Summary
オゾンと細菌性内毒素を組み合わせたマウスは、好中球を含む広域細胞死を示す。細胞骨格ラメリポディアの破壊、気管支-肺胞洗浄における複雑なV ATPシンターゼサブユニットβおよびアンジオスタチンの細胞発現の増加、肺免疫応答の抑制および好中球の遅れなど細胞適応を観察した。
Abstract
肺は、無菌(粒子または反応性毒素)および感染性(細菌、ウイルスまたは真菌)の炎症状態の形で直接的および間接的な侮辱に絶えず直面している。圧倒的な宿主応答は、呼吸の低下および急性肺損傷をもたらし、これは病理論理的宿主免疫、凝固および組織改修応答の結果として肺好中球の募集によって特徴付けられる。マウス肺の細胞適応を可視化し定量化する敏感な顕微鏡的方法は、低用量(0.05ppm)オゾンに応答して、細菌リポ多糖と組み合わせた強力な環境汚染物質、TLR4アゴニストであり、宿主の炎症および修復メカニズムを理解するために極めて重要である。各種肺および全身体区画、すなわち気管支肺胞洗浄液、肺血管透過液、左肺凍結切片、および胸骨骨髄透過液の包括的な蛍光顕微鏡分析について述べています。我々は、肺胞マクロファージ、好中球、肺の核組織、ならびに骨髄細胞と、分析された区画内の離散ケモカイン勾配によって特徴付けられた遅延(最大36〜72時間)の免疫応答と相関する骨髄細胞の損傷を示す。また、肺外細胞マトリックスおよび細胞細胞細胞骨格相互作用(アクチン、チューブリン)、ミトコンドリアおよび活性酸素種、抗凝固性プラスミノーゲン、抗血管新生ペプチド断片アンジオスタチン、ミトコンドリアATPシンターゼ複合体Vサブユニット、αおよびβを提示する。これらの代理マーカーは、 生体外 細胞ベースのアッセイおよび 生体内 動物イメージング技術(生体内顕微鏡など)を十分に補えば、新しい免疫調節剤に対する肺応答を理解するための重要な情報を提供できる。
Introduction
急性肺損傷(ALI)は、血液凝固、線維性および自然免疫系の同時活性化によって特徴付けされる感染性または他の有害な刺激に対する肺の重要な病理学的応答である1。好中球は、トール様受容体(TLR)ファミリー2、3、4を介して微生物と細胞内損傷パターンを速やかに感知する。好中球は、前形サイトカインおよび細胞傷害性顆粒内容物を放出し、その後、副次組織損傷を引き起こす可能性がある。続く歯槽の損傷は、アデノシン三リン酸(ATP)5などの分子の放出をもたらす二次細胞死と結婚し、免疫調節不全の悪循環に陥る。
ALIの理解における未解決の問題は、歯槽膜内で傷害がどのように開始されるかという問題に関連する。電子輸送複合体V、F1F0 ATP合成酵素は、炎症時に細胞(内皮、白血球、上皮を含む)の細胞上で、遍在的に発現することが知られているミトコンドリアタンパク質である。アクチンとチューブリンで構成される細胞骨格は、ミトコンドリアタンパク質と同様に、多くの細胞形状および機能調節を収容する。我々は最近、内因性分子によるATP合成酵素の遮断が、アンジオスタチン、無音性好中球の募集、活性化およびリポ多糖(LPS)が肺炎症を誘発したことを示した。したがって、生化学的(ATP合成酵素)と免疫(TLR4)の両方のメカニズムは、肺の炎症時に歯槽バリアを調節する可能性があります。
オゾン(O3)への暴露は、環境汚染物質、肺機能の低下、肺機能の低下、肺感染症への感受性の増大、およびO3曝露の短い低レベルは、基礎となる心呼吸状態7、8、9、10、11、12、13、14の死亡率のリスクを高める。従って、O3の生理学的に関連する濃度への暴露は、炎症7、8の基本的なメカニズムを研究するALIの有意義なモデルを提供する。私たちの研究室は最近、低用量O3誘導ALI15のマウスモデルを確立しました。低O3濃度に対して用量および時間応答を行った後、我々は、2時間の0.05 ppmO3への曝露が、LPSモデルと同様の肺ATPシンターゼ複合体Vサブユニットβ(ATPβ)およびアンジオスタチン発現によって特徴付けられた急性肺損傷を誘発することを観察した。インビタル肺イメージングは肺の損傷を示す肺胞アクチンマイクロフィラメントの解体を明らかにした、 そして、肺胞中隔反応性酸素種(ROS)レベルのアブレーション(ベースライン細胞シグナル伝達の省略を示す)およびミトコンドリア膜電位(急性細胞死を示す)を2時間暴露した後、異種肺18FDG保持16と相関した0.05 ppm O315に曝露し、好中球のリクルートおよびサイトカイン放出、最もILDF-16と16の放出を伴わない。私たちの最近の研究からの持ち帰りメッセージは、O3が人間の暴露のために8時間(1日あたり)にわたって0.063 ppmの許容限界を下回る濃度で暴露されると指数関数的に高い毒性を生み出すということです。重要なことに、これらのサブ臨床O3曝露が細菌内毒素17などによってTLR4媒介機構を調節できるかどうかについては、明確な理解は存在しない。そこで、デュアルヒットO3およびLPS曝露モデルを研究し、免疫および非免疫細胞適応を観察した。
各種肺および全身体区画、すなわち気管支肺胞洗浄液(すなわち、 BAL)肺胞空間をサンプリングするBAL)、肺血管穿孔体(すなわち、LVP)が肺血管構造および肺胞中隔間質を凝視し、内皮障壁が損なわれた場合に、左肺凍結管、ラビン肺組織に残された常駐の腹膜および付着性白血球を調べた。、循環性白血球を表す末梢血および胸骨および大腿骨骨髄は、それぞれ炎症時に造血細胞動員の近位および遠位部位をサンプリングする。
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Protocol
この研究デザインは、サスカチュワン大学の動物研究倫理委員会によって承認され、人道的動物使用に関するカナダ動物ケアガイドライン評議会に遵守されました。生後6-8週齢の雄C57BL/6Jマウスを調達した。注:予定された終点の前に重度の無気力、呼吸困難または重度の苦痛の他の徴候を発症する動物を安楽死させる。
注:次の準備:27-18 G針鈍(マウス気管径に依存する)、鈍い針に合わせて適切なサイズのPEチューブ(すべてのマウスにPEカニューレを作る)、カニューレ、 2つの鋭いはさみ、2つの鈍い鉗子(小さい)、1つの鋭い鉗子(小さい)、3 1 mLの注射器、ラベル付きマイクロフュージ管(BAL、血液、血管および骨髄のパーズートコレクションのため)および標識されたバイアル(組織固定用)、組織採取のためのサンプル袋/クライオビアル、肉屋の綿糸ロール(適切なサイズの合字にカット)。実験に利用されるすべての化学物質は、 材料表に示されています。
1. ネズミ肺損傷誘導のためのオゾンおよびLPS暴露
- オゾン暴露
- カスタムO3 誘導ボックスを準備します。マウスフィード、水筒、濃縮玩具、清潔な寝具を順番に追加し、マウスの住宅環境を模倣します。
注:これらの手順は、マウスがカスタム誘導ボックスに収容されたときに食べ物や水に自由にアクセスできることを保証し、過度のストレスを軽減するのに役立ちます。 - O3 キャリブレータ/ジェネレータ"ON"を切り替えて(入口ポートに向かって配置)、UVランプを手前(露出前の約15分)に安定化させ、インラインO3 モニタで接続します。
注:O3 モニターは、一定のチャンバー空気温度(72±3°F)および相対湿度(50±15%)で出口からサンプリングされた平均0.05ppmを読み取る必要があります。 - O3 曝露の場合、マウスをカスタム誘導ボックスにそっと配置し、マウスを0.05 ppmO3 に2時間連続的に曝露する。
- カスタムO3 誘導ボックスを準備します。マウスフィード、水筒、濃縮玩具、清潔な寝具を順番に追加し、マウスの住宅環境を模倣します。
- 麻酔および鼻腔内LPS投与
- ケタミンとキシラジンの10mg/mLストックを別途準備します。
- ケタミン20部とキシラジン1部を混合してカクテルを準備します。マウスの重さがXgの場合は、(X/200)mLのケタミン/キシラジンカクテルを腹腔に注入します。1本のマウスに対して、10mg/mLケタミンストック1000μLとキシラジンストック50μLからなるカクテル1mLを調製します。マイクロフュージチューブで上下にピペットを入れ、よく混ぜます。
注:ケタミンとキシラジンの在庫は、1週間前に準備することができます。 - 軽い腹腔内(IP)ケタミン(50mg/kg)/キシラジン(1mg/kg)の混合(例えば、25gマウスの場合、カクテルの0.125mLを注入する)の下でマウスを麻酔する。
- LPSの1mg/mL溶液を生理液で調製し、50μLの溶液をピペットで充填します。
