Summary
Denne protokollen presenterer en ny eksperimentell modell av proinflammatorisk, degenerativ bovinorgankultur for å simulere mellomvirvelskivedegenerering i tidlig fase.
Abstract
Symptomatisk intervertebrale plate (IVD) degenerasjon (IDD) er en stor sosioøkonomisk byrde og er preget av betennelse og vevsforringelse. På grunn av mangel på årsakssammenhenger er det et presserende behov for innovative eksperimentelle organkulturmodeller for å studere mekanismene som er involvert i sykdomsprogresjonen, finne terapeutiske mål og redusere behovet for dyremodeller. Vi presenterer her en ny, tredimensjonal organkulturmodellprotokoll som etterligner det proinflammatoriske og katabolske mikromiljøet, som er til stede under IDD.
I utgangspunktet ble bovine kaudale IVDer dissekert, rengjort og dyrket i vevskulturmediet. Dynamisk fysiologisk eller patologisk lasting ble brukt i en skreddersydd bioreaktor i 2 timer per dag. IVDer ble tildelt en kontrollgruppe (høyt glukosemedium, fysiologisk belastning, fosfatbufret saltvannsinjeksjon) og en patologisk gruppe (lavt glukosemedium, patologisk belastning, tumornekrosefaktor-alfainjeksjon) i fire dager. Genuttrykksanalyse fra innsamlede massosusceller av IVD-er og enzymbundet immunosorbentanalyse av de betingede organkulturmediene ble utført.
Våre data avdekket et høyere uttrykk for inflammatoriske markører og reduserte skivehøyder etter lasting i den patologiske gruppen sammenlignet med kontrollgruppen. Denne protokollen er pålitelig for å simulere IVD-betennelse og degenerasjon og kan utvides ytterligere for å utvide applikasjonsomfanget.
Introduction
Ryggsmerter (LBP) kan påvirke individer i alle aldre og er en ledende årsak til funksjonshemming over hele verden1,2,3. Den totale kostnaden forbundet med LBP overstiger $ 100 milliarder per år4,5. Symptomatisk intervertebrale plate (IVD) degenerasjon (IDD), en tilstand preget av betennelse og vevsforringelse, er en viktig årsak til LBP6,7. Spesielt er IDD preget av en gradvis utviklende nedbrytning av IVDs ekstracellulære matrise (ECM), indusert og utløst av flere faktorer som fører til en akselerert patologi, nevrologiske lidelser og til slutt funksjonshemming. Videre er IDD forbundet med frigjøring av proinflammatoriske cytokiner, endret ryggbiomekanikk, angiogenese og nervevekst, noe som øker smertefølelsen, og til sammen forårsaker kronisk LBP (aktiv diskopati)6,8. Til dags dato inkluderer behandlingsalternativer diskektomi og påfølgende fusjon av tilstøtende ryggvirvler, implantasjon av en IVD-protese eller ikke-kirurgiske tilnærminger, for eksempel ikke-steroide antiinflammatoriske legemidler, opioider og muskelavslappende midler for pasienter med IDD9. Både nåværende standard terapeutiske alternativer, kirurgiske og ikke-kirurgiske, er bare delvis effektive og unnlater å løse det underliggende biologiske problemet9,10. Tidlig degenerasjons skivesykdom er preget av en innledende inflammatorisk vevsrespons, spesielt en økning i tumornekrosefaktor-alfa (TNF-alfa) uttrykk11. Disse tidlige plateendringene skjer hovedsakelig på cellenivå uten å forstyrre platearkitekturen og kan tidligere etterlignes av ernæringsmessig mangel under proinflammatoriske forhold12. Derfor er presis simulering av in vivo-situasjonen for å undersøke disse degenerasjonsmekanismene og finne egnede terapeutiske mål avgjørende. I tillegg, til disse simuleringene av molekylære egenskaper, spiller det mekaniske lastemiljøet til platene en nøkkelrolle i patologiske og fysiologiske endringer av IVD. Følgelig vil det å kombinere disse tilnærmingene bringe oss et skritt fremover for å etterligne det komplekse mikromiljøet av IVDer in vivo. Det er for tiden ingen studier som vurderer aspektet av dynamisk lasting sammen med den proinflammatoriske og ernæringsmessige innstillingen etter beste evne.
Selv om store dyremodeller tillater undersøkelse av potensielle relevante in vivo-interaksjoner, er de kostbare og arbeidsintensive. Ettersom bruk av dyremodeller i forskning lenge har vært et spørsmål om kontrovers, er reduksjonen av antall dyr som trengs for å svare på viktige forskningsspørsmål av stor interesse. Til slutt er det for øyeblikket ingen ideell dyremodell for å etterligne IDD i IVD-forskning13,14. Derfor er det nødvendig å etablere en kostnadseffektiv og pålitelig erstatning, for eksempel en organkulturmodell for å simulere IDD og tilhørende inflammatoriske og degenerative prosesser. Nylig tillot anvendelsen av den nåværende protokollen om etablering av en proinflammatorisk og degenerativ organkulturmodell for å simulere mellomvirvelskivesykdom i tidlig fase oss å undersøke effekten av antiinflammatoriske legemidler i IDD-organkulturen15.
