Summary
Detta protokoll presenterar en ny experimentell modell av proinflammatoriska, degenerativa nötkreatur organ kultur att simulera tidigt stadium intervertebral skiva degeneration.
Abstract
Symptomatiskt intervertebral skiva (IVD) degeneration (IDD) är en stor socioekonomisk börda och kännetecknas av inflammation och vävnad nedbrytning. På grund av bristen på orsakssambehandlingar finns det ett akut behov av innovativa experimentella organkulturmodeller för att studera mekanismerna i sjukdomsförloppet, hitta terapeutiska mål och minska behovet av djurmodeller. Vi presenterar här ett nytt, tredimensionellt organkulturmodellprotokoll som efterliknar den proinflammatoriska och katabola mikromiljön, som finns under IDD.
Ursprungligen dissekerades, rengjordes och odlades nötkreatur caudal IVDs i vävnad kultur medium. Dynamiska fysiologiska eller patologiskt belastning tillämpades i en skräddarsydd bioreaktor i 2 timmar per dag. IVDs tilldelades en kontrollgrupp (hög glukos medium, fysiologisk belastning, fosfat-buffrad saltlösning injektion) och en patologisk grupp (låg glukos medium, patologiska belastning, tumör nekros faktor-alfa injektion) i fyra dagar. Genuttryck analys från insamlade kärnan pulposus celler i IVDs och enzym-linked immunosorbent analys av de betingade organ kultur medier utfördes.
Våra data visade ett högre uttryck för inflammatoriska markörer och minskade skivhöjder efter laddning i den patologiska gruppen jämfört med kontrollgruppen. Detta protokoll är tillförlitligt för att simulera IVD inflammation och degeneration och kan utökas ytterligare för att bredda dess tillämpningsomfång.
Introduction
Låg ryggsmärta (LBP) kan påverka individer i alla åldrar och är en ledande orsak till funktionshinder överhela världen 1,2,3. Den totala kostnaden i samband med LBP överstiger 100 miljarder USD per år4,5. Symptomatiskt intervertebral skiva (IVD) degeneration (IDD), ett tillstånd som kännetecknas av inflammation och vävnad nedbrytning, är en viktig orsak till LBP6,7. Specifikt kännetecknas IDD av en gradvis utvecklande nedbrytning av IVD: s extracellulära matris (ECM), inducerad och utlöst av flera faktorer som leder till en accelererad patologi, neurologiska störningar och så småningom funktionshinder. Dessutom är IDD förknippat med frisättning av proinflammatoriska cytokiner, förändrad ryggradsbiomekanik, angiogenes och nervväxt, vilket ökar smärtsensationen, vilket helt orsakar kronisk LBP (aktiv discopati)6,8. Hittills inkluderar behandlingsalternativ diskektomi och efterföljande fusion av angränsande ryggkotor, implantation av en IVD-protes eller icke-kirurgiska metoder, såsom icke-steroida antiinflammatoriska läkemedel, opioider och muskelavslappnande medel för patienter med IDD9. Båda nuvarande standard terapeutiska alternativ, kirurgiska och icke-kirurgiska, är bara delvis effektiva och misslyckas med att ta itu med det underliggande biologiskaproblemet 9,10. Tidig degenerativ skivsjukdom kännetecknas av en första inflammatorisk vävnad svar, särskilt en ökning av tumör nekros faktor-alfa (TNF-alfa) uttryck11. Dessa tidiga skivförändringar sker främst på cellnivå utan att störa skivarkitekturen och kan tidigare efterliknas av näringsbrist under proinflammatoriska tillstånd12. Därför är exakt simulering av in vivo-situationen för att undersöka dessa degenerationsmekanismer och hitta lämpliga terapeutiska mål avgörande. Dessutom, till dessa simuleringar av molekylära egenskaper, spelar den mekaniska laddningsmiljön för skivorna en nyckelroll i patologiska och fysiologiska förändringar av IVD. Att kombinera dessa tillvägagångssätt skulle därför föra oss ett steg framåt för att efterlikna den komplexa mikromiljön för IVD-ämnen in vivo. Det finns för närvarande inga studier som tar hänsyn till aspekten av dynamisk lastning tillsammans med den proinflammatoriska och näringsmässiga inställningen efter bästa kunskap.
Även om stora djurmodeller gör det möjligt att undersökning av potentiella relevanta in vivo-interaktioner, är de kostsamma och arbetsintensiva. Eftersom användningen av djurmodeller i forskning länge har varit en tvistefråga är minskningen av antalet djur som behövs för att besvara viktiga forskningsfrågor av stort intresse. Slutligen finns det för närvarande ingen idealisk djurmodell för att efterlikna IDD i IVD-forskning13,14. Därför är det nödvändigt att upprätta en kostnadseffektiv och pålitlig ersättning, till exempel en organkulturmodell för att simulera IDD och tillhörande inflammatoriska och degenerativa processer. Nyligen tillät tillämpningen av det nuvarande protokollet om upprättandet av en proinflammatorisk och degenerativ organkulturmodell för att simulera intervertebral disc disease i ett tidigt skede oss att undersöka effekten av antiinflammatoriska läkemedel i IDD organkultur15.