- マウスを手のひらの後ろ側/背側で直立し、同じ手で耳を持ちます。さて、50μLのLPS溶液18 を鼻孔の外に穏やかに置き(すなわち、各鼻孔に25μL、1つの鼻孔に50μL、手順が速い限りは問題ではない)、マウスがLPS溶液を吸入することを可能にする。
- 50 μLの滅菌生理液を含むマウスを植え付ける。
注意: 点心のために100 μLを超えないようにしてください。ボリュームが少なすぎると(すなわち、<50 μL)、鼻の沈着のみというリスクがあります。 - LPS投与後、頭をわずかに下に傾けた寝具のマウンドの上に、お腹や背中にそっとマウスを置きます。
注:この向きは、鼻腔19内の溶液の保持を延長します。 - 暴露後0、2、4、24、36、72時間で、ケタミン(200mg/kg)/キシラジン(4mg/kg)ミックス(すなわち、X/50 mLのカクテル)ミックス(すなわち、X/50 mLのカクテル、Xはマウス体重がグラムまたは25gで0.50mL)でマウスを麻酔する。
- マウスが意識を失い、右反射(すなわち、上に置かれたときに引き返さない)まで観察する。さて、1〜2分後に著しく落ちるはずの呼吸(リズミカルな胸の遠足)と心拍数を監視することによって、麻酔の深さについてマウスをチェックしてください。
- 次に、ペダル反射、すなわち、後肢の数字のいずれかをつまんで、反射として、手足の後退を観察するために確認してください。マウスが反応する場合は、必要に応じて、追加の 0.1 mL 注射以上でトップアップします。
注:深部麻酔を行うために、特定の株や肥満マウスは通常、分布の量が多いため、完全な麻酔(約10分以上)を許可しない場合は十分な時間を簡単に過剰に行うことができます。したがって、いくつかの株は麻酔に耐性があり、したがって、より多くのトップアップを必要とすることができます。この知識は、様々な系統および年齢のマウスに関する多くの実用的な観察と経験の後に取得されます。O3およびLPS露光の直後(すなわち、2時間の時点で)のパイロット実験もいくつか行われたので、我々はまた、これらの実験からのいくつかの非常に初期のBAL細胞分析を含み、O3とLPSの併用による即時の効果を強調した。
2. サンプルコレクション
- 外科用トレイにマウスを置きます。今、穏やかに液の損失を避けるために両方の目に潤滑目軟膏を置き、70%エタノールスプレーでマウスを消毒します。
- 気管と胸郭を露出させるために、はさみで上下の皮膚膜を小さく切り裂きます。
- 胸骨のすぐ下にカットを行い、心臓を露出します。
- 心臓穿刺
- ヘパリン化された注射器に取り付けられた25G針を右心室に入れ、心臓穿刺で血液を引き出す。
注:心臓を心臓穿刺に曝す時間が1分以内の場合、血液は通常、最小限のプランジャードローで引き出されます。約0.4〜0.5 mLを収集した後、残りの血液を収集する前に数秒間一時停止する必要があります。これは、心臓が右心室室に任意の残りの体積をポンプできるように行われます。採血の終わりまでに、心臓はポンプに停止します。 - 血液を収集し、さらなる処理のためのマイクロフュージチューブに保存します。
- ヘパリン化された注射器に取り付けられた25G針を右心室に入れ、心臓穿刺で血液を引き出す。
- 気管 切開
- ピンセット/鈍い鉗子を慎重に使用して、上の組織から気管領域を取り除きます。出血を避けるために、手術器具よりも手袋をした手を使用してください。多くの血液がにじみ出ている場合は、BALサンプルを汚染する危険性があります。好ましくないが、必要に応じて綿棒を使用してください。キムワイプはより良い選択肢です。
- さて、肺を露出させるために胸部を切り裂きます。ここでも、胸骨や肋間動脈や上大動脈を切断しないように 注意 してください。リブケージを進めながら小さな切り傷を作る)
- 気管切り取り口の下に綿の合字を渡し、当分の間そのままにしておきます。
- 遠位1/3rd部分の適切な位置で気管を切り取り、肺を指し示し、28G気管カニューレにアクセスできるようにする。
- 気管に28 G PEカニューレ(3-5 mmの最小の長さと挿入を容易にするためにトリム遠位端)を挿入します。分岐する前に気管の終わりに気をつけてから、1本のローブだけをサンプリングしないようにmmほど引き戻します。
- しっかりと、カニューレを所定の位置に保持するために綿の合字を結びます。カニューレを折り畳まないで下ろしてください。
- 気管支肺胞洗浄(BAL)
- 1 mL の注射器に 0.5 mL の PBS を充填します。
- 今徐々に1 mLの注射器の助けを借りてカニューレにPBSの0.5 mLを注入します。
- PBSを注入した後、吸引に抵抗しない限り注射器を吸引する。
注:BAL液を吸引している間に抵抗がある場合、それは肺胞または気管支組織の崩壊を示す。その場合、カニューレを小さな形で引き戻し、カニューレを組織の壁に取り外す。 - 標識されたマイクロフュージチューブに吸気液を採取し、氷の上に置きます。
- 同じバイアルで収集同様の方法で2つのより多くの洗浄を実行します(すなわち、0.5 X 3 = 1.5 mLの洗浄の合計)。
- 集めたBAL液の体積を測定します。洗浄の回復は90%に近いはずです。
- 肺血管透過物(LVP)
- 右心室を通して浸透しながら肺のパーフューズのバックアップを避けるために、胸部と腹部の半分の間の場所で下降胸部大動脈を切断します。
- 切り取られた大オルタの端の近くの空洞を、血液を含まないブロット。
- 次に、右心室を通して注入された室温ヘパリン化生理食い物の0.5 mLで肺を浸透する。
- 下降胸部大動脈の切り取り端にある空洞から血管透過液を採取し、マイクロフュージチューブに入れ、その体積を測定する。
- 右気管支の近位を気管から分岐(綿糸付き)にリゲートします。
- 左肺固定の場所で
- 1 mL シリンジを気管カニューレに接続します。
- 0.6 mLのマークまでシリンジに空気を引き戻します。
- その後、残りのシリンジ(最後まで)を室温で2%パラホルムアルデヒドで満たします。プランジャーがカニューレから空気を吸い戻すことなく飛び出す準備ができていることを確認してください。
- 次に、シリンジにスコッチテープを貼り付け、高さ20cmまで測定した直立容器に貼り付けます。
- 静かに、気管に向かって固定剤が流れるにはプランジャーを引き出します。カニューレに気泡が少しある場合は、シリンジの上にプランジャーをそっと置くと、数秒後に流体が流れ始めます。
- 左肺を20cmの水柱を形成する20cmの高さから5分間、 その中でその総容量に膨らませます。
- この手順の間、下流のアッセイに影響を与えるため、右肺葉がパラホルムアルデヒドと接触するのを防ぐようにしてください。
- 折り畳まれた実験室組織を置き、右肺葉に接触する可能性のあるパラホルムアルデヒドを吸収する。
注意:パラホルムアルデヒドは非常に有毒です。したがって、身体の露出部分を吸入したり、接触させたりしないでください。取り扱い中は細心の注意を払ってください。 - パラホルムアルデヒドの内在時に、腹部を消毒する。
- 右肺ローブを気管から切り取り、スレッドを除去し、すぐにローブをラベル付きのクライボビアルに入れ、下流分子/生化学的サイトカイン分析/肺ホモゲネートのRT-PCR/ウェスタンブロット分析のために液体窒素に落とします。
- 慎重に任意の結合組織または胸膜のための左肺をトリミングし、4 °Cで24時間の2%パラホルムアルデヒドに浸します。
- 標準埋め込みプロトコルに従って、固定肺をパラフィンに埋め込む。
注意: 肺サンプルを過熱しないでください。 - 腹部部分を切り、骨盤(股関節)の骨から脱皮する。
- 骨盤部分から左右の大腿骨の骨を分離し、氷の上に保管された生理食音で満たされたシャーレで。
- 胸骨および大腿骨骨髄吸引物コレクション
- 実験室の組織を使用して骨から組織と筋肉をきれいにします。
- 腹側胸部と胸骨を、氷の上に保管されている生理食動物で満たされたペトリ皿に集めます。
- 胸骨と大腿骨の遠位と近位の先端を切ります。
- 1 mLの注射器に十分に取り付けられた針(24〜28 G)を使用して、0.5 mLの生理食音で骨を4回浸透させ、各骨の分画をフィルターを取り付け、氷の上に置かれたラベル付きチューブに集めます。
注: 針ゲージは動物のサイズによって異なります。紅潮後、大腿骨は透明に表示されます。 - サンプルが採取されたら、マウスをビニール袋に入れ、適切な処分のために動物の死体冷凍庫に入れます。
3. サンプル処理
- 合計 (TLC) および差動 (DLC) 白血球数
- 遠心分離末血、BAL、肺血管透過物、骨髄(胸骨および大腿骨)サンプルを500gで10分間用いた。