Her beskriver vi hvordan du oppnår bovine intervertebrale plater og induserer tilstanden til tidlig stadium IDD via en katabolsk og proinflammatorisk mikromiljø forårsaket av direkte intradiskal injeksjon av tumornekrosefaktor-alfa (TNF-α) og degenerativ belastning i en bioreaktor under lave næringsrike middels forhold. Figur 1 illustrerer den eksperimentelle modellen og viser bioreaktoren som brukes til å simulere degenerative og fysiologiske belastningsforhold.
Figur 1: Illustrasjon av det eksperimentelle oppsettet. A: bovin hale; B: dissekerte bovine intervertebrale plater; C: overføring av platen til en brønnplate med kulturmedium; D: laste simuleringen i en bioreaktor; E: intradiskal injeksjonsteknikk; F: IVD etter injeksjon av PBS/trypan blå fargestoff for å avsløre distribusjon. IDD: mellomvirvelskive degenerasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Eksperimenter ble utført ved hjelp av bovine haler hentet fra lokale abattoirer. De biologiske materialene som brukes i den aktuelle studien er hentet fra næringskjeden og krever ingen etisk godkjenning i sveitsisk og europeisk lov.
1. Disseksjon av den bovine intervertebrale platen
- Skyll hele halen grundig med vann fra springen for å fjerne smuss og hår på overflaten.
MERK: Med intakte, distale ender kan maksimalt 9 IVDer (coccygeal 1-9) per hale brukes til forsøkene avhengig av ønsket størrelse på IVDene. Tatt i betraktning ønsket diameter mellom 15-20 mm, brukte vi 12 storfehaler med 5 IVDer per hale for forsøkene. - Senk hele halen i en boks som inneholder 1% betadinoppløsning i 10 min. Tørk kort halen med steril gasbind og legg den på en steril gardin.
MERK: Under disseksjonen av platen fukter du halene med Ringers oppløsning fuktet gasbind for å forhindre dehydrering. Oppbevar haler (eller venstre segmenter) innpakket i våt gasbind til hele disseksjonsprosedyren er fullført. - Bruk en skalpell (nr. 20) for å fjerne bløtvevet så fullstendig som mulig fra kaudal ryggraden for å lette identifiseringen av IVDene. Fjern spinøse og tverrgående prosesser i ryggvirvlene med benfjerning tanger.
MERK: Velg IVDer med ønsket diameter. IVDer med et diameterområde på 15-20 mm ble brukt i den nåværende studien. - Klipp tverrgående med bentangen gjennom midten av hver vertebrale kropp for å oppnå individuelle bevegelsessegmenter. Legg bevegelsessegmenter i en Petri-tallerken med gasbind fuktet med Ringers løsning.
- Finn IVD og vertebra ved palpasjon og ved å flytte bevegelsessegmentene forsiktig. Lag to parallelle kutt med båndsagen i vekstplaten på IVDene, en på hver side av IVD. Identifiser plasseringen av vekstplaten ved å berøre og finne det konvekse stedet til den benete endeplatedelen (hard) ved siden av platen (myk) med en sikkerhetsavstand på ca. 0,5-1 mm fra IVD mot ryggvirvelen. Påse at bladet på båndsagen er avkjølt med Ringers oppløsning mens du skjærer ryggvirvlene.
- Overfør IVDer i en ren Petri-tallerken med ren gasbind fuktet med Ringers løsning.
MERK: Gasbindet skal fuktes og ikke være for vått for å forhindre hevelse i IVDene, - Bruk skalpellbladet til å skrape av vertebrale kroppen (rødt / rosa bein), vekstplate (hvit brusk), la endeplaten være intakt (gul-rosa). Gjør de to flatene flate og parallelle for lasteprosedyren. Overfør skrapede IVDer til en frisk Petri-tallerken med gasbind fuktet med Ringers løsning.
MERK: Bruk en kjedeposthanske for å beskytte hånden mens du holder IVD og skraper. - Mål skivehøyden og diameteren med et kaliper. Rengjør blodproppene i ryggvirvlene med Ringers oppløsning ved hjelp av et jettoppsystem.
- Overfør IVDene til 50 ml plastrør, en IVD per rør. Tilsett 25 ml fosfatbufret saltvann (PBS) + 10% penicillin/streptomycin (P/S) per IVD og la den riste i 15 minutter på en orbital shaker ved romtemperatur.
- Aspirer supernatanten og tilsett 10 ml PBS + 1 % P/S per IVD i 2 minutter for å skylle IVDene.
2. IVD-kultur og lasting
- Overfør plater til IVD-kamre og legg til IVD-kulturmedium (Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, 4,5 g/L høy glukose DMEM for den fysiologiske gruppen og 2 g/l lav glukose DMEM for den patologiske gruppen) + 1% P/S + 2% fosterkalvserum + 1% ITS (inneholder 5 μg/ml insulin, 6 μg/ml transferrin og 5 ng/ml selevende syre) + 50 μg/ml askorbat-2-fosfat + 1% ikke-essensiell aminosyre + 50 μg/ml antimikrobielt middel for primærceller) og plasser i en inkubator ved 37 °C, 85 % fuktighet og 5 % CO2.