Här beskriver vi hur man får nötkreatur intervertebral skivor och inducera tillståndet av tidiga IDD via en katabol och proinflammatory microenvironment orsakas av direkt intradiscal injektion av tumör nekros faktor-alfa (TNF-α) och degenerativ belastning i en bioreaktor under låga näringsrika medium villkor. Figur 1 illustrerar den experimentella modellen och visar den bioreaktor som används för att simulera degenerativa och fysiologiska belastningsförhållanden.
Bild 1: Illustration av den experimentella inställningen. A: nötkreaturssvans. B: dissekerade bovina intervertebral skivor, C: överföring av skivan till en brunnsplatta med odlingsmedium; D: Lastning av simuleringen i en bioreaktor. E: intradiscal injektionsteknik; F: IVD efter injektion av PBS/trypan blå färgämne för att avslöja distribution. IDD: degenerering av intervertebral skiva. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Försök utfördes med hjälp av nötkreaturssvansar från lokala slakterier. De biologiska material som används i den aktuella studien är tagna från livsmedelskedjan och kräver inget etiskt godkännande i schweizisk och europeisk lagstiftning.
1. Dissekering av bovin intervertebral skiva
- Skölj hela svansen noggrant med kranvatten för att avlägsna smuts och hår på ytan.
OBS: Med intakta, distala ändar kan högst 9 IVDs (coccygeal 1-9) per svans användas för experimenten beroende på IVD: s önskade storlek. Med tanke på den önskade diametern mellan 15-20 mm använde vi 12 nötkreaturssvansar med 5 IVDs per svans för experimenten. - Sänk ner hela svansen i en låda som innehåller 1% betadinlösning i 10 min. Torka kort svansen med steril gasväv och placera den på ett sterilt draperi.
OBS: Fukta svansarna med Ringers lösning fuktad gasväv under dissekeringen av skivan för att förhindra uttorkning. Förvara svansarna (eller överknackade segment) inlindade i våt gasväv tills hela dissekeringsproceduren är klar. - Använd en skalpell (nr 20) för att avlägsna mjukvävnaden så fullständigt som möjligt från den kaudala ryggraden för att underlätta identifieringen av IVD: erna. Ta bort ryggkotornas spinous och tvärgående processer med benborttagningstänger.
OBS: Välj IVDs med önskad diameter. IVDs med ett diameterområde på 15-20 mm användes i den aktuella studien. - Skär tvärgående med bentänger genom mitten av varje ryggrad för att få enskilda rörelsesegment. Lägg rörelsesegment i en Petri-maträtt med gasväv våt med Ringers lösning.
- Lokalisera IVD och ryggkotan genom palpation och genom att flytta rörelsesegmenten försiktigt. Gör två parallella snitt med bandsågen i IVD:ornas tillväxtplatta, en på varje sida av IVD. Identifiera tillväxtplattans placering genom att vidröra och hitta konvexa platsen för den beniga ändplåtsdelen (hårt) intill skivan (mjuk) med ett säkerhetsavstånd på cirka 0,5-1 mm från IVD mot ryggkotan. Se till att bandsågens blad kyls med Ringers lösning medan du skär kotorna.
- Överför IVDs i en ren Petri-maträtt med ren gasväv våt med Ringers lösning.
OBS: Gasbindan ska fuktas och inte vara för våt för att förhindra svullnad av IVD: erna, - Använd skalpellbladet för att skrapa bort ryggraden (rött/rosa ben), tillväxtplatta (vitt brosk), lämna ändplattan intakt (gulrosa). Gör de två ytorna plana och parallella för belastningsproceduren. Överför skrapade IVDs till en färsk Petri-maträtt med gasväv våt med Ringers lösning.
OBS: Använd en kedjeposthandske för att skydda handen medan du håller IVD och skrapar. - Mät skivans höjd och diameter med en bromsok. Rengör blodpropparna i kotbenet med Ringers lösning med hjälp av ett jet lavage-system.
- Överför IVD:erna till 50 ml plaströr, en IVD per rör. Tillsätt 25 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) + 10% Penicillin/Streptomycin (P/S) per IVD och låt den skaka i 15 minuter på en orbital shaker vid rumstemperatur.
- Aspirera supernatanten och tillsätt 10 ml PBS + 1% P/S per IVD i 2 minuter för att skölja IVD: erna.
2. IVD-kultur och lastning
- Överför skivor till IVD-kammare och tillsätt IVD-odlingsmedium (Dulbeccos modifierade örnmedium (DMEM, 4,5 g/L dmem med hög glukos för den fysiologiska gruppen och 2 g/L dmem med låg glukoshalt för den patologiska gruppen) + 1 % P/S + 2 % fostrets kalvserum + 1 % ITS (innehåller 5 μg/mL insulin, 6 μg/ml transferrin och 5 ng/ml selensyra) + 50 μg/ml ascorbate-2-fosfat + 1% icke-essentiell aminosyra + 50 μg/mL antimikrobiellt medel för primärceller) och placera i en inkubator vid 37 °C, 85% luftfuktighet och 5% CO2.
