Summary
臭氧和细菌内毒素暴露的小鼠的结合显示广泛传播的细胞死亡，包括嗜中性粒细胞死亡。我们观察到细胞适应，如细胞骨质跛脚膜的中断，复杂V ATP合成酶亚单位β和血管他汀在支气管-阿尔韦奥拉厕所的细胞表达增加，抑制肺免疫反应和延迟中性粒细胞招募。
Abstract
肺部不断面临无菌（颗粒或活性毒素）和传染性（细菌、病毒或真菌）炎症等直接和间接的侮辱。压倒性的宿主反应可能导致呼吸受损和急性肺损伤，其特点是肺中性粒细胞的招募，由于病理逻辑宿主免疫，凝固和组织重塑反应。敏感的微观方法，可视化和量化Murine肺细胞适应，以响应低剂量（0.05ppm）臭氧，一种强大的环境污染物，结合细菌脂聚糖，TLR4激动剂，是至关重要的，以了解宿主炎症和修复机制。我们描述了对各种肺和全身体室的全面荧光微观分析，即支气管-肺泡乳液、肺血管灌注液、左肺冷冻切除和骨骼骨髓灌注。我们显示肺巨噬细胞、嗜中性粒细胞、肺乳腺组织以及骨髓细胞的损伤，这些细胞与被分析隔间中以离散化学素梯度为标志的延迟（高达36-72 h）免疫反应相关。此外，我们呈现肺细胞外基质和细胞细胞细胞相互作用（行为素，图布林），线粒体和活性氧物种，抗凝血性质氨酸，其抗血管生成肽片段血管他汀，线粒体ATP合成酶复合V亚单位，α和β。这些代孕标记，当辅之以足够的 体外 细胞检测和 体内 动物成像技术，如静脉显微镜，可以提供重要信息，了解肺对新型免疫调节剂的反应。
Introduction
急性肺损伤 （ALI） 是肺部对传染性或其他有害刺激的重要病理反应，其特点是同时激活凝固性、纤维化和与生俱来的免疫系统1。嗜中性粒细胞通过收费状受体（TLR）系列2、3、4迅速感知微生物以及细胞内损伤模式。嗜中性粒细胞释放预先形成的细胞因子和细胞毒性颗粒含量，然后可能导致附带组织损伤。随之而来的藻类损伤与继发细胞死亡一起受损，导致腺苷三磷酸盐（ATP）5等分子的释放，从而引发免疫调节的恶性循环。
在理解ALI时，一个尚未解决的问题涉及如何在气孔膜内启动损伤的问题。电子运输复合物V，F1F0 ATP合成酶，是一种线粒体蛋白，已知在炎症期间在细胞（包括内皮、白细胞、上皮）血浆膜上随处可见。细胞细胞细胞，由作用素和图布林组成，分别具有许多细胞形状和功能调节以及线粒体蛋白质。我们最近表明，由内源性分子、血管他汀、沉默中性粒细胞招募、活化和脂糖（LPS）引起的肺部炎症6对ATP合成酶的阻断。因此，生化（ATP合成酶）和免疫（TLR4）机制都可能调节肺部炎症期间的肺气道屏障。
接触臭氧（O3），环境污染物，损害肺功能，增加肺部感染的易感性，而短期低水平的O3暴露增加那些有基础心肺疾病7，8，9，10，11，12，13，14的死亡率的风险。因此，接触与生理相关的O3浓度为ALI研究炎症7、8的基本机制提供了一个有意义的模型。我们的实验室最近建立了低剂量O3诱导ALI15的穆林模型。在对低O3浓度进行剂量和时间反应后，我们观察到，暴露在0.05ppm O3中2小时，诱发急性肺损伤，其特征是肺ATP合成酶复合V亚单位β（ATP®）和血管他汀表达，类似于LPS模型。静脉肺成像显示肺活体作用微细丝的杂乱无章，表明肺部损伤， 和消融的肺膜隔膜活性氧物种 （ROS） 水平 （表示基线细胞信号的废除） 和线粒体膜潜力 （表示急性细胞死亡） 后 2 小时暴露到 0.05 ppm O315，这与异质肺18FDG 保留16，中性粒体招募和细胞因子释放有关， 最明显的是IL-16和自卫队-1+。我们最近的研究传达的信息是，当O3暴露在浓度低于允许的0.063ppm（每天）超过8小时（每天）的允许限值时，会产生指数级的高毒性。重要的是，对于这些亚临床O3暴露能否调节TLR4介质机制，如细菌内毒素17，目前还不清楚。因此，我们研究了双击O3和LPS暴露模型，并观察了免疫和非免疫细胞适应。
我们描述了对各种肺部和全身体室的全面荧光微观分析，即支气管-肺泡熔岩液（即， BAL）对肺血管空间（即LVP）进行采样，在内皮屏障、左肺冷冻时，对肺血管和肺间膜进行采样，以观察熔岩肺组织中残留的常驻肺细胞和粘附白细胞，代表循环白细胞的外周血液和胸骨和股骨骨髓分别在炎症期间采样造血细胞动员的近部和离位位。
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Protocol
这项研究的设计得到了萨斯喀彻温大学动物研究伦理委员会的批准，并遵守了加拿大动物护理委员会关于人道动物使用的准则。购买六至八周大的雄性C57BL/6J小鼠。注：在预定终点之前，对出现严重嗜睡、呼吸窘迫或其他严重不适迹象的动物实施安乐死。
注意：准备以下：27-18 G 针状（将取决于小鼠气管直径），适当大小的PE管，以适应钝针（为每只小鼠制作一个PE管），管子， 2 把锋利的剪刀、2 个钝钳（小）、1 个锋利的钳子（小）、3 个 1 mL 注射器、贴有标签的微胶管（用于 BAL、血液、血管和骨髓灌注），并贴有小瓶（用于组织固定）、用于组织收集的样品袋/冷冻液、屠夫的棉线卷（切成足够大小的连结）。用于实验的所有化学品均在 材料表中注明。
1. 臭氧和LPS暴露诱导穆林肺损伤
- 臭氧暴露
- 准备自定义 O3 感应框。加入鼠饲料，水瓶，浓缩玩具和干净的床上用品，以顺序和模仿老鼠的住房环境。
注意：这些步骤将确保小鼠在定制感应箱中自由获得食物和水，并有助于减轻不必要的压力。 - 切换 O3 校准器/发电机"ON"（放置在入口端口），在手前稳定紫外线灯（曝光前约 15 分钟），并与在线 O3 监视器连接。
注：O3 显示器应读取平均 0.05 ppm，从插座中以恒定的室温（72 ±3 °F）和相对湿度（50±15%）进行采样。 - 对于 O3 暴露，轻轻地将鼠标放在自定义感应框中，并持续将鼠标暴露在 0.05 ppm O3 中，持续 2 小时。
- 准备自定义 O3 感应框。加入鼠饲料，水瓶，浓缩玩具和干净的床上用品，以顺序和模仿老鼠的住房环境。
- 麻醉和内在 LPS 管理
- 分别准备10毫克/mL的氯胺酮和西拉津库存。
- 混合20份氯胺酮和1份西拉津，准备鸡尾酒。如果小鼠称X克，将氯胺酮/西拉津鸡尾酒（X/200）mL注射到腹腔中。对于一只小鼠，准备1mL的鸡尾酒，包括10毫克/mL氯胺酮库存的1000微升和50微升的锡拉津库存。通过在微管中上下管道很好地混合。
注：氯胺酮和锡拉津库存可以提前一周准备。 - 麻醉小鼠在光腹膜内 （IP） 氯胺酮 （50 毫克/千克） / xylazine （1 毫克/千克） 混合 （例如， 为 25 克小鼠， 注射 0.125 mL 的鸡尾酒）.