- 上清を収集し、フラッシュはそれらを凍結し、さらなる分析まで-80°Cでそれらを保存します。
- 200 μL以上のPBSで細胞を再構成します。
- 血球計上のBAL、血液、肺血管透過物および骨髄細胞を数えることによってTLCを行う。
- カルセイングリーンと赤エチジウムホモジマー-1の1 μLミックスを含むBALの別の9 μLアリコートを染色し、細胞内エステラーゼ活性と、血漿膜完全性の喪失による損傷したBAL細胞(赤)による生きた(緑色)細胞を定量化します。
- 2%の酢酸をRPCをlyseに加え、血液TLCの1:10比、肺血管パーフューゼートTLCの1:2比で添加する。
注意:濃度が1mL当たり1x106 細胞(骨髄サンプルにとって非常に重要)である場合は、PBSで希釈することによって細胞濃度を調整します。 - DLcの下で説明するように、スライドと汚れ上の細胞スピンを調製するために細胞を遠心分離します。
メモ:通常、1つのスライドに2つのサイトスピンを準備することができます。そして、10~15分間の空気乾燥後、染色工程を進める。 - 収集したBALをグループごとに3匹のパイロットマウスからそれぞれ2つのサイトスピンに分割し、活性酸化リン酸化(還元ミトトラッカー)でアクチン/チューブリンとミトコンドリアを染色します。さらに3匹のマウスのBALを利用して、それぞれ2つのサイトスピンに分け、NK1.1/Gr1/CX3CR1およびATPβ/Ki-67/CD61/アンジオスタチン染色スライド。BALを3匹のマウスからそれぞれ2つのサイトスピンに分割し、ATPα/Ly6GおよびCX3CR1/Siglec-Fの染色を行います。
- 気管支肺胞洗浄(BAL)および肺血管パーフサテ(LVP)総タンパク質定量
- O3およびLPS誘発された血管障壁の摂動または2つの肺区画における相対的な腫瘍圧(すなわち、肺胞中隔(間質)および肺血管透過体(血管)コンパートメントを定量するために、採取された流体中の全タンパク質含有量を測定する。
- 標準的な洗剤耐性の着色アッセイを使用して、その総タンパク質濃度の解凍された上清分を分析します。
- 気管支肺胞洗浄(BAL)および肺血管透過物(LVP)ケモカイン分析
- 次に、33プレックスの磁気ビーズベースの免疫測定法を用いて、BALおよび肺血管透過物(LVP)上清中のケモカインを解析する。これは、結合露光後に確立された気道/インタースティジウム対血管ケモカイン勾配の方向性について通知します。
- Analyze the following panel of chemokines : CXCL13 (B-lymphocyte chemoattractant), CCL27 (IL-11 R-alpha-locus chemokine (ILC)), CXCL5 (epithelial-derived neutrophil-activating peptide 78 (ENA-78)), CCL-11 (eotaxin-1), eotaxin-2 (CCL-24), CX3CL1 (fractalkine), GM-CSF (CSF-2), CCL1, IFNγ (interferon gamma), IL-10 (interleukin-10), IL-16 (interleukin-16), IL-1β (interleukin-1 beta), IL-2 (interleukin-2), IL-4 (interleukin-4), IL-6 (interleukin-6), CXCL-10 (interferon gamma-induced protein 10 (IP-10)), CXCL11 (Interferon-gamma-inducible protein 9 (IP-9)), KC (keratinocyte chemoattractant), MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1), MCP-3 (monocyte chemoattractant protein-3), MCP-5 (monocyte chemoattractant protein-5), MDC (macrophage-derived chemokine (CCL22)), MIP-1α (macrophage inflammatory protein-1 alpha), MIP-1β (macrophage inflammatory protein-1 beta), MIP-2 (macrophage inflammatory protein-2), MIP-3α (macrophage inflammatory protein-3 alpha), MIP-3β (macrophage inflammatoryタンパク質-3β)、RANTES(活性化に調節され、正常なT細胞発現および分泌(CCL5))、CXCL-16、CXCL-12/SDF-1α(間質細胞由来因子1)、TARC(胸腺および活性化調節ケモカイン(TARC))、TECK(胸腺発現ケモカイン(CCL25))およびTNF(腫瘍因子α)。
4. 細胞スピン染色と肺の細胞
- 細胞スピン生化学的染色
- 疎水性ペンでサイトスピンを囲み、処置中にインキュベーション用の化学物質を含む。
- 5分間PBSで細胞スピンを水分補給します。
- 2%パラホルムアルデヒドで細胞スピンサンプルを10分間固定し、それぞれ5分間PBSで3回洗浄します。
- 7分間70%のアセトンを氷冷で透過し、再びPBSで3回、それぞれ5分間洗浄します。
- アクチンとチューブリンまたは還元されたミトトラッカー(緑色で示すアレクサ488コンジュゲートファロイジンの2μg/ 50 μLの混合でインキュベート、および2μg/μLのAlexa 555コンジュゲートマウス抗αチューブリンまたは還元されたミトトラッカーを赤で示す)
注:マウスIgG1アイソタイプ対照抗体を別のサイトスピンで使用して、チューブリン染色プロトコルを検証します。4.1.1 から 4.1.8 まで説明されているのと同じ手順を実行しますが、アイソタイプ コントロールの場合は同じ手順を実行します。 - スライドからミックスをそっと傾けることで汚れを取り除きます。DAPI(4′,6-ジミディノ-2-フェニリンドール)でスライドを5〜10分間インキュベートして核を染色します。
- サイトスピンをPBSで3回洗浄し、それぞれ5分間、アンチフェードマウントメディアでカバースリップし、イメージング前に室温で暗い場所で一晩保管します。
- 科学カメラを搭載した広視野直立顕微鏡で画像を取得します。スライドをイメージングする際に、異なる蛍光チャンネルに設定されたカメラ露出時間を一貫して確保します。
- 細胞スピン免疫蛍光染色:
- 疎水性ペンでサイトスピンを囲み、処置中にインキュベーション用の化学物質を含む。5分間PBSで細胞スピンを水分補給します。
- 2%パラホルムアルデヒドで10分間インキュベートして細胞スピンサンプルを固定し、それぞれ5分間PBSで3回洗浄します。
- 0.1%冷たいトリトンX-100で2分間透過し、それぞれ5分間PBSで3回洗浄します。
- 次に、Fcブロックは、Fcブロック抗体ストックの1:50希釈でサイトスピンをインキュベートして15分間(一次マウス抗体がマウスFc抗体と非特異的に交差反応しないようにするため)である。
- スライドにヒントを与えてFcブロックを取り除き、目的とする3つの一次抗体を混合してサイトスピンを1%BSAに変更し(様々な組み合わせについては 表1 参照)30分間インキュベートします。
注:我々の最近の研究20で説明したように、isotype対照抗体(ステップ4.2.1〜4.2.9を実行し、抗体をアイソタイプコントロールに置き換えることによって、マウスIgG1とラットIgG2bカッパ一次抗体を併用してインキュベートする)を、対応する二次抗体と並行して実行してください。 - PBSで3回、それぞれ5分間洗います。適切に設計された二次抗体を混合してサイトスピンをインキュベートする(詳細は 表1 参照)。
- スライドからミックスをそっと傾けて汚れを取り除き、核を染色するために5〜10分間DAPI(4′,6-ジミジノ-2-フェニリンドール)でインキュベートします。PBSで3回、それぞれ5分間洗います。
- アンチフェード取り付けメディアでカバースリップし、イメージングの前に室温で暗い中で一晩保存します。
- 科学カメラを搭載した広視野直立顕微鏡で画像を取得します。スライドのイメージング時にすべての蛍光素チャネルに設定されたカメラ露出時間を一貫して確保します。
- ヘマトキシリンとエオシン(H&E)の病態
