Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Kvantitative metabolomics af saccharomyces Cerevisiae Ved hjælp af flydende kromatografi kombineret med tandem massespektrometri

Published: January 5, 2021 doi: 10.3791/62061
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Biology, Concordia University, 2Centre for Biological Applications of Mass Spectrometry, Concordia University

Summary

Vi præsenterer en protokol for identifikation og kvantificering af større klasser af vandopløselige metabolitter i gær saccharomyces cerevisiae. Den beskrevne metode er alsidig, robust og følsom. Det gør det muligt at udskille strukturelle isomerer og stereoisomeriske former for vandopløselige metabolitter fra hinanden.

Abstract

Metabolomics er en metode, der anvendes til identifikation og kvantificering af mange lav-molekylvægt mellemprodukter og produkter af stofskiftet i en celle, væv, organ, biologisk væske, eller organisme. Metabolomics traditionelt fokuserer på vandopløselige metabolitter. Den vandopløselige metabolom er det endelige produkt af et komplekst mobilnetværk, der integrerer forskellige genomiske, epigenomic, transskriptomiske, proteomiske og miljømæssige faktorer. Derfor vurderer den metabolomiske analyse direkte resultatet af handlingen for alle disse faktorer i en overflod af biologiske processer inden for forskellige organismer. En af disse organismer er den spirende gær Saccharomyces cerevisiae, en encellet eukaryote med det fuldt sekventeret genom. Fordi S. cerevisiae er modtagelig for omfattende molekylære analyser, bruges det som model for dissekere mekanismer, der ligger til grund for mange biologiske processer i den eukaryote celle. En alsidig analysemetode til en robust, følsom og nøjagtig kvantitativ vurdering af det vandopløselige metabolom ville være den nødvendige metode til dissekering af disse mekanismer. Her præsenterer vi en protokol for de optimerede betingelser for metabolisk aktivitet, der slukker i og vandopløselig metabolitudvinding fra S. cerevisiae celler. Protokollen beskriver også brugen af flydende kromatografi kombineret med tandem massespektrometri (LC-MS/MS) til kvantitativ analyse af de ekstrahviderede vandopløselige metabolitter. Den LC-MS/MS-metode til ikke-målrettede metabolomics, der er beskrevet her, er alsidig og robust. Det muliggør identifikation og kvantificering af mere end 370 vandopløselige metabolitter med forskellige strukturelle, fysiske og kemiske egenskaber, herunder forskellige strukturelle isomerer og stereoisomeriske former af disse metabolitter. Disse metabolitter omfatter forskellige energibærermolekyler, nukleotider, aminosyrer, monosaccharider, mellemprodukter af glykolyse og tricarboxylsyrecyklusprodukter. LC-MS/MS-metoden for ikke-målrettede metabolomics er følsom og gør det muligt at identificere og kvantificere nogle vandopløselige metabolitter i koncentrationer helt ned til 0,05 pmol/μL. Metoden er med succes blevet anvendt til vurdering af vandopløselige metabolomer af vilde og mutante gærceller, der dyrkes under forskellige forhold.

Introduction

Vandopløselige metabolitter er lavdybtrykære mellemprodukter og metabolismeprodukter, der bidrager til væsentlige cellulære processer. Disse evolutionært bevarede processer omfatter konvertering af næringsstoffer til brugbar energi, syntese af makromolekyler, cellulær vækst og signalering, cellecykluskontrol, regulering af genekspression, stressrespons, post-translationel regulering af metabolisme, vedligeholdelse af mitokondriefunktionalitet, køretøjs cellulær handel, autofagi, cellulær aldring og reguleret celledød1,2,3.

Mange af disse væsentlige roller af vandopløselige metabolitter er blevet opdaget ved undersøgelser i den spirende gær S. cerevisiae1,3,4,7,9,14,15,16,17,18,19,20,21,22. Denne encellede eukaryote er en nyttig modelorganisme til dissekeringsmekanismer , hvorigennem vandopløselige metabolitter bidrager til cellulære processer på grund af dets aenabilitet til avancerede biokemiske, genetiske og molekylære biologiske analyser23,24,25,26. Selv om LC-MS/MS-metoderne for ikke-målrettede metabolomics er blevet anvendt til at studere de vandopløselige metabolitters roller i spirende gær3,18,22,27, kræver denne type analyse en forbedring af dens alsidighed, robusthed, følsomhed og evne til at skelne mellem forskellige strukturelle isomerer og stereoisomeriske former af disse metabolitter.

De seneste år er præget af betydelige fremskridt med hensyn til at anvende LC-MS/MS-metoderne for ikke-målrettede metabolomics på profilering af vandopløselige metabolitter in vivo. Mange udfordringer ved at bruge denne metode er dog fortsat2,28,29,30,31,32,33,34,35,36. Disse udfordringer omfatter følgende. For det første er de intracellulære koncentrationer af mange vandopløselige metabolitter under en følsomhedstærskel for de nuværende anvendte metoder. For det andet er effektiviteten af metabolisk aktivitetsslukning for lav, og omfanget af slukningsrelateret cellelækage af intracellulære metabolitter er for høj til de nuværende metoder; Derfor undervurderer de nuværende anvendte metoder de intracellulære koncentrationer af vandopløselige metabolitter. For det tredje kan de eksisterende metoder ikke differentiere de strukturelle isomerer (dvs. molekyler med den samme kemiske formel, men forskellige atomnektivitet) eller stereoisomerer (dvs. molekyler med samme kemiske formel og atomare konnektivitet, men med den forskellige atomare ordning i rummet) af specifikke metabolitter; Dette forhindrer den korrekte anmærkning af visse metabolitter ved hjælp af de nuværende anvendte metoder. For det fjerde er de eksisterende massespektrale onlinedatabaser over forældre (MS1) og sekundære ioner (MS2) ufuldstændige; dette påvirker den korrekte identifikation og kvantitet af specifikke metabolitter ved hjælp af de rå LC-MS/MS-data, der er produceret ved hjælp af de nuværende metoder. For det femte kan de eksisterende metoder ikke anvende en enkelt type metabolitudvinding til at genvinde alle eller de fleste klasser af vandopløselige metabolitter. For det sjette kan de eksisterende metoder ikke bruge en enkelt type LC-kolonnen til at adskille alle eller de fleste klasser af vandopløselige metabolitter fra hinanden.

Her optimerede vi betingelserne for dæmpning af metabolisk aktivitet i S. cerevisiae celler, opretholde de fleste af de vandopløselige metabolitter i disse celler før ekstraktion, og udvinde de fleste klasser af vandopløselige metabolitter fra gærceller. Vi udviklede en alsidig, robust og følsom metode til LC-MS/MS-baseret identifikation og kvantificering af mere end 370 vandopløselige metabolitter udvundet fra S. cerevisiae celler. Denne metode til ikke-målrettede metabolomics gør det muligt at vurdere de intracellulære koncentrationer af forskellige energibærermolekyler, nukleotider, aminosyrer, monosaccharider, mellemprodukter af glykolyse og tricarboxyliske cyklus mellemprodukter. Den udviklede LC-MS/MS-metode gør det muligt at identificere og kvantificere forskellige strukturelle isomerer og stereoisomeriske former for vandopløselige metabolitter med forskellige strukturelle, fysiske og kemiske egenskaber.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling og sterilisering af et medium til dyrkning af gær

  1. Lav 180 mL af en komplet gær ekstrakt med bactopeptone (YP) medium. Det komplette YP-medium indeholder 1% (w/v) gærekstrakt og 2% (w/v) bactopeptone.
  2. YP-mediet fordeles ligeligt i fire 250 mL Erlenmeyer kolber. Hver af disse kolber indeholder 45 mL af YP-mediet.
  3. Kolberne steriliseres med YP-medium ved autoklavering ved 15 psi/121 °C i 45 min.