- 在盐水中准备 1 毫克/毫升的 LPS 溶液，并将 50 μL 的溶液填充在移液器中。
- 将鼠标直立在手掌上，用同一只手握住耳朵。现在，将LPS溶液 的50μL轻轻地放在鼻孔外（即每个鼻孔25μL或一个鼻孔中50μL;只要程序快并不重要），让小鼠吸入LPS溶液。
- 用50μL的无菌盐水灌输对小鼠。
注意：灌输不超过 100 μL，这可能是致命的。体积太少（即<50 μL），并且存在只有鼻腔沉积的风险。 - 在 LPS 管理之后，轻轻地将老鼠放在它们的肚子上或背上，它们的头部稍微向下倾斜。
注意：此方向延长了鼻腔19中溶液的保留。 - 在 0， 2、4、24、36和72 h接触后，用全剂量氯胺酮（200毫克/千克）/xylazine（4毫克/千克）混合（即X/50 mL的鸡尾酒，其中X是25克小鼠的鼠标重量为克或0.50 mL）。
- 观察鼠标，直到它失去知觉和正确的反射（即，躺在仰卧位置时不会回头）。现在，通过监测呼吸（有节奏的胸部短途旅行）和心率来检查鼠标麻醉的深度，这些心率在1-2分钟后会明显下降。
- 接下来，检查踏板反射，即捏捏后肢数字，并观察肢体的缩放，作为反射。如果鼠标响应，根据需要额外进行 0.1 mL 注射或更多充值。
注意：要实现深度麻醉，请记住，某些菌株或肥胖小鼠通常有较大的分布量，因此很容易过度服用，如果没有足够的时间，如果不允许全麻醉（这可能是大约10分钟或更长时间）。因此，一些菌株可以抵抗麻醉，因此需要更多的充值。这些知识是在对不同菌株和年龄的小鼠进行许多实际观察和经验后获得的。由于在 O3和 LPS 暴露（即在 2 h 时间点）之后，还立即进行了一些试点实验，因此我们还从这些实验中包括了一些非常早期的 BAL 细胞分析，以突出 O3和 LPS 联合暴露的直接影响。
2. 样本收集
- 将鼠标放在手术托盘上。现在，轻轻在两只眼睛上涂上润滑眼药膏，以避免液体流失，并使用70%的乙醇喷雾对小鼠进行消毒。
- 用剪刀在上部和下层皮肤膜上做小切口，露出气管和胸腔。
- 在胸骨下面切一下，露出心脏。
- 心脏穿刺
- 将附着在肝化注射器上的25G针头放入右心室，通过心脏穿刺抽血。
注：如果心脏被心脏穿刺的时间不到一分钟，血液通常用最少的柱塞抽取。收集约 0.4-0.5 mL 后，可能需要暂停几秒钟，然后再收集剩余的血液。这样做是为了让心脏泵到正确的心室任何剩余的体积。采血结束时，心脏停止抽水。 - 收集血液并储存在微管中以进行进一步处理。
- 将附着在肝化注射器上的25G针头放入右心室，通过心脏穿刺抽血。
- 气管 切开 术
- 小心使用钳子/钝钳清除气管区域，从过度组织。使用戴手套的手比手术器械更多，以避免出血。如果大量血液渗出，则存在污染物 BAL 样本的风险。如有必要，使用棉签，虽然不是首选。金威普斯是更好的替代品。
- 现在，切开肋骨露出肺部。再次，要 小心 不要割断胸骨和腹动脉或上升主动脉：在通过肋骨笼前进时进行较小的切割）
- 将棉质连字放在气管剪下方，暂时离开。
- 将气管切成1/3部分的合适位置，指向肺部，以便获得28G气管管。
- 将 28 G PE 管（最小长度为 3-5 mm，并修剪完结以方便插入）插入气管。在分叉前注意气管的末端，然后拉回约一毫米，以避免只取样单叶。
- 牢固地，系上棉连结，将管子保持到位。不要把管网折叠。
- 布朗乔-阿尔韦拉尔厕所（BAL）
- 在 1 mL 注射器中填充 0.5 mL 的 PBS。
- 现在在1mL注射器的帮助下，逐渐将0.5 mL的PBS注射到罐中。
- 注射 PBS 后，只要注射器不抵抗吸力，就吸气。
注意：如果在吸气 BAL 液体时存在阻力，则表示气管或支气管组织崩溃。在这种情况下，用一个微小的拉回管子，以分离形成组织壁的管子。 - 将吸气液收集到贴有标签的微管中，放在冰上。
- 在同一小瓶中以类似方式再进行两次熔岩收集（即共 0.5 X 3 = 1.5 mL 熔岩）。
- 测量收集的 BAL 流体的体积。熔岩恢复应该接近 90% 。
- 肺血管灌注剂 （LVP）
- 在胸腔和腹部两半之间的位置切下下胸动脉，避免在通过右心室灌注时肺部中任何香水的备份。
- 在切口末端附近打斑点腔，无血。
- 接下来，通过右心室注入0.5 mL室温肝盐水，给肺部注入。
- 从下行胸动脉切端的腔中收集血管灌注物，放入微浮管中，放在冰上测量其体积。
- 从气管（用棉线）靠近其分支的右支气管。
- 原位左肺固定
- 将 1 mL 注射器连接到气管管管，其时间足够长，可通过以前的气管切口插入。
- 在注射器中抽回高达 0.6 mL 标记的空气。
- 然后，在室温下用2%的副甲醛填充剩余的注射器（一直到最后）。确保柱塞准备好弹出，而不会从管子吸回任何空气。
- 现在，将注射器与苏格兰胶带粘贴到直立容器中，高度可达 20 厘米。
- 轻轻地，将柱塞拉出，让固定流向气管。如果罐内有一些气泡，轻轻地将柱塞放在注射器顶部，几秒钟后液体将开始流动。
- 让左肺原位膨胀到总容量， 从20厘米高处5分钟形成20厘米的水柱。
- 在此过程中，请确保保护右肺叶不接触副甲醛，因为这将影响下游检测。
- 放置折叠的实验室组织，以吸收任何可能与右肺叶接触的副甲醛。
注意：甲醛是剧毒的。因此，不要吸入或放置接触身体的任何暴露部分。处理时要格外小心。 - 在甲醛灌输期间，对腹部进行消毒。
- 切断气管上的右肺叶，确保去除任何线，并立即将叶放入贴有标签的低温叶中，将其放入液氮中，用于下游分子/生化细胞因子分析/RT-PCR/肺同质化的西斑分析。
- 小心修剪任何结缔组织或胸膜的左肺，并在4°C下将其浸入2%的副甲醛中24小时。
- 根据标准嵌入协议，将固定肺嵌入石蜡中。
注意：不要过热肺部样本。 - 切开腹部，从骨盆（臀部）骨上去皮。
- 将左右股骨骨骼与骨盆部分分开，放在冰上盐水填充的培养皿中。
- 斯特纳尔和股骨骨髓吸气收集
- 使用实验室组织清洁骨骼上的组织和肌肉。
- 将腹腔肋骨和胸骨收集到冰上充满盐水的培养皿中。
- 切断胸骨和股骨的解剖和近端。
- 用 0.5 mL 盐水将骨骼灌注 4 次，使用安装良好的针头（24 至 28 G）在 1 mL 注射器上，并将每个骨骼的分数收集到装有过滤器并放置在冰上的贴有标签的管中。
注：针头量表因动物大小而异。冲洗后，股骨应显示为透明。 - 采集样品后，将鼠标装在塑料袋中，并按照机构动物设施的准则放入动物尸体冰柜进行适当处理。
3. 样品处理
- 总 （TLC） 和差分 （DLC） 白细胞计数
- 离心外周血、BAL、肺血管灌注和骨髓（骨骼和股骨）样本在500克处10分钟。
- 收集超自然人，闪光冻结它们，并将它们存储在-80°C，直到进一步分析。
- 在至少 200 μL 的 PBS 中重建细胞。
- 通过在血细胞仪上计数BAL、血液、肺血管灌注和骨髓细胞来执行TLC。
- 染色另一个 9 μL 的 BAL 报价与 1 μL 混合的钙蛋白绿色和红色同位素 -1 量化活 （绿色） 细胞由于细胞内酯酶活性和任何损坏的 BAL 细胞 （红色） 由于失去血浆膜完整性.