- すべてのグループの肺クライオセクションで修正されたH&E染色3 を行う。
- 画像解析
- フィジーのImageJオープンソフトウェア(https://imagej.net/Fiji/Downloads)で画像データ(.tiff)ファイルを処理し、分析します。
- 必要なパラメータ (面積、周長、統合密度、形状記述子、フェレットの直径、円形度、表示ラベル) を [解析 ]タブと [測定を設定]の下に記録することを確認します。
- ROI マネージャを使用して、マージされたイメージ パネルの 50 ~ 200 個のセルを手動で「フリーハンド選択」ツールを使用してアウトラインを作成します。Ctrl+Tコマンドを使用して対象領域 (ROI) を保存し、各セルの保存された ROI をすべてのフルオロフォア チャネルにコピーします。
- 次に Ctrl+M を押して、すべての蛍光チャネル(例えば、405 nm(青でDAPIまたはATPβ)、488nm(緑色のアクチンまたはNK1.1またはKi-67)、568nm(赤でチューブリンまたはGr1またはCD61)および633nm(CX3CR1またはアンジオスタチン中のママ)の事前設定パラメータを測定する。
- 解析を表す適切な名前で結果.csvファイルとして保存します。.csvファイルの結果をスプレッドシートにコピーし、染色された分子の蛍光強度(FI)(結果ファイルの生の統合密度列)をDAPIまたはCD61 FIの場合、染色設計に従って分割します。これらの比率は、「DAPIまたはCD61正規化FI比」と呼ばれます。
- 次に、これらの正規化比率、円形度、細胞周囲およびフェレット径をプロットし、O3 とLPSを合わせた後の細胞サイズの変化を評価する。
- 適切な統計ソフトウェアを使用して、収集したデータの正規性を確認し、帰無仮説を検定します(以下の統計分析セクションを参照してください)。
- 統計分析
- SEM±平均として結果を表現します。1群につき少なくとも3匹のマウスを使用した。
- ケモカインデータ解析では、ベンジャニとホシュベルク補正に従って、誤検出率の一方向ANOVA p値を調整します。
- これらのデータが正常に分布していなかったので、画像パラメータ、細胞性、フェレット径、周長、DAPIまたはCD61正規化蛍光強度比をMann-Whitney U検定(2つのグループを比較するため)またはクルスカルウォリス試験(複数群を比較するため)による分析。
- 残りのイメージング実験では、一方向分散分析を使用して結果を分析し、その後にSidakの多重比較を行います。p値<0.05は有意であると考えられた。
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Representative Results
O3およびLPS曝露を組み合わせることで、72時間で全身性炎症および骨髄動員が発生する:異なるコンパートメントにおける細胞数は、末梢血の有意な変化を明らかにし、大腿骨骨髄総細胞数はO3およびLPSを合わせた。O3とLPSを合わせた露光は総BAL(図1A)またはLVP(図1B)の細胞数に変化を起こさなかったが、多形核細胞は24(図1F、補足図1)、36及び72時間で主要な細胞型として提示された。24時間BALサイトスピン画像で多形核細胞にSiglec-fおよびCX3CR1染色がないことに注意してください(図1F)。BALサイトスピンのトリプルDAPI/CD11b/Gr1染色は、0hのマクロファージである大きなCD11b-およびGr1陽性単核球の存在を示し、これは穿刺Gr1stainingを示すが、CD11b染色を4hで欠いている小さな多形核細胞に変化する(補足1Fのインセットに示すように)。BAL細胞の大部分は、CD11bおよびGr1の両方に対して多形核および陽性であり、露光後24時間(補足図1)である。
マウスは24時間(3.3倍対0h、p<0.05、 図1C)で全身白血球減少症を示し、 続いて白血球減少症は末梢血の24h(p<0.01)と4h(< p<0.01)と比較して13倍低く示された。胸骨骨髄細胞は、0hと比較した場合、またはO3 とLPSを併用した後も変化していない(図1D)。大腿骨骨髄数は、0h(p<0.01, 図1E)と他の時点(p<0.01, 図1E)と比較した場合、72時間で28.8倍のスパイクが遅れている。LVPの可視化、および大腿骨骨髄細胞だけでなく胸骨もまた、大腿骨の骨髄細胞も、主に多形核細胞に対する細胞型の変化を示した(補足図1)。胸骨骨髄細胞は、細胞外核物質によって証明されるように損傷の徴候を示した。大腿骨骨髄は、CD11bおよびGr1陽性細胞の数が多いことを示した(補足図1)、これは細胞数と一致する。
BAL総タンパク質含有量は、O3とLPSを合わせた後36時間で最も高かった:LVP及びBAL区画中の全タンパク質の定量化は、オゾン誘導肺浮腫すなわち、結合された曝露による血管及び上皮バリア障害による血漿タンパク質滲出を相関させるために行った。BAL総タンパク質は、4h(図2A)と比較して36時間(p<0.05)で4.5倍高かった。しかし、LVPタンパク質は暴露後に変化はなかった(図2B)。
O3およびLPS曝露は、BALではなく肺血管区画に強いケモカイン勾配を誘導する:ケモカイン多重アッセイはBALおよびLVP上清の両方に対して行われた。これら2つのコンパートメント間の相対的な違いは、特定のコンパートメントにおける優先的な保持を表していることに注意してください。好酸球化学誘引性エオタキシン-2は、0h(p<0.05、図3A)と比較して、LVPコンパートメントで4時間で4.3倍高かった。BALコンパートメントでは、0h(p<0.01、図3B)と比較すると、エオタキシン-2は4時間で3.2倍低かった。BALエオタキシン-2レベルは、0hと比較して12.6倍の減少で72時間まで一貫して減少し続けました(p<0.01、図3B)。リンパ球化学誘引剤IL-2は、0hと比較してLVPコンパートメントの4時間で10.1倍高かった(p<0.05、図3C)。BALコンパートメントでは、IL-2は0h(p<0.05、図3D)と比較して36時間で5.0倍低かった。BALエオタキシン-2レベルは、0h(p<0.05、図3D)と比較して72時間で一貫して5.9倍の減少を維持した。
興味深いことに、多くのケモカインはBALではなくLVPで4時間で変更された。これらのケモカインのほとんどは、後の時点と比較すると、4時間でLVPレベルの控えめな、まだ有意な増加を示した。エオタキシン-1レベルは、0hと比較すると露光後は高くはないが、24(2.7倍、p<0.05)および72h(5.0倍、p<0.01、図4A)と比較すると4時間で有意に高かった。LVP TNFαのレベルは、36h(p<0.05、図4B)と比較して4時間で3.4倍高かった。同様に、LVP IFNγは72h(p<0.05、図4C)と比較して4時間で2.9倍高かった。CX3CL1レベルは、24(1.7倍、p<0.05)、36(1.6倍、p<0.05)、および72h(2.2倍、p<0.01)と比較すると、4時間で高かった(図4D)。CCL27レベルは、24(2.7倍、p<0.05)、36(3.9倍、p<0.01)、および72h(2.9倍、p<0.05)と比較して、4時間で高いレベルを示した(図4E)。
一部のケモカインは、併用暴露後4時間でLVPに強い存在感を示し、かつ、曝露前後のBALでは変化せず、肺毛細血管からの強いケモカイン応答を示す。4時間で、IL-16 LVPレベルは0h(p<0.01)に比べて3.4倍、24h(p<0.01)に比べて3.2倍、36h(p<0.01)と比較して4.5倍、72h(p<<0.01)と比較して4.6倍であった(図4F)。4時間で、好中球ケモカイン、CXCL5 LVPレベルは、0h(p<0.01)に比べて2.0倍、24h(p<0.01)に比べて4.7倍、36h(p<0.01)と比較して2.2倍(p<0.01)および2.7倍の図(p<00.01)を合わせた後の図)4時間で、CXCL10 LVPレベルは0h(p<0.01)と比較して2.3倍、2.1倍は24h(p<0.05)、36h(p<0.01)と比較して2.5倍、組み合わせた暴露後の2.7倍<であった(図4H)。36時間で、好中球ケモカイン、SDF1α LVPレベルは0h(p<0.01)に比べて4.2倍、2.9倍は24h(p<0.05)と比較して2.8倍、併用暴露後の72h(p<0.01)と比較して6.8倍であった(図4I)。4時間で、MIP3β LVPレベルは0h(p<0.05)に比べて2.3倍、そして2.3倍の72h(p<0.05)を併用した後(図4J)。