2. Gærstamme af vildtypen

  1. Brug BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) strain.

3. Dyrkning gær i YP medium, der indeholder 2% glukose

  1. Sterilisere en 20% (w/v) bestand opløsning af glukose ved autoklavering ved 15 psi/121 °C i 45 min.
  2. Der tilsættes 5 mL af den autoklavede 20% (w/v) lageropløsning af glukose til hver af de to Erlenmeyer kolber med 45 mL af det steriliserede YP-medium. Den endelige koncentration glukose i YP medium er 2% (w /v).
  3. Brug en mikrobiologisk løkke til at vaccinere gærceller i hver af de to Erlenmeyer kolber med YP medium, der indeholder 2% glukose.
  4. Gærcellerne vokser natten over ved 30 °C i en rotations shaker, der er indstillet til 200 omdr./min.
  5. Tag en aliquot af gær kultur. Bestem det samlede antal gærceller pr. minut af kultur. Tæl celler ved hjælp af et hæmocytometer.

4. Celleoverførsel til og celle vokser i YP-mediet med 2% glukose

  1. Tilsæt 5 mL af den steriliserede 20% (w/v) lageropløsning af glukose til hver af de resterende to Erlenmeyer kolber med det autoklavede YP-medium. Den endelige koncentration af glukose er 2% (w /v).
  2. Overfør et volumen af natten gær kultur i YP medium med 2% glukose, der indeholder det samlede antal 5,0 x 107 celler i hver af de to Erlenmeyer kolber med YP medium indeholder 2% glukose. Brug en steril pipette til celleoverførslen.
  3. Gærcellerne dyrkes i mindst 24 timer (eller mere, hvis forsøget kræver det) ved 30 °C i en rotations shaker, der er indstillet til 200 omdrejninger.

5. Fremstilling af reagenser, forberedelse af labware og opsætning af udstyr til celleslukning

  1. Forbered følgende: 1) en slukningsopløsning (60% høj kvalitet (>99,9%) methanol i 155 mM ammoniumbicarbonat (ABC) buffer, pH = 8,0); 2) en iskold ABC-opløsning (pH = 8,0); 3) et digitalt termometer, der kan måle op til -20 °C 4) 500 mL store centrifugeflasker; 5) en forkølet højhastighedstogcentrifuge med en forkølet rotor og forkølede 500 mL centrifugeflasker til denne rotor, alt sammen ved -5 °C 6) metabolitudsugningsrør (15 mL højhastighedsglascentrifugrør med polytetrafluorethylenforede hætter); og 7) tøris.

6. Celleslukning

  1. Brug et hæmocytometer til at bestemme antallet af gærceller pr. ML af YP med 2% glukosekultur.
  2. Overfør et volumen af kulturen i YP medium med 2% glukose, der indeholder det samlede antal 5,0 x 108 celler til forkølede 500 mL centrifugeflasker.
  3. Fyld hurtigt centrifugeflasken, der indeholder cellerne, op til et volumen på 200 mL med en slukningsopløsning, der opbevares ved -20 °C.
  4. Centrifuge flaskerne i en højhastighedscentrifuge ved 11.325 x g i 3 min ved -5 °C.
  5. Hurtigt og ømt genvinde flasken fra centrifugen; skru låget forsigtigt af og fjern supernatanten uden at forstyrre pellet.
  6. Hurtigt genbruge cellepillen i 10 mL af iskold ABC buffer og overføre suspensionen i en 15 mL højhastighedstog glas centrifuge rør med en polytetrafluoroethylen-foret hætte til metabolit udvinding.
  7. Celler opsamles ved centrifugering i en klinisk centrifuge ved 3.000 x g i 3 min ved 0 °C.
  8. Fjern hurtigt supernatanten, og læg røret på tøris for at begynde metabolitudvindingen eller opbevare røret ved -80 °C indtil udvindingen.

7. Fremstilling af reagenser, laboratorieartikler og udstyr til metabolitudvinding

  1. Forbered følgende: 1) LC-MS grade kloroform; 2) LC-MS-methanol; 3) nano-rent vand af LC-kvalitet 4) LC-MS-klasse (ACN); 5) glasperler (syrevaskede, 425-600 μm); 6) en vortex med en skum rørholder kit med holder; 7) 15 mL højhastighedsglascentrifugrør med polytetrafluorethylenforede hætter; 8) MS hætteglas; 9) tøris; og 10) 1,5 mL rør vasket én gang med ethanol, én gang med ACN og en gang med nano-rent vand.
    BEMÆRK: Brug kun mikropipetspidser og rør af polypropylen, der er resistent over for organiske opløsningsmidler.

8. Metabolitudvinding

  1. Til de metabolitter, der opbevares på tøris eller opbevares ved -80 °C rør fra trin 6.7, tilsættes følgende: 1) 2 mL kloroform opbevaret ved -20 °C 2) 1 mL methanol lagret ved -20 °C 3) 1 mL iskoldt nano-rent vand og 4) 200 μL på 425-600 μm syrevaskede glasperler.
  2. Dæk og luk munden af et rør med aluminiumsfolie. Placer rør i et skumrørsholdersæt med holderen, og hvirvle dem i 30 min ved medium hastighed (dvs. ved en hastighed, der er indstillet til 6, med 12 er den maksimale hastighed af en vortex) ved 4 °C for at lette metabolitudvindingen.
  3. Inkuber røret i 15 minutter på is (IKKE tøris!) for at fremme proteinudfældning og adskillelsen af den øvre vandig fra den nedre organiske fase.
  4. Centrifuge røret i en klinisk centrifuge ved 3.000 x g i 10 min ved 4 °C. Dette centrifugeringstrin gør det muligt at adskille den øvre vandige fase (som indeholder vandopløselige metabolitter) fra det midterste lag (som indeholder cellerester og proteiner) og fra den nedre organiske fase (som for det meste indeholder lipider).
  5. Brug en mikropipette til at overføre den øvre vandige fase (400 μL) til et vasket og mærket 1,5 mL rør indeholdende 800 μL ACN, der blev opbevaret ved -20 °C.
    BEMÆRK: Der vil være hvid sky nedbør efter at have tilføjet den øvre vandige fase til ACN holdes på -20 °C.
  6. Centrifuge røret med prøven i en bordpladecentrifuge ved 13.400 x g i 10 min ved 4 °C.
    BEMÆRK: Den hvide sky nedbør vil forsvinde efter centrifugering.
  7. Overfør 800 μL fra den øverste del af en væske i røret til et mærket MS-hætteglas. Prøven opbevares ved 0 °C, indtil den analyseres af LC-MS/MS.

9. Forberedelse af reagenser, laboratorieartikler og udstyr til LC

  1. Forbered følgende: 1) en vortex; 2) en ultralyd soniker; 3) MS glas hætteglas; 4) et LC-system udstyret med en binær pumpe, degasser og autosampler; 5) en kromatografisøjle i zwitterionisk fase (5 μm polymer, 150 x 2,1 mm) med navnet i materialetabellen; 6) en søjlevarmer; og 7) mobile faser, herunder fase A (5:95 ACN:vand (v/v) med 20 mM ammoniumacetat, pH = 8,0) og fase B (100% ACN).

10. Adskillelse af udvundne metabolitter med LC

  1. Udsætte indholdet af MS hætteglas til ultralyd sonikering i 15 min.
  2. Vortex MS hætteglas 3x i 10 sek ved stuetemperatur (RT).
  3. Sæt MS-hætteglasset i brøndpladen.
  4. Under kromatografien skal kolonnen fastholdes ved 45 °C og en strømningshastighed på 0,250 mL/min. Prøven opbevares i brøndpladen ved 0 °C. Se tabel 1 for de remburs-forløb, der skal bruges under kromatografien.
    BEMÆRK: Et repræsentativt total ionkromatogram af vandopløselige metabolitter, der er udvundet fra celler af den vilde stamme BY4742, er vist i figur 1. Metabolitter adskilt af LC blev identificeret og kvantificeret ved massespektrometrisk analyse, der blev udført i positiv ioniseringstilstand [ESI (+)] som beskrevet for trin 11.