- 在裂解 RBC 中加入 2% 醋酸，血液 TLC 的比例为 1：10，肺血管富硫酸盐 TLC 的比例为 1：2。
注意：如果浓度超过每mL1x106 个细胞（对骨髓样本非常重要），则通过在PBS中稀释来调整细胞浓度。 - 将细胞离心，在幻灯片和污渍上准备细胞针，如下所述，用于 DLC。至少计算 100 个细胞，以进行微分白细胞细胞计数 （DLC）。
注意：通常情况下，一个人可以在一张幻灯片上准备两个细胞针。在10-15分钟的空气干燥后，继续染色步骤。 - 将收集的 BAL 从每组三只试点小鼠中分离成两个细胞平，并使用活性氧化磷酸化（减少线粒体）染色用于活性氧化磷酸化（ 减少线粒体）。利用另外三只小鼠的 BAL 将每个小鼠分裂成两个细胞平，用于 NK1.1/Gr1/CX3CR1 和 ATP®/Ki-67/CD61/血管他汀染色滑梯。将 BAL 从另外三只小鼠中分离成两个细胞针，分别染色 ATP® /Ly6G 和 CX3CR1/西格莱克-F。
- 布朗乔韦拉尔厕所 （BAL） 和肺血管香水 （LVP） 总蛋白质定量
- 为了量化两个肺室（即肺间）和肺血管灌注（血管）隔间中血管屏障或相对腹压的O3 和LPS诱发扰动，测量收集的液体中的总蛋白质含量。
- 使用标准洗涤剂耐色度测定分析分析解冻的超自然成分，以达到其总蛋白质浓度。
- 布朗乔韦拉尔厕所 （BAL） 和肺血管灌注 （LVP） 化学素分析
- 接下来，使用基于33个plex磁珠的免疫分析BAL和肺血管灌注（LVP）超级牛的化疗因子。这将告知在合并暴露后确定的气道/间歇物与血管化学梯度的方向。
- Analyze the following panel of chemokines : CXCL13 (B-lymphocyte chemoattractant), CCL27 (IL-11 R-alpha-locus chemokine (ILC)), CXCL5 (epithelial-derived neutrophil-activating peptide 78 (ENA-78)), CCL-11 (eotaxin-1), eotaxin-2 (CCL-24), CX3CL1 (fractalkine), GM-CSF (CSF-2), CCL1, IFNγ (interferon gamma), IL-10 (interleukin-10), IL-16 (interleukin-16), IL-1β (interleukin-1 beta), IL-2 (interleukin-2), IL-4 (interleukin-4), IL-6 (interleukin-6), CXCL-10 (interferon gamma-induced protein 10 (IP-10)), CXCL11 (Interferon-gamma-inducible protein 9 (IP-9)), KC (keratinocyte chemoattractant), MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1), MCP-3 (monocyte chemoattractant protein-3), MCP-5 (monocyte chemoattractant protein-5), MDC (macrophage-derived chemokine (CCL22)), MIP-1α (macrophage inflammatory protein-1 alpha), MIP-1β (macrophage inflammatory protein-1 beta), MIP-2 (macrophage inflammatory protein-2), MIP-3α (macrophage inflammatory protein-3 alpha), MIP-3β (macrophage inflammatory蛋白质-3测试版），RANTES（激活时受监管， 正常T细胞表达和分泌（CCL5）、CXCL-16、CXCL-12/SDF-1alpha（频闪细胞衍生因子1）、TARC（胸腺素和活化调节化学素（TARC）、TECK（蒂穆斯-表达切莫金（CCL25）和TNF®（肿瘤坏死因子阿尔法）。
4. 细胞素染色和肺组织学
- 细胞素生化染色
- 用疏水笔包围细胞针，以包含在手术过程中孵化的化学物质。
- 在 PBS 中补充细胞针 5 分钟。
- 将细胞平样品固定在2%的副甲醛中10分钟，用PBS洗3次，每次洗5分钟。
- 用冰冷的70%的王牌渗透7分钟，再用PBS洗3次，每次5分钟。
- 污渍为行为素和图布林或减少米托特拉克 （孵化与混合 2 μg/50 μL 的 Alexa 488 组合法洛丁显示在绿色， 和 2 μg/μL 的 Alexa 555 共生小鼠抗α塔布林或减少米托特拉克显示为红色， 15 分钟） 。
注意：使用小鼠IgG1同型控制抗体，在一个单独的细胞平，以验证图布林染色协议。执行与解释的 4.1.1 到 4.1.8 相同的步骤，但对于等型控件。 - 通过轻轻地从幻灯片上翻倒混合物来去除污渍。用 DAPI（4+，6-迪亚米迪诺-2-苯林多）孵化幻灯片 5-10 分钟以弄脏核。
- 用 PBS 清洗细胞针 3 次，每次 5 分钟，用防褪色安装介质盖住滑动，并在成像前在室温下在黑暗中存放过夜。
- 在配备科学相机的宽场直立显微镜下获取图像。确保成像幻灯片时为不同的荧光通道设置一致的相机曝光时间。
- 细胞素免疫荧光染色：
- 用疏水笔包围细胞针，以包含在手术过程中孵化的化学物质。在 PBS 中补充细胞针 5 分钟。
- 修复细胞平样品，在2%的副甲醛中孵育10分钟，用PBS洗3次，每次5分钟。
- 用0.1%的冷三吨X-100渗透2分钟，用PBS洗3次，每次5分钟。
- 接下来，Fc 通过 1：50 稀释 Fc 块抗体库存来孵育细胞针，从而阻止 15 分钟（以确保主要鼠标抗体不会与鼠标 Fc 抗体非具体交叉反应）。
- 提示幻灯片以去除 Fc 块，并更改为 1% BSA，用于并孵育细胞针，混合 3 种主要感兴趣的抗体（参照 表 1 表示各种组合）30 分钟。
注意：通过执行步骤4.2.1到4.2.9，用同型控制代替抗体，与我们最近研究20中讨论的相应二级抗体并行运行同型控制抗体（与混合小鼠IgG1和大鼠IgG2bkappa原发抗体一起孵化）。 - 用PBS洗3次，每次5分钟。用适当设计的二次抗体混合物孵育细胞针（详情请参阅表 1）。
- 通过轻轻地从滑梯上翻倒混合物来去除污渍，用 DAPI（4+，6-迪亚米迪诺-2-苯林多）孵育 5-10 分钟以弄脏核。用PBS洗3次，每次5分钟。