O3およびLPS露光を組み合わせることで壊死を誘発し、細胞細胞骨格、血漿膜およびミトコンドリア完全性を破壊する:区画白血球数およびタンパク質内容物がLVPケモカイン勾配と相関していなかったため、これらのコンパートメントから得られた細胞を視覚化することがより重要となった。ベースライン(0h)BAL細胞のEx vivoアクチン/チューブリン染色は、皮質アクチン、ストレス繊維、ラメリポディア(緑色、図5左上パネル)および微小管ネットワーク(赤、図5左上パネル)の存在を示し、ミトコンドリアの活性を示すミトトラッカー染色の減少と一致した(図5左パネルの図)BAL細胞の95%以上がベースラインで単核であった。4時間で、BAL細胞は、細胞外核物質、ラメリポディアを欠いた細胞質アクチン染色を穿刺し、皮質アクチン染色を減少させた(緑色、図5右上パネルで示す)、微小管網(赤、図5右上パネル)に対応しなかった微小管網(赤、図5右上パネル)を示した(赤、図5左パネル)。DAPI正規化アクチン蛍光強度分析は、露光後4時間でのアクチン染色の減少を示す比の3.7倍の減少を示した(p<0.01,図6A)。同様に、DAPI正規化されたチューブリン蛍光強度も、露光後1.5倍減少(p<0.01、図6B)、チューブリン染色の減少を示す。ラメリポディアの損失はBAL細胞細胞骨格の円形性の増加と共にすぐに明らかであった。 0hと比較した場合の露光後2時間(p<0.01,図6C)及び4時間(p<0.05,図6C)で、露光後24(p<0.05)および36時間(p<0.01)で細胞骨格の円形度の低下を比較すると、0h(図6C)と比較した場合。
最大24時間、結合露光からのBAL細胞は、カルセインに対して二重陽性(緑色、図7)活性エステラーゼ活性の存在を示し、エチジウム・ホモジマー(赤色、図7)は、一部の細胞が死んでいたが(赤色)、大部分が部分的に損なわれた細胞であることを示す。36時間で、BAL細胞は、大部分が生存可能(緑色)であり、他の全身コンパートメントからリクルートされた白血球による侵害細胞の置換を示す(図7)。
BAL細胞の特異的なATPαおよびLy6G染色は、細胞内局在化(Movies 1および2)の両方の細胞内局在化を明らかにした(Movies 1)ならびに露光後の好中球中のタンパク質の両方について(図7)。この合体露光は、ATPαのDAPI正規化蛍光強度比の低下(図7、8A)および細胞内Ly6Gタンパク質含有量の増加を引き起こした(図7、図8B、ムービー1および2)。ATPα染色の減少は、露光後24時間で、下管ビンと相関し、ある程度減少したマイトトラッカー染色を行った。また、曝露後の非核ATPα陽性細胞体(血小板)も観察した。しかし、我々は我々の調査結果を確認しませんでした。2時間で、0hと比較すると小さい単核BAL細胞(p<0.01図8C、p<0.01図8D)を0hと比較すると、単核細胞が大きかった(p<0.01図8C、p<0.01図8D)。. 24(p<0.01図8C、p<0.01図8D)および36h(p<0.01図8C、p<0.01図8D)では、BAL細胞は、0hと比較すると多形核細胞に向かってシフトするため、徐々に小さくなった。
BAL細胞の免疫フェノタイピングは、NK1.1、ATP βおよびKi-67の一過性の表現と、O3およびLPS曝露を組み合わせた後のGr1、CX3CR1およびアンジオスタチン陽性BAL細胞の持続的な表現を明らかにした:BALサイトスピンの最初のセットの免疫蛍光染色をDAPI染色に正規化した。細胞NK1.1陽性細胞は24時間(p<0.05対0h、図9、10A)で増加した。36時間で、BAL細胞は低い細胞NK1.1蛍光強度を持っていた(p<0.01対0および24時間、図9、10A)。細胞Gr1蛍光強度は24時間(p<0.01対0h、図9、10B)と36h(p<0.01対0h、図9、10B)で高かった。同様に、細胞のCX3CR1蛍光強度は24時間(p<0.01対0h、図9、10C)と36h(p<0.01対0h、図9、10C)で高かった。
発現中にも遍在している細胞CD61に正規化すると、細胞のATPβ蛍光強度が24時間(p<0.01対0h、 図9、10D)で増加し、細胞内のATPβ蛍光強度が36h(p<0.01対0および24h、 図9、10D)で減少することが明らかになった。特に、ATPβは、36時間での末梢局在化と比較して、主に24時間で核局在を示した(図9)。細胞増殖の指標であるBAL Ki-67の細胞蛍光強度は、0および36hと比較して24時間(p<0.01対36h、 図9、10E)で高かった。レベルはベースラインレベルを下回る36h(p<0.01, 図9,10E)で、36hの多形核CD61対Ki-67発現が高いためである可能性が最も高い(図9)。最後に、BALアンジオスタチンの細胞蛍光強度は、24および36h(p<0.01対0h、 図9、10F)の両方で一貫して高かったが、このメタロプロテイナーゼは、肺炎症反応の間にプラススミノーゲン断片を切断したこのメタロプロテイナーゼの特異的増加を示す。
併用暴露は、広く広がる肺損傷を生じる:肺の体系は、結合された暴露がH&E染色されたクライオセクションに見られるように肺に長時間の損傷を生じることを明らかにした(図11)。気管支内および歯槽中隔損傷が予想されたが、より大きな血管の内皮損傷を観察し、露光後36時間で観察することは、驚くべきものでした(図11)。損傷した肺胞中隔および気管支内領域には、接着性血管内白血球、白血球凝集体(好中球を含む)の斑点があった(図11)。
図1:区画白血球数:A) 気管支肺胞洗浄(BAL)総白血球数は0(すなわち、ベースライン)、4、24、36、72時間を組み合わせた後、0.05 ppbオゾン(O3)および50μgの鼻腔内LPSをマウスに曝露した。 B) 肺血管透過体(LVP)総白血球濃度は0(すなわち、ベースライン)、4、24、36及び72時間を組み合わせた後、0.05 ppbオゾン(O3)および50μgの鼻腔内LPSをマウスに曝露した。 C) 末梢血(PB)全白血球濃度を0(すなわち、ベースライン)で、0.05ppbオゾン(O3)および50μgの鼻腔内LPSをマウスに曝した後に、4、24、36および72時間を併用した。 D) 胸骨骨髄(BM)総白血球濃度は0(すなわち、ベースライン)、4、24、36および72時間を組み合わせた後、0.05 ppbオゾン(O3)および50μgの鼻腔内LPSをマウスに曝露した。 E) 大腿骨骨髄(BM)総白血球濃度は0(すなわち、ベースライン)、4、24、36および72hを組み合わせた後、0.05 ppbオゾン(O3)および50μgの鼻腔内LPSをマウスに曝露した。グラフ A-E の場合、0 h は青、4 h は赤、24 h は緑、36 h は紫、オレンジ色のデータ ポイントでは 72 h です。* p<0.05 と ** p<0.01.F)代表BAL細胞スピンは24時間暴露から、DAPI(青色)、CX3CR1(緑色)およびシグレックF(赤)で核に染色された場合の単核および多形核細胞を示す。CX3CR1とシグレックFのマージはオレンジ色の黄色で表示されることに注意してください。単核細胞の大部分は、肺胞マクロファージの特徴であるシグレック-Fに陽性である。スケールバー= 50 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:総タンパク質定量:A)気管支肺胞洗浄(BAL)総タンパク質含量およびB)肺血管パーフューズト(LVP)全タンパク質濃度を、Pierce 660 nmタンパク質アッセイ(熱科学的、IL、米国)によって推定した。グラフ A-B の場合、0 h は青、4 h は赤、緑は 24 時間、紫は 36 h、オレンジ色のデータ ポイントでは 72 h です。* p<0.05.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:肺エオタキシン-2およびIL-2ケモカイン勾配:33ケモカインのうち、 肺血管パーフセート(LVP)および気管支肺胞洗浄(BAL)および0.05 ppbオゾン(O 3)および50μgの鼻腔内LPS曝露後の流体に有意に変化した2つのケモカイン(O 3)および50μgの鼻内LPSマウスへの暴露の後にA)LVPエオタキシン-2、C)LVP-2、C)LVP-2およびIL-2-BAL-2- データを一方のアノバで分析し、複数変数の偽発見率のp値を、ベンジャニとホシュベルクの補正に従って調整した。グラフA-Dの場合、0hは青、4時間は赤、24時間は緑、36hは紫、オレンジ色のデータポイントでは72時間です。対フェローニの補正後に対比を分析した。