11. Massespektrometrisk analyse af metabolitter adskilt af LC

  1. Brug et massespektrometer udstyret med opvarmet elektrosprayionisering (HESI) til identifikation og kvantisering af vandopløselige metabolitter, der blev adskilt af LC. Brug massespektrometerets analysator til MS1-ioner og massespektrometerets detektor til MS2-ioner. Brug indstillingerne i tabel 2 og tabel 3 til dataafhængig anskaffelse af henholdsvis MS1 og MS2- ioner.
  2. Brug et prøvevolumen på 10 μL til injektionen i både ESI-tilstand (+) og ESI (-) tilstand.

12. Identifikation og kvantificering af forskellige metabolitter ved behandling af rådata fra LC-MS/MS

  1. Brug den software, der er nævnt i Tabel over Materialer, til at udføre identifikation og kvantificering af forskellige vandopløselige metabolitter fra rå LC-MS/MS-filer. Denne software bruger MS1 til metabolit kvantitet og MS2 til metabolit identifikation. Softwaren udnytter den mest omfattende kurateret masse spektral fragmentering bibliotek til at anmærke metabolitter ved hjælp af LC-MS / MS rå data ved at matche MS spektre. Denne software bruger også den nøjagtige masse af MS1 og isotop mønster match til at anmærke metabolitter ved hjælp af online databaser. Se figur 2 for detaljer.
  2. Brug biblioteket af databaser og spektre, som er frit tilgængelige online (https://www.mzcloud.org), til at søge efter MS2 spektre af de rå data.

13. Membranintegritetsanalyse ved propidium jod (PI) farvning og fluorescensmikroskopi

  1. Når celleslukningen er udført som beskrevet for trin 6, skal de slukkede celler vaskes grundigt med 15 mL ABC-buffer for at fjerne slukningsopløsningen. Celler opsamles ved centrifugering ved 3.000 x g i 5 min ved 0 °C.
  2. Cellpillen genbruges i 1 mL ABC-buffer, og der tilsættes 0,5 mL af PI-opløsningen (0,5 mg/mL).
  3. Vortex et rør med prøven 3x i 10 s og inkubere det i 10 min i mørke og på is.
  4. Centrifuge røret med prøven i en bordpladecentrifuge ved 13.400 x g i 10 min ved 4 °C.
  5. Fjern supernatanten, og brug pelleten igen i 1 mL ABC-buffer.
  6. Centrifugere røret ved 13.400 x g i 10 min ved 4 °C og fjern supernatanten. Gentag dette trin 2 gange mere for at fjerne den PI, der er bundet til celleoverfladen.
  7. Brugpillen igen i 300 μL ABC-buffer. Placer 10 μL af suspensionen på overfladen af et mikroskop dias.
  8. FANG DIC-kontrasten (differentialinterferens) og fluorescensmikroskopibillederne med et fluorescensmikroskop. Brug et filter, der er konfigureret ved excitations- og emissionsbølgelængderne på henholdsvis 593 nm og 636 nm.
  9. Brug en software til at tælle det samlede celletal (i DIC-tilstand) og antallet af fluorescerende farvede celler. Brug også denne software til at bestemme intensiteten af farvning for individuelle celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at forbedre en kvantitativ vurdering af vandopløselige metabolitter i en gærcelle optimerede vi betingelserne for celleslukning til metabolitdetektering. Celleslukning til dette formål indebærer en hurtig anholdelse af alle enzymatiske reaktioner i en celle31,33,37,38. En sådan anholdelse af cellulær metabolisk aktivitet er et vigtigt trin i enhver metode til kvantificering af vandopløselige metabolitter in vivo , fordi det forhindrer undervurdering af deres intracellulære koncentrationer31,33,37,38. Celleslukning til metabolitvurdering forringer altid plasmamembranens (PM) (og cellevæggens (CW) integritet( hvis den er til stede); dette medfører metabolitlækage fra celle31,33,37,38. Metoden anvender celleslukningsforhold, der minimerer en sådan svækkelse, hvilket reducerer den quenching-associerede cellelækage af intracellulære metabolitter betydeligt. De fleste nuværende metoder til celleslukning omfatter faktisk anvendelse af en vis koncentration af methanol (dvs. 40 % (v/v), 60 % (v/v), 80 % (v/v) eller 100 % (v/v)) ved en bestemt temperatur (dvs. -20 °C, -40 °C eller -60 °C) med eller uden buffer31,33,37,38. Vi sammenlignede effektiviteten af PM- og CW-værdiforringelsen for en af de aktuelt anvendte celleslukningsmetode (dvs. ved cellebehandling med 80 % (v/v) methanol ved -40 °C i mangel af buffer38) med metoden for den modificerede celleslukningsmetode (dvs. ved cellebehandling med 60 % (v/v) methanol ved -20 °C i nærværelse af en isotonisk bufferopløsning af ABC ved pH = 8,0). PI er et fluorescerende farvestof, der er uigennemtrængeligt for intakte celler; Den kan kun indtaste cellen, hvis PM'ens (og CW's integritet, hvis den findes) er svækket39. Desuden stiger intensiteten af fluorescensemissionen ved PI med 30 gange, når den er bundet til DNA eller RNA39. Således kan en PI farvning assay bruges til at vurdere effektiviteten af slukning-associerede celle lækage af intracellulære metabolitter, fordi disse metabolitter kan lække ind i ekstracellulære rum, hvis PM og CW af en gær celle er beskadiget39. Vi fandt ud af, at den ændrede celleslukningsmetode forårsager betydeligt lavere skade på PM og CW end slukningsmetoden ved cellebehandling med ikke-buffered 80% (v /v) methanol ved -40 °C (Figur 3). Faktisk udviste næsten alle celler, der blev udsat for slukning ved hjælp af metoden, en rød fluorescensemission, som er karakteristisk for gærcellerne, hvis PM og CW ikke er beskadiget (figur 3). I modsætning hertil viste næsten alle celler, der blev udsat for dæmpning ved hjælp af den anden metode, grøn fluorescensemission, der er karakteristisk for gærcellerne, hvis PM og CW er væsentligt beskadiget (figur 3). Den mest intense røde fluorescens blev konverteret til grøn fluorescens af en software til at skelne mellem den stærke røde fluorescens og mild rød fluorescens emissioner.

Den modificerede celleslukningsmetode forårsagede betydeligt lavere lækage af vandopløselige metabolitter fra gærceller end - slukningsmetoden ved cellebehandling med ikke-buffered 80% (v/v) methanol ved -40 °C. Vi udsatte lige mange gærceller for at slukke ved hjælp af enten metoden (dvs. ved cellebehandling med 60% (v/v) methanol ved -20 °C i nærværelse af en isotonisk bufferopløsning af ABC ved pH = 8,0; Figur 4) eller den anden metode (dvs. ved cellebehandling med ikke-buffered 80% (v/v) methanol ved -40 °C Figur 5. Omfanget af slukningsrelateret cellelækage i den ekstracellulære opløsning blev vurderet for specifikke vandopløselige metabolitter ved hjælp af LC-MS/MS. Koncentrationerne af forskellige aminosyreklasser (dvs. store og små sure, grundlæggende, neutrale ikkepolare og neutrale polar aminosyrer) i den ekstracellulære opløsning blev målt før og efter celleslukning. Vi fandt ud af, at celleslukningsmetoden forårsager betydeligt lavere lækage af alle disse aminosyreklasser i den ekstracellulære opløsning (Figur 4) end den anden metode (Figur 5).

