Flowmeters | Bel-art | 65 mm (H40406-0010) / 150 mm (H40407-0075) | One of each |
| GCMS vials and caps | Thermo-fisher scientific | 2-SVWKA8-CPK | To prepare odorant dilutions |
| Glass syringes (Fortuna) | Sigma Aldrich | Z314307 | For odor delivery to the EAG prep |
| Humbug | Quest Scientific | http://www.quest-sci.com/ | Noise reducer |
| 2 mm Jack Holder, Narrow, 90 deg., With Wire | A-M Systems | 675748 | Electrode holder |
| Magnetic bases | Kanetec | MB-FX | x 2 |
| MATLAB + Toolboxes | Mathworks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | For delivering the pulses |
| Medical air | Airgas or Praxair | N/A | For main airline |
| Microscope | Nikkon | SMZ-800N | |
| Micromanipulators Three-Axis Coarse/Fine Compact Micromanipulator | Narishige | MHW-3 | x 2 |
| Microelectrode amplifier with headstage | A-M Systems | Model 1800 | |
| Mosquito rearing supplies | Bioquip | https://www.bioquip.com/Search/WebCatalog.asp | |
| Needles | BD | 25G (305127) / 21G (305165) | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-6A | For odor delivery to the EAG prep |
| PTFE Tubing of different diameters | Mc Master Carr | N/A | To connect solenoid valve, flowmeter, airline ect. |
| 30V/5A DC Power Supply | Dr. Meter | PS-305DM | |
| R version 3.5.1 | R project | https://www.r-project.org/ | For data analyses |
| Relay for solenoid valve | N/A | Custom made | |
| Silver wire 0.01” | A-M Systems | 782500 | |
| Solenoid valve (3-way) | The Lee Company | LHDA0533115H | |
| WinEDR software | Strathclyde Electrophysiology Software | WinEDR V3.9.1 | For EAG recording |
| Whatman paper | Cole Parmer | UX-06648-03 | To load chemical in glass syringe / Pasteur pipette |
References
- World Health Organization. World health statistics 2019: monitoring health for the SDGs, sustainable development goals. World Health Organization. , Geneva. (2019).
- Takken, W. The role of olfaction in host-seeking of mosquitoes: a review. International Journal of Tropical Insect Science. 12 (1-2-3), 287-295 (1991).
- Zwiebel, L. J., Takken, W.
- Potter, C. J. Stop the biting: targeting a mosquito's sense of smell. Cell. 156 (5), 878-881 (2014).
- Paluch, G., Bartholomay, L., Coats, J. Mosquito repellents: a review of chemical structure diversity and olfaction. Pest Management Science. 66 (9), 925-935 (2010).
- Schneider, D. Electrophysiological investigation on the antennal receptors of the silk moth during chemical and mechanical stimulation. Experientia. 13 (2), 89-91 (1957).
- Raguso, R. A., Light, D. M., Pickersky, E. Electroantennogram responses of Hyles lineata (Sphingidae: Lepidoptera) to volatile compounds from Clarkia breweri (Onagraceae) and other moth-pollinated flowers. Journal of Chemical Ecology. 22 (10), 1735-1766 (1996).
- Schweitzer, E. S., Sanes, J. R., Hildebrand, J. G. Ontogeny of electroantennogram responses in the moth, Manduca sexta. Journal of Insect Physiology. 22 (7), 955-960 (1976).
- Martel, V., Anderson, P., Hansson, B. S., Schlyter, F. Peripheral modulation of olfaction by physiological state in the Egyptian leaf worm Spodoptera littoralis (Lepidoptera: Noctuidae). Journal of Insect Physiology. 55 (9), 793-797 (2009).
- Spaethe, J., Brockmann, A., Halbig, C., Tautz, J. Size determines antennal sensitivity and behavioral threshold to odors in bumblebee workers. Naturwissenschaften. 94 (9), 733-739 (2007).
- Suchet, C., et al. Floral scent variation in two Antirrhinum majus subspecies influences the choice of naïve bumblebees. Behavioral Ecology and Sociobiology. 65 (5), 1015-1027 (2011).
- De Jong, R., Pham-Delègue, M. H. Electroantennogram responses related to olfactory conditioning in the honeybee (Apis mellifera ligustica). Journal of Insect Physiology. 37 (4), 319-324 (1991).
- Patte, F., Etcheto, M., Marfaing, P., Laffort, P. Electroantennogram stimulus-response curves for 59 odourants in the honeybee, Apis mellifica. Journal of Insect Physiology. 35 (9), 667-675 (1989).
- Alcorta, E. Characterization of the electroantennogram in Drosophila melanogaster and its use for identifying olfactory capture and transduction mutants. Journal of Neurophysiology. 65 (3), 702-714 (1991).
- Park, K. C., Ochieng, S. A., Zhu, J., Baker, T. C. Odor discrimination using insect electroantennogram responses from an insect antennal array. Chemical Senses. 27 (4), 343-352 (2002).
- Du, Y. J., Millar, J. G. Electroantennogram and oviposition bioassay responses of Culex quinquefasciatus and Culex tarsalis (Diptera: Culicidae) to chemicals in odors from Bermuda grass infusions. Journal of Medical Entomology. 36 (2), 158-166 (1999).
- Costantini, C., et al. Electroantennogram and behavioural responses of the malaria vector Anopheles gambiae to human-specific sweat components. Medical and Veterinary Entomology. 15 (3), 259-266 (2001).
- Collins, L. E., Blackwell, A. Electroantennogram studies of potential oviposition attractants for Toxorhynchites moctezuma and T. amboinensis mosquitoes. Physiological Entomology. 23 (3), 214-219 (1998).
- Seenivasagan, T., Sharma, K. R., Sekhar, K., Ganesan, K., Prakash, S., Vijayaraghavan, R. Electroantennogram, flight orientation, and oviposition responses of Aedes aegypti to the oviposition pheromone n-heneicosane. Parasitology Research. 104 (4), 827-833 (2009).
- Puri, S. N., Mendki, M. J., Sukumaran, D., Ganesan, K., Prakash, S., Sekhar, K. Electroantennogram and behavioral responses of Culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae) females to chemicals found in human skin emanations. Journal of Medical Entomology. 43 (2), 207-213 (2014).
- Cooperband, M. F., McElfresh, J. S., Millar, J. G., Carde, R. T. Attraction of female Culex quinquefasciatus Say (Diptera: Culicidae) to odors from chicken feces. Journal of Insect Physiology. 54 (7), 1184-1192 (2008).
- Dekker, T., Ignell, R., Ghebru, M., Glinwood, R., Hopkins, R. Identification of mosquito repellent odours from Ocimum forskolei. Parasites & Vectors. 4 (1), 183 (2011).
- Choo, Y. M., et al. Reverse chemical ecology approach for the identification of an oviposition attractant for Culex quinquefasciatus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), 714-719 (2018).
- Wolff, G. H., Lahondère, C., Vinauger, C., Riffell, J. A. Neuromodulation and differential learning across mosquito species. bioRxiv. , 755017 (2019).
- Lahondère, C., et al. The olfactory basis of orchid pollination by mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (1), 708-716 (2020).
- Beyenbach, K., Masia, R. Membrane conductances of principal cells in Malpighian tubules of Aedes aegypti. Journal of Insect Physiology. 48, 375-386 (2002).
- Oesterle, A. The Pipette Cookbook. , (2018).
- R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. (2018).
- Afify, A., Betz, J. F., Riabinina, O., Lahondère, C., Potter, C. J. Commonly used insect repellents hide human odors from Anopheles mosquitoes. Current Biology. 29 (21), 3669-3680 (2019).
- Martin, F., Riveron, J., Alcorta, E. Environmental temperature modulates olfactory reception in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 57 (12), 1631-1642 (2011).
- Qiu, Y. T., Gort, G., Torricelli, R., Takken, W., van Loon, J. J. Effects of blood-feeding on olfactory sensitivity of the malaria mosquito Anopheles gambiae: application of mixed linear models to account for repeated measurements. Journal of Insect Physiology. 59 (11), 1111-1118 (2013).
- Taylor, B., Jones, M. D. R. The circadian rhythm of flight activity in the mosquito Aedes aegypti (L.): the phase-setting effects of light-on and light off. Journal of Experimental Biology. 51 (1), 59-70 (1969).
- Eilerts, D. F., VanderGiessen, M., Bose, E. A., Broxton, K., Vinauger, C. Odor-specific daily rhythms in the olfactory sensitivity and behavior of Aedes aegypti mosquitoes. Insects. 9 (4), 147 (2018).
- Krishnan, B., Dryer, S. E., Hardin, P. E. Circadian rhythms in olfactory responses of Drosophila melanogaster. Nature. 400 (6742), 375-378 (1999).
- Pelletier, J., Guidolin, A., Syed, Z., Cornel, A. J., Leal, W. S. Knockdown of a mosquito odorant-binding protein involved in the sensitive detection of oviposition attractants. Journal of Chemical Ecology. 36 (3), 245-248 (2010).