- Kultur platene i 4 dager innenfor et bioreaktorsystem i henhold til eksperimentelle grupper16. I den patologiske gruppen opprettholder du degenerative lasteforhold ved 0,32-0,5 MPa, 5 Hz i 2 timer / dag. I den fysiologiske kontrollgruppen bruker du en lasteprotokoll på 0,02-0,2 MPa, 0,2 Hz i 2 timer/dag.
MERK: Plasser IVDene i kamre som inneholder 5 ml IVD-medium under lasteprosedyrene. Volumet avhenger av størrelsen på bioreaktorens lastekamre. Mellom lasteprosedyrene plasserer du IVDene i seks brønnplater med 7 ml IVD-kulturmedium for fri hevelse. - For å analysere endringene i platehøyde i den eksperimentelle perioden, mål skivehøyden med et kaliper etter IVD-disseksjon (baseline) og deretter daglig etter den frie hevelsesperioden og etter dynamisk lasting for eksperimentell varighet.
3. Intradiskal tumornekrose faktor-alfa (TNF-α) injeksjon
- Rett etter den første dynamiske lastesyklusen på dag 1, plasser IVDene i en Petri-tallerken i vertikal stilling og stabiliser IVDene med en pinsett.
- Injiser rekombinant TNF-α (100 ng i 70 μL PBS per IVD) med en 30-gauge insulinnål i nukleus pulposusvevet i den patologiske gruppen17. Injiser sakte med en hastighet på ca. 70 μL på 1 min.
- Etter injeksjon trekker du sprøyten halvveis tilbake i IVD og trekker sprøytestempelen for å lage et vakuum som forhindrer at den injiserte oppløsningen lekker tilbake, før du fjerner kanylen og sprøyten helt fra IVD.
MERK: Utfør et piloteksperiment ved å injisere PBS som inneholder trypanblå fargestoff for å evaluere fordelingen av den injiserte løsningen etter lasting og nattkultur.
4. Genuttrykk
- Høst IVDene på dag 4. Samle nukleus pulposus (NP) vev (gelly del i midten av IVD) med en biopsi punch. Samle den ytre annulus fibrosus (AF) med et skalpellblad (nr. 20).
MERK: For referanselinjen på dag 0, samle vev umiddelbart etter disseksjon for RNA-ekstraksjon. - Bruk mengden NP- eller AF-vev som trengs for genuttrykksanalyse, avhengig av eksperimentell design.
MERK: For de nåværende eksperimentene ble det brukt ca. 150 mg vev. Forholdet mellom RNA-isolasjonsløsning og vevsmasse bør være minst 2 ml per 100-150 mg vev for effektiv ekstraksjon. - Fordøye NP- eller AF-vevet med fordøyelsesoppløsningen (0,2% pronase i DMEM, filtersterilisert) og inkuber i 1 time ved 37 °C med magnetisk omrøring18.
- Flash-fryse vevsprøvene ved hjelp av flytende nitrogen og pulverisere til et fint pulver. Del pulverisert vevspulver likt i to 2 ml rør som hver inneholder 1 ml guanidintiocyanat og fenol i en monofaseoppløsning (RNA-isolasjonsløsning).
- Utfør homogeniseringen i 2 ml rør som inneholder RNA-isolasjonsløsningen og pulverisert vevspulver. Homogeniser vevspulveret 5x med en 8 mm rustfritt stålkule og en vevslyser på 30 Hz i 3 minutter. Sentrifuge ved 12.000 x g, 4 °C i 10 minutter og overfør supernatanten til et nytt rør. Supernatantene kan oppbevares ved -80 °C i minst én måned.
- Tilsett 0,1 ml 1-bromo-3-kloropropan (BCP) per 1 ml RNA-isolasjonsløsning og rist kraftig i 15 s. Oppbevar den resulterende blandingen ved romtemperatur på en orbital shaker i 15 min og sentrifuge ved 12.000 x g i 15 min ved 4 °C.
MERK: RNA forblir utelukkende i den øvre vandige fasen. - Overfør den vandige fasen til et friskt rør og bunnfall RNA med 0,25 ml isopropanol og 0,25 ml høy saltutfellingsløsning per 1 ml RNA-isolasjonsløsning som brukes til innledende homogenisering. Oppbevar prøvene ved romtemperatur i 15 minutter på en orbital shaker og sentrifuge ved 12.000 x g i 8 min ved 4 °C.
MERK: Alternativt kan du bruke den kolonnebaserte RNA-ekstraksjonsmetoden som vanligvis fører til høyere RNA-renhet, men lavere RNA-utbytte. - Fjern supernatanten og vask RNA-pelletsen med 1 ml 75% etanol per 1 ml RNA-isolasjonsløsning som brukes til innledende homogenisering. Sentrifuge ved 7500 x g i 5 min ved 4 °C.
- Fjern etanolvasken og lufttørk RNA-pellets en kort stund i 3-5 min. Løs opp RNA i 20 μL dietylpyrokarbonat (DEPC) behandlet vann ved å passere løsningen noen ganger gjennom en pipettespiss og inkubere i 10-15 min ved 55-60 °C.
- Mål absorbansen ved henholdsvis 230 nm, 260 nm og 280 nm (henholdsvis A230, A260 og A280). A260 av 1,0 tilsvarer 40 μg/ml RNA. Det forventes et A260/A280-forhold på 1,6-1,9, mens forurensning resulterer i et A260/A280-forhold på <1,6.