LC-MS/MS-metoden til en kvantitativ vurdering af vandopløselige metabolitter i en gærcelle anvender en enkelt type søjle til kromatoografisk adskillelse af alle vandopløselige metabolitklasser. Denne kolonne er den zwitterioniske fasekolonne, der er navngivet i Materialetabel. Vi fandt, at denne kolonne giver en langt mere effektiv adskillelse af forskellige klasser af vandopløselige metabolitter end den omvendte fase kolonne nævnt i Tabel over materialer ( supplerende tabel1). Faktisk var retentionstidens skiftværdier for vandopløselige metabolitstandarder (dvs. NAD+, AMP, GMP, arginin og glutaminsyre) betydeligt lavere, og topformerne var væsentligt skarpere for zwitterionisk fasekolonne sammenlignet med kolonnen i omvendt fase (supplerende tabel 1). LC-betingelser, der anvendes til kromatografisk adskillelse af alle metabolitter (dvs. vandopløselige og vandløse) til kolonnen i omvendt fase, er angivet i supplerende tabel 2.

En anden fordel ved LC-MS/MS-metoden består i evnen til kromatotonadskillelse på ovenstående zwitterioniske fase kolonne til effektivt at adskille sig fra hinanden forskellige vandopløselige metabolitter med forskellige strukturelle, fysiske og kemiske egenskaber. Disse vandopløselige metabolitter omfatter følgende metabolitklasser: 1) sure, grundlæggende, neutrale polare og ikke-neutrale polargnuler, herunder deres forskellige strukturelle isomerer (figur 6); 2) stabile og ustabile nukleotider og deres derivater, der udfører vitale funktioner i en celle (figur 7); og 3) forskellige monosaccharider, herunder deres forskellige stereoisomeriske former (figur 8).

Det er vigtigt, at LC-MS/MS-metoden til en kvantitativ vurdering af vandopløselige metabolitter i en gærcelle var alsidig og robust. Det gav os mulighed for at identificere og kvantificere 374 vandopløselige metabolitter med forskellige strukturelle, fysiske og kemiske egenskaber i S. cerevisiae celler, der blev kultiveret i det komplette YP-medium, der oprindeligt indeholdt 2% glukose (supplerende tabel 3). 240 metabolitter blev påvist i positiv ioniseringstilstand, og der blev påvist 134 metabolitter i negativ ioniseringstilstand. Identiteterne af alle disse vandopløselige metabolitter blev bekræftet ved at matche deres dataafhængige erhvervelse (DDA) MS2-fragmenter, der blev erhvervet både i de positive og negative ioniseringstilstande, til MS2 mzCloud-spektralbiblioteket. Dette onlinebibliotek indeholder spektret af metabolitstandarder, der adskiller sig i deres MS1- og DDA MS2-parametre. For at maksimere omfanget af at matche MS2-spektret af prøven med onlinespektralbiblioteket brugte vi forskellige DDA MS2-parametre. Disse parametre findes i supplerende tabel 4. Næsten 6.000 funktioner (putative metabolitter) for den samme prøve blev erhvervet ved hjælp af højenergi-induceret-kollision-dissociation (HCD) eller kollision-induceret dissociation (CID) fragmentering metode, ved hjælp af top 5 MS2 begivenheder, 35 kollision energi værdier, og 10 ms aktivering gange. Efter filtrering af de resulterende filer med > 95% MS2 matching og > 90% MS1 isotopmønster matching kriterier, kun 162 metabolitter under HCD fragmenteret tilstand og 142 metabolitter under CID fragmenteret tilstand blev identificeret. 81 ud af 162 metabolitter var unikke for HCD-fragmenteringsmetoden, mens 42 ud af 142 var unikke for CID-fragmenteringsmetoden (se et ark med navnet "T5_35E__10 ms_HCD vs CID" i supplerende tabel 4). Derfor konkluderede vi, at den korrekte anmærkning af vandopløselige metabolitter ved hjælp af LC-MS/MS-metoden kræver brug af mange forskellige DDA MS2-parametre.

LC-MS/MS-metoden er også meget følsom. Det gør det muligt at identificere og kvantificere nogle vandopløselige metabolitter i koncentrationer helt ned til 0,05 pmol/μL (se data for phenylalanin i tabel 4). Denne kvantitetsgrænse varierer inden for en lang række koncentrationer for forskellige metabolitklasser (tabel 4).

Det MS-system, der anvendes her, har et bredt (mindst to størrelsesordener) lineært dynamikområde til måling af koncentrationerne af forskellige metabolitter (supplerende tabel 5).

Figure 1
Figur 1: Det samlede ionkromatogram (TIC) fra flydende kromatografi/massespektrometri (LC-MS) data af vandopløselige metabolitter, der blev udvundet fra celler af den vilde stamme BY4742. Metabolitterne blev adskilt af LC på den zwitterioniske fase kromatografi kolonne navngivet i Tabel over materialer. Metabolitterne blev opdaget af MS af forældreioner (MS1), der blev oprettet ved hjælp af den positive elektrosprayioniseringstilstand. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: En arbejdsgang, der anvendes til analyse af vandopløselige metabolitter ved hjælp af den software, der er nævnt i materialetabellen. Alle parametre blev automatisk korrigeret af softwaren baseret på MS-rådata, undtagen følgende: 1) fanen "Detekter forbindelser": sæt min, spidsintensitet 10.000; og 2) fanen "Søg ChemSpider": 4 online databaser blev udvalgt til identifikation af metabolitter, herunder BioCyc, Human Metabolome Database, KEGG og Gær Metabolome Database. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Differentialinterferenskontrast (DIC; øverste række) og fluorescens (nederste række) mikroskopiske billeder af gærceller, der er slukket enten med ammoniumbicarbonatbuffer (ABC) (pH = 8,0; kontrol) eller med en anden dæmpningsopløsning. Efter celleslukning blev der inkuberet et tilsvarende antal celler med PI-opløsningen i 10 min i mørke og på is. Den mest intense røde fluorescens blev konverteret til grøn fluorescens ved software for at skelne mellem den stærke røde fluorescens og milde røde fluorescensemissioner. Effektiviteten af skader på PM og CW blev sammenlignet for metoden til celleslukning (dvs. ved cellebehandling med 60% (v/v) methanol ved -20 °C i nærværelse af en isotonisk bufferopløsning af ABC ved pH = 8,0) og en af de anvendte metoder (dvs. ved cellebehandling med 80% (v/v) methanol ved -40 °C i mangel af buffer). Der vises en skalalinje. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Lækageprocenten af forskellige aminosyreklasser til metoden til celleslukning. 5,0 x 108 gærceller blev udsat for slukning ved behandlingen med 60% (v/v) methanol ved -20 °C i nærværelse af en isotonisk bufferopløsning af ABC ved pH = 8,0. Lækageprocenten af forskellige aminosyreklasser blev vurderet ved hjælp af LC-MS/MS til at måle deres koncentrationer i den ekstracellulære opløsning før og efter slukning. Middelværdierne ± SD og individuelle datapunkter vises (n = 3). * p < 0,05. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Lækageprocenten af forskellige aminosyreklasser for en af de aktuelt anvendte celleslukningsmetoder. 5,0 x 108 gærceller blev udsat for udslip ved behandlingen med 80 % (v/v) methanol ved -40 °C i mangel af buffer. Lækageprocenten af forskellige aminosyreklasser blev vurderet ved hjælp af LC-MS/MS til at måle deres koncentrationer i den ekstracellulære opløsning før og efter slukning. Middelværdierne ± SD og individuelle datapunkter vises (n = 3). * p < 0,05. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Effektiv kromatoografisk adskillelse af sure, grundlæggende, neutrale polar- og ikke-neutrale polargårer, herunder to strukturelle isomerer (dvs. leucin og isoleucin), på den zwitterioniske fasekolonne, der er nævnt i Materialetabel. Alle disse aminosyrer blev opdaget af MS/MS i positiv ioniseringstilstand [ESI (+)] tilstand. Betingelser for remburs på kromatografikolonnen i zwitterionisk fase er beskrevet i tabel 1. Betingelserne for MS/MS er beskrevet i tabel 2 og tabel 3. Alle aminosyrestandarder købes kommercielt (f.eks. Sigma). Fastholdelsestiden skifter mellem 3 uafhængige kromatografikørsler er mindre end ± 10 sekunder. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: Effektiv kromatografisk adskillelse af forskellige klasser af nukleotider, herunder energisk ustabile nukleotider (nukleoside monophosphater, nukleoside diphosphater og nukleoside triphosphater) og elektronbærermolekyler (NADH og NAD+), på den zwitterioniske fasekolonne,der er nævnt imaterialetabellen. Alle disse nukleotider blev registreret af MS/MS i positiv ioniseringstilstand [ESI (+)] . Betingelser for remburs på kromatografikolonnen i zwitterionisk fase er beskrevet i tabel 1. Betingelserne for MS/MS er beskrevet i tabel 2 og tabel 3. Alle nukleotidstandarder købes kommercielt (f.eks. Sigma). Fastholdelsestiden skifter mellem 3 uafhængige kromatografikørsler er mindre end ± 10 sekunder. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: Effektiv kromatoografisk adskillelse af forskellige klasser af monosaccharider, herunder strukturelle isomerer og stereoisomeriske former for aldo- og ketohexoses (fructose, mannose og galactose) og aldopentoses (ribose og arabinose), på zwitterionisk fase kolonne,der er nævnt imaterialetabellen. Alle disse monosaccharider blev opdaget af MS/MS i positiv ioniseringstilstand [ESI (+)] . Betingelser for remburs på kromatografikolonnen i zwitterionisk fase er beskrevet i tabel 1. Betingelserne for MS/MS er beskrevet i tabel 2 og tabel 3. Alle monosaccharid standarder købes kommercielt (f.eks Sigma). Fastholdelsestiden skifter mellem 3 uafhængige kromatografikørsler er mindre end ± 10 sekunder. Klik her for at se en større version af dette tal.