- 盖片带有防褪色安装介质，在成像前在室温下在黑暗中存放过夜。
- 在配备科学相机的宽场直立显微镜下获取图像。确保成像幻灯片时为所有氟磷通道设置一致的相机曝光时间。
- 血氧林和黄素（H&E）组织学
- 对所有组的肺冷冻部分进行修改后的 H&E 染色3。
- 图像分析
- 处理和分析斐济图像J开放软件（https://imagej.net/Fiji/Downloads）中的图像数据（.tiff）文件。
- 检查所需的参数（区域、周边、综合密度、形状描述符、Feret 直径、圆形、显示标签），以记录在 分析 选项卡和 设置测量下。
- 使用 投资回报率管理器，使用"徒手选择"工具手动勾勒出合并后的图像面板中大约 50-200 个单元。使用 Ctrl+T 命令保存感兴趣的区域 （ROI），并将每个单元的保存投资回报率复制到所有氟化通道。
- 下一步按 Ctrl+M 测量所有荧光通道的预设参数（例如， 405 nm （蓝色 DAPI 或 ATP®），488 nm（行为或NK1.1 或 Ki-67 绿色）、568 nm（图布林或 Gr1 或 CD61 红色）和 633 nm（CX3CR1 或品红色血管他汀）。
- 将结果保存为.csv文件，以代表您的分析的适当名称保存。将.csv文件的结果复制到电子表格中，并根据染色设计，将染色分子的荧光强度 （FI） （即结果文件中的原始集成密度列）除以 DAPI 或 CD61 FI 的荧光强度 （FI）。这些比率称为"DAPI 或 CD61 规范化 FI 比率"。
- 接下来，绘制这些规范化比率、圆形、细胞周界和 Feret 直径，以评估合并 O3 和 LPS 暴露后细胞大小的任何变化。
- 使用适当的统计软件检查收集数据的正常性并测试空假设（请参阅下面的统计分析部分）。
- 统计分析
- 将结果表示为平均± SEM。每组至少使用三只小鼠。
- 对于化学素数据分析，根据本杰明尼和霍什伯格的更正调整单向 ANOVA p 值以获得虚假发现率。
- 通过曼-惠特尼 U 测试（用于比较两组）或 Kruskal Wallis 测试（用于比较多个组），分析图像参数、细胞、Feret 直径、周长、DAPI 或 CD61 规范化荧光强度比，因为这些数据通常不会分布。
- 对于其他成像实验，使用对方差的单向分析分析结果，然后是 Sidak 的多重比较。p 值<0.05 被认为显著。
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Representative Results
O3和 LPS的合并暴露导致系统炎症和骨髓在 72 h 时的动员：不同隔间中的细胞计数显示外周血液发生显著变化，股骨骨髓总细胞计数取决于合并 O3和 LPS 暴露。虽然结合O3和LPS暴露并没有诱发任何变化的总BAL（图1A）或LVP（图1B）细胞计数，多态核细胞呈现为主要细胞类型在24（图1F，补充图1），36和72小时后暴露。请注意，在 24 h BAL 细胞素图像 （图 1F）的多态核细胞中不存在西格莱克-f 和 CX3CR1 染色。BAL细胞平的三重DAPI/CD11b/Gr1染色显示存在大型CD11b-和Gr1阳性单核细胞，这些细胞在0 h时是巨噬细胞，它改变为较小的多态核细胞，显示穿刺Gr1染色，但在4小时时没有CD11b染色（如补充1F的插图所示）。大多数BAL细胞是多态核的，CD11b和Gr1均呈阳性，在暴露后24小时（补充图1）。
小鼠在24小时（3.3倍对0小时）显示全身白细胞增多症， p<0.05， 图1C），其次是72小时白血病，其标志是外周血液计数比24小时（p<0.01）低13倍，与4小时（p<0.05）相比低8.6 倍（图1C）。与 0 h 或合并 O3 和 LPS 暴露后（图 1D）相比，骨骼骨髓细胞也保持不变。股骨骨髓计数显示，与0小时（p<0.01， 图1E）以及其他时间点（p<0.01， 图1E）相比，72小时时会出现28.8倍的峰值。LVP、胸骨和股骨骨髓细胞的可视化也显示了细胞类型的变化，以多态核细胞为主（补充图1）。骨骼骨髓细胞显示出损伤的迹象，细胞外核材料就证明了这一点。股骨骨髓显示CD11b和Gr1阳性细胞（补充图1）的数量较高，这与细胞计数相吻合。
BAL 总蛋白质含量在 O 3 和 LPS 联合暴露后最高，为36 h：对 LVP 和 BAL 隔间中的总蛋白质进行量化，以相关臭氧诱导肺水肿，即由于合并暴露导致血管和上皮屏障损伤而渗出的血浆蛋白。BAL总蛋白质在36小时（p<0.05）时比4小时（图2A）高4.5倍。然而，LVP蛋白在接触后没有变化（图2B）。
结合O3 和LPS暴露诱导肺血管隔间中强化学素梯度，而不是BAL： 在BAL和LVP超自然体上进行切莫金多路复用检测。请注意，这两个隔间之间的相对差异表示特定隔间中的优先保留。在LVP舱中，嗜血性化疗素eotaxin-2在4h时比0小时（p<0.05， 图3A）高4.3倍。在BAL舱室中，eotaxin-2在4小时时比0时低3.2倍（p<0.01， 图3B）。BAL eotaxin-2 水平持续下降，直到 72 h，与 0 h 相比减少了 12.6 倍（p<0.01， 图 3B）。淋巴细胞化疗的IL-2在LVP舱室的4小时时比0小时（p<0.05， 图3C）高10.1倍。在 BAL 舱室中，IL-2 在 36 h 时比 0 h（p <0.05， 图 3D）低 5.0倍。BAL eotaxin-2 水平在 72 h 时持续下降 5.9 倍，而 0 小时（p<0.05， 图 3D）。
有趣的是，许多化疗因子在4小时时被改变，在LVP，而不是BAL。与以后的时间点相比，这些化疗因子大多在4h时显示LVP水平略有增加，但显著增加。虽然与0小时相比，eotaxin-1的暴露后水平并不高，但与24（2.7倍，p<0.05）和72小时（5.0倍，p<0.01，图4A）相比，在4h水平明显较高。LVP TNF® 的含量在 4 h 时比 36 h（p <0.05，图 4B）高 3.4倍。同样，LVP IFNγ在 4 小时时比 72 小时（p <0.05，图 4C）高 2.9倍。CX3CL1 水平也高于 4 h，而合并曝光后为 24 （1.7 倍、p<0.05）、36 （1.6 倍、p<0.05） 和 72 小时（2.2 倍、p<0.01）。CCL27 水平显示较高的水平在 4 h 以及相比 24 （2.7 倍， p<0.05）， 36 （3.9 倍， p<0.01） 和 72 小时 （2.9 倍， p<0.05） 后合并曝光 （图 4E）.