* は p<0.05 を表し、** は p<0.01 を表します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:肺血管透過物ケモカイン濃度:さらに10個のケモカイン濃度が変化したが、肺血管透過物(LVP)コンパートメント内でのみ変化した。A)エオタキシン-1, B) TNFα, C) IFNγ, D) CX3CL1, E) CCL27, F) IL-16, G) CXCL5, H) CXCL10, I) SDF1αおよびJ) MIP3β. グラフA-Jの場合、0hは青、4時間は赤、24時間は緑、36hは紫、オレンジ色のデータポイントでは72時間です。対フェローニの補正後に対比を分析した。* は p<0.05 を表し、** は p<0.01 を表します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:気管支肺胞洗浄(BAL)サイトスピンアクチン/チューブリンおよび減少マイトトラッカー染色:A)0hおよびB)4時間を組み合わせた後のアクチン/チューブリン染色BALサイトスピンの代表的な画像(O3)および50μgの鼻腔内LPSをマウスに曝露した。DAPI は青、アクチンは緑、チューブリンは赤で示されています。還元されたミトトラッカーの代表的な画像は、A)0hおよびB)4時間から、0.05 ppbオゾン(O3)および50μgの鼻腔内LPSをマウスに曝露した後に4時間染色した。DAPI は青で表示され、縮小されたマイトトラッカーは赤で表示されます。スケールバー= 50 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:気管支肺胞洗浄(BAL)細胞骨格タンパク質および円形性分析:ACTINおよびチューブリンに染色されたBALサイトスピンを、DAPI正規化パラメータすなわち、正規化されたパラメータについて分析した。 A)アクチンからDAPI蛍光強度(FI)0および4hの比、B)0および4hおよびCにおけるDAPI蛍光強度(FI)比、および0(n=75細胞)におけるBAL細胞細胞量、2(n=105細胞)、4(n=66細胞)、24(n=31細胞)、36(n=154細胞)h。O3およびLPS暴露の直後に、すなわち、2時間の時点で、我々はまた、O3の即時の効果を強調するために、2時間の時点からいくつかの非常に初期のBAL細胞性分析を含むいくつかのパイロット実験を行った。グラフA-Cの場合、0hは青、2hは赤、4hは緑、紫は24時間、オレンジ色のデータポイントでは36時間です。* は p<0.05 を表し、** は p<0.01 を表します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7:気管支肺胞洗浄(BAL)細胞内および細胞質膜の状態:Bal細胞は、重要な染色、カルセイン(緑色)およびエチジウムホモダイマー/EthHD(赤色)に染色された(A)0、B)24およびC)36時間後の代表的な上部画像パネルに示されるように、LPS曝露後。 スケールバー=200μm.BALサイトスピンは、DAPI(青色)、ATPα(緑色)およびLy6G(赤色)について免疫染色された。代表的な画像は、O3およびLPS露光後のA)0およびB)24時間の下の画像パネルに示されている。スケールバー= 50 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図8:気管支肺胞洗浄(BAL)ミトコンドリアタンパク質ATPα、リソソームタンパク質Ly6Gおよび細胞サイズ分析:免疫染色BAL細胞を、A)ATPα〜DAPI蛍光強度(Fi)比およびB)Ly6G対DAPI FI比を、O3およびLPS曝露後0、24時間で正規化した。 免疫染色BAL細胞も、そのA)最長すなわち、フェレット直径およびB)周囲、0、2、4、24および36時間のO3およびLPS曝露後の周長について分析した。グラフ A-D の場合、0 h (n=119 細胞) は青、2 h (n=105 セル) は赤、4 h (n=66 セル) は緑、24 h (n =309 セル) は紫、36 h (n=154 セル) はオレンジ色のデータ ポイントで表されます。* は p<0.05 を表し、** は p<0.01 を表します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図9:気管支肺胞洗浄(BAL)細胞内表現型:BAL細胞を、O3およびLPS曝露後のA)0、B)24およびCの代表的な上部画像パネルに示すように、DAPI(青色)、NK1.1(緑色)、Gr1(赤)およびCX3CR1(マゼンタ)に対して免疫染色した。 スケールバー=50μm BAL細胞スピンは、ATPβ(青色)、Ki-67(緑色)、CD61(赤)およびアンギオスタチン(マゼンタ)に対して免疫染色した。代表的な画像は、O3およびLPS露光後のA)0、B)24およびC)36時間の下の画像パネルに示されている。 スケールバー= 50 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図10:気管支肺胞洗浄(BAL)ミトコンドリアタンパク質ATPβ、 リソソームタンパク質Gr1、細胞内CX3CR1およびアンジオスタチン分析:免疫染色BAL細胞を、A)NK1.1からDAPI蛍光強度(FI)比、B)Gr1対DAPI FI比およびC)CX3CR1〜DAPI FI比を計算するために正規化した。 免疫染色BAL細胞は、A)ATPβからDAPI蛍光強度(FI)比B)へのキ-67対DAPI FI比およびB)アンジオスタチン(ANG)対DAPI FI比、O3およびLPS曝露後0、24及び36時間でA)を算出するために正規化した。グラフ A から F の場合、0 h (n=21 セル) は青、24 h (n=796 セル) は赤、36 h (n=2692 セル) は緑のデータ ポイントで表されます。* は p<0.05 を表し、** は p<0.01 を表します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図11:肺ヘマトキシリンとエオシン(H&E)のヒストロジー オゾン(O3)およびLPSは、O3 とLPSの露光を組み合わせた後、0、24、36時間で肺凍結切開H&Eのヒストロジーを誘導した。肺胞上皮損傷の領域は、黒い矢の頭部による黒い矢と内皮損傷によって特徴付けられます。黄色のアスタリスク(*)は、歯槽中隔領域の白血球のパッチを表します。 A = 歯槽腔 、B = 気管支 、V =脈管、スケールバー= 左手の画像パネルは100 μm、右側の画像パネルの場合は50 μm。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| S.No。 | 一次抗体 | インビトロジェン二次抗体 |
| 1 | マウスアンチNK1.1 IgG2aカッパ(クローンPK136)、インビトロジェンカタログ第16-5941-82 | アレクサ488コンジュゲートヤギアンチマウスIgG(H +L)、カタログNo.A11002 |
| 2 | ラット抗Ly6G/Ly6C(Gr1)IgG2bカッパ(クローンRB6-8C5)、インビトロジェンカタログ第53-5931-82 | アレクサ568コンジュゲートヤギアンチラットIgG(H +L)、カタログNo.A11077 |
| 3 | ウサギ抗CX3CR1 IgG(RRID 467880)、インビトロジェンカタログ第14-6093-81 | アレクサ633コンジュゲートヤギ抗ウサギIgG(H +L)、カタログNo.A21070 |
| 4 | マウス抗ATP5A1 IgG2b (クローン7H10BD4F9),インビトロジェンカタログ第459240 | アレクサ488コンジュゲートヤギアンチマウスIgG(H +L)、カタログNo.A11002 |
| 5 | ラット抗Ly6G IgG2aカッパ(クローン1A8)、インビトロジェンカタログ第16-9668-82 | アレクサ568コンジュゲートヤギアンチラットIgG(H +L)、カタログNo.A11077 |
| 6 | マウス抗ATP5β IgG2b(クローン3D5AB1)、サーモフィッシャーカタログNo.A-21351 | アレクサ350コンジュゲートヤギアンチマウスIgG(H + L)、カタログNo.A11045 |
| 7 | ラット抗Ki-67(クローンSolA15)IgG2aカッパ、インビトロジェンカタログ第14-5698-82 | アレクサ568コンジュゲートヤギアンチラットIgG(H +L)、カタログNo.A11077 |