- Forbered en omvendt transkripsjonsreaksjonsblanding (RT) for et 20 μL reaksjonsvolum. Blandingen inneholder RT enzymblanding, ribonukleasehemmer, hjelperprotein, primere, dNTPer, MgCl2, RNase fritt vann og 0,4 μg RNA-prøve.
- Sentrifuger RT-rørene kort for å blande alle komponentene nederst på røret.
- Plasser prøvene i termosirkuleringsinstrumentet. Velg riktig program for RT. Kjør RT i 10 minutter ved 25 °C, etterfulgt av det omvendte transkripsjonstrinnet i 120 min ved 42 °C og deaktivering av omvendt transkripsjon i 5 minutter ved 85 °C, og avkjøl den ned til 4 °C på slutten.
- Fortynn den resulterende cDNA med Tris(hydroksymetyl)aminometan (Tris)-etylendiamintetraketisk syre (EDTA) (TE) buffer (10 mM Tris med 1 mM EDTA) til en endelig konsentrasjon på 0,4 μg RNA som brukes til RT per 100 μL cDNA-løsning. Oppbevar cDNA-prøvene ved -20 °C.
- Utfør sanntids polymerasekjedereaksjon (PCR) ved hjelp av et 10 μL reaksjonsvolum. Reaksjonsvolumet inneholder masterblandingen (som inneholder DNA-polymerase, uracil-DNA glykosylase, dNTPer med dUTP, passiv referanse og optimaliserte bufferkomponenter), foroverprimer 45 μM, reversprimer 45 μM, sonde 12,5 μM (som inneholder en reporterfarge knyttet til sondens 5' ende, en mindre sporbinder på 3' enden av sonden, og en ikke-svovelcent quencher i 3' enden av sonden) , 2 μL cDNA og DEPC-behandlet vann.
- Kjør en endogen kontroll (RPLP0) for relativ kvantifisering med 2-ΔΔCT-metoden 19.
- Legg til eksempler i duplikater, og kjør en kontroll uten mal ved å legge til TE-buffer i stedet for cDNA. Kjør PCR ved standardforhold (2 min ved 50 °C, 10 min ved 95 °C, 40 sykluser på 15 s ved 95 °C og 1 min ved 60 °C).
- Utfør relativ kvantifisering av mRNA-mål etter den komparative CT-metoden. Mengden mRNA normalisert til basisprøven beregnes som 2-ΔΔCT, mens ΔΔCT er forskjellen mellom ΔCT (CT-mål-CT endogen kontroll) av prøve og ΔCT (CT-mål og CT endogen kontroll) i basislinjeprøven.
5. Kvantifisering av proteininnhold i IVD-mediet
- Samle mediet betinget av IVD-prøvene for å måle proteininnholdet i mediet. Utfør enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) i henhold til protokollen til målproteinet.
- Bovine interleukine-8 (IL-8) kvantifiseres av anti-bovint IL8 ELISA-sett i henhold til produsentens instruksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Degenerativ belastning i lavt glukosemedium kombinert med TNF-α injeksjon forårsaket en betydelig økning av genuttrykket til proinflammatoriske markører interleukin 6 (IL-6) og interleukin 8 (IL-8) sammenlignet med den fysiologiske kontrollgruppen i NP-celler etter 4 dager med kultur (Figur 2). Derimot observerte vi ikke signifikante endringer for proinflammatoriske gener interleukin 1β (IL-1β) og TNF-α i NP-celler (data ikke vist). Videre endret degenerative kulturforhold ikke genuttrykket til IL-6 og IL-8 i AF-celler.
Figur 2: Genuttrykksnivåer i nukleus pulposus (NP) vev og annulus fibrosus (AF) vev. Disse ble målt etter 4 dager med kultur under fysiologisk eller patologisk kulturtilstand, normalisert til baseline (dag 0). Betyr ± 95 % konfidensintervall n=8, **p<0,01. Dette tallet er endret fra20. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
I samsvar med genuttrykksfunnene viste IL-8-proteininnholdet i mediet en markert økning etter 2 dager og 4 dager sammenlignet med den fysiologiske tilstanden (figur 3). Målingene på dag 3 (etter fri hevelse eller lasting) viste imidlertid ingen signifikante forskjeller mellom studiegruppene, selv om resultatene indikerte høyere verdier for degenerativ gruppe.
Figur 3: Kvantifisering av det proinflammatoriske proteinet IL-8-frigjøring i IVD-kulturmediet etter fri hevelseskultur (FS) og dynamisk lasting (Belastning). Resultatene vises som de opprinnelige konsentrasjonene i ng/ml i mediet uten normalisering. Gjennomsnittlig ± konfidensintervall på 95 %, n=8, **p<0,01. Dette tallet er endret fra20. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Skivehøyden (DH) endres normalisert til DH etter disseksjonen er vist i figur 4. Mens DH-reduksjoner etter lasting avdekket høyere verdier (dvs. mer høydereduksjon) for degenerativ gruppe sammenlignet med de fysiologiske gruppene, ble det ikke sett forskjeller i skivehøydeøkninger etter at den frie hevelsesperioden ble sett mellom studiegruppene. Dette indikerte at forskjellen i skivehøyde endres mellom den patologiske og fysiologiske gruppen var høyere etter lasteprosedyren. Videre var forskjellene mindre uttalt etter 1 dag sammenlignet med målingene på dag 2 og 3, noe som indikerer en progressiv effekt av degenerative og inflammatoriske forhold.