一些化疗因子在联合暴露后4小时在LVP中具有很强的存在，在接触前后BAL中没有改变，这表明肺毛细管有很强的化学反应。在 4 小时时，IL-16 LVP 级别为 3.4 倍，而 0 小时（p <0.01），3.2 倍于 24 小时（p <0.01）， 4.5 倍，而 36 小时（p<0.01） 和 4.6 倍，而 72 小时（p<0.01） 后，合并曝光 （图 4F）.在4小时，中性粒细胞化学素， CXCL5 LVP 水平为 2.0 倍，而 0 小时（p <0.01），4.7 倍，而 24 小时（p <0.01），2.01 2 倍，而 36 小时（p<0.01） 和 2.7 倍相比，72 小时 （p<0.01） 后，合并曝光 （图 4G）.在 4 小时时，CXCL10 LVP 级别为 2.3 倍，而 0 小时（p<0.01），是 24 小时（p <0.05） 的 2.1 倍。 2.5 倍，而 36 小时（p<0.01）和 2.7 倍，而 72 小时（p <0.01） 后，合并曝光 （图 4H）.在36小时时，中性粒细胞、SDF1®LVP水平为4.2倍，而混合暴露后为0小时（p<0.01），2.9倍，而24小时（p<0.05），6.8倍，而合并暴露后为72小时（p<0.01）。在 4 小时时，MIP3® LVP 水平为 2.3 倍，而 0 小时（p<0.05）和 2.3 倍，而合并曝光后为 72 小时（p <0.05）（图 4J）。
O3和 LPS 的结合暴露会诱发坏死，破坏细胞细胞骨质、血浆膜和线粒体完整性：由于分泌白细胞计数和蛋白质含量与 LVP 化学素梯度不相关，因此可视化从这些隔间获得的细胞变得更加重要。基线 （0 h） BAL 细胞的活体作用/图布林染色显示存在皮质作用素、应力纤维以及跛脚皮皮质（以绿色显示，图5左上面板）和微管网络（以红色显示，图5左上面板显示），与减少线粒体染色表示存在活动线粒体（以红色显示，图 5左下面板显示）。超过 95% 的 BAL 细胞是基线的单核细胞。在4小时时，BAL细胞显示细胞外核材料，穿插细胞质作用在染色中没有跛脚菌和减少皮质作用染色（以绿色显示，图5右上面板），扇形微管网络（以红色显示，图5右上面板），与减少的线粒体染色不对应（以红色显示，图5左右面板）。DAPI规范化作用素荧光强度分析显示，暴露后4小时行为素染色率下降3.7倍（p<0.01，图6A）。同样，DAPI规范化的图布林荧光强度在接触后也降低了1.5倍（p<0.01，图6B），表明图布林染色量减少。随着BAL细胞细胞的循环性立即增加，即在2小时（p<0.01，跛脚足的丧失是显而易见的，图6C）和4小时（p<0.05，图6C）暴露后，与0小时相比，细胞骨循环在24（p<0.05）和36小时（p<0.01）后，与0小时（图6C）相比下降。
高达24小时，从联合暴露的BAL细胞是双阳性的钙素（绿色，图7）表示存在活性酯酶活性，和同位素（红色，图7），表明虽然有些细胞已经死亡（红色），但大多数细胞是部分受损的细胞。在36小时，BAL细胞基本上是可行的（绿色），表明从其他系统舱室招募的白细胞取代了受损细胞（图7）。
BAL细胞的特定ATP®和Ly6G染色揭示了血管巨噬细胞中蛋白质的离散细胞内定位（电影1和2），以及暴露后嗜中性粒细胞（图7）。合并暴露导致ATP®（图7，8A）的DAPI规范化荧光强度比降低，细胞内Ly6G蛋白质含量增加（图7，图8B，电影1和2）。ATP® 染色减少，暴露后 24 小时，与较低的图布林相关，并在一定程度上减少了线粒体染色。我们还观察到暴露后无核ATP®阳性细胞体，可能是血小板。然而，我们没有证实我们的发现。在2小时，我们观察到较小的单核BAL细胞（p<0.01图8C，p<0.01图8D），而在4小时，单核细胞更大（p<0.01图8C，p<0.01图8D）相比0小时。 在24（p<0.01图8C，p<0.01图8D）和36小时（p<0.01图8C，p<0.01图8D），BAL细胞逐渐变小，由于向多态核细胞的转变，相比之下0小时。
BAL细胞的免疫电位化揭示了NK1.1、ATP β和Ki-67的瞬时表达，以及Gr1、CX3CR1和血管他汀阳性BAL细胞在O3和LPS联合暴露后的持续表达：第一组BAL细胞的免疫荧光染色被正常化为DAPI染色。细胞NK1.1正细胞在24h（p<0.05对0h，图9，10A）时增加。在36小时时，BAL细胞具有较低的细胞NK1.1荧光强度（p<0.01 vs 0和24h，图9，10A）。蜂窝 Gr1 荧光强度较高，为 24 h（p <0.01 vs 0 h，图 9， 10B）以及 36 h（p<0.01 对 0 h，图 9， 10B）。同样，蜂窝 CX3CR1 荧光强度较高，为 24 h（p <0.01 x 0 h，图 9， 10C）以及 36 h（p<0.01 vs 0 h，图 9， 10C）。
当标准化为蜂窝 CD61 时， 在表达上也无处不在，显示细胞ATP®荧光强度在24小时（p<0.01对0小时， 图9，10D）和细胞ATP®荧光强度在36小时（p<0.01与0和24小时， 图9，10D）下降。值得注意的是，ATP®显示主要是核本地化在24小时，而外围定位在36小时（图9）。BAL Ki-67的细胞荧光强度高于0和36小时（p<0.01对36h， 图9，10E）。水平低于基线水平在36小时（p<0.01， 图9，10E），最有可能由于较高的多态核CD61与Ki-67表达在36小时（图9）。最后，BAL血管他汀的细胞荧光强度在24和36h（p<0.01 vs 0 h， 图9，10F）时一直很高，表明在肺部炎症反应期间，这种金属蛋白酶裂开的质粒素片段有特定的增加。
合并暴露会产生广泛的肺损伤： 肺组织学显示，合并暴露对肺造成长期损害，如在H&E染色冷冻切除术（图11）中看到。虽然支气管和肺膜隔膜的损伤是预料之中的，但观察大型船只的内皮损伤，在暴露后36小时（图11）。在受损的白细胞隔膜和腹膜区域（图11）有粘附的血管内白细胞、白细胞聚合物（包括嗜中性粒细胞）斑块。
图1：共分白细胞计数： A） 布朗乔-阿尔韦奥拉拉瓦奇 （BAL） 总白细胞计数为 0 （即基线）， 4， 24， 36 和 72 小时后， 合并 0.05 ppb 臭氧 （O3）和 50μg 内 LPS 暴露给小鼠. B） 肺血管灌注 （LVP） 总白细胞浓度为 0 （即基线）， 4， 24， 36 和 72 h 后， 组合 0.05 ppb 臭氧 （O3）和 50μg 内 LPS 暴露在小鼠. C） 周围血液 （PB） 总白细胞浓度为 0（即基线）、4、24、36 和 72 h，合并后为 0.05 ppb 臭氧 （O3）和 50μg 鼻内 LPS 接触小鼠。 D） 斯特纳尔骨髓 （BM） 总白细胞浓度为 0 （即基线）， 4， 24， 36 和 72 h 后， 结合 0.05 ppb 臭氧 （O3）和 50 μg 内 LPS 暴露给小鼠. E） 女性骨髓 （BM） 总白细胞浓度为 0（即基线），4、24、36 和 72 h，合并后为 0.05 ppb 臭氧 （O3）和 50μg 鼻内 LPS 接触小鼠。对于图形 A-E，0 h 表示为蓝色，4 h 表示红色，24 h 表示绿色，36 h 表示紫色，72 h 表示橙色数据点;*p<0.05和**p<0.01。F） 代表 BAL 细胞弹从 24 h 暴露中滑动，显示单核细胞和多态核细胞在染色时为核（蓝色）、CX3CR1（绿色）和西格莱克-F（红色）。请注意，CX3CR1 和西格莱克-F 的合并显示为橙色黄色。大多数单核细胞对Siglec-F呈阳性，这是白细胞巨噬细胞的一个特征。比例尺 = 50μm. 请单击此处查看此图的更大版本。