Kolonnetype SeQuant ZIC-pHILIC 5μm polymer 150 x 2,1 mm
Opløsningsmiddel A LC-MS klasse H2O: ACN (95:5, v/v) 20 mM Ammonium acetat
Opløsningsmiddel B Acetonitril (ACN) af LC-MS-kvalitet
Trykgrænse Maksimum = 300 bar Minimum = 0
HPLC-forløbsprogram
Tid (minutter) Strømningshastighed (0,25 ml/min) Kompositioner
A% B%
0.5 0.25 5 95
26 0.25 40 60
30 0.25 70 30
31 0.25 70 30
31.1 0.4 5 95
43.9 0.4 5 95
44 0.25 5 95
45 0.25 5 95

Tabel 1: LC-tilstand, der anvendes til adskillelse af vandopløselige metabolitter ved hjælp af den zwitterioniske fasekolonne, derer nævnt iMaterialetabel. Disse betingelser blev brugt i alle eksperimenter beskrevet her.

Fuld scanning masseområde (Dalton) 70-900
FTMS (Orbitrap analyzer) fuld scanningsopløsning 6,0 x 104
FTMS (Orbitrap analysator) HCD opløsning 7500
FTMS fuld scanning AGC mål 1,0 x 106
FTMS MSn AGC-mål 5,0 x 104
Ion fælde (LTQ) MSn AGC mål 1,0 x 104
Ionkildetype Opvarmet elektrosprayionisering
Kapillær temperatur (°C) 275
Kildevarmer Temperatur (°C) 250
Kappe gas flow 10
Aux Gas flow 5

Tabel 2: De massespektrometerindstillinger, der bruges til at analysere metabolitter, der blev adskilt af remburs. Disse betingelser blev anvendt til analyse af metabolitter i alle eksperimenter beskrevet her. Forkortelser: FTMS = Fourier transform (FTMS); HCD = højenergi-induceret-kollision-dissociation; LTQ = lineær fælde quadrupole; AGC = automatisk gain control, en ionpopulationsværdi for MS og MS/MS.

Instrument polaritet Positiv/negativ
Aktiveringstype CID/HCD
Min. signal kræves 5000
Isolationsbredde 2
Normaliserede kollisionsenergier til CID 35, 60
Normaliserede kollisionsenergier til HCD 35, 45, 55
Standardgebyrtilstand 1
Aktiveringstid for CID (ms) 10, 30
Aktiveringstid for HCD (ms) 10
Antal MS/MS-hændelser i CIU Top 3, Top 5, Top 10
Antal MS/MS-hændelser i HCD Top 5
Antal mikroscanninger, der anvendes i både HCD og CID 1

Tabel 3: De massespektrometerindstillinger, der bruges til at registrere sekundære ioner (MS2). Forkortelser: HCD = højenergi-induceret-kollision-dissociation; CID = kollision induceret dissociation; ms = millisekunder.

Std metabolitter M.W. (g/muldvarp) [M+H]+1 [M-H]-1 Registreringstilstand Laveste koncentration opdaget (pmol/μL)
glycin 75.03203 76.03931 74.02475 P 7.43E+00
Tryptophan 204.08988 205.09716 203.0826 P 5.56E-02
fenylalanin 165.07898 166.08626 164.0717 P 5.14E-02
Arginin 174.11168 175.11896 173.1044 P 7.14E-02
threonine* 119.05824 120.06552 118.05096 P
Serin 105.04259 106.04987 104.03531 P 4.66E+00
Glutamat 147.05316 148.06044 146.04588 P 4.20E-01
Methionin 149.05105 150.05833 148.04377 P 1.96E+00
aspartate 133.03751 134.04479 132.03023 P 3.75E+00
Valin 117.07898 118.08626 116.0717 P 1.49E+00
Isoleucin 131.09463 132.10191 130.08735 P 1.84E+00
leucin 131.09463 132.10191 130.08735 P 2.26E+00
Histidin 155.06948 156.07676 154.0622 P 2.53E+00
Tyrosin 181.07389 182.08117 180.06661 P 8.72E-02
Lysin 146.10553 147.11281 145.09825 P 1.43E-01
alanin 89.04768 90.05496 88.0404 P 1.12E+00
Prolin 115.06333 116.07061 114.05605 P 1.05E+00
cystein 121.01975 122.02703 120.01247 P 8.22E-01
asparagine 132.05349 133.06077 131.04621 P 1.08E+00
Glutamin 146.06914 147.07642 145.06186 P 1.92E+00
guanine 151.04941 152.05669 150.04213 P 5.47E+00
guanosin 283.09167 284.09895 282.08439 P 3.67E-01
GMP 363.058 364.06528 362.05072 P 7.17E-01
BNP 443.02434 444.03162 442.01706 P 2.57E+00
GTP 522.99067 523.99795 521.98339 P 2.27E+00
AMP 347.06309 348.07037 346.05581 P 5.25E-01
ADP 427.02942 428.0367 426.02214 P 1.32E+00
ATP 506.99575 508.00303 505.98847 P 1.77E+00
NADH 665.12478 666.13206 664.1175 P 1.47E+00
NAD+ 663.10912 664.1164 662.10184 P 3.03E+00
glukose** 180.06339 181.07067 179.05611
fructose*** 180.06339 181.07067 179.05611 N 5.67E-01
mannose*** 180.06339 181.07067 179.05611 N 1.05E+00
galactose*** 180.06339 181.07067 179.05611 N 9.00E-01
ribose*** 150.05283 151.06011 149.04555 N 1.10E+00
arabinose*** 150.05283 151.06011 149.04555 N 1.23E+00
fructose-6-fosfat*** 260.02972 261.037 259.02244 N 6.60E+00
glukose-6-fosfat*** 260.02972 261.037 259.02244 N 4.27E+00
citronsyre 192,12 g 193.034279 191.019726 N 9.33E-01
æblesyre 134.09 135.0288 133.014247 N 1.23E+00
pyruvsyre 88.06 89.02332 87.008768 N 2.77E+00