Figur 4: Platehøyden endres normalisert til grunnlinjeverdiene (etter disseksjon). Gjennomsnittlig ± konfidensintervall på 95 %. FS: fri hevelse. N=10, ***p<0,001. Dette tallet er endret fra20. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har her gitt en detaljert protokoll for å simulere degenerativ og inflammatorisk IVDD. Denne protokollen kan brukes til detaljerte undersøkelser av inflammatoriske veier som fører til de ødeleggende effektene på platen. Videre kan protokollen bidra til å bestemme lovende terapeutiske mål involvert i sykdomsprogresjonen.
Vi viste nylig at human rekombinant TNF-α kunne indusere betennelse i både storfe og humane NP-celler21, som er i samsvar med andre studier på feltet som bekrefter at TNF-α kan brukes til betennelsessimulering i IVD-celler22,23. I den nåværende studien ble en dose på 100 ng TNF-α per IVD brukt til å indusere betennelse. Denne dosen viste effektiv induksjon av inflammatoriske markører når den brukes i kombinasjon med degenerativ lasting og begrenset ernæring15,20. I en nylig studie ved hjelp av TNF-α som den eneste initieringsfaktoren for IVD-degenerasjon, er en terskel på 100 ng TNF-α / cm3 skivevolum blitt bestemt som en effektiv dose for induksjon av inflammatoriske og degenerative endringer i IVD21. Det foreslås at TNF-α dose som brukes til å indusere betennelse, bør normaliseres til volumet av platen for reproduserbare effekter. Videre bør det sikres at det er en god fordeling av injeksjonsmaterialet i IVD og at denne injeksjonen vil være tilstrekkelig reproduserbar i etterfølgende eksperimenter. Siden injeksjonstrykket kan variere mellom individer, kan det være forskjellige fordelinger av materialet blant de samme studiegruppene i ulike eksperimenter. En tilnærming vi valgte å undersøke lik fordeling var å bruke PBS fortynnede trypan blå injeksjoner. Det anbefales å standardisere injeksjonsteknikken, for eksempel med injeksjonspumper og forhåndsdefinerte og reproduserbare injeksjonshastigheter. Som vist tidligere, forårsaket en enkelt nål punktering med 22-gauge, 25-gauge eller 30-gauge nåler i IVD ikke en effekt som interagerte med studieresultater20,21,24,25. Det anbefales å vurdere platestørrelsen for volumet av stoffet som skal injiseres og for nålestørrelsen som brukes til injeksjon. Videre anbefales det å bruke en enkelt injeksjon for å unngå å indusere potensielle degenerative effekter forårsaket av flere ringformede injeksjoner21,26.
Noen begrensninger i den nåværende modellen må løses. Lasting av IVD-ene krever tilgang til bioreaktorer, som for tiden ikke er allment tilgjengelige i mange laboratorier som jobber med IDD. Behovet for prekliniske IVD-degenerasjonsmodeller øker imidlertid. Organkulturmodeller gir etiske fordeler ved å redusere behovet for dyremodeller, og engangsinvesteringen på bioreaktorkostnader kan være rimelig med tanke på reproduserbarheten av degenerativ stimulering, og reduksjonene i kostnadene forbundet med dyreforsøk. Likevel kan noen in vivo-interaksjoner, for eksempel immunsystemets rolle, ikke simuleres med den medfølgende organkulturmodellen. Videre kan måling av nervesignaler og evaluering av smerte som ville være mulig i dyremodeller for tiden ikke vurderes med dagens modell. Noen bekymringer ble reist om de mekaniske egenskapene til hale IVDer kan sammenlignes med menneskelige IVDer, da den oppreiste ryggraden er unik hos mennesker28. Anatomiske og molekylære egenskaper til bovine hale IVDer, for eksempel celletetthet, mangel på notochordale celler, biokjemisksammensetning 29,30og mekaniske egenskaper av bovine kaudale IVDer, for eksempel bevegelsesområde i fleksjon, forlengelse, torsjon og bøyning31 er svært lik menneskelige IVDer. Spesielt får menneskelige IVDer mer og mer oppmerksomhet nylig for organkulturmodeller28. Menneskelige kadaveriske IVDer i ex vivo-modeller anses som svært effektive, da de kan unngå artsforskjeller som er mer klinisk relevante32. I motsetning til bovine IVD-haler hentet fra abattoirene, ville dette kreve transplantasjon av menneskelige IVDer 24 h post mortem og dermed etisk godkjenning etter lokale organtransplantasjonslover28. Den nåværende metoden kan også enkelt tilpasses andre arter.