图2：蛋白质定量总：A）布朗乔韦拉尔厕所（BAL）总蛋白质含量和B）肺血管灌注（LVP）总蛋白质浓度估计由Pierce 660 nm蛋白质测定（热科学，伊利诺伊州，美国）。对于图形 A-B，0 h 表示为蓝色，4 h 表示红色，24 h 表示绿色，36 h 表示紫色，72 h 表示橙色数据点：*p<0.05。请单击此处查看此图的较大版本。
图3： 肺Eotaxin-2和IL-2化学素梯度： 在33个化疗因中， 结合 0.05 ppb 臭氧 （O3）和 50μg 内 LPS 接触小鼠 A） LVP eotaxin-2 B 后，在肺血管灌注 （LVP） 和支气管血管内熔炉 （BAL） 和液体中显著改变的两种化疗因子， C） LVP IL-2 和 D） 巴尔 IL-2。数据通过单向新星分析，根据本杰明尼和霍什伯格的校正调整多个变量的误发现率的 p 值。对于图形 A-D，0 h 表示为蓝色，4 h 表示红色，24 h 表示绿色，36 h 表示紫色，72 h 表示橙色数据点。邦费罗尼更正后对对比较进行了分析。*表示p<0.05，**表示p<0.01。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：肺血管灌注化学素浓度： 十多片化疗剂的浓度被改变，但仅在肺血管灌注（LVP）隔间中。 A） 欧他信 -1， B） Tnf®， C） IFNγ， D） CX3CL1， E） CCL27， F） IL-16， G） CXCL5， H） CXCL10， I） SDF1® 和 J） MIP3® 。对于图形 A-J，0 h 表示为蓝色，4 h 表示红色，24 h 表示绿色，36 h 表示紫色，72 h 表示橙色数据点。邦费罗尼更正后对对比较进行了分析。*表示p<0.05，**表示p<0.01。 请单击此处查看此图的较大版本。
图5：布朗乔韦拉尔厕所 （BAL） 细胞平作用素/图布林和减少线粒体染色：活性蛋白/图布林染色 BAL 细胞针的代表图像从A） 0 h 和B） 4 小时后组合 0.05 ppb 臭氧 （O3）和 50 μg 内皮质暴露在小鼠.请注意，DAPI 以蓝色显示，在绿色中显示，在红色中显示图布林。在合并 0.05 ppb 臭氧 （O3）和 50μg 内 LPS 接触小鼠后，A） 0 h 和B） 4 h 的减量线粒细胞污染 BAL 细胞平的代表性图像。请注意，DAPI 以蓝色显示，并以红色减少线粒体。比例尺 = 50μm.请单击此处查看此图的更大版本。
图6：布朗乔韦拉尔厕所 （BAL） 细胞骨质蛋白和循环分析： BAL 细胞针染色为 actin 和图布林被分析为 DAPI 规范化参数， 即， A） Actin 与 DAPI 荧光强度 （FI） 比在 0 和 4 h， B） 图布林与 DAPI 荧光强度 （FI） 比为 0 和 4 h 和 C） BAL 细胞细胞在 0 （n=75 细胞）， 2 （n=105 细胞）， 4 （n =66 细胞）， 24 （n=31 细胞）， 36 （n=154 细胞） h.由于在O3 和LPS暴露后，即在2小时的时间点，我们也包括一些非常早期的BAL细胞分析从2小时的时间点，以突出O3的直接影响后立即进行一些试点实验。对于图形 A-C，0 h 表示为蓝色，2 h 表示红色，4 h 表示绿色，24 h 表示紫色，36 h 表示橙色数据点。*表示p<0.05，**表示p<0.01。 请单击此处查看此图的较大版本。
图7： 布朗乔韦拉尔熔岩 （BAL） 细胞内和血浆膜状态： BAL 细胞被染色为重要的污渍， 钙素 （绿色） 和乙酰同位素 /EthHD （红色）， 如在具有代表性的上部图像面板在 A） 0， B） 24 和 C） 36 h 后 O3 和 LPS 暴露.比例杆 = 200μm. BAL 细胞针被免疫为 DAPI （蓝色）、ATP® （绿色） 和 Ly6G （红色） 。在 O3 和 LPS 曝光后 24 小时，在 A） 0 和 B） 下图像面板中显示代表性图像。比例尺 = 50μm. 请单击此处查看此图的更大版本。
图8：布朗丘尔韦拉尔厕所 （BAL） 线粒体蛋白 ATP® 、溶酶蛋白 Ly6G 和细胞大小分析：免疫染色 BAL 细胞正常化，用于 DAPI 计算A） ATP® 与 DAPI 荧光强度 （FI） 比和B） Ly6G 与 DAPI FI 比率，在 O3和 LPS 暴露后为 0 和 24 h。还分析了免疫染色BAL细胞的A）最长的即雪铁龙直径和B）周长，在O 3和LPS暴露后为0、2、4、24和36小时。对于图形 A-D，0 h （n=119 细胞） 以蓝色表示，2 h （n=105 细胞）表示为红色，4 h（n=66 细胞）表示为绿色，24 h（n=309 细胞）表示为紫色，36 h（n=154 细胞）表示为橙色数据点。*表示p<0.05，**表示p<0.01。请单击此处查看此图的较大版本。
图9：布朗乔韦拉尔厕所 （BAL） 细胞内表型：BAL细胞在 O 3 和 LPS 暴露后 36 h 为 DAPI（蓝色）、NK1.1（绿色）、Gr1（红色）和 CX3CR1（品红色）接种，如具有代表性的上部图像面板（A） 0、B） 24 和C） 36 h。 比例杆 = 50μm. BAL 细胞素接种了 ATP® （蓝色）、Ki-67 （绿色）、CD61 （红色） 和血管他汀 （品红色） 的免疫。具有代表性的图像显示在较低的图像面板中，在A） 0、 B） 24 和C） O3和 LPS 曝光后 36 h。比例尺 = 50μm.请单击此处查看此图的更大版本。
图10：布朗乔韦拉尔厕所 （BAL） 线粒体蛋白 ATP®， 溶酶蛋白 Gr1， 细胞内CX3CR1和血管他汀分析：免疫染色BAL细胞正常化，DAPI计算A）NK1.1至DAPI荧光强度（FI）比，B）Gr1与DAPI FI比和C）CX3CR1与DAPI FI比，在O 3和LPS暴露后为0、24和36小时。免疫染色 BAL 细胞正常化为 CD61 计算A） ATP® 与 DAPI 荧光强度 （FI） 比B） Ki-67 与 DAPI FI 比和B）血管他汀 （ANG） 与 DAPI FI 比率，在 O3和 LPS 暴露后为 0、24 和 36 h。对于图形 A-F，0 h （n=21 细胞） 以蓝色表示，24 h （n=796 细胞）表示红色，36 h（n=2692 单元格）表示绿色数据点。*表示p<0.05，**表示p<0.01。请单击此处查看此图的较大版本。
图11：肺血氧林和黄素（H&E）组织学。 臭氧 （O3）和 LPS 在结合O 3 和 LPS 暴露后，在 0、24 和 36 h 时诱导肺低温切除 H&E 组织学。藻类上皮损伤区域由实心黑箭头标记，内皮损伤由黑色箭头标记。黄色星号 （*） 表示白细胞在白细胞隔膜区域的补丁。 A = 肺空间 ，B = 支气管 ，V = 血管，比例杆 = 100 μm 左手图像面板和 50 μm 用于右侧的图像面板。 请单击此处查看此图的较大版本。
| S.No | 主要抗体 | 英异激素二次抗体 |
| 1 | 鼠标抗NK1.1 IgG2a卡帕（克隆PK136），英创目录16-5941-82 | 亚历克萨 488 结合山羊反鼠标 Igg （H+L）， 目录号A11002 |
| 2 | 鼠抗 Ly6G/Ly6C （Gr1） IgG2b 卡帕 （克隆 RB6-8C5）， 英创基因目录号 53-5931-82 | 亚历克萨 568 结合山羊抗鼠 IgG （H+L）， 目录号A11077 |
| 3 | 兔子抗CX3CR1 IgG （RRID 467880），英创基因目录14-6093-81 | 亚历克萨 633 结合山羊反兔子 Igg （H+L）， 目录号A21070 |
| 4 | 鼠标抗 ATP5A1 IgG2b （克隆 7H10BD4F9），英创目录号 459240 | 亚历克萨 488 结合山羊反鼠标 Igg （H+L）， 目录号A11002 |
