Summary
이 프로토콜은 초기 단계 무척추 디스크 퇴행성을 시뮬레이션하기 위해 염증, 퇴행성 소 장기 문화의 새로운 실험 모델을 제시합니다.
Abstract
증상 간무성 디스크(IVD) 변성(IDD)은 사회경제적 부담이 주요이며 염증 및 조직 저하를 특징으로 합니다. 인과 치료의 부족으로 인해 질병의 진행에 관련된 메커니즘을 연구하고 치료 목표를 찾고 동물 모델의 필요성을 줄이기 위한 혁신적인 실험 기관 배양 모델이 절실히 필요합니다. 우리는 여기에 IDD 동안 존재하는 염증성 및 이발성 미세 환경을 모방하는 새로운 3 차원 장기 배양 모델 프로토콜을 제시합니다.
처음에, 소 caudal IVDs는 조직 배양 배지에서 해부, 청소 및 배양되었다. 동적 생리학적 또는 병리학적 적재는 하루에 2시간 동안 맞춤형 생물반응기에서 적용되었다. IVDs는 4일 동안 대조군(고포도당 배지, 생리적 적재, 인산염 완충식염 주입) 및 병리학적 군(저포도당 배지, 병리학 적재, 종양 괴사 인자-알파 주입)에 할당되었다. 조절된 장기 배양 배지의 효소 연계 면역소벤트 분석의 수집된 핵 펄포서스 세포로부터의 유전자 발현 분석이 수행되었다.
우리의 데이터는 대조군에 비해 병리학 적 단에 적재 한 후 염증 성 마커의 높은 발현과 감소 된 디스크 높이를 밝혔다. 이 프로토콜은 IVD 염증 및 변성을 시뮬레이션할 수 있으며 적용 범위를 넓히기 위해 더욱 확장될 수 있습니다.
Introduction
요통(LBP)은 모든 연령대의 개인에게 영향을 미칠 수 있으며 전 세계적으로 장애의 주요원인인 1,2,3. LBP와 관련된 총 비용은연간4,5를초과합니다. 염증 및 조직 분해를 특징으로 하는 질환인 증상 추간판(IVD) 변성(IDD)은 LBP6,7의주요 원인이다. 구체적으로, IDD는 IVD의 세포외 매트릭스(ECM)의 점진적으로 진화하는 고장을 특징으로 하며, 가속병리학, 신경장애 및 결국 장애로 이어지는 여러 요인에 의해 유도되고 유발된다. 더욱이, IDD는 염증성 사이토카인의 방출과 연관되어, 변경된 척추 생체역학, 혈관신생 및 신경성장, 통증 감각을 증가시켜 만성 LBP(활성 디스코파시증)6,8을유발한다. 현재까지, 치료 옵션은 인접한 척추의 내분 및 후속 융합, IVD 보철물의 이식, 또는 비스테로이드 항염증제 약물, 오피오이드 및 IDD9환자를 위한 근육 이완제와 같은 비수술적 접근법을 포함한다. 현재 표준 치료 옵션, 외과 및 비 수술, 부분적으로 효과적이며 근본적인 생물학적 문제를 해결하지 못합니다9,10. 초기 단계 퇴행성 디스크 질환은 초기 염증 조직 반응, 특히 종양 괴사 인자-알파(TNF-alpha)발현(11)의증가를 특징으로 한다. 이러한 초기 디스크 변화는 주로 디스크 아키텍처를 방해하지 않고 세포 수준에서 발생하며 이전에 는 염증성 조건12에서영양 결핍에 의해 모방 될 수 있습니다. 따라서 이러한 변성 메커니즘을 조사하고 적절한 치료 목표를 찾기 위해 생체 내 상황을 정밀하게 시뮬레이션하는 것이 중요하다. 또한 이러한 분자 특성 시뮬레이션에 대해 디스크의 기계적 적재 환경은 IVD의 병리학적 및 생리적 변화에 중요한 역할을 합니다. 따라서 이러한 접근 방식을 결합하면 생체 내에서 IVD의 복잡한 미세 환경을 모방하기 위해 한 걸음 앞으로 나아갈 수 있습니다. 현재 우리의 지식의 최선을 프로 염증 및 영양 설정과 함께 동적 로딩의 측면을 고려 하는 연구는 없습니다.
대형 동물 모델은 생체 내 상호 작용에서 잠재적 인 관련조사를 허용하지만 비용이 많이 들고 집약적입니다. 더욱이, 연구에서 동물 모델의 사용은 오랫동안 논쟁의 문제이기 때문에 중요한 연구 질문에 대답하는 데 필요한 동물의 수가 감소하는 것은 큰 관심사입니다. 마지막으로, 현재 IVD 연구13,14에서IDD를 모방하는 이상적인 동물 모델은 없습니다. 따라서 IDD 및 관련 염증 및 퇴행성 공정을 시뮬레이션하기 위해 장기 배양 모델과 같은 비용 효율적이고 신뢰할 수 있는 대체품을 확립할 필요가 있다. 최근에는 초기 단계 추간판 질환을 시뮬레이션하기 위해 염증성 및 퇴행성 장기 배양 모델의 확립에 관한 본 프로토콜의 적용을 통해 IDD 장기배양(15)에서항염증제의 효과를 조사할 수 있게 되었다.