En stor fordel med teknikken sammenlignet med andre metoder for ex vivo-kulturer er kombinasjonen av intradiskal injeksjon, patologiske middels forhold og skadelig lasting for å simulere den tidlige fasen av degenerative plater bedre. Walter et al.23 brukte TNF-alfa i mediet av dynamisk belastede bovine IVDer i stedet for injeksjon i IVD-ene og viste økt transport av TNF-alfa fra mediet inn i kjernen massosus sammenlignet med annulus fibrosus, som er i samsvar med våre resultater. Da vi hadde som mål å simulere de tidlige stadiene av IDD, som oppstår på cellenivå uten store forstyrrelser i diskarkitekturen12, valgte vi TNF-alfakonsentrasjonene basert på tidligere organkulturstudier ved hjelp av TNF-alfa i mediet for å simulere de tidlige stadiene av IDD12,22,23. Bruken av andre inflammatoriske sentralstimulerende midler og høyere konsentrasjoner av TNF-alfa kan testes for å simulere ønsket degenerativ platetilstand avhengig av studiespørsmålet. Høyere konsentrasjoner av TNF-alfa kan bedre kompensere mangelen på systemiske immunregulatoriske tilbakemeldinger tilstede under disk degenerasjon som foreslått av Ponnappan et al.12 Bruken av skadelige medieforhold med lav glukose var basert på tidligere arbeid som viser at ernæringsmessig begrensende medier og eksponering for TNF-alfa etterligner molekylære endringsegenskaper som er tilgjengelige i tidlig disk degenerasjon tilstand12,27. Dermed kombinerer tilnærmingen bevisene fra tidligere studier i en ex vivo organkulturmodell av tidlig degenerativ skivesykdom.
Denne protokollen kan forbedres ytterligere på flere måter. Varigheten og omfanget av laste- og fri hevelsesperioden kan velges basert på ønsket studieplan. Langsiktige effekter av inflammatoriske eller degenerative stimuleringer på skivedegenerering er av høy klinisk interesse og kan oppnås med dagens protokoll. Vi brukte bare utvalgte gener som anses som svært relevante for tidlig tilstand av IDD11. Ytterligere validering av denne modellen kan omfatte en utvidet vurdering av gener og proteiner, for eksempel omics tilnærminger. Følgelig kan andre inflammatoriske faktorer undersøkes i kombinasjon med degenerativ lasting, avhengig av ønsket degenerativ tilstand. For eksempel har lipopolysakkaridinjeksjoner vist seg å stimulere betennelse i IVD33. En sammenligning av forskjellige inflammatoriske sentralstimulerende midler kan oppnås med den nåværende protokollen for å finne det mest hensiktsmessige inflammatoriske stimulerende middelet for ønsket studiespørsmål. Vi har evaluert endringer av utvalgte inflammatoriske markører (IL-6, IL-8), anabole markører (aggrecan, kollagen) og katabolske markører (matrise metallopeptidases, en disintegrin og metalloproteinaser med trombospondin motiver) med dagens protokoll20. Ettersom hele genuttrykksprofilen kan endre seg, kan fremtidige undersøkelser omfatte neste generasjons RNA-sekvenseringsteknikker for å bestemme nye biomarkører for diskdegenereringsdiagnostikk og terapeutiske mål for tidlig biologisk inngrep. Videre kan andre metoder, som histologi, immunhiistokjemisk farging, biokjemiske målinger av ekstracellulære matrisekomponenter (som glykosaminoglykaner, GAG-er) og dynamiske kompressive tester utføres for å analysere de biologiske, biokjemiske og biomekaniske egenskapene til IVDer med den nåværende modellen ytterligere. En annen mulig analytisk måte ville være å analysere virkningen på ytre AF- og NP-vev separat ved å bruke bCol1a1, Col1a2, CD146, SM22α og MKX som genuttrykksmarkører for ytre AF34,35. Spine Research Interest Group på det årlige ORS-møtet i New Orleans i 2014 anbefalte følgende sunne NP fenotypiske markører: HIF-1alpha, GLUT-1, aggrecan/collagen II ratio >20, Shh, Brachyury, KRT18/19, CA12 og CD2436. NP-markørgenene bBrachyury/T og bSecreted frizzled-relatert protein 2 var de mest overbevisende som separerte NP fra indre og ytre AF-vev i bovint IVD34. Videre ble sGAG-innholdet i NP rapportert å være betydelig høyere sammenlignet med ytre AF34.
Til slutt gir denne nye proinflammatoriske og degenerative IVD organkulturmodellen relevante forhold for å simulere tidlig IDD i et svært relevant 3D-mikromiljø. Den nåværende protokollen kan absolutt endres ytterligere i henhold til etterforskerens mål. Videre er vår modell i stand til å redusere antall nødvendige studiedyr og dermed helt gjenspeile 3R-prinsippene for å redusere, erstatte, foredle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av AO Foundation og AOSpine International. Babak Saravi fikk stipendstøtte fra den tyske ryggstiftelsen og den tyske osteoartrittstiftelsen. Gernot Lang ble støttet av Berta-Ottenstein-programmet for avanserte klinikerforskere, Det medisinske fakultet, Universitetet i Freiburg, Tyskland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Bromo-3-chloropropane(BCP) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | B9673 | |
| Ascorbate-2-phosphate | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | A8960 | |
| Band saw | Exakt Apparatebau, Norderstedt, Germany | model 30/833 | |
| Betadine | Munndipharma, Frankfurt, Germany | ||
| Bovine IL-8 Do.it-Yourself ELISA | Kingfisher Biotech, St. Paul, USA | DIY1028B-003 | |
| Corning ITS Premix | Corning Inc., New York, USA | 354350 | |
| DMEM high glucose | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 10741574 | |
| DMEM low glucose | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 11564446 | |
| Ethanol for molecular biology | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 09-0851 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | A4766801 | |
| Non-essential amino acid solution | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 11140050 | |
| Penicillin/Streptomycin(P/S) | gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 11548876 | |
| Phosphate Buffer Solution, tablet | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P4417 | |
| Pronase | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 10165921001 | |
| Primocin | InvivoGen, Sandiego, USA | ant-pm-05 | |
| Pulsavac Jet Lavage System | Zimmer, IN,USA | ||
| TissueLyser II | Quiagen, Venlo, Netherlands | 85300 | |
| Streptavidinn-HRP | Kingfisher Biotech, St. Paul, USA | AR0068-001 | |
| Superscript VILO | Invitrogen by life Technologies, Carlsbad, USA | 10704274 | |
| cDNA Synthesis Kit | Applied Biosystems by life technologies | 10400745 | |
| TaqMan Universal Master Mix | Applied Biosystems by life technologies | ||
| TNF-alpha, recombinant human protein | R&D systems, Minnesota, USA | 210-TA-005 | |
| TRI Reagent | Molecular Research Center, Cincinnati, USA | TR 118 | |
| Tris-EDTA buffer solution | sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 93283 | |
| Gene bIL-6 | Applied Biosystems by life technologies | Custom made probes | Primer fw (5′–3′) TTC CAA AAA TGG AGG AAA AGG A Primer rev (5′–3′) TCC AGA AGA CCA GCA GTG GTT Probe (5′FAM/3′TAMRA) CTT CCA ATC TGG GTT CAA TCA GGC GATT |
| Gene bIL8 | Applied Biosystems by life technologies | Bt03211906_m1 | |
| Gene bTNF-alpha | Applied Biosystems by life technologies | Custom made probes | Primer fw (5′–3′) CCT CTT CTC AAG CCT CAA GTA ACA A Primer rev (5′–3′) GAG CTG CCC CGG AGA GTT Probe (5′FAM/3′TAMRA) ATG TCG GCT ACA ACG TGG GCT ACC G |
| GENE bIL1beta | Applied Biosystems by life technologies | Custom made probes | Primer fw (5′–3′) TTA CTA CAG TGA CGA GAA TGA GCT GTT Primer rev (5′–3′) GGT CCA GGT GTT GGA TGC A Probe (5′FAM/3′TAMRA) CTC TTC ATC TGT TTA GGG TCA TCA GCC TCA A |
| RPLP0 | Applied Biosystems by life technologies | Bt03218086_m1 |
References
- Vos, T., et al. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 328 diseases and injuries for 195 countries, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet. 390 (10100), 1211-1259 (2017).
- Hoy, D., et al. Measuring the global burden of low back pain. Best Practice & Research Clinical Rheumatology. 24 (2), 155-165 (2010).
- Thiese, M. S., et al. Prevalence of low back pain by anatomic location and intensity in an occupational population. BMC Musculoskeletal Disorders. 15 (1), 283 (2014).
- Katz, J. N. Lumbar Disc Disorders and Low-Back Pain: Socioeconomic Factors and Consequences. The Journal of Bone and Joint Surgery (American). 88, suppl_2 21 (2006).
- Vlaeyen, J. W. S., et al.
- Khan, A. N., et al. Inflammatory biomarkers of low back pain and disc degeneration: a review: Biomarkers of disc degeneration and back pain. Annals of the New York Academy of Sciences. 1410 (1), 68-84 (2017).
- Kim, H. S., Wu, P. H., Jang, I. T. Lumbar Degenerative Disease Part 1: Anatomy and Pathophysiology of Intervertebral Discogenic Pain and Radiofrequency Ablation of Basivertebral and Sinuvertebral Nerve Treatment for Chronic Discogenic Back Pain: A Prospective Case Series and Review of Literature. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1483 (2020).
- Adams, M. A., Roughley, P. J. What is Intervertebral Disc Degeneration, and What Causes It. Spine. 31 (18), 2151-2161 (2006).
- Wu, P. H., Kim, H. S., Jang, I. T. Intervertebral Disc Diseases Part 2: A Review of the Current Diagnostic and Treatment Strategies for Intervertebral Disc Disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (6), 2135 (2020).
- Lurie, J. D., et al. Surgical Versus Nonoperative Treatment for Lumbar Disc Herniation: Eight-Year Results for the Spine Patient Outcomes Research Trial. Spine. 39 (1), 3-16 (2014).
- Risbud, M. V., Shapiro, I. M. Role of cytokines in intervertebral disc degeneration: pain and disc content. Nature Reviews Rheumatology. 10 (1), 44-56 (2014).
- Ponnappan, R. K., et al. An organ culture system to model early degenerative changes of the intervertebral disc. Arthritis Research & Therapy. 13 (5), 171 (2011).
- O'Connell, G. D., Vresilovic, E. J., Elliott, D. M. Comparison of Animals Used in Disc Research to Human Lumbar Disc Geometry. Spine. 32 (3), 328-333 (2007).
- Stannard, J. T., et al. Development of a whole organ culture model for intervertebral disc disease. Journal of Orthopaedic Translation. 5, 1-8 (2016).
- Li, Z., et al. Preclinical ex-vivo Testing of Anti-inflammatory Drugs in a Bovine Intervertebral Degenerative Disc Model. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 583 (2020).
- Li, Z., et al. Development of an ex vivo cavity model to study repair strategies in loaded intervertebral discs. European Spine Journal. 25 (9), 2898-2908 (2016).
- Kazezian, Z., Li, Z., Alini, M., Grad, S., Pandit, A. Injectable hyaluronic acid down-regulates interferon signaling molecules, IGFBP3 and IFIT3 in the bovine intervertebral disc. Acta Biomaterialia. 52, 118-129 (2017).
- Caprez, S., Menzel, U., Li, Z., Grad, S., Alini, M., Peroglio, M. Isolation of high-quality RNA from intervertebral disc tissue via pronase predigestion and tissue pulverization. JOR Spine. 1 (2), 1017 (2018).
- Lopa, S., Ceriani, C., Cecchinato, R., Zagra, L., Moretti, M., Colombini, A. Stability of housekeeping genes in human intervertebral disc, endplate and articular cartilage cells in multiple conditions for reliable transcriptional analysis. European Cells & Materials. 31, 395-406 (2016).
- Lang, G., et al. An intervertebral disc whole organ culture system to investigate proinflammatory and degenerative disc disease condition. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (4), 2051-2061 (2018).
- Du, J., et al. Proinflammatory intervertebral disc cell and organ culture models induced by tumor necrosis factor alpha. JOR Spine. 3, 1104 (2020).
- Purmessur, D., Walter, B. A., Roughley, P. J., Laudier, D. M., Hecht, A. C., Iatridis, J. A role for TNFα in intervertebral disc degeneration: A non-recoverable catabolic shift. Biochemical and Biophysical Research Communications. 433 (1), 151-156 (2013).
- Walter, B. A., Likhitpanichkul, M., Illien-Junger, S., Roughley, P. J., Hecht, A. C., Iatridis, J. C. TNFα Transport Induced by Dynamic Loading Alters Biomechanics of Intact Intervertebral Discs. PLOS One. 10 (3), 0118358 (2015).
- Gullbrand, S. E., et al. A large animal model that recapitulates the spectrum of human intervertebral disc degeneration. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (1), 146-156 (2017).
- Willems, N., et al. Safety of intradiscal injection and biocompatibility of polyester amide microspheres in a canine model predisposed to intervertebral disc degeneration: intradiscal application of pea microspheres. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 105 (4), 707-714 (2017).
- Michalek, A. J., Buckley, M. R., Bonassar, L. J., Cohen, I., Iatridis, J. C. The effects of needle puncture injury on microscale shear strain in the intervertebral disc annulus fibrosus. The Spine Journal. 10 (12), 1098-1105 (2010).
- Illien-Jünger, S., et al. The combined effects of limited nutrition and high-frequency loading on intervertebral discs with endplates. Spine. 35 (19), 1744-1752 (2010).
- Gantenbein, B., et al. Organ culture bioreactors--platforms to study human intervertebral disc degeneration and regenerative therapy. Current Stem Cell Research & Therapy. 10 (4), 339-352 (2015).
- Boubriak, O. A., Watson, N., Sivan, S. S., Stubbens, N., Urban, J. P. G. Factors regulating viable cell density in the intervertebral disc: blood supply in relation to disc height. Journal of Anatomy. 222 (3), 341-348 (2013).
- Maroudas, A., Stockwell, R. A., Nachemson, A., Urban, J. Factors involved in the nutrition of the human lumbar intervertebral disc: cellularity and diffusion of glucose in vitro. Journal of Anatomy. 120, Pt 1 113-130 (1975).
- Beckstein, J. C., Sen, S., Schaer, T. P., Vresilovic, E. J., Elliott, D. M. Comparison of Animal Discs Used in Disc Research to Human Lumbar Disc: Axial Compression Mechanics and Glycosaminoglycan Content. Spine. 33 (6), 166-173 (2008).
- Walter, B. A., Illien-Jünger, S., Nasser, P. R., Hecht, A. C., Iatridis, J. C. Development and validation of a bioreactor system for dynamic loading and mechanical characterization of whole human intervertebral discs in organ culture. Journal of Biomechanics. 47 (9), 2095-2101 (2014).
- Rajan, N. E., et al. Toll-Like Receptor 4 (TLR4) Expression and Stimulation in a Model of Intervertebral Disc Inflammation and Degeneration. Spine. 38 (16), 1343-1351 (2013).
- vanden Akker, G. G., Rorije, A. J., Davidson, E. N. B., vander Kraan, P. M. Phenotypic marker genes distinguish inner and outer annulus fibrosus from nucleus pulposus tissue in the bovine intervertebral disc. Osteoarthritis and Cartilage. 25, 402 (2017).
- Du, J., et al. Functional cell phenotype induction with TGF-β1 and collagen-polyurethane scaffold for annulus fibrosus rupture repair. European Cells & Materials. 39, 1-17 (2020).
- Risbud, M. V., et al. Defining the phenotype of young healthy nucleus pulposus cells: recommendations of the Spine Research Interest Group at the 2014 annual ORS meeting. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 33 (3), 283-293 (2015).