Tabel 4:De laveste koncentrationer af forskellige vandopløselige metabolitstandarder, som LC-MS/MS-metoden kan identificere og kvantificere. MS1-spidsområdet for hver metabolitstandard blev anvendt til at estimere den laveste kvantificerbare koncentration for denne metabolit. Der vises gennemsnitsværdier for to uafhængige eksperimenter. Tre tekniske kopier blev udført for hver af de to uafhængige eksperimenter. BEMÆRK: Threonine* kan påvises, men kan ikke kvantificeres på grund af dets sammenløsning med homoserin, en kemisk isomer af threonine. Glukose ** kan ikke identificeres, fordi det skaber flere kromatografi toppe. Metabolitstandarder*** kan kun identificeres og kvantificeres i individuelle prøver, men ikke i en blanding af metabolitstandarder eller en biologisk blanding af metabolitter.

Supplerende tabel 1: Retention Time (RT) shift værdier af samme sæt metabolitter for zwitterionic-fase og omvendt fase kolonner (se Tabel over materialer) efter kolonne ekvilibrering. Tabellen sammenligner fastholdelse reproducerbarheden af zwitterionisk fase og omvendt fase kolonner for et særskilt sæt af metabolitter adskiller sig fra hinanden i deres hydrofilitet og hydrofobicity. Disse metabolitter blev identificeret ved hjælp af LC-MS/MS. Bemærk, at RT-skiftværdierne for hydrofile metabolitter (dvs. NAD+, AMP, GMP, arginin og glutaminsyre) er betydeligt lavere, og topformerne er væsentligt skarpere for den zwitterioniske fasekolonne sammenlignet med kolonnen i omvendt fase. I modsætning hertil er RT-skiftværdierne for hydrofobiske metabolitter (dvs. stearinsyre, laurinsyre og decanoinsyre) betydeligt lavere, og topformerne er væsentligt skarpere for kolonnen i omvendt fase sammenlignet med den zwitterioniske fasekolonne. Betingelserne for kromatografisk adskillelse af metabolitter ved hjælp af kolonnerne i den zwitterioniske fase og omvendte fase er beskrevet i henholdsvis tabel 1 og supplerende tabel 2. De rapporterede her RT-skiftværdier er baseret på måling af 20 forskellige prøver taget fra forskellige hætteglas. Prøverne blev analyseret efter kolonne ekvilibrering. Metabolitterne i hver prøve blev udvundet fra 5,0 × 108 gærceller. RT-skiftværdier er et middel til 20 forskellige prøver (n = 20). De p-værdier, der er afledt af den umalede t-test, blev brugt til at sammenligne de to kolonner med den samme varians mellem de to stikprøvetyper. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende tabel 2: LC betingelser for den omvendte fase 8 kolonne navngivet i tabel over materialer og anvendes til at adskille forskellige metabolitter i denne undersøgelse. Kolonneegenskaber var som følger: 150 x 2,1 mm, 5 μm polymer. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende tabel 3: En liste over alle 374 vandopløselige metabolitter genvundet og kommenteret ved hjælp af LC-MS/MS-metoden. Alle metabolitter blev genvundet fra den samme LC-forløbskørsel, udsat for en dataafhængig EDA-fragmenteringsalgoritme , der er beskrevet i supplerende tabel 4, og kommenteret ved hjælp af den software, der er nævnt i Materialetabel. MS1-topfigurerne på 211 metabolitter (hvis status i tabellen er angivet som en tom) var passende til at blive brugt til kvantificering, og deres respektive MS2-spektre havde fulde match med mzCloud-spektralbiblioteket. MS2-spektre på 38 metabolitter (hvis status i tabellen er angivet som et d) havde fulde match med onlinespektralbiblioteket. Alligevel var deres MS1-topformer ikke egnede til at blive brugt til kvantificering. MS2-spektre på 125 metabolitter (hvis status i tabellen er angivet som n) havde ikke fulde match med onlinespektralbiblioteket. Disse metabolitter blev kommenteret som følger: 1) ved hjælp af "Predict composition node" (som annoter metabolitter baseret på det nøjagtige match af MS1-værdier, antallet af matchede og ubesvarede isotoper og isotop % intensitet matchet med den teoretiske referencestandarder); 2) ved hjælp af "ChemSpider node" (som anmærkninger metabolitter baseret på den nøjagtige match af MS1 værdier og lighed match score af MS2 spektre med online spektral bibliotek); og 3) ved hjælp af metabolitternes opbevaringstidsværdier (RT) (disse værdier afhænger af metabolitternes fysiske struktur og kemiske egenskaber). De metabolitter, der er anført i tabellen, blev fundet i alle 3 biologiske replikater udført, med RT-skiftværdierne på < 0,2 min. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende tabel 4: En dataafhængig erhvervelsesalgoritme (DDA), der blev brugt her til anmærkning af vandopløselige metabolitter ved hjælp af den software, der er nævnt i Tabel over Materialer.

Supplerende tabel 5: Et typisk lineært dynamikområde, som vi observerede, da vi målte koncentrationerne af forskellige aminosyrer ved hjælp af MS-systemet, der er nævnt i Materialetabel. Det MS-system, der anvendes her, har et bredt (mindst to størrelsesordener) lineært dynamikområde til måling af forskellige metabolitters koncentrationer. Klik her for at downloade denne tabel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hvis du vil bruge den protokol, der er beskrevet her, skal du følge de forebyggende foranstaltninger, der er beskrevet nedenfor. Kloroform og methanol ekstraherer forskellige stoffer fra laboratorieplast. Håndter dem derfor med forsigtighed. Undgå brug af plast i trin, der involverer kontakt med nogen af disse to organiske opløsningsmidler. Brug borosilicate glas pipetter til disse trin. Oplad disse pipetter med kloroform og methanol før brug. Brug kun mikropipetspidser og rør lavet af polypropylen, der er resistent over for organiske opløsningsmidler. Under prøveforberedelse til LC-MS/MS skal alle luftbobler i glasglassene fjernes, før de indsættes i en brøndplade.

Den zwitterioniske fase kolonne, der anvendes her kræver omfattende re-conditioning efter hver kørsel for at minimere RT skift. Til omkonditionering af kolonner anbefaler vi, at du bruger en diskenhed af rekonditioneringsløsningen, der er ca. 20 bind af kolonnen. Kolonnen skal omformeres med den indledende mobile fase i 15 min med en øget strømningshastighed på 0,4 mL/min. For at undgå skader på kolonnen under genopfrisningen skal kolonnetrykket holdes under den øvre trykgrænse, som fabrikanten anbefaler.

Bemærk, at nogle blandede separationskromatografikolonner, der opererer i omvendt fasetilstand, tillader opløsning af ladede metabolitter40,41. Disse kolonner med blandet adskillelse er baseret på den kolonne i omvendt fase , der bruges her (se Materialetabel) og indeholder polære integrerede grupper, der kan adskille metabolitter baseret på lade40,41.