- Kultur skivorna i 4 dagar inom ett bioreaktorsystem enligt experimentella grupper16. I patologiskt gruppen, upprätthålla degenerativa belastningsförhållanden vid 0,32-0,5 MPa, 5 Hz för 2 h/ dag. I den fysiologiska kontrollgruppen, använd ett belastningsprotokoll på 0,02-0,2 MPa, 0,2 Hz för 2 timmar/dag.
OBS: Placera IVD:erna i kammare som innehåller 5 ml IVD-medium under lastprocedurerna. Volymen beror på storleken på bioreaktorns lastkammare. Mellan belastningsförfarandena placerar du IVDs i sexbrunnsplattor med 7 ml IVD-odlingsmedium för fri svullnad återhämtning. - För att analysera förändringarna i skivhöjden under försöksperioden, mät skivhöjden med en bromsok efter IVD-dissekering (baslinje) och sedan dagligen efter den fria svullnadsperioden och efter dynamisk belastning under försökstiden.
3. Intradiscal tumör nekros faktor-alfa (TNF-α) injektion
- Direkt efter den första dynamiska laddningscykeln på dag 1, placera IVDs i en Petri-skål i vertikalt läge och stabilisera IVDs med en pincett.
- Injicera rekombinant TNF-α (100 ng i 70 μL PBS per IVD) med en 30-gauge insulinnål i kärnan pulposusvävnaden i patologiska gruppen17. Injicera långsamt med en hastighet av cirka 70 μL på 1 minut.
- Efter injektionen, dra sprutan halvvägs tillbaka i IVD och dra sprutkolven för att skapa ett vakuum som förhindrar att den injicerade lösningen läcker tillbaka, innan du tar bort nålen och sprutan helt från IVD.
OBS: Utför ett pilotexperiment genom att injicera PBS som innehåller trypanblå färgämne för att utvärdera fördelningen av den injicerade lösningen efter lastning och över natten kultur.
4. Genuttryck
- Skörda IVD:erna dag 4. Samla kärnan pulposus (NP) vävnad (gelly del i mitten av IVD) med en biopsi stans. Samla upp den yttre annulusfibrosen (AF) med ett skalpellblad (nr 20).
OBS: För baslinjereferensen dag 0, samla vävnader omedelbart efter dissekering för RNA-extraktion. - Använd den mängd NP- eller AF-vävnad som behövs för genuttrycksanalys, beroende på den experimentella designen.
OBS: För de nuvarande experimenten användes cirka 150 mg vävnad. Förhållandet mellan RNA-isoleringslösning och vävnadsmassa bör vara minst 2 ml per 100-150 mg vävnad för effektiv extraktion. - Smält NP- eller AF-vävnaden med rötningslösningen (0,2% pronas i DMEM, filtrera steriliserad) och inkubera i 1 timme vid 37 °C med magnetisk omrörning18.
- Flash-frysa vävnadsproverna med flytande kväve och pulverisera till ett fint pulver. Dela det pulveriserade vävnadspulvret lika i två 2 ml-rör som var och en innehåller 1 ml guanidintiocyanat och fenol i en monofaslösning (RNA-isoleringslösning).
- Utför homogeniseringen i 2 ml-rör som innehåller RNA-isoleringslösningen och det pulveriserade vävnadspulvret. Homogenisera vävnadspulvret 5x med en 8 mm rostfri kula och en vävnadslyzer vid 30 Hz i 3 min. Centrifug vid 12 000 x g,4 °C i 10 min och överför supernaten till ett nytt rör. Supernatanterna kan förvaras vid -80 °C i minst en månad.
- Tillsätt 0,1 ml 1-bromo-3-kloropropan (BCP) per 1 ml RNA-isoleringslösning och skaka kraftigt i 15 s. Förvara den resulterande blandningen i rumstemperatur på en orbital shaker i 15 min och centrifug vid 12 000 x g i 15 min vid 4 °C.
OBS: RNA förblir uteslutande i den övre vattenfasen. - Överför vattenfasen till ett färskt rör och fäll ut RNA med 0,25 ml isopropanol och 0,25 ml hög saltutfällningslösning per 1 ml RNA-isoleringslösning som används för initial homogenisering. Förvara proverna i rumstemperatur i 15 minuter på en orbital shaker och centrifug vid 12 000 x g i 8 min vid 4 °C.
OBS: Alternativt, använd den kolumnbaserade RNA-extraktionsmetoden som i allmänhet leder till högre RNA-renhet men lägre RNA-utbyte. - Ta bort supernatanten och tvätta RNA-pelleten med 1 ml 75% etanol per 1 ml RNA-isoleringslösning som används för initial homogenisering. Centrifugera vid 7 500 x g i 5 min vid 4 °C.
- Ta bort etanoltvätten och kortvarigt lufttorka RNA-pelleten i 3-5 min. Lös upp RNA i 20 μL diethylpyrocarbonat (DEPC) behandlat vatten genom att passera lösningen några gånger genom en pipettspets och inkubera i 10-15 min vid 55-60 °C.
- Mät absorbansen vid 230 nm, 260 nm respektive 280 nm (A230, A260 respektive A280). A260 på 1,0 motsvarar 40 μg/ml RNA. Ett A260/A280-förhållande på 1,6–1,9 förväntas, medan kontaminering resulterar i ett A260/A280-förhållande på <1,6.