| 8 | アルメニアハムスター抗CD61(クローン2C9.G2) IgG1カッパ、BDカタログ553343 | アレクサ568コンジュゲートヤギアンチハムスターIgG(H + L)、カタログNo.A21112 |
| 9 | ウサギ抗アンギオスタチン(マウスaa 98-116)IgG、AbcamカタログNo.ab2904 | アレクサ633コンジュゲートヤギ抗ウサギIgG(H +L)、カタログNo.A21070 |
表 1: サンプルから調製したサイトスピンを染色するために使用される一次および二次抗体の組み合わせ。
| 読み上げた | バル | LVP | PB | SBM | FBM |
| TLC | * | * | +24時間で。- 36、72時間で | + 72時間 | |
| 好 中球 | +24、36、72時間で | +24時間で | * | +4、24、36、72時間で | +4、24、36、72時間で |
| 蛋白質 | +36時間で | * | n.d. | n.d. | n.d. |
| ケモカインプロファイル | - エオタキシン-2の場合、IL-2は4、24、36、72時間 | +エオタキシン-1/2、IL-2、TNFα、IFNγ、CX3CL1、CCL27、IL-16、CXCL5、CXCL10、MIP3βを4 hで。36時間でSDF1α用+ | n.d. | n.d. | n.d. |
| セルサイズ | +4時間で。- 24、36時間で | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. |
| ATPα | - 24時間で | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. |
| NK1.1/キ-67 | +24時間で | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. |
| ATPβ/Gr1/CX3CR1/ANG | +24、36時間で | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. |
表 2: 異なるコンパートメントにおける研究の主な所見の包括的な要約。* は変化がないことを示し、+ は増加を示し、測定されたパラメータの減少を示します。 BAL は気管支肺胞洗浄液を示し 、LVP は肺血管透過を示し 、PB は末梢血を示し 、SBM は胸骨骨髄を示し 、FBM は大腿骨骨髄区画を示す。
補足図1:Gr1およびCD11b免疫染色: DAPI(青色)、Gr1(緑色)およびCD11b(赤)の蛍光免疫染色細胞スピンスライド肺血管パーフューザート(LVP)、胸骨骨髄(BM)および大腿骨骨髄(BM)コンパートメントからO3 とLPSを組み合わせた後0、4および24時間の骨髄(BM)の代表的な画像。スケールバー= 50 μm.このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ムービー 1 0時間からBALマクロファージの3次元レンダリング体積(すなわち、ベースライン)、核(青色で示す)およびATPα(緑色で示す)およびLy6G(赤色で示す)に対する免疫染色を示す。このムービーをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足動画2:O3とLPSを合わせた後の24時間のタイムポイントからのBALマクロファージの3次元レンダリング体積は、核(青色で示される)およびATPα(緑色で示される)およびLy6G(赤色で示される)に対する免疫染色を示す。非核ATPα陽性体の存在と断片化した細胞に注意してください。このムービーをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
現在の研究で提示された方法は、肺の炎症中に複数の細胞事象を研究するための複数のコンパートメント分析の有用性を強調する。我々は、その結果を表2にまとめた。私たちおよび多くの研究室は、肺中球の急速な採用によって特徴付けられた鼻内LPS点眼に対するマウス応答を広範囲に研究してきました。そして最近、サブ臨床O3(2時間0.05ppm)単独で、肺血管区画内の好中球の分離によって特徴付けられたC57BL/6NJサブストレイン15に重大な肺損傷を誘発し、BALでは損傷したマクロファージおよび破片が観察され、O3の炎症性の可能性を示す。そのモデルでは、肺胞マクロファージによる肺胞上皮損傷および貪食の結果として、肺胞コンパートメント内の好中球の存在を観察した。O3モデルで細胞外DNAと破片を観察しただけでなく、BALマクロファージは高いIL-16レベルと相関する異形性であり、通常は死にかけている好中球によって放出される警報である。したがって、これらのサブ臨床O3レベルは、それ以外の場合の強いC57BL/6Jサブ株における免疫応答に影響を与えることができるかどうかを理解することが重要である、上副生理学的O3レベル21で述べるように。我々は、O3と鼻腔内細菌内の内毒素を組み合わせることで、BAL、肺血管透過物、胸骨および大腿骨骨髄区画における損傷した好中球の存在が特徴である肺および全身コンパートメントにおける好中球の募集を誘導し、24、36および72時間で高いままであった4時間から始まることを観察した。細胞の損傷は、皮質アクチンおよびラメリポディアの損失およびBAL白血球における細胞サイズの増加として表された。好中球は、BALコンパートメントで分析し、微小管、ATP合成複合体Vサブユニットα(ATPα)および活性ミトコンドリア染色に対する有意に減少した陽性反応性を示した。肺は、細胞ATP合成複合体Vサブユニットβ(ATPβ)の発現を高調節することによってこの結合暴露に適応する(ATPβ)ならびにATPβリガンドの発現を調節することによって、アンジオスタチン(表2)。
炎症を研究する重要な側面はケモカイン勾配と一緒に細胞壊死を理解することです。.興味深いことに、白血球の総数は末梢血と大腿骨骨髄区画を除いて変わらなかった。これらの観察により、細胞細胞パターン、サイズ、免疫フェノタイピングを調べた。細胞の損傷を示すBAL細胞におけるラメリポディアおよび活性ミトコンドリアの喪失を観察した。皮質アクチン組織は、細胞間シグナリングおよび結果として生じるバリア特性の必須の特徴である。したがって、壊死が評価するほど明白でないときの細胞損傷の細胞の損傷の細胞骨格の組織の組織化は良好なマーカーである。36時間でも、BAL細胞はエチジウムホモジウム染色によって示されるように、形質膜を損なっていた。結合暴露の直後に、BALの好中球はGr1陽性を示したが、CD11bに対して本質的に陰性染色を示し、これは先端に向かって局所化し、歯槽中隔クロール22を助ける。したがって、併用露光はCD11bタンパク質を欠いた非定型好中球の蓄積を招く。LPSはCD11bのダウンレギュレーションを誘導しない。したがって、この特徴は、O3 が好中球に対する損傷を誘発した結果である可能性が高い。
BAL細胞は、0hと比較して24時間で高いNK1.1、Ki-67およびATPβ染色を有する独特のタンパク質シグネチャを有する(表2)。BAL細胞は、0hと比較した場合、24と36時間で、Gr1、CX3CR1、ならびにアンジオスタチンの発現が高い(表2)。これらの知見は、BALにおける徐々に多くのGr1陽性好中球の存在によって裏付けられたが、24時間および36時間で、暴露後(表2)。NK1.1、CX3CR1およびGr1陽性細胞の存在は、24時間で、BALにおける単核および多形核細胞の両方の採用を示す。Ki-67とアンジオスタチンの両方をマーカーとして含めることで、BALにおける増殖対抗血管新生ミリューについてそれぞれ知らせてきました。したがって、O3とLPSの曝露を組み合わせることで、好中球浸潤による抗血管新生ミリューが続くマクロファージの増殖が生じる。ATPβ染色の一過性増加は、24時間でBAL白血球の生存率の増加に向けた重要な適応を示し得る。ATPβは、アンジオスタチンに結合し、長期生存を阻害することができる6,23であり、実際には36時間の曝露時で低下するKi-67指数に反映される。
