Biochemistry
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Kvantitative metabolomics af saccharomyces Cerevisiae Ved hjælp af flydende kromatografi kombineret med tandem massespektrometri
Chapters
Summary January 5th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Vi præsenterer en protokol for identifikation og kvantificering af større klasser af vandopløselige metabolitter i gær saccharomyces cerevisiae. Den beskrevne metode er alsidig, robust og følsom. Det gør det muligt at udskille strukturelle isomerer og stereoisomeriske former for vandopløselige metabolitter fra hinanden.
Transcript
Denne protokol har mange fordele i forhold til de aktuelt anvendte gær metabolomics, fordi det har høj specificitet, høj følsomhed, og også det kan profilere mange forskellige klasser af metabolitter, herunder isomerisk, isobar, hydrofil, og hydrofobiske molekyler. Den slukningsmetode, der anvendes i denne protokol, stopper alle enzymatiske reaktioner, mens det reducerer lækagen af metabolitter fra cellerne betydeligt. MS1-biblioteket, der er indbygget i denne protokol, er fra de forskellige MS2-kørsler.
Efter overnatning kultur på 30 grader Celsius og 200 omdrejninger i minuttet, bestemme antallet af gærceller pr milliliter af kultur og tilføje fem milliliter steriliseret 20% lageropløsning af glukose til hver af to Erlenmeyer kolber indeholdende 45 milliliter autoklavet YP medium pr kolbe. Brug en steril overførsel pipette til at tilføje fem gange 10 til den syvende gær celler til hver kolbe og vokse gærceller i mindst 24 ekstra timer ved 30 grader Celsius ved 200 omdrejninger i minuttet. Til metabolitudvinding, efter kultur, opsamle gærcellerne ved centrifugering og fjern hurtigt supernatanten.
Placer røret på tøris og tilsæt to milliliter minus 20 grader Celsius chloroform, en milliliter på minus 20 grader Celsius methanol, en milliliter iskoldt nano rent vand og 200 mikroliter af 425 til 600 mikron syrevaskede glasperler til cellerne. Når perlerne er tilsat, placere røret dækket med aluminiumsfolie i et skum rørholder kit med en holder og vortex prøven i 30 minutter ved medium hastighed ved fire grader Celsius for at lette metabolitudvinding. Derefter inkuberes røret i 15 minutter på is, før prøven centrifugeres for at tillade adskillelse af den øvre vandige fase fra mellemaffald og protein og lavere organiske faser.
Brug en mikropipette til at overføre ca. 400 mikroliter af den øvre vandige fase til et vasket og mærket 1,5 milliliterrør, der indeholder 800 mikroliter på minus 20 grader Celsius acetonitril. Derefter centrifugere prøven og overføre 800 mikroliter af den øverste del af supernatanten til en mærket massespektrometri hætteglas for nul graders opbevaring indtil flydende kromatografi tandem massespektrometri analyse. For at adskille de ekstraherede metabolitter ultralydsprøver prøveglasset i 15 minutter efterfulgt af tre 10-sekunders hvirvler ved stuetemperatur.
Efter hvirvlen skal hætteglasset placeres i væskekromatografiens brøndplade og indstille kolonnen til 45 grader Celsius med en strømningshastighed på 0,25 milliliter i minuttet og brøndpladen til nul grader Celsius. Brug derefter tabellen til at indstille de flydende kromatografigradienter til analysen. Efter adskillelse skal du bruge 10 mikroliterprøvemængder af injektionen i både elektrosprayioniseringspositive og negative tilstande i et massespektrometer udstyret med opvarmet elektrosprayionisering for at identificere og kvantificere de vandopløselige metabolitter.
I slutningen af analysen skal du åbne de rå data i et passende softwareprogram til sammensatte analyser og bruge massespektralfragmenteringsbiblioteket til at matche massespektret for at kommentere de metabolitter, der er identificeret i analysen. De nøjagtige masser af MS1- og isotopmønstrene kan også identificeres for at tillade anmærkning af metabolitterne ved hjælp af onlinedatabaser. Brug derefter biblioteket af databaser og spektre til at søge efter MS2-spektret af de rå data.
Den næste dag, efter at have slukket gærcellerne, vask cellerne grundigt med 15 milliliter ABC-buffer og opsamler cellerne ved centrifugering. Resuspend pellet i en milliliter frisk ABC buffer og tilsæt 500 mikroliter af propidium jodopløsningen til cellerne. Vortex prøven tre gange i 10 sekunder pr vortex og inkubere cellerne i 10 minutter på is beskyttet mod lys.
I slutningen af inkubationen opsamles cellerne ved centrifugering og cellerne vaskes tre gange med en milliliter frisk ABC-buffer pr. Vask. Efter den sidste vask skal pelleten genbruges i 300 mikroliter af frisk ABC-buffer og tilføje 10 mikroliter af den resulterende celleaffjedring til et mikroskopdias. Brug et fluorescensmikroskop til at fange differentialinterferenskontrast og fluorescensmikroskopibilleder af cellerne med filtrene indstillet til en excitationsbølgelængde på 593 nanometer og en emissionsbølgelængde på 636 nanometer.
Brug derefter et passende billedanalyseprogram til at tælle det samlede celletal af celler i lysmarks- og fluorescensbillederne og til at bestemme fluorescensintensiteten af farvning for individuelle celler. Den modificerede celleslukningsmetode forårsager betydeligt lavere skade på plasmamembranen og cellevæggen end den ikke-bufferede 80%methanol ved minus 40 grader Celsius slukningsmetode. Faktisk udviser næsten alle de celler, der udsættes for dæmpning ved hjælp af den modificerede metode, rød fluorescensemission, som er karakteristisk for gærceller, hvor plasmamembranen og cellevæggen ikke beskadiges.
I modsætning hertil viste næsten alle de celler, der blev udsat for slukning ved hjælp af den ikke-bufferede 80%metanol ved 40 grader Celsius-metoden, grøn fluorescensemission, som er karakteristisk for gærceller, hvor plasmamembranen og cellevæggen er betydeligt beskadiget. Den modificerede celleslukningsmetode forårsager også betydeligt lavere lækage af vandopløselige metabolitter fra gærceller end den ikke-bufferede 80%methanol ved minus 40 grader Celsius slukningsmetode. Retentionstidsskifteværdierne for vandopløselige metabolitstandarder er betydeligt lavere, og topformerne er væsentligt skarpere for den zwitterioniske fasekolonne sammenlignet med den omvendte fasekolonne.
En anden fordel ved den flydende kromatografi tandem massespektrometri metode er evnen til at bruge den zwitterioniske fase kolonne til effektivt at adskille forskellige vandopløselige metabolitter med forskellige strukturelle, fysiske og kemiske egenskaber. Sørg for at gøre propidium jod stående i mørke og sørg også for at indsamle den øverste fase, mens ikke forstyrre den midterste fase. Hvis en MFP ikke kan kommenteres på grund af manglen på MS2-spektralbiblioteket, skal du bruge en NMR til at illustrere denne struktur.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.