- Förbered en omvänd transkriptasreaktionsblandning (RT) för en reaktionsvolym på 20 μL. Blandningen innehåller RT enzymblandning, ribonukleasehämmare, hjälparprotein, primers, dNTPs, MgCl2,RNase fritt vatten och 0,4 μg RNA-prov.
- Centrifuga kort RT-rören för att blanda alla komponenter längst ner på röret.
- Placera proverna i termocyklistinstrumentet. Välj lämpligt program för RT. Kör RT i 10 min vid 25 °C, följt av det omvända transkriptionssteget i 120 min vid 42 °C och inaktivering av den omvända transkriptionen i 5 min vid 85 °C och kyl ner den till 4 °C i slutet.
- Späd ut den resulterande cDNA med Tris(hydroxymethyl)aminometan (Tris)-etylendiaminetetraacetic acid (EDTA) (TE) buffert (10 mM Tris med 1 mM EDTA) till en slutlig koncentration av 0,4 μg RNA som används för RT per 100 μL cDNA lösning. Förvara cDNA-proverna vid -20 °C.
- Utför polymeraskedjereaktion i realtid (PCR) med en reaktionsvolym på 10 μL. Reaktionsvolymen innehåller huvudmixen (innehållande DNA-polymeras, uracil-DNA-glykosylas, dNTP med dUTP, passiv referens och optimerade buffertkomponenter), framåtprimer 45 μM, omvänd primer 45 μM, sond 12,5 μM (innehållande ett reporterfärgämne kopplat till sondens 5' ände, ett mindre spårbindemedel i sondens 3' ände och en icke-fluorescerande quencher vid sondens 3" ände) , 2 μL cDNA och DEPC-behandlat vatten.
- Kör en endogen kontroll (RPLP0) för relativ kvantifiering med 2-ΔΔCT-metoden 19.
- Lägg till exempel i dubbletter och kör ingen mallkontroll genom att lägga till TE-buffert i stället för cDNA. Kör PCR vid standardförhållanden (2 min vid 50 °C, 10 min vid 95 °C, 40 cykler på 15 s vid 95 °C och 1 min vid 60 °C).
- Utför relativ kvantifiering av mRNA-mål enligt den jämförande CT-metoden. Mängden mRNA som normaliserats till baslinjeprovet beräknas som 2-ΔΔCT,medan ΔΔCT är skillnaden mellan ΔCT (CT-mål- CT endogen kontroll) av provet och ΔCT (CT-mål och CT endogen kontroll) i baslinjeprovet.
5. Kvantifiering av proteinhalten i IVD-mediet
- Samla in det medium som konditioneras av IVD-proverna för att mäta proteinhalten i mediet. Utför enzymkopplade immunosorbentanalyser (ELISA) enligt målproteinets protokoll.
- Bovin interleukine-8 (IL-8) kvantifieras med antivint IL8 ELISA-kit enligt tillverkarens anvisningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Degenerativ belastning i lågsockermedium i kombination med TNF- α injektion orsakade en betydande ökning av genuttrycket av proinflammatoriska markörer interleukin 6 (IL-6) och interleukin 8 (IL-8) jämfört med den fysiologiska kontrollgruppen i NP-celler efter 4 dagars kultur (figur 2). Däremot observerade vi inte signifikanta förändringar för proinflammatoriska gener interleukin 1β (IL-1β) och TNF-α i NP-celler (data visas inte). Degenerativa odling villkor ändrade inte gen uttrycket för IL-6 och IL-8 i AF celler.
Figur 2: Genuttrycksnivåer i kärnan pulposus (NP) vävnad och annulus fibrösa (AF) vävnader. Dessa mättes efter 4 dagars kultur under fysiologisk eller patologisk odling villkor, normaliserade till baslinjen (dag 0). Betyder ± 95% konfidensintervall n=8, **p<0,01. Denna siffra har ändrats från20. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
I överensstämmelse med genuttrycksresultaten visade IL-8-proteinhalten i mediet en markant ökning efter 2 dagar och 4 dagar jämfört med det fysiologiska tillståndet (figur 3). Mätningarna dag 3 (efter fri svullnad eller lastning) visade dock inga signifikanta skillnader mellan studiegrupperna, även om resultaten indikerade högre värden för den degenerativa gruppen.
Figur 3:Kvantifiering av det proinflammatoriska proteinet IL-8 frigörs i IVD-odlingsmediet efter fri svullnadskultur (FS) och dynamisk belastning (Belastning). Resultaten visas som de ursprungliga koncentrationerna i ng/ml i mediet utan normalisering. Medelvärde ± 95% konfidensintervall, n=8, **p<0,01. Denna siffra har ändrats från20. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Skivhöjden (DH) ändras normaliserat till DH efter dissekering visas i figur 4. Medan DH-minskningar efter lastning visade högre värden (dvs. mer höjdreduktion) för den degenerativa gruppen jämfört med de fysiologiska grupperna, sågs inga skillnader i skivhöjdsvinster efter frisvullnadsperioden mellan studiegrupperna. Detta indikerade att skillnaden i skivhöjdsförändringar mellan den patologiska och fysiologiska gruppen var högre efter belastningsproceduren. Dessutom var skillnaderna mindre uttalade efter 1 dag jämfört med mätningarna dag 2 och 3, vilket indikerar en progressiv effekt av de degenerativa och inflammatoriska tillstånden.