Her beskrev vi en LC-MS/MS-baseret metode til ikke-målrettede metabolomics til kvantitativ analyse af mange vandopløselige metabolitter udvundet fra gærceller. Metoden giver flere fordele i forhold til LC-MS/MS-metoderne for ikke-målrettede metabolomics, der i øjeblikket anvendes til dette formål. Disse fordele omfatter følgende. For det første er metoden følsom og gør det muligt at identificere og kvantificere nogle vandopløselige metabolitter i koncentrationer helt ned til 0,05 pmol/μL. Den rapporterede følsomhed af de eksisterende LC-MS/MS-metoder er lavere3,22,27,42. For det andet anvender metoden en celleslukningsprocedure, der fremkalder en betydeligt lavere lækage af intracellulære metabolitter fra cellen end den, der er rapporteret for de nuværende anvendte procedurer31,33,38. Således sænker den procedure, vi udviklede til celleslukning, i hvilket omfang de aktuelt anvendte procedurer undervurderer de intracellulære koncentrationer af vandopløselige metabolitter. For det tredje skelner metoden i modsætning til de eksisterende LC-MS/MS-metoder2,31,33- mellem forskellige strukturelle isomerer og stereoisomeriske former for mange metabolitter. Disse metabolitter omfatter forskellige energibærermolekyler, nukleotider, aminosyrer, monosaccharider, mellemprodukter af glykolyse og tricarboxylsyrecyklusprodukter. For det fjerde brugte vi metoden til at oprette en omfattende massespektral database over MS1 og MS2 til korrekt identifikation og kvantificering af en lang række specifikke metabolitter ved hjælp af de rå LC-MS/MS-data. I modsætning hertil er de eksisterende massespektrale onlinedatabaser for MS1 og MS2 ufuldstændige43,44,45. For det femte bruger metoden en enkelt type metabolitudvinding til at genvinde vandopløselige metabolitter med forskellige strukturelle, fysiske og kemiske egenskaber. Disse metabolitters mangfoldighed overstiger betydeligt alternative metoder til en enkelttrinsudvinding af vandopløselige metabolitter fragærcellerne 3,22,27,46. Seks, i modsætning til de eksisterende LC-MS / MS metoder3,22,47,48, metoden bruger en enkelt type af LC kolonne til at adskille fra hinanden forskellige strukturelle og funktionelle klasser af vandopløselige metabolitter. For det syvende gør metoden det muligt at identificere og kvantificere mere end 370 vandopløselige metabolitter udvundet fra gærceller. Dette antal identificerbare og kvantificerbare metabolitter overstiger antallet af metabolitter , der rapporteres for andre metoder til ikke-målrettet metabolomics i gær3,22,27,49,50.

Metoden har flere begrænsninger. Disse begrænsninger er som følger. Den zwitterioniske fase kolonne, der anvendes til metabolit adskillelse af LC kræver omfattende re-conditioning efter hver kørsel. Desuden er metoden kun effektiv for ikke-målrettede metabolomics af vandopløselige, hydrofile metabolitter. Desuden kan forskellige isomeriske former for kulhydrater (herunder isomerer af fructose, glukose og galaktose) ikke kvantificeres ved hjælp af metoden. Dette skyldes, at den zwitterioniske fase kolonne, der anvendes i metoden ikke kan adskille disse kulhydrat isomerer fra hinanden, når de er til stede i en blanding med andre metabolitter. Desuden kan metoden ikke udnyttes til at identificere glukose, fordi dette kulhydrat skaber flere toppe under kromatografi på den zwitterioniske fase kolonne, der anvendes i metoden. Endelig kan threonine ikke kvantificeres ved hjælp af metoden på grund af co-elution af denne aminosyre med sin isomer homoserin under metabolitadskillelse ved kromatografi.

Vi bruger denne LC-MS/MS-metode til at studere aldrende ændringer i den vandopløselige metabolom af den spirende gær S. cerevisiae. Vi anvender også denne metode til at undersøge, hvor mange aldringsforhaling genetiske, kost- og farmakologiske interventioner påvirker gærcellernes vandopløselige metabolom under deres kronologiske aldring. På grund af sin alsidighed, robusthed og følsomhed kan LC-MS/MS-metoden med succes anvendes til kvantitativ vurdering af de vandopløselige metabolomer i evolutionært fjerne eukaryoteorganer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Vi er taknemmelige over for nuværende og tidligere medlemmer af Titorenko-laboratoriet for drøftelser. Vi anerkender Center for Biologiske Anvendelser af Mass Spectrometry, Center for Strukturel og Funktionel Genomforskning, og Center for Mikroskopi og Cellulær Imaging (alle på Concordia University) for fremragende tjenester. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) i Canada (RGPIN 2014-04482 og CRDPJ 515900 - 17). K.M. blev støttet af Concordia University Armand C. Archambault Fellowship og Concordia University Dean of Arts and Sciences Award of Excellence.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Acetonitrile Fisher Scientific A9554
Ammonium acetate Fisher Scientific A11450
Ammonium bicarbonate Sigma 9830
Bactopeptone Fisher Scientific BP1420-2
Chloroform Fisher Scientific C297-4
Glucose Fisher Scientific D16-10
L-histidine Sigma H8125
L-leucine Sigma L8912
L-lysine Sigma L5501
Methanol Fisher Scientific A4564
Methanol Fisher Scientific A4564
Propidium iodide Thermo Scientific R37108
Uracil Sigma U0750
Yeast extract Fisher Scientific BP1422-2
Hardware equipment
500 ml centrifuge bottles Beckman 355664
Agilent 1100 series LC system Agilent Technologies G1312A
Beckman Coulter Centrifuge Beckman 6254249
Beckman Coulter Centrifuge Rotor Beckman JA-10
Centra CL2 clinical centrifuge Thermo Scientific 004260F
Digital thermometer Omega HH509
Foam Tube Holder Kit with Retainer Thermo Scientific 02-215-388
SeQuant ZIC-pHILIC zwitterionic-phase column (5µm polymer 150 x 2.1 mm) Sigma Milipore 150460
Thermo Orbitrap Velos MS Fisher Scientific ETD-10600
Ultrasonic sonicator Fisher Scientific 15337416
Vortex Fisher Scientific 2215365
ZORBAX Bonus-RP, 80Å, 2.1 x 150 mm, 5 µm Agilent Technologies 883725-901
Laboratory materials
2-mL Glass sample vials with Teflon lined caps Fisher Scientific 60180A-SV9-1P
Glass beads (acid-washed, 425-600 μm) Sigma-Aldrich G8772
Hemacytometer Fisher Scientific 267110
15-mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps PYREX 05-550
Software
Compound Discoverer 3.1 Fisher Scientific V3.1
Yeast strain
Yeast strain BY4742 Dharmacon YSC1049