여기서, 우리는 소 간장 디스크를 얻고 종양 괴사 인자-알파 (TNF-α)의 직접 무분별한 주입에 의한 이화 및 염증성 미세 환경을 통해 초기 단계 IDD의 상태를 유도하고 낮은 영양 중간 조건하에서 생물 반응기에서 퇴행성 적재하는 방법을 설명합니다. 도 1은 실험 모델을 나타내고 퇴행성 및 생리적 적재 조건을 시뮬레이션하는 데 사용되는 생물 반응기를 보여줍니다.
그림 1: 실험 설정의 그림입니다. A: 소 꼬리; B: 해부된 소 상호 디스크; C: 문화 배지가 있는 잘 플레이트에 디스크를 전송; D: 생물 반응기에서 시뮬레이션을 적재; E: 무내 분사 기술; F: PBS/트라이판 블루 염료를 주입한 후 IVD가 분포를 드러냅니다. IDD: 추간판 변성. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Protocol
실험은 현지 아바토이르로부터 얻은 소 꼬리를 사용하여 수행하였다. 현재 연구에 사용되는 생물학적 물질은 식품 체인에서 채취되며 스위스 및 유럽 법에 윤리적 승인을 필요로하지 않습니다.
1. 소 추간판 해부
- 수돗물로 꼬리 전체를 철저히 헹구어 표면의 먼지와 머리카락을 제거합니다.
참고: 손상되지 않은 말단을 사용하면 꼬리당 최대 9개의 IVD(미주 1-9)를 IVDs의 원하는 크기에 따라 실험에 사용할 수 있습니다. 15-20mm 사이의 원하는 직경을 고려하여, 우리는 실험을 위해 꼬리 당 5 개의 IVDs가있는 12 소 꼬리를 사용했습니다. - 1% 베타딘 용액이 들어 있는 상자에 전체 꼬리를 10분 동안 담가 두어 주세요. 살균 거즈로 꼬리를 짧게 말리고 멸균 커튼에 놓습니다.
참고: 디스크를 해부하는 동안, 탈수를 방지하기 위해 링거의 용액이 젖은 거즈로 꼬리를 가습시합니다. 전체 해부 절차가 완료될 때까지 젖은 거즈에 싸인 꼬리(또는 남은 세그먼트)를 보관합니다. - 메스(20번)를 사용하여 CAUdal 척추에서 가능한 한 연조직을 완전히 제거하여 IVDs의 식별을 용이하게 한다. 뼈 제거 펜치로 척추의 가시 및 횡방향 공정을 제거합니다.
참고: 원하는 직경의 IVD를 선택합니다. 직경 범위가 15-20mm인 IVD가 현재 연구에서 사용되었습니다. - 개별 운동 세그먼트를 얻기 위해 각 척추 몸의 중간을 통해 뼈 펜치와 반대로 잘라. 링거의 용액에 젖은 거즈를 가진 페트리 접시에 모션 세그먼트를 넣습니다.
- IVD와 척추를 심Pation및 모션 세그먼트를 부드럽게 이동하여 찾습니다. IVDs의 성장 판에서 본 밴드와 함께 두 개의 병렬 컷을 확인, IVD의 각 측면에 하나. IVD에서 척추를 향해 약 0.5-1mm의 안전 거리를 가진 디스크(soft)에 인접한 뼈 엔드플레이트 부분(hard)의 볼록 부위를 만지고 찾아성장판의 위치를 식별한다. 척추를 자르면서 링거의 용액으로 밴드 톱의 블레이드를 식히는지 확인합니다.
- 링거의 용액에 젖은 깨끗한 거즈와 깨끗한 페트리 접시에 IVDs를 전송합니다.
참고 : 거즈는 IVDs의 붓기를 방지하기 위해 너무 젖지 않고 촉촉해야하며, - 메스 블레이드를 사용하여 척추 몸체 (빨간색 / 분홍색 뼈), 성장 판 (흰색 연골)을 긁어 내고 엔드 플레이트를 그대로 둡니다 (노란색 분홍색). 로딩 프로시저에 대해 두 표면을 평평하고 평행하게 만듭니다. 스크랩된 IVD를 링거의 용액에 젖은 거즈를 곁들인 신선한 페트리 요리로 옮습니다.
참고: IVD를 잡고 긁는 동안 손을 보호하기 위해 체인 메일 장갑을 착용하십시오. - 캘리퍼로 디스크 높이와 직경을 측정합니다. 제트 라베이지 시스템을 사용하여 링거의 용액으로 척추 뼈의 혈전을 청소하십시오.
- IVD를 튜브당 하나의 IVD인 50mL 플라스틱 튜브로 이송합니다. IVD당 25mL의 인산염 버퍼식 살린(PBS) + 10% 페니실린/스트렙토마이신(P/S)을 추가하고 실온에서 궤도 셰이커에서 15분 동안 흔들어 둡니다.
- 수퍼네티드를 흡인하고 IVD당 10mL + IVD당 1% P/S를 2분 동안 추가하여 IVD를 헹구십시오.
2. IVD 배양 및 적재
- IVD 챔버로 디스크를 옮기고 IVD 배양 배지(DMEM, 생리군용 4.5g/L 고혈당 DMEM, 병리학군용 2g/L 저혈당 DMEM) + 1% P/S + 2% 태아 송아지 혈청 + 1% ITS(5μg/mL, 인슐린 포함) 6 μg/mL 이송린, 및 5 ng/mL 셀레니스트 산) + 50 μg/mL 아스코르바테-2-인산염 + 1% 비필수 아미노산 + 50 μg/mL 항균제 1차 세포에 대한 50 μg/mL 항균제) 및 37°C, 85% 습도 및 5%CO2%
- 실험군(16)에따른 생물반응기 시스템 내에서 4일 동안 디스크를 배양한다. 병리학 군에서 퇴행성 적재 조건을 0.32-0.5 MPa, 2h/day동안 5Hz로 유지합니다. 생리적 대조군에서는 0.02-0.2 MPa의 로딩 프로토콜을 사용하고, 2시간/일 동안 0.2Hz를 사용한다.
참고: 로딩 절차 동안 IVD 배지 5mL를 포함하는 챔버에 IVD를 배치합니다. 부피는 생물 반응기의 적재 챔버의 크기에 따라 달라집니다. 로딩 절차 사이에, 자유로운 팽창 복구를 위한 IVD 배양 배지의 7mL와 함께 6웰 플레이트에 IVD를 놓습니다. - 실험 기간 동안 디스크 높이의 변화를 분석하기 위해, IVD 해부(baseline) 후 캘리퍼로 디스크 높이를 측정한 다음, 무료 붓기 기간 이후에 매일 및 실험 기간 동안 동적 로딩 후.
3. 무분별한 종양 괴사 인자 -알파 (TNF-α) 주입
- 첫날 첫 번째 동적 로딩 주기 직후, IVD를 페트리 접시에 수직 위치에 놓고 트위저로 IVD를 안정화시하십시오.
- 재조합 TNF-α(IVD당 PBS의 70 μL에서 100 ng)를 병리학군(17)의핵 펄포스 조직내30게이지 인슐린 바늘을 주입한다. 1 분 에 약 70 μL의 속도로 천천히 주입.
- 주사 후, 주사기를 IVD 내에서 반쯤 당겨 주사기 플런저를 당겨 주입된 용액이 다시 누출되는 것을 방지하는 진공을 만든 후, IVD에서 바늘과 주사기를 완전히 제거한다.
참고: 트립팬 블루 염료를 함유한 PBS를 주입하여 로딩 및 야간 배양 후 주입된 용액의 분포를 평가하여 파일럿 실험을 수행한다.
4. 유전자 발현
- 4일째에 IVD를 수확하십시오. 생검 펀치로 핵 펄포서스(NP) 조직(IVD 의 중간에 겔부분 부분)을 수집한다. 메스 블레이드(No.20)로 외부 판음 섬유증(AF)을 수집합니다.
참고: 0일째 기준기준 참조의 경우 RNA 추출을 위해 해부 직후 조직을 수집합니다. - 실험 설계에 따라 유전자 발현 분석에 필요한 NP 또는 AF 조직의 양을 사용한다.
참고: 본 실험의 경우 약 150 mg의 조직이 사용되었습니다. 조직 질량에 대한 RNA 격리 용액의 비율은 효율적인 추출을 위해 100-150 mg 조직 당 적어도 2 mL이어야한다. - 소화용액(DMEM의 PRONase 0.2%, 필터 살균)으로 NP 또는 AF 조직을 소화하고 자기 교반18로37°C에서 1시간 동안 배양한다.
- 액체 질소를 사용하여 조직 샘플을 플래시 동결시키고 미세 분말로 분쇄합니다. 분쇄된 조직 분말을 각각 1mL의 구아니딘 티오야네이트및 페놀을 포함하는 2개의 2mL 튜브로 동등하게 분할하여 모노위상 용액(RNA 절연 용액)에서 나눕니다.
- RNA 절연 용액 및 분쇄 조직 분말을 함유한 2mL 튜브에서 균질화를 수행한다. 조직 분말 5x를 8mm 스테인리스 스틸 볼과 30Hz의 티슈 리저로 3분 간 균질화합니다. 원심분리기는 12,000 x g,4°C에서 10분 동안 상류체를 신선한 튜브로 옮긴다. 초월제는 적어도 한 달 동안 -80 °C에서 저장할 수 있습니다.
- RNA 절연 용액 의 1 mL 당 1-브로모-3-클로로 프로판 (BCP)의 0.1 mL을 추가하고 15 s에 대해 적극적으로 흔들어. 결과 혼합물을 궤도 셰이커에 실온에서 15분 동안 저장하고 원심분리기는 4°C에서 15분 동안 12,000 x g로 저장합니다.
참고: RNA는 상부 수성 상에서 독점적으로 남아 있습니다. - 수성 상체를 초기 균질화에 사용되는 RNA 절연 용액의 1mL당 0.25 mL의 이소프로판올 및 0.25 mL의 고염 침전용으로 RNA를 침전시한다. 시료를 실온에서 15분 동안 실온에서 저장하여 궤도 셰이커와 원심분리기는 4°C에서 8분 동안 12,000 x g로 저장합니다.
참고: 대안적으로, 일반적으로 더 높은 RNA 순도그러나 더 낮은 RNA 수율로 이끌어 내는 컬럼 계 RNA 추출 방법을 사용하십시오. - 상체를 제거하고 RNA 펠릿을 초기 균질화에 사용되는 RNA 절연 용액 의 1 mL 당 75 % 에탄올1 mL로 세척하십시오. 원심분리기는 7,500 x g에서 4°C에서 5분 동안.
- 에탄올 세척을 제거하고 3-5 분 동안 간략하게 공기 건조 RNA 펠릿을 제거합니다. 피펫 팁을 통해 용액을 몇 번 전달하고 55-60°C에서 10-15분 동안 배양함으로써 처리된 물 인디틸피로카보네이트(DEPC)의 20μL에서 RNA를 용해한다.
- 흡광도는 230nm, 260nm, 280nm(각각 A230, A260 및 A280)에서 측정합니다. 1.0의 A260은 40 μg/mL RNA에 해당합니다. A260/A280 비율은 1.6-1.9로 예상되는 반면 오염으로 인해 A260/A280 비율은 <1.6입니다.
- 20 μL 반응 부피에 대한 역전사(RT) 반응 믹스를 준비한다. 혼합에는 RT 효소 믹스, 리보누클레스 억제제, 도우미 단백질, 프라이머, dNTPs, MgCl2,RNase 무료 물 및 RNA 샘플의 0.4 μg가 포함되어 있습니다.
- RT 튜브를 간략하게 원심분리하여 튜브 바닥의 모든 구성 요소를 혼합합니다.
- 샘플을 써모사이클러 기기에 배치합니다. RT에 적합한 프로그램을 선택하십시오. 25°C에서 10분 동안 RT를 실행하고, 42°C에서 120분 동안 역전사 단계를 밟고 85°C에서 5분 동안 역전사의 비활성화를 거쳐 마지막에 4°C까지 냉각한다.
- 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(Tris)-에틸렌디아민트라아세산(EDTA) (TE) 완충제(1mM EDTA)로 생성된 cDNA를 100 μL cDNA 용액당 RT에 사용되는 0.4 μg RNA의 최종 농도로 희석시켰다. cDNA 샘플을 -20°C에 저장합니다.
- 10 μL 반응 부피를 사용하여 실시간 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 수행합니다. 반응 부피는 마스터 믹스(DNA 중합효소를 함유하고, uracil-DNA 글리코슬라스, dUTP, 수동 레퍼런스 및 최적화된 완충 성분을 가진 dNTP), 전방 프라이머 45 μM, 리버스 프라이머 45 μM, 프로브 12.5 μM(프로브의 5'엔드에 연결된 기자 염료 포함, 프로브의 3'끝에 있는 사소한 그루브 바인더 및 비형광의 3엔드에 비형광 , 2 μL cDNA 및 DEPC 처리 된 물.
- 2-ΔΔCT 방법(19)을사용하여 상대적 정량화를 위한 내인성 제어(RPLP0)를 실행한다.
- 중복된 샘플에 샘플을 추가하고 cDNA 대신 TE 버퍼를 추가하여 템플릿 컨트롤을 실행하지 않습니다. 표준 조건에서 PCR을 실행하십시오 (50 °C에서 2 분, 95 °C에서 10 분, 95 °C에서 15 초40 사이클, 60 °C에서 1 분).
- 비교 CT 방법에 따라 mRNA 표적의 상대적 정량화를 수행한다. 기준선 시료로 정규화된 mRNA의 양은2-ΔΔCT,ΔΔCT는 기준선 샘플의 ΔCT(CT 표적-CT 내인성 제어)의 차이이다.
5. IVD 배지에서 단백질 함량의 정량화
- IVD 샘플에 의해 조절된 배지를 수집하여 배지내의 단백질 함량을 측정한다. 표적 단백질의 프로토콜에 따라 효소-연결된 면역흡소분석(ELISA)을 수행한다.
- 소 인터류킨-8 (IL-8)은 제조업체의 지시에 따라 항소 IL8 ELISA 키트에 의해 정량화된다.
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Representative Results
TNF-α 주입과 결합된 저포도당 배지의 퇴행성 적재는 4일간의 배양 후 NP 세포의 생리적 대조군에 비해 염증성 마커 인터류키 6(IL-6) 및 인터류키닌 8(IL-8)의 유전자 발현이 현저한 증가를일으켰다(도 2). 대조적으로, 우리는 NP 세포에서 염증 유전자 인터류인 1β (IL-1β) 및 TNF-α 대한 중요한 변화를 관찰하지 않았다 (데이터는 도시되지 않음). 더욱이, 퇴행성 배양 조건은 AF 세포에서 IL-6 및 IL-8의 유전자 발현을 변경하지 않았다.
도 2: 핵 펄포서스(NP) 조직 및 무분별 섬유증(AF) 조직에서 유전자 발현 수준이다. 이들은 생리학적 또는 병리학 적 배양 조건 하에서 배양 4 일 후에 측정되었으며 기준선 (0 일)으로 정규화되었습니다. 95% 신뢰 구간 n=8, **p<0.01을 ± 의미합니다. 이 그림은20에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
유전자 발현 결과와 일치하여, 배지내의 IL-8 단백질 함량은 생리적상태(도 3)에비해 2일 및 4일 후에 현저한 증가를 보였다. 그러나, 3일째(자유 부종 또는 적재 후)의 측정은 퇴행성 그룹에 대한 더 높은 값을 나타내었지만 연구 그룹 간에 유의한 차이를 나타내지 않았습니다.
도 3: 자유로운 부종 배양(FS) 및 동적 적재(Load) 후 IVD 배양 배지에서 프로 염증성 단백질 IL-8 방출의 정량화. 결과는 정규화 없이 매체에서 ng/mL의 원래 농도로 표시됩니다. 평균 ± 95% 신뢰 구간, n=8, **p<0.01. 이 그림은20에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
해부 후 DH로 정규화된 디스크 높이(DH) 변경 내용은 도 4에표시됩니다. 로딩 후 DH 감소는 생리군에 비해 퇴행성 군에 대한 더 높은 값(즉, 더 높이 감소)을 드러냈지만, 유동기간 이후에는 디스크 높이 상승에 차이가 없었다. 이것은 병리학적 및 생리성 그룹 사이의 디스크 높이 변화의 차이가 로딩 절차 후에 더 높았다는 것을 나타냈습니다. 더욱이, 그 차이는 퇴행성 및 염증 조건의 점진적 효과를 나타내는 2일과 3일에 측정에 비해 1일 후에 덜 두드러졌다.
그림 4: 디스크 높이 변경 내용이 기준값으로 정규화됩니다(해부 후). 평균 ± 95% 신뢰 구간. FS: 무료 붓기. N=10, ***p<0.001. 이 그림은20에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
우리는 여기에 퇴행성 및 염증 성 IVDD를 시뮬레이션하는 상세한 프로토콜을 제공했다. 이 프로토콜은 디스크에 파괴적인 효과로 이어지는 염증 경로의 상세한 검사를 신청할 수 있습니다. 더욱이, 프로토콜은 질병의 진행에 관련시키는 유망한 치료 표적을 결정하는 것을 도울 수 있습니다.
최근에는 인간 재조합 TNF-α 소와 인간 NP세포(21)의염증을 유발할 수 있음을 보여주었는데, 이는 TNF-α IVD세포(22,23)의염증 시뮬레이션에 사용될 수 있음을 확인하는 분야의 다른 연구에 따른 것이다. 본 연구에서는, IVD 당 100 ng TNF-α 의 투여량은 염증을 유도하기 위해 사용되었다. 이 복용량은 퇴행성 적재 및 제한된 영양15,20과함께 적용 할 때 염증 성 마커의 효과적인 유도를 보였다. 최근 연구에서는 TNF-α IVD 퇴행성의 유일한 개시 인자로, 100ng TNF-α/cm3 디스크 부피의 임계값은 IVD21의염증 및 퇴행성 변화의 유도를 위한 효과적인 투여량으로 결정되었다. 염증을 유도하는 데 사용되는 TNF-α 투여량은 재현 가능한 효과를 위해 디스크의 부피로 정상화되어야 한다는 것이 좋습니다. 더욱이, IVD에서 주사 물질의 좋은 분포가 있고 이 주입이 후속 실험에서 적절히 재현될 것이라는 것을 확인되어야 한다. 주입 압력은 개별 사이에서 다를 수 있기 때문에, 다른 실험에 있는 동일 연구 단 중 자료의 다른 분포가 있을 지도 모릅니다. 우리가 동등한 분포를 검토하기로 선택한 한 가지 방법은 PBS 희석 된 trypan 블루 주사를 사용하는 것이었습니다. 사출 기술을 표준화하는 것이 좋습니다, 예를 들어, 사출 펌프와 미리 정의 및 재현 가능한 사출 비율. 앞서 나타난 바와 같이, IVD내22게이지, 25게이지 또는 30게이지 바늘을 가진 단일 바늘 천자 하나도연구 결과(20,21,24,25)와상호 작용하는 효과를 일으키지 않았다. 주입되는 물질의 부피와 주사에 사용되는 바늘 크기에 대한 디스크 크기를 고려하는 것이 좋습니다. 또한, 다중 환상주사(21,26)로인한 잠재적 퇴행성 효과를 유도하지 않도록 단일 주사를 사용하는 것이 좋습니다.
현재 모델의 몇 가지 제한 사항은 해결해야 합니다. IVD의 로딩은 현재 IDD에서 작업하는 많은 실험실에서 널리 사용할 수 없는 생물 반응기에 대한 액세스가 필요합니다. 그러나, 전임상 IVD 변성 모델에 대한 필요성이 증가하고 있다. 장기 배양 모델은 동물 모델의 필요성을 줄이는 윤리적 이점을 가져오며, 퇴행성 자극의 재현성 및 동물 실험과 관련된 비용의 감소를 고려하여 생물 반응기 비용에 대한 일회성 투자가 저렴할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 면역 계통의 역할과 같은 생체 내 상호 작용은 제공된 장기 배양 모델로 시뮬레이션할 수 없습니다. 더욱이, 신경 신호의 측정및 동물 모형에서 가능할 고통의 평가는 현재 모형으로 고려될 수 없습니다. 꼬리 IVDs의 기계적 특성이 인간28에서유일하기 때문에 꼬리 IVDs의 기계적 특성이 인간 IVD와 비교할 수 있는지 여부에 대한 우려가 제기되었습니다. 세포 밀도, 노토코드 세포의 부족, 생화학 조성29,30및 굴곡, 확장, 비틀림 및굽힘(31)의 운동 범위와 같은 소 소 소 의 기계적 특성과 같은 소 꼬리 IVDs의 해부학적 및 분자 특성은 인간 IVD와 매우 유사하다. 특히, 인간 IVDs는 장기 배양모델(28)에대해 최근 점점 더 많은 관심을 얻고 있다. 전 생체 모델의 인간 cadaveric IVDs는 임상적으로 더 관련성이 높은 종 차이를 피할 수 있기 때문에 매우 효율적인 것으로 간주됩니다32. 아바토이르로부터 얻은 소 IVD 꼬리와는 달리, 이것은 인간 IVDs 24 h 사후 모템의 이식이 필요하며, 따라서 지역 장기이식법(28)에따른 윤리적 승인이 필요합니다. 본 방법은 다른 종에도 쉽게 적응할 수 있다.
ex vivo 배양의 다른 방법에 비해 기술의 한 가지 주요 장점은 퇴행성 디스크의 초기 단계를 더 잘 시뮬레이션하기 위해 무분별 한 주입, 병리학 적 중간 조건 및 해로운 로딩의 조합입니다. Walter et al.23은 IVDs에 주입하는 대신 동적으로 로드된 소 IVDs의 배지에서 TNF-알파를 사용했으며, 당사의 결과에 따른 제눌루스 섬유소에 비해 배지에서 핵 펄포소로 TNF-알파의 수송이 증가하는 것으로 나타났다. 디스크아키텍처(12)의큰 중단 없이 세포 수준에서 발생하는 IDD의 초기 단계를 시뮬레이션하기 위해 배지에서 TNF-알파를 사용하여 이전 장기 배양 연구를 기반으로 TNF-알파 농도를 선택하여 IDD12,22,23의초기 단계를 시뮬레이션하였다. TNF-알파의 다른 염증성 각성제 및 더 높은 농도의 사용은 연구 질문에 따라 원하는 퇴행성 디스크 상태를 시뮬레이션하기 위해 테스트될 수 있었다. TNF-알파의 높은 농도는 Ponnappan et al. 12에 의해 제안된 바와 같이 디스크 변성 도중 존재하는 전신 면역 조절 피드백의 부족을 더 잘 보상할 수있습니다. 12 저혈당을 가진 해로운 중간 조건의 사용은 영양적으로 제한되는 매체및 TNF 알파에 대한 노출이 초기 디스크 퇴행성 상태에서 유효하다는 것을 보여주는 이전 작업에 근거를 두었기 때문에 초기 디스크 퇴행성12,277에서사용할 수 있는 분자 변화 특성을 모방하였다. 따라서, 접근법은 초기 퇴행성 디스크 질환의 한 전 생체 기관 배양 모델에서 이전 연구에서 제공하는 증거를 결합한다.
이 프로토콜은 여러 가지 방법으로 더 개선 될 수 있습니다. 하중 및 자유 부종 기간의 지속 시간 및 범위는 원하는 연구 계획에 따라 선택할 수 있습니다. 디스크 퇴화에 대한 염증성 또는 퇴행성 자극의 장기적인 효과는 높은 임상 적 관심사이며 현재 프로토콜로 달성 될 수 있습니다. 우리는 IDD11의초기 상태에 대해 매우 관련이 있는 것으로 간주되는 선택된 유전자만 사용했습니다. 이 모형의 추가 검증은 omics 접근과 같은 유전자와 단백질의 확대된 평가를 포함할 수 있었습니다. 따라서, 다른 염증 성 요인은 원하는 퇴행성 상태에 따라 퇴행성 적재와 함께 조사 될 수있다. 예를 들어, 리포폴리사카라이드 주사는 IVD33에서염증을 자극하는 것으로 나타났다. 다른 염증 성 각성의 비교는 원하는 연구 질문에 가장 적합한 염증 성 각성제를 찾기 위해 현재 의정서와 함께 달성 될 수있다. 본프로토콜(20)을통해 선택된 염증성 마커(IL-6, IL-8), 단백동화 마커(아그리칸, 콜라겐), 및 이환마커(매트릭스 메탈로펩티다제, 혈전폰딘 모티프를 가진 불신한 및 금속단백질제)의 변화를 평가하였다. 전체 유전자 발현 프로필이 변경될 수 있기 때문에, 미래 검사는 초기 생물학 내정간섭을 위한 디스크 변성 진단 및 치료 표적을 위한 새로운 biomarkers를 결정하기 위하여 차세대 RNA 시퀀싱 기술을 포함할 수 있었습니다. 더욱이, 조직학, 면역조직화학적 염색, 세포외 매트릭스 성분의 생화학적 측정(예: 글리코사미노글리산, GAGs) 및 동적 압축 성 검사와 같은 다른 방법론은 본 모델을 사용하여 IVD의 생물학적, 생화학적 및 생화학적 특성을 더욱 분석하기 위해 수행될 수 있다. 또 다른 가능한 분석 방법은 bCol1a1, Col1a2, CD146, SM22α 및 MKX를 외부 AF34,35에대한 유전자 발현 마커로 사용하여 외부 AF 및 NP 조직에 미치는 영향을 별도로 분석하는 것이다. 뉴올리언스에서 열린 2014 연례 ORS 회의에서 척추 연구 관심 그룹은 건강한 NP 페노티픽 마커에 따라 권장: HIF-1alpha, GLUT-1, 아그레칸/콜라겐 II 비율 >20, Shh, Brachyury, KRT18/19, CA12, CD2436. NP 마커 유전자 bBrachyury/T 및 bSecreted 곱슬머리 관련 단백질 2는 소 IVD34에서내부 및 외부 AF 조직에서 NP를 분리하는 가장 설득력 있는 단백질이었다. 더욱이, NP의 SGAG 함량은 외부AF(34)에비해 상당히 높은 것으로 보고되었다.
결론적으로, 이 새로운 선동성 및 퇴행성 IVD 장기 배양 모형은 매우 관련성이 높은 3D 마이크로 환경에서 초기 단계 IDD를 시뮬레이션하기 위하여 관련 조건을 제공합니다. 물론, 현재 프로토콜은 조사자의 목표에 따라 더 수정될 수 있습니다. 또한, 우리의 모델은 필요한 연구 동물의 수를 줄일 수 있으므로 완전히 감소, 교체, 정제의 3R 원칙을 반영합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 AO 재단과 AOSpine 인터내셔널에 의해 지원되었다. 바박 사라비는 독일 척추 재단과 독일 골관절염 재단으로부터 펠로우십 지원을 받았다. 게르노 랭은 고급 임상의 과학자를위한 베르타 - 오텐슈타인 프로그램에 의해 지원되었다, 의학 학부, 프라이부르크 대학, 독일.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Bromo-3-chloropropane(BCP) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | B9673 | |
| Ascorbate-2-phosphate | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | A8960 | |
| Band saw | Exakt Apparatebau, Norderstedt, Germany | model 30/833 | |
| Betadine | Munndipharma, Frankfurt, Germany | ||
| Bovine IL-8 Do.it-Yourself ELISA | Kingfisher Biotech, St. Paul, USA | DIY1028B-003 | |
| Corning ITS Premix | Corning Inc., New York, USA | 354350 | |
| DMEM high glucose | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 10741574 | |
| DMEM low glucose | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 11564446 | |
| Ethanol for molecular biology | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 09-0851 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | A4766801 | |
| Non-essential amino acid solution | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 11140050 | |
| Penicillin/Streptomycin(P/S) | gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 11548876 | |
| Phosphate Buffer Solution, tablet | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P4417 | |
| Pronase | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 10165921001 | |
| Primocin | InvivoGen, Sandiego, USA | ant-pm-05 | |
| Pulsavac Jet Lavage System | Zimmer, IN,USA | ||
| TissueLyser II | Quiagen, Venlo, Netherlands | 85300 | |
| Streptavidinn-HRP | Kingfisher Biotech, St. Paul, USA | AR0068-001 | |
| Superscript VILO | Invitrogen by life Technologies, Carlsbad, USA | 10704274 | |
| cDNA Synthesis Kit | Applied Biosystems by life technologies | 10400745 | |
| TaqMan Universal Master Mix | Applied Biosystems by life technologies | ||
| TNF-alpha, recombinant human protein | R&D systems, Minnesota, USA | 210-TA-005 | |
| TRI Reagent | Molecular Research Center, Cincinnati, USA | TR 118 | |
| Tris-EDTA buffer solution | sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 93283 | |
| Gene bIL-6 | Applied Biosystems by life technologies | Custom made probes | Primer fw (5′–3′) TTC CAA AAA TGG AGG AAA AGG A Primer rev (5′–3′) TCC AGA AGA CCA GCA GTG GTT Probe (5′FAM/3′TAMRA) CTT CCA ATC TGG GTT CAA TCA GGC GATT |
| Gene bIL8 | Applied Biosystems by life technologies | Bt03211906_m1 | |
| Gene bTNF-alpha | Applied Biosystems by life technologies | Custom made probes | Primer fw (5′–3′) CCT CTT CTC AAG CCT CAA GTA ACA A Primer rev (5′–3′) GAG CTG CCC CGG AGA GTT Probe (5′FAM/3′TAMRA) ATG TCG GCT ACA ACG TGG GCT ACC G |
| GENE bIL1beta | Applied Biosystems by life technologies | Custom made probes | Primer fw (5′–3′) TTA CTA CAG TGA CGA GAA TGA GCT GTT Primer rev (5′–3′) GGT CCA GGT GTT GGA TGC A Probe (5′FAM/3′TAMRA) CTC TTC ATC TGT TTA GGG TCA TCA GCC TCA A |
| RPLP0 | Applied Biosystems by life technologies | Bt03218086_m1 |
References
- Vos, T., et al. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 328 diseases and injuries for 195 countries, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet. 390 (10100), 1211-1259 (2017).
- Hoy, D., et al. Measuring the global burden of low back pain. Best Practice & Research Clinical Rheumatology. 24 (2), 155-165 (2010).
- Thiese, M. S., et al. Prevalence of low back pain by anatomic location and intensity in an occupational population. BMC Musculoskeletal Disorders. 15 (1), 283 (2014).
- Katz, J. N. Lumbar Disc Disorders and Low-Back Pain: Socioeconomic Factors and Consequences. The Journal of Bone and Joint Surgery (American). 88, suppl_2 21 (2006).
- Vlaeyen, J. W. S., et al. Low back pain. Nature Reviews Disease Primers. 4 (1), 52 (2018).
- Khan, A. N., et al. Inflammatory biomarkers of low back pain and disc degeneration: a review: Biomarkers of disc degeneration and back pain. Annals of the New York Academy of Sciences. 1410 (1), 68-84 (2017).
- Kim, H. S., Wu, P. H., Jang, I. T. Lumbar Degenerative Disease Part 1: Anatomy and Pathophysiology of Intervertebral Discogenic Pain and Radiofrequency Ablation of Basivertebral and Sinuvertebral Nerve Treatment for Chronic Discogenic Back Pain: A Prospective Case Series and Review of Literature. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1483 (2020).
- Adams, M. A., Roughley, P. J. What is Intervertebral Disc Degeneration, and What Causes It. Spine. 31 (18), 2151-2161 (2006).
- Wu, P. H., Kim, H. S., Jang, I. T. Intervertebral Disc Diseases Part 2: A Review of the Current Diagnostic and Treatment Strategies for Intervertebral Disc Disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (6), 2135 (2020).
- Lurie, J. D., et al. Surgical Versus Nonoperative Treatment for Lumbar Disc Herniation: Eight-Year Results for the Spine Patient Outcomes Research Trial. Spine. 39 (1), 3-16 (2014).
- Risbud, M. V., Shapiro, I. M. Role of cytokines in intervertebral disc degeneration: pain and disc content. Nature Reviews Rheumatology. 10 (1), 44-56 (2014).
- Ponnappan, R. K., et al. An organ culture system to model early degenerative changes of the intervertebral disc. Arthritis Research & Therapy. 13 (5), 171 (2011).
- O'Connell, G. D., Vresilovic, E. J., Elliott, D. M. Comparison of Animals Used in Disc Research to Human Lumbar Disc Geometry. Spine. 32 (3), 328-333 (2007).
- Stannard, J. T., et al. Development of a whole organ culture model for intervertebral disc disease. Journal of Orthopaedic Translation. 5, 1-8 (2016).
- Li, Z., et al. Preclinical ex-vivo Testing of Anti-inflammatory Drugs in a Bovine Intervertebral Degenerative Disc Model. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 583 (2020).
- Li, Z., et al. Development of an ex vivo cavity model to study repair strategies in loaded intervertebral discs. European Spine Journal. 25 (9), 2898-2908 (2016).
- Kazezian, Z., Li, Z., Alini, M., Grad, S., Pandit, A. Injectable hyaluronic acid down-regulates interferon signaling molecules, IGFBP3 and IFIT3 in the bovine intervertebral disc. Acta Biomaterialia. 52, 118-129 (2017).
- Caprez, S., Menzel, U., Li, Z., Grad, S., Alini, M., Peroglio, M. Isolation of high-quality RNA from intervertebral disc tissue via pronase predigestion and tissue pulverization. JOR Spine. 1 (2), 1017 (2018).
- Lopa, S., Ceriani, C., Cecchinato, R., Zagra, L., Moretti, M., Colombini, A. Stability of housekeeping genes in human intervertebral disc, endplate and articular cartilage cells in multiple conditions for reliable transcriptional analysis. European Cells & Materials. 31, 395-406 (2016).
- Lang, G., et al. An intervertebral disc whole organ culture system to investigate proinflammatory and degenerative disc disease condition. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (4), 2051-2061 (2018).
- Du, J., et al. Proinflammatory intervertebral disc cell and organ culture models induced by tumor necrosis factor alpha. JOR Spine. 3, 1104 (2020).
- Purmessur, D., Walter, B. A., Roughley, P. J., Laudier, D. M., Hecht, A. C., Iatridis, J. A role for TNFα in intervertebral disc degeneration: A non-recoverable catabolic shift. Biochemical and Biophysical Research Communications. 433 (1), 151-156 (2013).
- Walter, B. A., Likhitpanichkul, M., Illien-Junger, S., Roughley, P. J., Hecht, A. C., Iatridis, J. C. TNFα Transport Induced by Dynamic Loading Alters Biomechanics of Intact Intervertebral Discs. PLOS One. 10 (3), 0118358 (2015).
- Gullbrand, S. E., et al. A large animal model that recapitulates the spectrum of human intervertebral disc degeneration. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (1), 146-156 (2017).
- Willems, N., et al. Safety of intradiscal injection and biocompatibility of polyester amide microspheres in a canine model predisposed to intervertebral disc degeneration: intradiscal application of pea microspheres. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 105 (4), 707-714 (2017).
- Michalek, A. J., Buckley, M. R., Bonassar, L. J., Cohen, I., Iatridis, J. C. The effects of needle puncture injury on microscale shear strain in the intervertebral disc annulus fibrosus. The Spine Journal. 10 (12), 1098-1105 (2010).
- Illien-Jünger, S., et al. The combined effects of limited nutrition and high-frequency loading on intervertebral discs with endplates. Spine. 35 (19), 1744-1752 (2010).
- Gantenbein, B., et al. Organ culture bioreactors--platforms to study human intervertebral disc degeneration and regenerative therapy. Current Stem Cell Research & Therapy. 10 (4), 339-352 (2015).
- Boubriak, O. A., Watson, N., Sivan, S. S., Stubbens, N., Urban, J. P. G. Factors regulating viable cell density in the intervertebral disc: blood supply in relation to disc height. Journal of Anatomy. 222 (3), 341-348 (2013).
- Maroudas, A., Stockwell, R. A., Nachemson, A., Urban, J. Factors involved in the nutrition of the human lumbar intervertebral disc: cellularity and diffusion of glucose in vitro. Journal of Anatomy. 120, Pt 1 113-130 (1975).
- Beckstein, J. C., Sen, S., Schaer, T. P., Vresilovic, E. J., Elliott, D. M. Comparison of Animal Discs Used in Disc Research to Human Lumbar Disc: Axial Compression Mechanics and Glycosaminoglycan Content. Spine. 33 (6), 166-173 (2008).
- Walter, B. A., Illien-Jünger, S., Nasser, P. R., Hecht, A. C., Iatridis, J. C. Development and validation of a bioreactor system for dynamic loading and mechanical characterization of whole human intervertebral discs in organ culture. Journal of Biomechanics. 47 (9), 2095-2101 (2014).
- Rajan, N. E., et al. Toll-Like Receptor 4 (TLR4) Expression and Stimulation in a Model of Intervertebral Disc Inflammation and Degeneration. Spine. 38 (16), 1343-1351 (2013).
- vanden Akker, G. G., Rorije, A. J., Davidson, E. N. B., vander Kraan, P. M. Phenotypic marker genes distinguish inner and outer annulus fibrosus from nucleus pulposus tissue in the bovine intervertebral disc. Osteoarthritis and Cartilage. 25, 402 (2017).
- Du, J., et al. Functional cell phenotype induction with TGF-β1 and collagen-polyurethane scaffold for annulus fibrosus rupture repair. European Cells & Materials. 39, 1-17 (2020).
- Risbud, M. V., et al. Defining the phenotype of young healthy nucleus pulposus cells: recommendations of the Spine Research Interest Group at the 2014 annual ORS meeting. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 33 (3), 283-293 (2015).