Bild 4: Skivhöjden normaliseras till baslinjevärdena (efter dissekering). Medelvärde ± 95% konfidensintervall. FS: frisvullnad. N=10, ***p<0.001. Denna siffra har ändrats från20. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi här tillhandahöll ett detaljerat protokoll för att simulera degenerativ och inflammatorisk IVDD. Detta protokoll kan tillämpas för detaljerade undersökningar av inflammatoriska vägar som leder till de destruktiva effekterna på skivan. Dessutom kan protokollet hjälpa till att bestämma lovande terapeutiska mål som är involverade i sjukdomsförloppet.
Vi visade nyligen att mänskliga rekombinanta TNF-α kan inducera inflammation i både nötkreatur och mänskligaNP-celler 21, vilket är i enlighet med andra studier på området som bekräftar att TNF-α kan användas för inflammationssimulering i IVD-celler22,23. I den aktuella studien användes en dos på 100 ng TNF- α per IVD för att inducera inflammation. Denna dos visade effektiv induktion av inflammatoriska markörer när den applicerades i kombination med degenerativ belastning och begränsad näring15,20. I en nyligen genomförd studie med TNF-α som enda initieringsfaktor för IVD-degeneration har en tröskel på 100 ng TNF-α / cm3 skivvolym fastställts som en effektiv dos för induktion av inflammatoriska och degenerativa förändringar i IVD21. Det föreslås att TNF-α dos som används för att inducera inflammation bör normaliseras till skivans volym för reproducerbara effekter. Dessutom bör det säkerställas att injektionsmaterialet distribueras på ett bra sätt i IVD och att denna injektion kommer att kunna reproduceras på lämpligt sätt i efterföljande experiment. Eftersom injektionstrycket kan variera mellan individer kan det finnas olika fördelningar av materialet mellan samma studiegrupper i olika experiment. Ett tillvägagångssätt som vi valde att undersöka lika fördelning var att använda PBS utspädda trypanblå injektioner. Det rekommenderas att standardisera injektionstekniken, till exempel med injektionspumpar och fördefinierade och reproducerbara injektionshastigheter. Som tidigare visats orsakade en enda nålpunktion med 22-gauge, 25-gauge eller 30-gauge nålar i IVD inte en effekt som interagerade med studieresultat20,21,24,25. Det rekommenderas att överväga skivstorleken för volymen av ämnet som ska injiceras och för den nålstorlek som används för injektion. Vidare rekommenderas att använda en enda injektion för att undvika att inducera potentiella degenerativa effekter orsakade av flera ringformiga injektioner21,26.
Vissa begränsningar i den nuvarande modellen måste åtgärdas. Lastningen av IVDs kräver tillgång till bioreaktorer, som för närvarande inte är allmänt tillgängliga i många laboratorier som arbetar med IDD. Behovet av prekliniska IVD-degenerationsmodeller ökar dock. Organkulturmodeller medför etiska fördelar med att minska behovet av djurmodeller, och engångsinvesteringen på bioreaktorkostnader kan vara överkomlig med tanke på degenerativa stimulansens reproducerbarhet och de minskade kostnaderna i samband med djurförsök. Vissa in vivo-interaktioner, såsom immunsystemets roll, kan dock inte simuleras med den medföljande organkulturmodellen. Dessutom kan mätningen av nervsignaler och utvärderingen av smärta som skulle vara möjlig i djurmodeller för närvarande inte övervägas med den nuvarande modellen. Vissa farhågor togs upp om de mekaniska egenskaperna hos svans IVDs kunde jämföras med mänskliga IVDs eftersom den upprättstående ryggraden positionen är unik hos människor28. Anatomiska och molekylära egenskaper hos nötkreatur svans IVDs, såsom celldensitet, brist på notokordal celler, biokemiskasammansättning 29,30, och mekaniska egenskaper hos nötkreatur caudal IVDs, såsom rörelseomfång i flexion, förlängning, torsion och böjning31 är mycket lik mänskliga IVDs. Noterbart är att mänskliga IVDs får mer och mer uppmärksamhet nyligen för organkulturmodeller28. Humana cadaveric IVDs i ex vivo modeller anses vara mycket effektiva eftersom de kan undvika artskillnader som är mer kliniskt relevanta32. I motsats till nötkreatur IVD svansar som erhållits från slakterierna, skulle detta kräva transplantation av mänskliga IVDs 24 h obduktion och därmed etiskt godkännande enligt lokala organ transplantation lagar28. Den nuvarande metoden kan också enkelt anpassas till andra arter.
En stor fördel med tekniken jämfört med andra metoder för ex vivo kulturer är kombinationen av intradiscal injektion, patologiska medium villkor och skadlig belastning för att simulera det tidiga skedet av degenerativa skivor bättre. Walter et al.23 använde TNF-alfa i mediet av dynamiskt laddade nötkreatur IVDs i stället för injektion i IVDs och visade ökad transport av TNF-alfa från mediet till kärnan pulposus jämfört med annulus fibrösa, vilket överensstämmer med våra resultat. Eftersom vi syftade till att simulera de tidiga stadierna av IDD, som uppstår på cellnivå utan större störningar i skivansarkitektur 12,valde vi TNF-alfakoncentrationerna baserat på tidigare organkulturstudier med TNF-alfa i mediet för att simulera de tidiga stadierna av IDD12,22,23. Användningen av andra inflammatoriska stimulantia och högre koncentrationer av TNF-alfa kan testas för att simulera önskat degenerativt skivtillstånd beroende på studiefrågan. Högre koncentrationer av TNF-alfa kan bättre kompensera bristen på systemisk immunreglering som finns under skivdegeneration enligt ponnappan et al.12 Användningen av skadliga medelförhållanden med låg glukos baserades på tidigare arbete som visar att näringsmässigt begränsande media och exponering för TNF-alfa efterliknar molekylära förändringsegenskaper som finns tillgängliga i tidigt skivdegenerationstillstånd12,27. Tillvägagångssättet kombinerar således de bevis som lämnats av tidigare studier i en ex vivo organkultur modell av tidiga degenerativa skiva sjukdom.
Detta protokoll kan förbättras ytterligare på flera sätt. Varaktigheten och omfattningen av belastnings- och frisvullnadsperioden kan väljas baserat på önskad studieplan. Långsiktiga effekter av inflammatoriska eller degenerativa stimuleringar på skivdegeneration är av högt kliniskt intresse och kan uppnås med det nuvarande protokollet. Vi använde endast utvalda gener som anses vara mycket relevanta för det tidiga tillståndet för IDD11. Ytterligare validering av denna modell kan inkludera en breddad bedömning av gener och proteiner, såsom omikmetoder. Följaktligen kan andra inflammatoriska faktorer undersökas i kombination med den degenerativa belastningen, beroende på önskat degenerativt tillstånd. Till exempel har lipopolysackaridinjektioner visat sig stimulera inflammation i IVD33. En jämförelse av olika inflammatoriska stimulantia kan uppnås med det nuvarande protokollet för att hitta det lämpligaste inflammatoriska stimulerande för önskad studiefråga. Vi har utvärderat förändringar av utvalda inflammatoriska markörer (IL-6, IL-8), anabola markörer (aggrecan, kollagen) och katabola markörer (matris metallopeptidaser, en desintegrin och metalloproteinaser med trombospondin motiv) med nuvarande protokoll20. Som hela genuttrycksprofilen kan förändras, kan framtida undersökningar omfatta nästa generations RNA-sekvenseringstekniker för att bestämma nya biomarkörer för skivdegeneration diagnostik och terapeutiska mål för tidig biologisk intervention. Dessutom kan andra metoder, såsom histologi, immunohistokemisk färgning, biokemiska mätningar av extracellulära matriskomponenter (såsom glykosaminoglykaner, GAGs) och dynamiska trycktester utföras för att ytterligare analysera IVD: s biologiska, biokemiska och biomekaniska egenskaper med den nuvarande modellen. Ett annat möjligt analytiskt sätt skulle vara att separat analysera påverkan på yttre AF- och NP-vävnad med hjälp av bCol1a1, Col1a2, CD146, SM22α och MKX som genuttrycksmarkörer för de yttre AF34,35. Spine Research Interest Group vid 2014 års ORS-möte i New Orleans rekommenderade följande friska NP fenotypiska markörer: HIF-1alpha, GLUT-1, aggrecan / kollagen II-förhållandet >20, Shh, Brachyury, KRT18/ 19, CA12 och CD2436. NP-markörgenerna bBrachyury/T och bSecreted frizzled-relaterade protein 2 var de mest övertygande separera NP från inre och yttre AF-vävnad i nötkreatur IVD34. Dessutom rapporterades sgag-halten i nödlidande lån vara betydligt högre jämfört med den yttre AF34.