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hackett, S. R., et al. Systems-level analysis of mechanisms regulating yeast metabolic flux. Science. 354 (6311), aaf2786 (2016).
  2. Johnson, C. H., Ivanisevic, J., Siuzdak, G. Metabolomics: beyond biomarkers and towards mechanisms. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (7), 451-459 (2016).
  3. Mülleder, M., et al. Functional metabolomics describes the yeast biosynthetic regulome. Cell. 167 (2), 553-565 (2016).
  4. López-Otín, C., Galluzzi, L., Freije, J., Madeo, F., Kroemer, G. Metabolic control of longevity. Cell. 166 (4), 802-821 (2016).
  5. Krishnaiah, S. Y., et al. Clock regulation of metabolites reveals coupling between transcription and metabolism. Cell Metabolism. 25 (4), 961-974 (2017).
  6. Lee, H. J. Proteomic and metabolomic characterization of a mammalian cellular transition from quiescence to proliferation. Cell Reports. 20 (3), 721-736 (2017).
  7. Stryeck, S., Birner-Gruenberger, R., Madl, T. Integrative metabolomics as emerging tool to study autophagy regulation. Microbial Cell. 4 (8), 240-258 (2017).
  8. Babst, M. Eisosomes at the intersection of TORC1 and TORC2 regulation. Traffic. 20 (8), 543-551 (2019).
  9. Pedro, J., Sica, V., Madeo, F., Kroemer, G. Acyl-CoA-binding protein (ACBP): the elusive 'hunger factor' linking autophagy to food intake. Cell Stress. 3 (10), 312-318 (2019).
  10. Rahmani, S., Defferrari, M. S., Wakarchuk, W. W., Antonescu, C. N. Energetic adaptations: Metabolic control of endocytic membrane traffic. Traffic. 20 (12), 912-931 (2019).
  11. Viltard, M., et al. The metabolomic signature of extreme longevity: naked mole rats versus mice. Aging. 11 (14), 4783-4800 (2019).
  12. Zhu, J., Thompson, C. B. Metabolic regulation of cell growth and proliferation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (7), 436-450 (2019).
  13. Morrison, A. J. Chromatin-remodeling links metabolic signaling to gene expression. Molecular Metabolism. 38, 100973 (2020).
  14. Bitterman, K. J., Medvedik, O., Sinclair, D. A. Longevity regulation in Saccharomyces cerevisiae: linking metabolism, genome stability, and heterochromatin. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (3), 376-399 (2003).
  15. Carmona-Gutierrez, D. Apoptosis in yeast: triggers, pathways, subroutines. Cell Death and Differentiation. 17 (5), 763-773 (2010).
  16. Minois, N., Carmona-Gutierrez, D., Madeo, F. Polyamines in aging and disease. Aging. 3 (8), 716-732 (2011).
  17. Ring, J., et al. The metabolism beyond programmed cell death in yeast. Experimental Cell Research. 318 (11), 1193-1200 (2012).
  18. Ibáñez, A. J., et al. Mass spectrometry-based metabolomics of single yeast cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8790-8794 (2013).
  19. Pietrocola, F., et al. Acetyl coenzyme A: a central metabolite and second messenger. Cell Metabolism. 21 (6), 805-821 (2015).
  20. Carmona-Gutierrez, D., et al. Guidelines and recommendations on yeast cell death nomenclature. Microbial Cell. 5 (1), 4-31 (2018).
  21. Zimmermann, A., et al. Yeast as a tool to identify anti-aging compounds. FEMS Yeast Research. 18 (6), foy020 (2018).
  22. Leupold, S., et al. Saccharomyces cerevisiae goes through distinct metabolic phases during its replicative lifespan. eLife. 8, e41046 (2019).
  23. Weissman, J., Guthrie, C., Fink, G. R. Guide to Yeast Genetics: Functional Genomics, Proteomics, and Other Systems Analyses. , Academic Press. Burlington. (2010).
  24. Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: an experimental organism for 21st century biology. Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).
  25. Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).
  26. Strynatka, K. A., Gurrola-Gal, M. C., Berman, J. N., McMaster, C. R. How surrogate and chemical genetics in model organisms can suggest therapies for human genetic diseases. Genetics. 208 (3), 833-851 (2018).
  27. Boer, V. M., et al. Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations. Molecular Biology of the Cell. 21 (1), 198-211 (2010).
  28. Clish, C. B. Metabolomics: an emerging but powerful tool for precision medicine. Cold Spring Harbor Molecular Case Studies. 1 (1), a000588 (2015).
  29. Fuhrer, T., Zamboni, N. High-throughput discovery metabolomics. Current Opinion in Biotechnology. 31, 73-78 (2015).
  30. Liu, X., Locasale, J. W. Metabolomics: A primer. Trends in Biochemical Sciences. 42 (4), 274-284 (2017).
  31. Lu, W., et al. Metabolite measurement: pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
  32. Riekeberg, E., Powers, R. New frontiers in metabolomics: from measurement to insight. F1000 Reseach. 6, 1148 (2017).
  33. Gertsman, I., Barshop, B. A. Promises and pitfalls of untargeted metabolomics. Journal of Inherited Metabolic Disease. 41 (3), 355-366 (2018).
  34. Cui, L., Lu, H., Lee, Y. H. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
  35. Ivanisevic, J., Want, E. J. From samples to insights into metabolism: Uncovering biologically relevant information in LC-HRMS metabolomics data. Metabolites. 9 (12), 308 (2019).
  36. Srivastava, S. Emerging insights into the metabolic alterations in aging using metabolomics. Metabolites. 9 (12), 301 (2019).
  37. Chetwynd, A. J., Dunn, W. B., Rodriguez-Blanco, G. Collection and preparation of clinical samples for metabolomics. Advances in Experimental Medicine and Biology. 965, 19-44 (2017).
  38. Pinu, F. R., Villas-Boas, S. G., Aggio, R. Analysis of intracellular metabolites from microorganisms: quenching and extraction protocols. Metabolites. 7 (4), (2017).
  39. Zhang, N., et al. Cell permeability and nuclear DNA staining by propidium iodide in basidiomycetous yeasts. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (9), 4183-4191 (2018).
  40. Tu, B. P., et al. Cyclic changes in metabolic state during the life of a yeast cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (43), 16886-16891 (2007).
  41. Walvekar, A., Rashida, Z., Maddali, H., Laxman, S. A versatile LC-MS/MS approach for comprehensive, quantitative analysis of central metabolic pathways. Wellcome Open Research. 3, 122 (2018).
  42. Buescher, J. M., Moco, S., Sauer, U., Zamboni, N. Ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for fast and robust quantification of anionic and aromatic metabolites. Analytical Chemistry. 82 (11), 4403-4412 (2010).
  43. Cui, L., Lu, H., Lee, Y. H. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
  44. Oberacher, H., et al. Annotating nontargeted LC-HRMS/MS data with two complementary tandem mass spectral libraries. Metabolites. 9 (1), 3 (2018).
  45. Tada, I., et al. Creating a reliable mass spectral-retention time library for all ion fragmentation-based metabolomics. Metabolites. 9 (11), 251 (2019).
  46. Villas-Bôas, S. G., et al. Global metabolite analysis of yeast: evaluation of sample preparation methods. Yeast. 22 (14), 1155-1169 (2005).
  47. Crutchfield, C. A., Lu, W., Melamud, E., Rabinowitz, J. D. Mass spectrometry-based metabolomics of yeast. Methods in Enzymology. 470, 393-426 (2010).
  48. Zhang, T., Creek, D. J., Barrett, M. P., Blackburn, G., Watson, D. G. Evaluation of coupling reversed phase, aqueous normal phase, and hydrophilic interaction liquid chromatography with Orbitrap mass spectrometry for metabolomic studies of human urine. Analytical Chemistry. 84 (4), 1994-2001 (2012).
  49. Villas-Bôas, S. G., Moxley, J. F., Akesson, M., Stephanopoulos, G., Nielsen, J. High-throughput metabolic state analysis: the missing link in integrated functional genomics of yeasts. Biochemical Journal. 388 (Pt 2), 669-677 (2005).
  50. Buescher, J. M., Moco, S., Sauer, U., Zamboni, N. Ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for fast and robust quantification of anionic and aromatic metabolites. Analytical Chemistry. 82 (11), 4403-4412 (2010).

Tags

Biokemi udgave 167 vandopløselige metabolitter metabolomics profilering slukning af metabolisk aktivitet propidiumiodidfarvning fluorescensmikroskopi udvinding af metabolitter energibærermolekyler nukleotider aminosyrer monosaccharider flydende kromatografi massespektrometri
Kvantitative metabolomics af <em>saccharomyces Cerevisiae</em> Ved hjælp af flydende kromatografi kombineret med tandem massespektrometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mohammad, K., Jiang, H., Titorenko,… More

Mohammad, K., Jiang, H., Titorenko, V. I. Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (167), e62061, doi:10.3791/62061 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter