Summary
Denne protokol præsenterer en ny eksperimentel model af proinflammatorisk, degenerativ kvægorgankultur for at simulere tidlig intervertebral diskdegeneration.
Abstract
Symptomatisk intervertebrale disk (IVD) degeneration (IDD) er en stor socioøkonomisk byrde og er kendetegnet ved betændelse og vævsforringelse. På grund af manglen på årsagssammenhænge er der et presserende behov for innovative eksperimentelle organkulturmodeller for at studere de mekanismer, der er involveret i sygdommens progression, finde terapeutiske mål og reducere behovet for dyremodeller. Vi præsenterer her en ny, tredimensionel organkulturmodelprotokol, der efterligner det proinflammatoriske og kataboliske mikromiljø, som er til stede under IDD.
I første omgang blev kvæg kaudale IVD'er dissekeret, renset og dyrket i vævskulturmediet. Dynamisk fysiologisk eller patologisk belastning blev anvendt i en specialfremstillet bioreaktor i 2 timer om dagen. IVD'er blev tildelt en kontrolgruppe (høj glukosemedium, fysiologisk belastning, fosfatbufferet saltvandsindsprøjtning) og en patologisk gruppe (lavt glukosemedium, patologisk belastning, tumornekrosefaktor-alfainjektion) i fire dage. Der blev udført analyse af genekspression fra indsamlede kernen pulposusceller i IVD'erne og enzymrelateret immunosorbentanalyse af de betingede organkulturmedier.
Vores data afslørede et højere udtryk for inflammatoriske markører og reducerede skivehøjder efter indlæsning i den patologiske gruppe sammenlignet med kontrolgruppen. Denne protokol er pålidelig til at simulere IVD inflammation og degeneration og kan udvides yderligere for at udvide dens anvendelsesområde.
Introduction
Lbp (Low Back Pain) kan påvirke personer i alle aldre og er en af de vigtigste årsager til handicap på verdensplan1,2,3. De samlede omkostninger forbundet med LBP overstiger 100 mia. Symptomatisk intervertebrale disk (IVD) degeneration (IDD), en tilstand karakteriseret ved betændelse og vævsforringelse, er en væsentlig årsag til LBP6,7. Specifikt er IDD karakteriseret ved en gradvist udviklende nedbrydning af IVD's ekstracellulære matrix (ECM), induceret og udløst af flere faktorer, der fører til en accelereret patologi, neurologiske lidelser og i sidste ende handicap. Desuden er IDD forbundet med frigivelsen af proinflammatoriske cytokiner, ændrede rygsøjlebiomekanik, angiogenese og nerveindvækst, hvilket øger smertefornemmelse, der helt forårsager kronisk LBP (aktiv discopati)6,8. Til dato omfatter behandlingsmuligheder discektomi og efterfølgende fusion af de tilstødende hvirvler, implantation af en IVD-protese eller ikke-kirurgiske tilgange, såsom ikke-steroide antiinflammatoriske lægemidler, opioider og muskelafslappende midler til patienter med IDD9. Begge nuværende standard terapeutiske muligheder, kirurgiske og ikke-kirurgiske, er kun delvist effektive og undlader at løse det underliggende biologiske problem9,10. Tidlig degenerativ disk disease er karakteriseret ved en indledende inflammatorisk vævsrespons, især en stigning i tumornekrosefaktor-alpha (TNF-alpha) udtryk11. Disse tidlige diskændringer sker primært på celleniveau uden at forstyrre diskarkitekturen og kan tidligere efterlignes af ernæringsmæssig mangel under proinflammatoriske tilstande12. Derfor er præcis simulering af in vivo-situationen for at undersøge disse degenerationsmekanismer og finde passende terapeutiske mål afgørende. Derudover spiller diskens mekaniske belastningsmiljø en central rolle i patologiske og fysiologiske ændringer af IVD. Derfor ville en kombination af disse tilgange bringe os et skridt fremad for at efterligne det komplekse mikromiljø af ivds in vivo. Der er i øjeblikket ingen undersøgelser i betragtning af aspektet af dynamisk belastning sammen med de proinflammatoriske og ernæringsmæssige omgivelser efter vores bedste viden.
Selv om store dyremodeller gør det muligt at undersøge potentielle relevante in vivo-interaktioner, er de dyre og arbejdsintensive. Da brugen af dyremodeller i forskning længe har været genstand for kontroverser, er reduktionen af antallet af dyr, der er nødvendige for at besvare vigtige forskningsspørgsmål, af stor interesse. Endelig er der i øjeblikket ingen ideel dyremodel til at efterligne IDD i IVD forskning13,14. Derfor er det nødvendigt at etablere en omkostningseffektiv og pålidelig udskiftning, såsom en organkulturmodel for at simulere IDD og tilknyttede inflammatoriske og degenerative processer. For nylig gav anvendelsen af denne protokol om oprettelse af en proinflammatorisk og degenerativ organkulturmodel til simulerer tidlig intervertebrale disk disease os mulighed for at undersøge effekten af antiinflammatoriske lægemidler i IDD-organkulturen15.
Her beskriver vi, hvordan man opnår kvæg intervertebral diske og fremkalde tilstanden af tidlige fase IDD via en katabolsk og proinflammatorisk mikromiljø forårsaget af direkte intradiscal injektion af tumor nekrose faktor-alpha (TNF-α) og degenerativ belastning i en bioreaktor under lav næringsrige medium betingelser. Figur 1 illustrerer forsøgsmodellen og viser den bioreaktor, der anvendes til at simulere degenerative og fysiologiske belastningsforhold.
Figur 1: Illustration af den eksperimentelle opsætning. A: kvæghale; B: dissekeret mellemdiske diske af kvæg; C: overførsel af skiven til en brøndplade med dyrkningsmedium; D: indlæsning af simuleringen i en bioreaktor E: intradiscal injektionsteknik; F: IVD efter injektion af PBS/trypan blå farvestof for at afsløre distributionen. IDD: intervertebral disk degeneration. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Der blev udført forsøg med kvæghaler fra lokale slagterier. De biologiske materialer, der anvendes i den aktuelle undersøgelse, er taget fra fødekæden og kræver ingen etisk godkendelse i schweizisk og europæisk lovgivning.
1. Dissektion af bovinets intervertebrale skive
- Skyl hele halen grundigt med vand fra hanen for at fjerne snavs og hår på overfladen.
BEMÆRK: Med intakte, distale ender kan der maksimalt anvendes 9 IVD'er (hale 1-9) pr. hale til forsøgene afhængigt af ivd'ernes ønskede størrelse. I betragtning af den ønskede diameter mellem 15-20 mm brugte vi 12 kvæghaler med 5 IVD pr. Hale til forsøgene. - Fordyb hele halen i en kasse, der indeholder 1% betadinopløsning i 10 minutter. Tør kortvarigt halen med steril gaze og læg den på en steril drapering.
BEMÆRK: Under dissektion af disken, befugte halerne med Ringer's løsning fugtet gaze for at forhindre dehydrering. Opbevar halerne (eller sidestenssegmenterne) indpakket i våd gaze, indtil hele dissektionsproceduren er afsluttet. - Brug en skalpel (nr. 20) til at fjerne det bløde væv så fuldstændigt som muligt fra den kaudale rygsøjle for at lette identifikationen af IVD'erne. Fjern de spinøse og tværgående processer i hvirvlerne med knoglefjernelsestænger.
BEMÆRK: Vælg IVD'er med den ønskede diameter. Ivd'er med en diameter på 15-20 mm blev anvendt i den aktuelle undersøgelse. - Skær tværgående med knogletænger gennem midten af hvert hvirvellegeme for at opnå individuelle bevægelsessegmenter. Sæt bevægelsessegmenter i en petriskål med gaze betændt med Ringers løsning.
- Find IVD og ryghvirvel ved palpation og ved at flytte bevægelsessegmenterne forsigtigt. Lav to parallelle snit med båndsaven i vækstpladen på IVD'erne, en på hver side af IVD. Identificer placeringen af vækstpladen ved at røre ved og finde konvekst sted for den benede endepladedel (hård) ved siden af disken (blød) med en sikkerhedsafstand på ca. 0,5-1 mm fra IVD mod ryghvirvlen. Sørg for, at klingen på båndsaven afkøles med Ringers opløsning, mens ryghvirvlerne skæres.
- Overfør IVD'er i en ren petriskål med ren gaze betændt med Ringers opløsning.
BEMÆRK: Gaze skal fugtes og ikke være for vådt til at forhindre hævelse af IVD'erne, - Brug skalpelbladet til at skrabe rygsøjlen af (rød/lyserød knogle), vækstplade (hvid brusk), lad endepladen være intakt (gul-pink). Gør de to overflader flade og parallelle til lasteproceduren. Overfør skrabede IVD'er til en frisk petriskål med gaze betændt med Ringers opløsning.
BEMÆRK: Brug en chainmail-handske for at beskytte hånden, mens du holder IVD og skrabning. - Mål skivens højde og diameter med en caliper. Rengør blodpropper i ryghvirvlerne knogle med Ringer's løsning ved hjælp af en jet lavage system.
- Overfør IVD'erne til 50 mL plastrør, en IVD pr. rør. Der tilsættes 25 ml fosfat-bufferet saltvand (PBS) + 10% Penicillin/Streptomycin (P/S) pr. IVD, og det ryster i 15 minutter på en orbital shaker ved stuetemperatur.
- Aspirere supernatant og tilsæt 10 mL PBS + 1% P / S pr IVD i 2 min for at skylle IVD'erne.
2. IVD kultur og lastning
- Overfør skiver til IVD-kamre og tilsæt IVD-dyrkningsmedium (Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, 4,5 g/L høj glukose DMEM for den fysiologiske gruppe og 2 g/L lav glukose DMEM for den patologiske gruppe) + 1% P/S + 2% føtal kalveserum + 1% ITS (indeholder 5 μg/mL insulin, 6 μg/mL transferrin og 5 ng/mL selensyre) + 50 μg/mL ascorbat-2-fosfat + 1% ikke-essentiel aminosyre + 50 μg/mL antimikrobielt middel til primærceller) og anbringes i en inkubator ved 37 °C, 85% fugtighed og 5% CO2.
- Kultur diskene i 4 dage inden for et bioreaktorsystem i henhold til eksperimentelle grupper16. I den patologiske gruppe skal du opretholde degenerative belastningsforhold ved 0,32-0,5 MPa, 5 Hz i 2 timer om dagen. I den fysiologiske kontrolgruppe skal du bruge en lasteprotokol på 0,02-0,2 MPa, 0,2 Hz i 2 timer om dagen.
BEMÆRK: Placer IVD'erne i kamre, der indeholder 5 mL IVD-medium, under indlæsningsprocedurerne. Volumenet afhænger af størrelsen af bioreaktorens lastekamre. Mellem lasteprocedurerne skal du placere IVD'erne i seksbrøndsplader med 7 mL IVD-dyrkningsmedie for fritrensende opsving. - Til analyse af ændringerne i diskhøjden i forsøgsperioden måles skivehøjden med en caliper efter IVD-dissektion (baseline) og derefter dagligt efter den frie hævelsesperiode og efter dynamisk belastning i forsøgsperioden.
3. Intradiscal tumor nekrose faktor-alpha (TNF-α) injektion
- Umiddelbart efter den første dynamiske belastningscyklus på dag 1 skal du placere IVD'erne i en petriskål i lodret position og stabilisere IVD'erne med en pincet.
- Der tilføres rekombinant TNF-α (100 ng i 70 μL PBS pr. IVD) med en 30-gauge insulinnål i kernen pulposusvævet i den patologiske gruppe17. Injiceres langsomt med en hastighed på ca. 70 μL på 1 min.
- Efter injektionen trækkes sprøjten halvvejs tilbage i IVD'en, og sprøjtestemplet trækkes for at skabe et vakuum, der forhindrer den injicerede opløsning i at lække tilbage, før du fjerner kanylen og sprøjten helt fra IVD' en.
BEMÆRK: Udfør et pilotforsøg ved at injicere PBS, der indeholder trypanblåt farvestof, for at evaluere fordelingen af den injicerede opløsning efter pålæsning og overnatningskultur.
4. Genekspression
- Høst IVD'erne på dag 4. Opsamle kernen pulposus (NP) væv (gelly del i midten af IVD) med en biopsi punch. Saml den ydre annulus fiber (AF) med en skalpelblad (No.20).
BEMÆRK: Til basisreferencen på dag 0 opsamles væv umiddelbart efter dissektion til RNA-ekstraktion. - Brug mængden af NP eller AF væv er nødvendig for genekspression analyse, afhængigt af det eksperimentelle design.
BEMÆRK: Til de nuværende forsøg blev der anvendt ca. 150 mg væv. Forholdet mellem RNA-isoleringsopløsning og vævsmasse skal være mindst 2 ml pr. 100-150 mg væv for effektiv ekstraktion. - NP- eller AF-vævet fordøjes med fordøjelsesopløsningen (0,2% pronase i DMEM, filtersteriliseret) og inkuberes i 1 time ved 37 °C under magnetisk omrøring18.
- Flash-fryse vævsprøver ved hjælp af flydende nitrogen og pulverisere til et fint pulver. Pulveriseret vævspulver opdeles ligeligt i to 2 ml rør, der hver indeholder 1 ml guanidinthocyanat og phenol i en monofaseopløsning (RNA-isoleringsopløsning).
- Homogeniseringen udføres i 2 ml rør, der indeholder RNA-isoleringsopløsningen og pulveriseret vævspulver. Homogeniser vævspulveret 5x med en 8 mm kugle i rustfrit stål og en vævslyzer ved 30 Hz i 3 min. Centrifuge ved 12.000 x g, 4 °C i 10 minutter og overføre supernatanten til et frisk rør. Supernatanterne kan opbevares ved -80 °C i mindst en måned.
- Der tilsættes 0,1 ml 1-bromo-3-chlorpropan (BCP) pr. 1 ml RNA-isoleringsopløsning, og der rystes kraftigt i 15 s. Den resulterende blanding opbevares ved stuetemperatur på en orbital shaker i 15 min. og centrifuge ved 12.000 x g i 15 minutter ved 4 °C.
BEMÆRK: RNA'et forbliver udelukkende i den øverste vandige fase. - Den vandige fase overføres til et friskrør og bundfalds-RNA med 0,25 ml isopropanol og 0,25 ml høj saltudfældningsopløsning pr. 1 ml RNA-isoleringsopløsning, der anvendes til indledende homogenisering. Prøverne opbevares ved stuetemperatur i 15 minutter på en orbital shaker og centrifuge ved 12.000 x g i 8 min ved 4 °C.
BEMÆRK: Alternativt kan du bruge den kolonnebaserede RNA-ekstraktionsmetode, som generelt fører til højere RNA-renhed, men lavere RNA-udbytte. - Supernatanten fjernes, og RNA-pellet vaskes med 1 ml 75% ethanol pr. 1 ml RNA-isoleringsopløsning, der anvendes til indledende homogenisering. Centrifuge ved 7.500 x g i 5 min ved 4 °C.
- Fjern ethanolvasken og lufttørre RNA-pelleten i 3-5 min. RNA'et opløses i 20 μL diethylpyrocarbonat (DEPC) behandlet vand ved at føre opløsningen et par gange gennem en pipettespids og inkubere i 10-15 minutter ved 55-60 °C.
- Absorbansen måles ved 230 nm, 260 nm og 280 nm (henholdsvis A230, A260 og A280). A260 på 1,0 svarer til 40 μg/mL RNA. Der forventes et A260/A280-forhold på 1,6-1,9, mens kontaminering resulterer i et A260/A280-forhold på <1,6.
- Der fremstilles en omvendt transskriptionsase (RT) reaktionsblanding for et 20 μL reaktionsvolumen. Blandingen indeholder RT-enzymblanding, ribonukleasehæmmer, hjælpeprotein, primere, dNTP'er, MgCl2, RNase-frit vand og 0,4 μg RNA-prøve.
- Centrifuger kortvarigt RT-rørene for at blande alle komponenterne i bunden af røret.
- Prøverne anbringes i termocykelinstrumentet. Vælg det relevante program til RT. Kør RT i 10 min ved 25 °C efterfulgt af det omvendte transskriberingstrin i 120 min ved 42 °C og inaktivering af den omvendte transskriptionase i 5 minutter ved 85 °C, afkøling til 4 °C i slutningen.
- Den resulterende cDNA fortyndes med Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris)-ethylendiaminetetraeddikesyre (EDTA) (TE) buffer (10 mM Tris med 1 mM EDTA) til en endelig koncentration på 0,4 μg RNA anvendt til RT pr. 100 μL cDNA-opløsning. CDNA-prøverne opbevares ved -20 °C.
- Udfør polymerasekædereaktion i realtid (PCR) ved hjælp af et 10 μL reaktionsvolumen. Reaktionsvolumen indeholder masterblandingen (indeholdende DNA polymerase, uracil-DNA glycosylase, dNTP'er med dUTP, passiv reference og optimerede bufferkomponenter), fremadprimer 45 μM, bakprimtal 45 μM, sonde 12,5 μM (indeholdende et reporterfarvestof knyttet til sondens 5' ende, et mindre rillebind i sondens 3' ende og en ikke-fluorescerende quencher i sondens ende) , 2 μL cDNA og DEPC-behandlet vand.
- Kør en endogen kontrol (RPLP0) for relativ kvantificering med 2-ΔΔCT-metoden 19.
- Tilføj eksempler i dubletter, og kør et kontrolelement uden skabeloner ved at tilføje TE-buffer i stedet for cDNA. Pcr køres ved standardbetingelser (2 min ved 50 °C, 10 min ved 95 °C, 40 cyklusser på 15 s ved 95 °C og 1 min ved 60 °C).
- Udfør relativ kvantificering af mRNA-mål efter den sammenlignende CT-metode. Den mængde mRNA, der normaliseres til basisprøven, beregnes som 2-ΔΔCT, mens ΔΔCT er forskellen mellem ΔCT (CT-mål- CT-endogen kontrol) af stikprøven og ΔCT (CT-mål og CT-endogen kontrol) i basisprøven.
5. Kvantificering af proteinindholdet i IVD-mediet
- Saml det medium, der er konditioneret af IVD-prøverne, for at måle proteinindholdet i mediet. Udfør enzymrelateret immunosorbentanalyse (ELISA) i henhold til målproteinets protokol.
- Kvæg interleukine-8 (IL-8) kvantificeres med anti-kvæg IL8 ELISA kit i henhold til fabrikantens instruktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Degenerativ belastning i lavt glukosemedium kombineret med TNF-α injektion forårsagede en betydelig stigning i genekspressionen af proinflammatoriske markører interleukin 6 (IL-6) og interleukin 8 (IL-8) sammenlignet med den fysiologiske kontrolgruppe i NP-celler efter 4 dages kultur (Figur 2). I modsætning hertil observerede vi ikke væsentlige ændringer for proinflammatoriske gener interleukin 1β (IL-1β) og TNF-α i NP-celler (data vist ikke). Desuden ændrede degenerative kulturforhold ikke genekspressionen af IL-6 og IL-8 i AF-celler.
Figur 2: Genekspressionsniveauer i kernen pulposus (NP) væv og annulus fibrosus (AF) væv. Disse blev målt efter 4 dages kultur under fysiologisk eller patologisk kulturtilstand, normaliseret til baseline (dag 0). Betyder ± 95% konfidensinterval n=8, **p<0,01. Dette tal er blevet ændret fraden 20. Klik her for at se en større version af dette tal.
I overensstemmelse med genekspressionsresultaterne viste IL-8-proteinindholdet i mediet en markant stigning efter 2 dage og 4 dage sammenlignet med den fysiologiske tilstand (figur 3). Målingerne på dag 3 (efter fritspvulst eller belastning) viste imidlertid ingen signifikante forskelle mellem undersøgelsesgrupperne, selv om resultaterne tydede på højere værdier for den degenerative gruppe.
Figur 3: Kvantificering af det proinflammatoriske protein IL-8-udslip i IVD-kulturmediet efter fri hævelseskultur (FS) og dynamisk belastning (Load). Resultaterne vises som de oprindelige koncentrationer i ng/mL i mediet uden normalisering. Middelværdi ± 95% konfidensinterval, n=8, **p<0,01. Dette tal er blevet ændret fraden 20. Klik her for at se en større version af dette tal.
Diskhøjden (DH) ændres normaliseret til DH, efter at dissektionen er vist i figur 4. Mens DH-reduktioner efter belastning afslørede højere værdier (dvs. mere højdereduktion) for den degenerative gruppe sammenlignet med de fysiologiske grupper, blev der ikke set nogen forskelle i skivehøjdegevinster efter den fritsvulstperiode mellem studiegrupperne. Dette tydede på, at forskellen i skivehøjdeændringer mellem den patologiske og fysiologiske gruppe var højere efter indlæsningsproceduren. Desuden var forskellene mindre udtalte efter 1 dag sammenlignet med målingerne på dag 2 og 3, hvilket indikerer en progressiv effekt af de degenerative og inflammatoriske tilstande.
Figur 4: Diskhøjden ændres normaliseret til grundlinjeværdierne (efter dissektion). Middel ± 95% konfidensinterval. FS: hævelse. N=10, ***p<0,001. Dette tal er blevet ændret fraden 20. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi leverede her en detaljeret protokol til at simulere degenerativ og inflammatorisk IVDD. Denne protokol kan anvendes til detaljerede undersøgelser af inflammatoriske veje, der fører til de destruktive virkninger på disken. Desuden kan protokollen bidrage til at bestemme lovende terapeutiske mål, der er involveret i sygdommens progression.
Vi har for nylig vist, at human rekombinant TNF-α kunne fremkalde betændelse i både kvæg og humane NP celler21, som er i overensstemmelse med andre undersøgelser på området, der bekræfter, at TNF-α kan bruges til inflammation simulering i IVD celler22,23. I denne undersøgelse blev der anvendt en dosis på 100 ng TNF-α pr. IVD til at fremkalde betændelse. Denne dosis viste effektiv induktion af inflammatoriske markører, når den anvendes i kombination med degenerativ belastning og begrænset ernæring15,20. I en nylig undersøgelse, der bruger TNF-α som den eneste indledningsfaktor for IVD-degeneration, er en tærskel på 100 ng TNF-α / cm3 skivevolumen blevet bestemt som en effektiv dosis til induktion af inflammatoriske og degenerative ændringer i IVD21. Det foreslås, at TNF-α dosis, der anvendes til at fremkalde betændelse, normaliseres til skivens volumen for reproducerbare virkninger. Det bør desuden sikres, at injektionsmaterialet i ivd'en fordeles godt, og at denne injektion kan reproduceres tilstrækkeligt i efterfølgende forsøg. Da injektionstrykket kan variere mellem individer, kan der være forskellige fordelinger af materialet blandt de samme studiegrupper i forskellige eksperimenter. En tilgang, vi valgte at undersøge den lige fordeling var ved hjælp af PBS fortyndet trypan blå injektioner. Det anbefales at standardisere injektionsteknikken, for eksempel med injektionspumper og foruddefinerede og reproducerbare injektionshastigheder. Som tidligere vist forårsagede en enkelt nål punktering med 22-gauge, 25-gauge eller 30-gauge nåle i IVD ikke en effekt, der interagerede med undersøgelsesresultater20,21,24,25. Det anbefales at overveje skivestørrelsen for det volumen af stoffet, der skal injiceres, og for den nålestørrelse, der anvendes til injektion. Desuden anbefales det at bruge en enkelt injektion for at undgå at fremkalde potentielle degenerative virkninger forårsaget af flere ringformede injektioner21,26.
Nogle begrænsninger i den nuværende model skal afhjælpes. Indlæsningen af ivd'erne kræver adgang til bioreaktorer, som i øjeblikket ikke er bredt tilgængelige i mange laboratorier, der arbejder på IDD. Men behovet for prækliniske IVD degeneration modeller er stigende. Organkulturmodeller giver etiske fordele ved at reducere behovet for dyremodeller, og engangsinvesteringen i bioreaktoromkostninger kan være overkommelig i betragtning af reproducerbarheden af den degenerative stimulering og reduktionerne i omkostningerne i forbindelse med dyreforsøg. Ikke desto mindre kan nogle in vivo-interaktioner, såsom immunsystemets rolle, ikke simuleres med den medfølgende organkulturmodel. Desuden kan måling af nervesignaler og evaluering af smerte, der ville være mulig i dyremodeller, i øjeblikket ikke overvejes med den nuværende model. Nogle bekymringer blev rejst, om de mekaniske egenskaber af hale IVD'er kunne sammenlignes med menneskelige IVD'er, da den opretstående rygsøjleposition er unik hos mennesker28. Anatomiske og molekylære egenskaber af kvæghale-IVD'er, såsom celletæthed, mangel på notochordale celler, biokemisk sammensætning29,30og mekaniske egenskaber af kvægkadale IVD'er, såsom bevægelsesområde i fleksion, udvidelse, torsion ogbøjning 31 ligner meget menneskelige IVD'er. Især får menneskelige IVD'er mere og mere opmærksomhed for nylig for organkulturmodeller28. Humane kadaveriske IVD'er i ex vivo-modeller betragtes som yderst effektive, da de kan undgå artsforskelle, som er mere klinisk relevante32. I modsætning til kvæg IVD haler opnået fra slagterierne, ville dette kræve transplantation af humane IVDs 24 h post mortem og dermed etisk godkendelse efter lokale organtransplantation love28. Den nuværende metode kan også let tilpasses andre arter.
En væsentlig fordel ved teknikken sammenlignet med andre metoder til ex vivo-kulturer er kombinationen af intradiscal injektion, patologiske mediumforhold og skadelig belastning for at simulere det tidlige stadium af degenerative diske bedre. Walter et al.23 brugte TNF-alpha i medium dynamisk lastet kvæg IVDs i stedet for injektion i IVD'erne og viste øget transport af TNF-alpha fra mediet ind i kernen pulposus i forhold til annulus fibrosus, hvilket er i overensstemmelse med vores resultater. Da vi havde til formål at simulere de tidlige stadier af IDD, som forekommer på celleniveau uden større forstyrrelser af diskens arkitektur12, valgte vi TNF-alfa-koncentrationerne baseret på tidligere organkulturundersøgelser ved hjælp af TNF-alpha i mediet for at simulere de tidlige stadier af IDD12,22,23. Brugen af andre inflammatoriske stimulanser og højere koncentrationer af TNF-alpha kunne testes for at simulere den ønskede degenerative disktilstand afhængigt af undersøgelsesspørgsmålet. Højere koncentrationer af TNF-alpha kan bedre kompensere for manglen på systemiske immunregulerende tilbagemeldinger, der er til stede under diskdegeneration som foreslået af Ponnappan et al.12 Brugen af skadelige mellemstore tilstande med lavglukose, var baseret på tidligere arbejde, der viste, at ernæringsmæssigt begrænsende medier og eksponering for TNF-alpha efterligner molekylære ændringskarakteristika, som er tilgængelige i tidlig diskdegenerationstilstand12,27. Tilgangen kombinerer således de beviser, der er fremlagt af tidligere undersøgelser i en ex vivo-organkulturmodel for tidlig degenerativ disk disease.
Denne protokol kan forbedres yderligere på flere måder. Varigheden og omfanget af belastningen og fri hævelsesperioden kan vælges ud fra den ønskede undersøgelsesplan. Langsigtede virkninger af inflammatoriske eller degenerative stimuleringer på diskdegeneration er af høj klinisk interesse og kan opnås med den nuværende protokol. Vi brugte kun udvalgte gener, der blev anset for meget relevante for den tidlige tilstand af IDD11. Yderligere validering af denne model kunne omfatte en udvidet vurdering af gener og proteiner, såsom omiske tilgange. Derfor kan andre inflammatoriske faktorer undersøges i kombination med den degenerative belastning, afhængigt af den ønskede degenerative tilstand. For eksempel har lipopolysaccharid injektioner vist sig at stimulere inflammation i IVD33. En sammenligning af forskellige inflammatoriske stimulanser kan opnås med denne protokol for at finde det mest passende inflammatoriske stimulerende middel til det ønskede undersøgelsesspørgsmål. Vi har evalueret ændringer af udvalgte inflammatoriske markører (IL-6, IL-8), anabolske markører (aggrecan, kollagen) og katabolske markører (matrix metallopeptidaser, en disintegrin og metalloproteinaser med thrombospondin motiver) med denne protokol20. Da hele genekspressionsprofilen kan ændre sig, kan fremtidige undersøgelser omfatte næste generations RNA-sekventeringsteknikker til bestemmelse af nye biomarkører til diskdegenerationsdiagnostik og terapeutiske mål for tidlig biologisk intervention. Desuden kan andre metoder, såsom histologi, immunohistokemisk farvning, biokemiske målinger af ekstracellulære matrixkomponenter (såsom glycosaminoglycaner, GAG'er) og dynamiske trykprøver, udføres for yderligere at analysere de biologiske, biokemiske og biomekaniske egenskaber af IVD'er med den nuværende model. En anden mulig analytisk måde ville være at analysere virkningen på ydre AF- og NP-væv separat ved hjælp af bCol1a1, Col1a2, CD146, SM22α og MKX som genekspressionsmarkører for den ydre AF34,35. Spine Research Interest Group på det årlige ORS-møde i New Orleans i 2014 anbefalede følgende sunde NP-fænotypiske markører: HIF-1alpha, GLUT-1, aggrecan / kollagen II-forholdet >20, Shh, Brachyury, KRT18/19, CA12 og CD2436. NP-markørgener bBrachyury/T og bSecreted frizzled-relateret protein 2 var de mest overbevisende, der adskilte NP fra indre og ydre AF-væv i kvæg IVD34. Desuden blev det rapporteret, at NP's SGAG-indhold var betydeligt højere sammenlignet med den ydre AF34.
Afslutningsvis vil jeg sige, at denne nye proinflammatoriske og degenerative IVD-organkulturmodel giver relevante betingelser for at simulere tidlig fase IDD i et yderst relevant 3D-mikromiljø. Den nuværende protokol kan ganske vist ændres yderligere i overensstemmelse med investigators mål. Desuden er vores model i stand til at reducere antallet af nødvendige forsøgsdyr og afspejler dermed fuldstændigt 3R-principperne om at reducere, erstatte, forfine.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af AO Foundation og AOSpine International. Babak Saravi modtog stipendium støtte fra den tyske Spine Foundation og den tyske Slidgigt Foundation. Gernot Lang blev støttet af Berta-Ottenstein-programmet for forskere fra avancerede klinikere, Det Sundhedsvidenskabelige Fakultet, Universitetet i Freiburg, Tyskland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Bromo-3-chloropropane(BCP) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | B9673 | |
| Ascorbate-2-phosphate | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | A8960 | |
| Band saw | Exakt Apparatebau, Norderstedt, Germany | model 30/833 | |
| Betadine | Munndipharma, Frankfurt, Germany | ||
| Bovine IL-8 Do.it-Yourself ELISA | Kingfisher Biotech, St. Paul, USA | DIY1028B-003 | |
| Corning ITS Premix | Corning Inc., New York, USA | 354350 | |
| DMEM high glucose | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 10741574 | |
| DMEM low glucose | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 11564446 | |
| Ethanol for molecular biology | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 09-0851 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | A4766801 | |
| Non-essential amino acid solution | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 11140050 | |
| Penicillin/Streptomycin(P/S) | gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 11548876 | |
| Phosphate Buffer Solution, tablet | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P4417 | |
| Pronase | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 10165921001 | |
| Primocin | InvivoGen, Sandiego, USA | ant-pm-05 | |
| Pulsavac Jet Lavage System | Zimmer, IN,USA | ||
| TissueLyser II | Quiagen, Venlo, Netherlands | 85300 | |
| Streptavidinn-HRP | Kingfisher Biotech, St. Paul, USA | AR0068-001 | |
| Superscript VILO | Invitrogen by life Technologies, Carlsbad, USA | 10704274 | |
| cDNA Synthesis Kit | Applied Biosystems by life technologies | 10400745 | |
| TaqMan Universal Master Mix | Applied Biosystems by life technologies | ||
| TNF-alpha, recombinant human protein | R&D systems, Minnesota, USA | 210-TA-005 | |
| TRI Reagent | Molecular Research Center, Cincinnati, USA | TR 118 | |
| Tris-EDTA buffer solution | sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 93283 | |
| Gene bIL-6 | Applied Biosystems by life technologies | Custom made probes | Primer fw (5′–3′) TTC CAA AAA TGG AGG AAA AGG A Primer rev (5′–3′) TCC AGA AGA CCA GCA GTG GTT Probe (5′FAM/3′TAMRA) CTT CCA ATC TGG GTT CAA TCA GGC GATT |
| Gene bIL8 | Applied Biosystems by life technologies | Bt03211906_m1 | |
| Gene bTNF-alpha | Applied Biosystems by life technologies | Custom made probes | Primer fw (5′–3′) CCT CTT CTC AAG CCT CAA GTA ACA A Primer rev (5′–3′) GAG CTG CCC CGG AGA GTT Probe (5′FAM/3′TAMRA) ATG TCG GCT ACA ACG TGG GCT ACC G |
| GENE bIL1beta | Applied Biosystems by life technologies | Custom made probes | Primer fw (5′–3′) TTA CTA CAG TGA CGA GAA TGA GCT GTT Primer rev (5′–3′) GGT CCA GGT GTT GGA TGC A Probe (5′FAM/3′TAMRA) CTC TTC ATC TGT TTA GGG TCA TCA GCC TCA A |
| RPLP0 | Applied Biosystems by life technologies | Bt03218086_m1 |
References
- Vos, T., et al. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 328 diseases and injuries for 195 countries, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet. 390 (10100), 1211-1259 (2017).
- Hoy, D., et al. Measuring the global burden of low back pain. Best Practice & Research Clinical Rheumatology. 24 (2), 155-165 (2010).
- Thiese, M. S., et al. Prevalence of low back pain by anatomic location and intensity in an occupational population. BMC Musculoskeletal Disorders. 15 (1), 283 (2014).
- Katz, J. N. Lumbar Disc Disorders and Low-Back Pain: Socioeconomic Factors and Consequences. The Journal of Bone and Joint Surgery (American). 88, suppl_2 21 (2006).
- Vlaeyen, J. W. S., et al.
- Khan, A. N., et al. Inflammatory biomarkers of low back pain and disc degeneration: a review: Biomarkers of disc degeneration and back pain. Annals of the New York Academy of Sciences. 1410 (1), 68-84 (2017).
- Kim, H. S., Wu, P. H., Jang, I. T. Lumbar Degenerative Disease Part 1: Anatomy and Pathophysiology of Intervertebral Discogenic Pain and Radiofrequency Ablation of Basivertebral and Sinuvertebral Nerve Treatment for Chronic Discogenic Back Pain: A Prospective Case Series and Review of Literature. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1483 (2020).
- Adams, M. A., Roughley, P. J. What is Intervertebral Disc Degeneration, and What Causes It. Spine. 31 (18), 2151-2161 (2006).
- Wu, P. H., Kim, H. S., Jang, I. T. Intervertebral Disc Diseases Part 2: A Review of the Current Diagnostic and Treatment Strategies for Intervertebral Disc Disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (6), 2135 (2020).
- Lurie, J. D., et al. Surgical Versus Nonoperative Treatment for Lumbar Disc Herniation: Eight-Year Results for the Spine Patient Outcomes Research Trial. Spine. 39 (1), 3-16 (2014).
- Risbud, M. V., Shapiro, I. M. Role of cytokines in intervertebral disc degeneration: pain and disc content. Nature Reviews Rheumatology. 10 (1), 44-56 (2014).
- Ponnappan, R. K., et al. An organ culture system to model early degenerative changes of the intervertebral disc. Arthritis Research & Therapy. 13 (5), 171 (2011).
- O'Connell, G. D., Vresilovic, E. J., Elliott, D. M. Comparison of Animals Used in Disc Research to Human Lumbar Disc Geometry. Spine. 32 (3), 328-333 (2007).
- Stannard, J. T., et al. Development of a whole organ culture model for intervertebral disc disease. Journal of Orthopaedic Translation. 5, 1-8 (2016).
- Li, Z., et al. Preclinical ex-vivo Testing of Anti-inflammatory Drugs in a Bovine Intervertebral Degenerative Disc Model. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 583 (2020).
- Li, Z., et al. Development of an ex vivo cavity model to study repair strategies in loaded intervertebral discs. European Spine Journal. 25 (9), 2898-2908 (2016).
- Kazezian, Z., Li, Z., Alini, M., Grad, S., Pandit, A. Injectable hyaluronic acid down-regulates interferon signaling molecules, IGFBP3 and IFIT3 in the bovine intervertebral disc. Acta Biomaterialia. 52, 118-129 (2017).
- Caprez, S., Menzel, U., Li, Z., Grad, S., Alini, M., Peroglio, M. Isolation of high-quality RNA from intervertebral disc tissue via pronase predigestion and tissue pulverization. JOR Spine. 1 (2), 1017 (2018).
- Lopa, S., Ceriani, C., Cecchinato, R., Zagra, L., Moretti, M., Colombini, A. Stability of housekeeping genes in human intervertebral disc, endplate and articular cartilage cells in multiple conditions for reliable transcriptional analysis. European Cells & Materials. 31, 395-406 (2016).
- Lang, G., et al. An intervertebral disc whole organ culture system to investigate proinflammatory and degenerative disc disease condition. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (4), 2051-2061 (2018).
- Du, J., et al. Proinflammatory intervertebral disc cell and organ culture models induced by tumor necrosis factor alpha. JOR Spine. 3, 1104 (2020).
- Purmessur, D., Walter, B. A., Roughley, P. J., Laudier, D. M., Hecht, A. C., Iatridis, J. A role for TNFα in intervertebral disc degeneration: A non-recoverable catabolic shift. Biochemical and Biophysical Research Communications. 433 (1), 151-156 (2013).
- Walter, B. A., Likhitpanichkul, M., Illien-Junger, S., Roughley, P. J., Hecht, A. C., Iatridis, J. C. TNFα Transport Induced by Dynamic Loading Alters Biomechanics of Intact Intervertebral Discs. PLOS One. 10 (3), 0118358 (2015).
- Gullbrand, S. E., et al. A large animal model that recapitulates the spectrum of human intervertebral disc degeneration. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (1), 146-156 (2017).
- Willems, N., et al. Safety of intradiscal injection and biocompatibility of polyester amide microspheres in a canine model predisposed to intervertebral disc degeneration: intradiscal application of pea microspheres. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 105 (4), 707-714 (2017).
- Michalek, A. J., Buckley, M. R., Bonassar, L. J., Cohen, I., Iatridis, J. C. The effects of needle puncture injury on microscale shear strain in the intervertebral disc annulus fibrosus. The Spine Journal. 10 (12), 1098-1105 (2010).
- Illien-Jünger, S., et al. The combined effects of limited nutrition and high-frequency loading on intervertebral discs with endplates. Spine. 35 (19), 1744-1752 (2010).
- Gantenbein, B., et al. Organ culture bioreactors--platforms to study human intervertebral disc degeneration and regenerative therapy. Current Stem Cell Research & Therapy. 10 (4), 339-352 (2015).
- Boubriak, O. A., Watson, N., Sivan, S. S., Stubbens, N., Urban, J. P. G. Factors regulating viable cell density in the intervertebral disc: blood supply in relation to disc height. Journal of Anatomy. 222 (3), 341-348 (2013).
- Maroudas, A., Stockwell, R. A., Nachemson, A., Urban, J. Factors involved in the nutrition of the human lumbar intervertebral disc: cellularity and diffusion of glucose in vitro. Journal of Anatomy. 120, Pt 1 113-130 (1975).
- Beckstein, J. C., Sen, S., Schaer, T. P., Vresilovic, E. J., Elliott, D. M. Comparison of Animal Discs Used in Disc Research to Human Lumbar Disc: Axial Compression Mechanics and Glycosaminoglycan Content. Spine. 33 (6), 166-173 (2008).
- Walter, B. A., Illien-Jünger, S., Nasser, P. R., Hecht, A. C., Iatridis, J. C. Development and validation of a bioreactor system for dynamic loading and mechanical characterization of whole human intervertebral discs in organ culture. Journal of Biomechanics. 47 (9), 2095-2101 (2014).
- Rajan, N. E., et al. Toll-Like Receptor 4 (TLR4) Expression and Stimulation in a Model of Intervertebral Disc Inflammation and Degeneration. Spine. 38 (16), 1343-1351 (2013).
- vanden Akker, G. G., Rorije, A. J., Davidson, E. N. B., vander Kraan, P. M. Phenotypic marker genes distinguish inner and outer annulus fibrosus from nucleus pulposus tissue in the bovine intervertebral disc. Osteoarthritis and Cartilage. 25, 402 (2017).
- Du, J., et al. Functional cell phenotype induction with TGF-β1 and collagen-polyurethane scaffold for annulus fibrosus rupture repair. European Cells & Materials. 39, 1-17 (2020).
- Risbud, M. V., et al. Defining the phenotype of young healthy nucleus pulposus cells: recommendations of the Spine Research Interest Group at the 2014 annual ORS meeting. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 33 (3), 283-293 (2015).