Sammanfattningsvis ger denna nya proinflammatoriska och degenerativa IVD-organkulturmodell relevanta förutsättningar att simulera tidigt IDD i en mycket relevant 3D-mikromiljö. Det nuvarande protokollet kan förvisso ändras ytterligare i enlighet med utredarens mål. Dessutom kan vår modell minska antalet nödvändiga studiedjur och återspeglar därmed helt 3R-principerna om att minska, ersätta, förfina.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av AO Foundation och AOSpine International. Babak Saravi fick stipendiestöd från tyska Ryggradsstiftelsen och tyska Artrosstiftelsen. Gernot Lang stöddes av Berta-Ottenstein-programmet för avancerade kliniker, medicinska fakulteten, universitetet i Freiburg, Tyskland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Bromo-3-chloropropane(BCP) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | B9673 | |
| Ascorbate-2-phosphate | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | A8960 | |
| Band saw | Exakt Apparatebau, Norderstedt, Germany | model 30/833 | |
| Betadine | Munndipharma, Frankfurt, Germany | ||
| Bovine IL-8 Do.it-Yourself ELISA | Kingfisher Biotech, St. Paul, USA | DIY1028B-003 | |
| Corning ITS Premix | Corning Inc., New York, USA | 354350 | |
| DMEM high glucose | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 10741574 | |
| DMEM low glucose | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 11564446 | |
| Ethanol for molecular biology | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 09-0851 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | A4766801 | |
| Non-essential amino acid solution | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 11140050 | |
| Penicillin/Streptomycin(P/S) | gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 11548876 | |
| Phosphate Buffer Solution, tablet | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P4417 | |
| Pronase | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 10165921001 | |
| Primocin | InvivoGen, Sandiego, USA | ant-pm-05 | |
| Pulsavac Jet Lavage System | Zimmer, IN,USA | ||
| TissueLyser II | Quiagen, Venlo, Netherlands | 85300 | |
| Streptavidinn-HRP | Kingfisher Biotech, St. Paul, USA | AR0068-001 | |
| Superscript VILO | Invitrogen by life Technologies, Carlsbad, USA | 10704274 | |
| cDNA Synthesis Kit | Applied Biosystems by life technologies | 10400745 | |
| TaqMan Universal Master Mix | Applied Biosystems by life technologies | ||
| TNF-alpha, recombinant human protein | R&D systems, Minnesota, USA | 210-TA-005 | |
| TRI Reagent | Molecular Research Center, Cincinnati, USA | TR 118 | |
| Tris-EDTA buffer solution | sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 93283 | |
| Gene bIL-6 | Applied Biosystems by life technologies | Custom made probes | Primer fw (5′–3′) TTC CAA AAA TGG AGG AAA AGG A Primer rev (5′–3′) TCC AGA AGA CCA GCA GTG GTT Probe (5′FAM/3′TAMRA) CTT CCA ATC TGG GTT CAA TCA GGC GATT |
| Gene bIL8 | Applied Biosystems by life technologies | Bt03211906_m1 | |
| Gene bTNF-alpha | Applied Biosystems by life technologies | Custom made probes | Primer fw (5′–3′) CCT CTT CTC AAG CCT CAA GTA ACA A Primer rev (5′–3′) GAG CTG CCC CGG AGA GTT Probe (5′FAM/3′TAMRA) ATG TCG GCT ACA ACG TGG GCT ACC G |
| GENE bIL1beta | Applied Biosystems by life technologies | Custom made probes | Primer fw (5′–3′) TTA CTA CAG TGA CGA GAA TGA GCT GTT Primer rev (5′–3′) GGT CCA GGT GTT GGA TGC A Probe (5′FAM/3′TAMRA) CTC TTC ATC TGT TTA GGG TCA TCA GCC TCA A |
| RPLP0 | Applied Biosystems by life technologies | Bt03218086_m1 |
References
- Vos, T., et al. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 328 diseases and injuries for 195 countries, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet. 390 (10100), 1211-1259 (2017).
- Hoy, D., et al. Measuring the global burden of low back pain. Best Practice & Research Clinical Rheumatology. 24 (2), 155-165 (2010).
- Thiese, M. S., et al. Prevalence of low back pain by anatomic location and intensity in an occupational population. BMC Musculoskeletal Disorders. 15 (1), 283 (2014).
- Katz, J. N. Lumbar Disc Disorders and Low-Back Pain: Socioeconomic Factors and Consequences. The Journal of Bone and Joint Surgery (American). 88, suppl_2 21 (2006).
- Vlaeyen, J. W. S., et al.
- Khan, A. N., et al. Inflammatory biomarkers of low back pain and disc degeneration: a review: Biomarkers of disc degeneration and back pain. Annals of the New York Academy of Sciences. 1410 (1), 68-84 (2017).
- Kim, H. S., Wu, P. H., Jang, I. T. Lumbar Degenerative Disease Part 1: Anatomy and Pathophysiology of Intervertebral Discogenic Pain and Radiofrequency Ablation of Basivertebral and Sinuvertebral Nerve Treatment for Chronic Discogenic Back Pain: A Prospective Case Series and Review of Literature. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1483 (2020).
- Adams, M. A., Roughley, P. J. What is Intervertebral Disc Degeneration, and What Causes It. Spine. 31 (18), 2151-2161 (2006).
- Wu, P. H., Kim, H. S., Jang, I. T. Intervertebral Disc Diseases Part 2: A Review of the Current Diagnostic and Treatment Strategies for Intervertebral Disc Disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (6), 2135 (2020).
- Lurie, J. D., et al. Surgical Versus Nonoperative Treatment for Lumbar Disc Herniation: Eight-Year Results for the Spine Patient Outcomes Research Trial. Spine. 39 (1), 3-16 (2014).
- Risbud, M. V., Shapiro, I. M. Role of cytokines in intervertebral disc degeneration: pain and disc content. Nature Reviews Rheumatology. 10 (1), 44-56 (2014).
- Ponnappan, R. K., et al. An organ culture system to model early degenerative changes of the intervertebral disc. Arthritis Research & Therapy. 13 (5), 171 (2011).
- O'Connell, G. D., Vresilovic, E. J., Elliott, D. M. Comparison of Animals Used in Disc Research to Human Lumbar Disc Geometry. Spine. 32 (3), 328-333 (2007).
- Stannard, J. T., et al. Development of a whole organ culture model for intervertebral disc disease. Journal of Orthopaedic Translation. 5, 1-8 (2016).