| 5 | 鼠抗 Ly6G IgG2a 卡帕 （克隆 1A8）， 英创基因目录号 16-9668-82 | 亚历克萨 568 结合山羊抗鼠 IgG （H+L）， 目录号A11077 |
| 6 | 鼠标防 ATP5® IgG2b （克隆 3D5AB1），恒温钓鱼者目录号A-21351 | 亚历克萨 350 结合山羊反鼠标 Igg （H+L）， 目录号A11045 |
| 7 | 鼠抗Ki-67（克隆SolA15）IgG2a卡帕，英创目录第14-5698-82号 | 亚历克萨 568 结合山羊抗鼠 IgG （H+L）， 目录号A11077 |
| 8 | 亚美尼亚仓鼠抗CD61（克隆2C9。G2） IgG1 卡帕，BD 目录号 553343 | 亚历克萨 568 结合山羊反仓鼠 Igg （H +L）， 目录号A21112 |
| 9 | 兔子抗血管他汀 （鼠标 aa 98-116） 伊格， Abcam 目录号ab2904 | 亚历克萨 633 结合山羊反兔子 Igg （H+L）， 目录号A21070 |
表1： 用于染色细胞钉的初级和次要抗体组合，从样品中制备。
| 读出 | 巴尔 | 副总裁 | 铅 | 斯BM | FBM |
| 薄 | * | * | +在24小时：-在36，72小时 | +在72小时 | |
| 中性 粒 细胞 | +在24，36，72小时 | +在24小时 | * | +在4，24，36，72小时 | +在4，24，36，72小时 |
| 蛋白 | +在36小时 | * | n.d. | n.d. | n.d. |
| 切莫金配置文件 | -对于欧他辛-2，IL-2在4，24，36，72小时 | + 用于欧他信-1/2、IL-2、TNF®、IFNγ、CX3CL1、CCL27、IL-16、CXCL5、CXCL10、MIP3+在4小时：+SDF1®在36小时 | n.d. | n.d. | n.d. |
| 细胞大小 | +在4小时：-在24，36小时 | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. |
| ATP® | -在24小时 | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. |
| NK1.1/Ki-67 | +在24小时 | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. |
| ATP® /Gr1/CX3CR1/安 | +在24，36小时 | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. |
表2： 对不同隔间研究的主要发现进行全面总结。*表示无更改，+表示增加，-表示已测量参数的减少。 BAL 表示支气管 -肺油脂熔岩液 ，LVP 表示肺血管灌注 ，PB 表示外周血液 ，SBM 表示胸骨骨髓 ，FBM 表示股骨骨髓隔间。
补充图1：Gr1和CD11b免疫学： 来自DAPI（蓝色）、Gr1（绿色）和CD11b（红色）荧光免疫染色细胞平滑梯的具有代表性的图像，在结合O3 和LPS暴露后，在0、4和24小时内在肺血管灌注（LVP）、骨骼骨髓（BM）和股骨骨髓（BM）隔间中滑动。比例栏 =50μm.请单击此处下载此文件。
辅助电影 1 从 0 h 时间点（即基线）向 BAL 巨噬细胞的三维渲染体积，显示原子核（以蓝色显示）和 ATP® 免疫（以绿色显示）和 Ly6G（以红色显示）。请点击这里下载这部电影。
辅助电影 2： 结合 O3 和 LPS 暴露后，从 24 h 时间点的 BAL 巨噬细胞的三维渲染体积，显示原子核（以蓝色显示）和 ATP® 免疫（以绿色显示）和 Ly6G（以红色显示）。注意存在无核 ATP® 正体以及支离破碎的细胞。请点击这里下载这部电影。
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Discussion
本研究中提出的方法突出了多个隔间分析对于研究肺部炎症期间的多个细胞事件的有用性。我们已在第 二表中总结了研究结果。我们和许多实验室广泛研究了对鼻内LPS灌输的穆林反应，其特点是肺中性粒细胞的快速招募，其峰值在6-24小时之间，随后，分辨率开始生效。最近，我们已表明，仅亚临床O3（ 在0.05ppm为2 h）就可诱发C57BL/6NJ亚株15的显著肺损伤，其特点是肺血管隔间中嗜中性粒细胞的分割，而BAL中观察到受损的巨噬细胞和碎屑，从而表明O3的炎症潜力。在该模型中，我们观察到由于O3 诱导的肺上皮损伤和肺巨噬细胞引起的噬细胞形成，在肺室中没有嗜中性粒细胞。我们不仅在O3 模型中观察到细胞外DNA和碎片，BAL巨噬细胞体也具有畸形，与高IL-16水平相关，这是一种通常由垂死的嗜中性粒细胞释放的警报素。因此，重要的是要了解这些亚临床O3 水平是否可以影响免疫反应，否则强大的C57BL/6J亚应变，如超生理O3 级21所指出。我们观察到，结合O3 和鼻内细菌内毒素诱导中性粒细胞在肺和系统舱的招募，其特点是BAL、肺血管灌注、胸骨和股骨骨髓隔间中存在受损的嗜中性粒细胞，从4小时开始，在24、36和72h时保持高位。细胞损伤表现为皮质作用和跛脚皮质损失，以及BAL白细胞细胞细胞大小增加：在BAL舱中分析的嗜中性粒细胞对微管、ATP合成酶复合V亚单位α（ATP®）和活性线粒体污渍的正反应显著降低。肺通过调节细胞ATP合成酶复合V亚单位β（ATP+）以及ATP®配体、血管他汀（表2）的表达来适应这种联合暴露。
研究炎症的一个重要方面是了解细胞坏死以及化学素梯度。有趣的是，白细胞总数没有不同，除了在外周血液和股骨骨髓室。这些观察导致我们研究细胞细胞骨质模式，大小和免疫嗜血。我们观察到BAL细胞中跛脚足症和活性线粒体的丧失，表明细胞损伤。皮质作用组织是细胞间信号及其障碍特性的一个基本特征。因此，当坏死没有那么明显时，细胞骨质混乱是细胞损伤的良好标志。即使在36小时，BAL细胞也损害了血浆膜，正如同质体染色所表明的那样。在联合暴露后，BAL中的嗜中性粒细胞立即显示出Gr1的积极性，但对CD11b来说本质上是负面的污渍，CD11b对前缘有局部作用，在22号腹膜隔膜爬行中具有辅助作用。因此，合并暴露导致缺乏CD11b蛋白质的非典型嗜中性粒细胞的积累。LPS 不会导致 CD11b 的放松管制。因此，此功能可能是 O3 诱导中性粒细胞损伤的结果。
BAL细胞具有独特的蛋白质特征，NK1.1、Ki-67和ATP+在24h染色，而0h（表2）。与0小时（表2）相比，BAL细胞在24小时和36小时时具有较高的Gr1、CX3CR1和血管他汀的表达。这些发现得到了证实，在接触后（表2）中，BAL中24和36小时存在越来越多的GR1阳性嗜中性粒细胞。NK1.1、CX3CR1和Gr1正细胞在24小时内的存在表明BAL中单核细胞和多态核细胞的招募。 在单核细胞中，CX3CR1正细胞在36h时占主导地位，表明存在间质巨噬细胞、血小板或单细胞衍生巨噬细胞。将 Ki-67 和血管他汀作为标记物，分别在 BAL 中通报了扩散与抗血管生成环境。因此，O3和LPS的合并暴露导致可能巨噬细胞的增殖，随后由于嗜中性渗透而产生抗血管生成环境。ATP® 染色量的短暂增加可能表明对 BAL 白细胞在 24 h 时生存率增加的重要适应。必须指出，ATP®可以与血管他汀结合，抑制长期生存6，23，这实际上反映在较低的Ki-67指数在36小时后暴露。
虽然BAL蛋白最高为36h，而不是其他时间点，但肺血管灌注剂在接触前后没有显示蛋白质浓度的任何变化。血管隔间可能没有受到影响，但很可能由于O3诱导的自由基和由此产生的表面活性蛋白（SP-A、SP-B）的氧化以及血管泄漏24、25、26等富含电子的氨基酸而混淆。BAL IgM、BAL表面活性蛋白、BAL白蛋白或染料外流（使用埃文斯蓝色或荧光乙异氰酸酯（FITC）除蜡素）的量化是评估上皮和内皮完整性的替代方法。