BALタンパク質は36時間で最も高く、他のタイムポイントではなかったが、肺血管透過物は暴露前または暴露後のタンパク質濃度の変化を示さなかった。血管コンパートメントが影響を受けなかった可能性があるが、これは、O3誘導フリーラジカルおよび得られた界面活性タンパク質(SP-A、SP-B)分解ならびに血管漏れ24、25、26によるメチオニン、ヒスチジンおよびシステインなどの電子リッチなアミノ酸の酸化により混乱する可能性が最も高い。BAL IgM、BAL界面活性剤タンパク質、BALアルブミンまたは色素外開法(エバンスブルーまたはフルオレセイン等チオシアネート(FITC)デキストランを使用)の定量化は、上皮および内皮完全性を評価するための代替方法である。
興味深いことに、エオタキシン-2およびIL-2の肺血管パーフューザートレベルは、4時間の時点で急性に上昇した。BALエオタキシン-2およびIL-2レベルは、曝露後に有意に低下し、肺胞空間の分解または肺血管構造の閉じ込めのいずれかを示した。肺血管パーフューザートで分析されたより多くのケモカインは、好酸球ケモカイン(eotaxin-1)、TNFα、より高いレベルを明らかにした、 IFNγは、リンパ節由来単核細胞ケモカイン(CX3CL1、CXCL10、CCL27、MIP3β)、上皮由来好中球ケモカイン(CXCL5)、および好中球27の二次壊死後に放出される警報(IL-16)と、暴露後4時間でしか放出されなかった。36時間で、骨髄由来の汎白血球ケモカイン、SDF1α28は、肺血管透過物においてより高かった。骨髄由来のSDF1α濃度は、CD11bおよびGr1陽性細胞が曝露後24時間および36時間で豊富に存在する細胞診所の所見と相関している。従って、ケモカインおよび細胞学的プロファイルは、骨髄区画からの有意な白血球動員を反映している(表2)。
私たちの動物モデルと研究結果は、都市環境での生き物がそのようなサブ臨床O3および感染性物質8にさらされる可能性が高い現実世界の状況を念頭に置いて不可欠です。我々のマウスモデルは、COVID-19感染29の場合と同様に、侵襲性細胞死および感染症の肺および肺外メカニズムを研究するためのレベル2の封じ込めラボで再現できる容易にアクセス可能なプロトタイプとして機能する。将来の研究は、長期的な細胞適応を調査するために、修復または後期フォローアップだけでなく、慢性的な暴露を視覚化することに向けられるべきです。したがって、生きた臓器15および動物16、30、31イメージング技術を含む包括的な肺炎症研究のために、現在の終点研究設計は、低用量O3(細胞死)およびLPS(免疫刺激)を組み合わせた宿主応答に関する重要な洞察を提供し、したがって急性肺傷害のメカニズムを解読することができる。
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Disclosures
著者は、利益相反や開示を行う必要はありません。
Acknowledgments
実施された研究は、大統領のNSERC助成金とシルビア・フェドーク・カナダ原子力イノベーションセンターからのスタートアップ資金によって資金提供されています。シルビア・フェドールク・カナダ原子力イノベーションセンターは、イノベーション・サスカチュワン州が資金を提供しています。蛍光イメージングは、NSERCが資金を提供するWCVMイメージングセンターで行われました。ジェシカ・ブロコス(MScスチューデント)とマンプリート・カウル(MScスチューデント)は、シルビア・フェドーク・カナディアン・イノベーション・センターのスタートアップ資金によって資金提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 33-plex Bioplex chemokine panel | Biorad | 12002231 | |
| 63X oil (NA 1.4-0.6) Microscope objectives | Leica | HCX PL APO CS (11506188) | |
| Alexa 350 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11045 | |
| Alexa 488 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11002 | |
| Alexa 488 conjugated phalloidin | Invitrogen | A12370 | |
| Alexa 555 conjugated mouse anti-α tubulin clone DM1A | Millipore | 05-829X-555 | |
| Alexa 568 conjugated goat anti-hamster IgG (H+L) | Invitrogen | A21112 | |
| Alexa 568 conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Invitrogen | A11077 | |
| Alexa 633 conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A21070 | |
| Armenian hamster anti-CD61 (clone 2C9.G2) IgG1 kappa | BD Pharmingen | 553343 | |
| C57BL/6 J Mice | Jackson Laboratories | 64 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | Leica TCS SP5 | |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Invitrogen | D1306 | aliquot in 2 µl stocks and store at -20°C |
| Inverted fluorescent wide field microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Ketamine (Narketan) | Vetoquinol | 100 mg/ml | Dilute 10 times to make a 10 mg/ml stock |
| Live (calcein)/Dead (Ethidium homodimer-1) cytotoxicity kit | Invitrogen | L3224 | |
| Mouse anti-ATP5A1 IgG2b (clone 7H10BD4F9) | Invitrogen | 459240 | |
| Mouse anti-ATP5β IgG2b (clone 3D5AB1) | Invitrogen | A-21351 | |
| Mouse anti-NK1.1 IgG2a kappa (clone PK136) | Invitrogen | 16-5941-82 | |
| Pierce 660 nm protein assay | Thermoscientific | 22660 | |
| Rabbit anti-angiostatin (mouse aa 98-116) IgG | Abcam | ab2904 | |
| Rabbit anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880) | Invitrogen | 14-6093-81 | |
| Rat anti-Ki-67 (clone SolA15) IgG2a kappa | Invitrogen | 14-5698-82 | |
| Rat anti-Ly6G IgG2a kappa (clone 1A8) | Invitrogen | 16-9668-82 | |
| Rat anti-Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b kappa (clone RB6-8C5) | Invitrogen | 53-5931-82 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block (clone 2.4G2) | BD Pharmingen | 553142 | |
| Reduced mitotracker orange | Invitrogen | M7511 | |
| Xylazine (Rompun) | Bayer | 20 mg/ml | Dilute 2 times to make a 10 mg/ml stock |
References
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