- Li, Z., et al. Preclinical ex-vivo Testing of Anti-inflammatory Drugs in a Bovine Intervertebral Degenerative Disc Model. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 583 (2020).
- Li, Z., et al. Development of an ex vivo cavity model to study repair strategies in loaded intervertebral discs. European Spine Journal. 25 (9), 2898-2908 (2016).
- Kazezian, Z., Li, Z., Alini, M., Grad, S., Pandit, A. Injectable hyaluronic acid down-regulates interferon signaling molecules, IGFBP3 and IFIT3 in the bovine intervertebral disc. Acta Biomaterialia. 52, 118-129 (2017).
- Caprez, S., Menzel, U., Li, Z., Grad, S., Alini, M., Peroglio, M. Isolation of high-quality RNA from intervertebral disc tissue via pronase predigestion and tissue pulverization. JOR Spine. 1 (2), 1017 (2018).
- Lopa, S., Ceriani, C., Cecchinato, R., Zagra, L., Moretti, M., Colombini, A. Stability of housekeeping genes in human intervertebral disc, endplate and articular cartilage cells in multiple conditions for reliable transcriptional analysis. European Cells & Materials. 31, 395-406 (2016).
- Lang, G., et al. An intervertebral disc whole organ culture system to investigate proinflammatory and degenerative disc disease condition. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (4), 2051-2061 (2018).
- Du, J., et al. Proinflammatory intervertebral disc cell and organ culture models induced by tumor necrosis factor alpha. JOR Spine. 3, 1104 (2020).
- Purmessur, D., Walter, B. A., Roughley, P. J., Laudier, D. M., Hecht, A. C., Iatridis, J. A role for TNFα in intervertebral disc degeneration: A non-recoverable catabolic shift. Biochemical and Biophysical Research Communications. 433 (1), 151-156 (2013).
- Walter, B. A., Likhitpanichkul, M., Illien-Junger, S., Roughley, P. J., Hecht, A. C., Iatridis, J. C. TNFα Transport Induced by Dynamic Loading Alters Biomechanics of Intact Intervertebral Discs. PLOS One. 10 (3), 0118358 (2015).
- Gullbrand, S. E., et al. A large animal model that recapitulates the spectrum of human intervertebral disc degeneration. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (1), 146-156 (2017).
- Willems, N., et al. Safety of intradiscal injection and biocompatibility of polyester amide microspheres in a canine model predisposed to intervertebral disc degeneration: intradiscal application of pea microspheres. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 105 (4), 707-714 (2017).
- Michalek, A. J., Buckley, M. R., Bonassar, L. J., Cohen, I., Iatridis, J. C. The effects of needle puncture injury on microscale shear strain in the intervertebral disc annulus fibrosus. The Spine Journal. 10 (12), 1098-1105 (2010).
- Illien-Jünger, S., et al. The combined effects of limited nutrition and high-frequency loading on intervertebral discs with endplates. Spine. 35 (19), 1744-1752 (2010).
- Gantenbein, B., et al. Organ culture bioreactors--platforms to study human intervertebral disc degeneration and regenerative therapy. Current Stem Cell Research & Therapy. 10 (4), 339-352 (2015).
- Boubriak, O. A., Watson, N., Sivan, S. S., Stubbens, N., Urban, J. P. G. Factors regulating viable cell density in the intervertebral disc: blood supply in relation to disc height. Journal of Anatomy. 222 (3), 341-348 (2013).
- Maroudas, A., Stockwell, R. A., Nachemson, A., Urban, J. Factors involved in the nutrition of the human lumbar intervertebral disc: cellularity and diffusion of glucose in vitro. Journal of Anatomy. 120, Pt 1 113-130 (1975).
- Beckstein, J. C., Sen, S., Schaer, T. P., Vresilovic, E. J., Elliott, D. M. Comparison of Animal Discs Used in Disc Research to Human Lumbar Disc: Axial Compression Mechanics and Glycosaminoglycan Content. Spine. 33 (6), 166-173 (2008).
- Walter, B. A., Illien-Jünger, S., Nasser, P. R., Hecht, A. C., Iatridis, J. C. Development and validation of a bioreactor system for dynamic loading and mechanical characterization of whole human intervertebral discs in organ culture. Journal of Biomechanics. 47 (9), 2095-2101 (2014).
- Rajan, N. E., et al. Toll-Like Receptor 4 (TLR4) Expression and Stimulation in a Model of Intervertebral Disc Inflammation and Degeneration. Spine. 38 (16), 1343-1351 (2013).
- vanden Akker, G. G., Rorije, A. J., Davidson, E. N. B., vander Kraan, P. M. Phenotypic marker genes distinguish inner and outer annulus fibrosus from nucleus pulposus tissue in the bovine intervertebral disc. Osteoarthritis and Cartilage. 25, 402 (2017).
- Du, J., et al. Functional cell phenotype induction with TGF-β1 and collagen-polyurethane scaffold for annulus fibrosus rupture repair. European Cells & Materials. 39, 1-17 (2020).
- Risbud, M. V., et al. Defining the phenotype of young healthy nucleus pulposus cells: recommendations of the Spine Research Interest Group at the 2014 annual ORS meeting. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 33 (3), 283-293 (2015).