有趣的是，肺血管灌注水平的eotaxin-2和IL-2在4小时的时间点急性提高。BAL eotaxin-2 和 IL-2 水平在暴露后显著降低，表明肺部空间或肺血管内的陷附退化。在肺血管灌注中分析的更多化疗因子显示，嗜血杆菌化学素（eotaxin-1），TNF®， IFNγ，淋巴结衍生单核细胞化疗因子（CX3CL1，CXCL10，CCL27，MIP3+），上皮衍生中性粒细胞化学碱（CXCL5），和警报素（IL-16）释放后，中性粒细胞27的二次坏死，但只有4小时后暴露。在36小时，骨髓衍生的泛白细胞化学素，SDF1+28，在肺血管灌注更高。骨髓衍生的SDF1®浓度与细胞学发现相关，CD11b和Gr1阳性细胞在暴露后24和36小时内非常丰富。因此，化学素和细胞学特征反映了骨髓室中大量白细胞的动员（表2）。
我们的动物模型和研究结果是至关重要的，记住现实世界的情况，即生活在城市环境中的生物可能暴露在这种亚临床O3和感染剂8。我们的murine模型是一个容易获得的原型，可以在2级遏制实验室复制，用于研究肺和肺外侵入性细胞死亡和感染机制，就像COVID-19感染29一样。未来的研究应针对可视化修复或后期随访以及慢性暴露，以调查长期细胞适应。因此，对于涉及活体器官15和动物16、30、31成像技术的全面肺炎症研究，目前的终点研究设计可以提供对联合低剂量O3（细胞死亡）和LPS（免疫刺激）的宿主反应的重要见解，从而破译急性肺损伤的机制。
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Disclosures
作者没有利益冲突或披露。
Acknowledgments
这项研究由国家核创新委员会主席的赠款以及西尔维亚·费多鲁克加拿大核创新中心的启动资金资助。西尔维亚·费多鲁克加拿大核创新中心由萨斯喀彻温省创新中心资助。荧光成像是在WCVM成像中心进行的，该中心由国家SERC资助。杰西卡·布罗科斯（理学硕士学生）和曼普雷特·考尔（硕士生）由西尔维亚·费多鲁克加拿大核创新中心的启动基金资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 33-plex Bioplex chemokine panel | Biorad | 12002231 | |
| 63X oil (NA 1.4-0.6) Microscope objectives | Leica | HCX PL APO CS (11506188) | |
| Alexa 350 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11045 | |
| Alexa 488 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11002 | |
| Alexa 488 conjugated phalloidin | Invitrogen | A12370 | |
| Alexa 555 conjugated mouse anti-α tubulin clone DM1A | Millipore | 05-829X-555 | |
| Alexa 568 conjugated goat anti-hamster IgG (H+L) | Invitrogen | A21112 | |
| Alexa 568 conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Invitrogen | A11077 | |
| Alexa 633 conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A21070 | |
| Armenian hamster anti-CD61 (clone 2C9.G2) IgG1 kappa | BD Pharmingen | 553343 | |
| C57BL/6 J Mice | Jackson Laboratories | 64 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | Leica TCS SP5 | |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Invitrogen | D1306 | aliquot in 2 µl stocks and store at -20°C |
| Inverted fluorescent wide field microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Ketamine (Narketan) | Vetoquinol | 100 mg/ml | Dilute 10 times to make a 10 mg/ml stock |
| Live (calcein)/Dead (Ethidium homodimer-1) cytotoxicity kit | Invitrogen | L3224 | |
| Mouse anti-ATP5A1 IgG2b (clone 7H10BD4F9) | Invitrogen | 459240 | |
| Mouse anti-ATP5β IgG2b (clone 3D5AB1) | Invitrogen | A-21351 | |
| Mouse anti-NK1.1 IgG2a kappa (clone PK136) | Invitrogen | 16-5941-82 | |
| Pierce 660 nm protein assay | Thermoscientific | 22660 | |
| Rabbit anti-angiostatin (mouse aa 98-116) IgG | Abcam | ab2904 | |
| Rabbit anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880) | Invitrogen | 14-6093-81 | |
| Rat anti-Ki-67 (clone SolA15) IgG2a kappa | Invitrogen | 14-5698-82 | |
| Rat anti-Ly6G IgG2a kappa (clone 1A8) | Invitrogen | 16-9668-82 | |
| Rat anti-Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b kappa (clone RB6-8C5) | Invitrogen | 53-5931-82 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block (clone 2.4G2) | BD Pharmingen | 553142 | |
| Reduced mitotracker orange | Invitrogen | M7511 | |
| Xylazine (Rompun) | Bayer | 20 mg/ml | Dilute 2 times to make a 10 mg/ml stock |
References
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