Summary
Questo protocollo presenta un nuovo modello sperimentale di coltura proinfiammatoria e degenerativa di organi bovini per simulare la degenerazione del disco intervertebrale in fase iniziale.
Abstract
La degenerazione del disco intervertebrale sintomatico (IVD) (IDD) è un importante fardello socioeconomico ed è caratterizzata da infiammazione e degradazione dei tessuti. A causa della mancanza di terapie causali, c'è un'urgente necessità di modelli sperimentali innovativi di coltura degli organi per studiare i meccanismi coinvolti nella progressione della malattia, trovare obiettivi terapeutici e ridurre la necessità di modelli animali. Qui presentiamo un nuovo protocollo di modello tridimensionale di coltura di organi che imita il microambiente proinfiammatorio e catabolico, presente durante l'IDD.
Inizialmente, gli IVD caudali bovini venivano sezionati, puliti e coltivati nel mezzo di coltura tissutale. Il carico fisiologico dinamico o patologico è stato applicato in un bioreattore su misura per 2 ore al giorno. Gli IVD sono stati assegnati a un gruppo di controllo (mezzo di glucosio elevato, carico fisiologico, iniezione salina tamponata da fosfati) e a un gruppo patologico (mezzo a basso glucosio, carico patologico, iniezione di fattore di necrosi tumorale-alfa) per quattro giorni. È stata eseguita l'analisi dell'espressione genica da cellule pulpose del nucleo raccolte degli IVD e il saggio immunoassorbente legato all'enzima del supporto di coltura degli organi condizionati.
I nostri dati hanno rivelato una maggiore espressione di marcatori infiammatori e una riduzione dell'altezza del disco dopo il caricamento nel gruppo patologico rispetto al gruppo di controllo. Questo protocollo è affidabile per simulare l'infiammazione e la degenerazione dell'IVD e può essere ulteriormente ampliato per ampliare il suo ambito di applicazione.
Introduction
Lo loto antisoccito (LBP) può colpire individui di tutte le età ed è una delle principali cause di disabilità intutto il mondo 1,2,3. Il costo totale associato a LBP supera $ 100 miliardi all'anno4,5. La degenerazione del disco intervertebrale sintomatico (IVD), una condizione caratterizzata da infiammazione e degradazione dei tessuti, è una delle principali cause di LBP6,7. In particolare, l'IDD è caratterizzato da una rottura in graduale evoluzione della matrice extracellulare (ECM) dell'IVD, indotta e innescata da molteplici fattori che portano a una patologia accelerata, disturbi neurologici ed eventualmente disabilità. Inoltre, l'IDD è associato al rilascio di citochine proinfiammatorie, biomeccanica della colonna vertebrale alterata, angiogenesi e crescita nervosa, che aumenta la sensazione di dolore, causando del tutto LBP cronico (discopatia attiva)6,8. Ad oggi, le opzioni di trattamento includono discectomia e successiva fusione delle vertebre adiacenti, impianto di una protesi IVD o approcci non chirurgici, come farmaci antinfiammatori non steroidei, oppioidi e rilassanti muscolari per pazienti con IDD9. Entrambe le attuali opzioni terapeutiche standard, chirurgiche e non chirurgiche, sono solo parzialmente efficaci e non riescono ad affrontare il problema biologicosottostante 9,10. La malattia degenerativa del disco in fase iniziale è caratterizzata da una risposta iniziale del tessuto infiammatorio, in particolare un aumento dell'espressione fattore-alfa della necrosi tumorale (TNF-alfa)11. Questi primi cambiamenti del disco si verificano principalmente a livello cellulare senza interrompere l'architettura del disco e potrebbero in precedenza essere mimicked da carenza nutrizionale in condizioni pro-infiammatorie12. Pertanto, è fondamentale una simulazione precisa della situazione in vivo per indagare questi meccanismi di degenerazione e trovare obiettivi terapeutici adeguati. Inoltre, a queste simulazioni di proprietà molecolari, l'ambiente di carico meccanico dei dischi gioca un ruolo chiave nei cambiamenti patologici e fisiologici dell'IVD. Di conseguenza, combinare questi approcci ci farebbe fare un passo avanti per imitare il complesso microambiente dei D IVD in vivo. Attualmente non ci sono studi che considerino al meglio l'aspetto del carico dinamico insieme all'ambiente pro-infiammatorio e nutrizionale.
Sebbene i modelli animali di grandi dimensioni consentano di investigre potenziali interazioni in vivo pertinenti, sono costosi e richiede molto lavoro. Inoltre, poiché l'uso di modelli animali nella ricerca è stato a lungo oggetto di controversie, la riduzione del numero di animali necessari per rispondere a importanti domande di ricerca è di grande interesse. Infine, attualmente non esiste un modello animale ideale per imitare l'IDD nella ricerca IVD13,14. Pertanto, è necessario stabilire una sostituzione economica e affidabile, come un modello di coltura di organi per simulare l'IDD e i processi infiammatori e degenerativi associati. Recentemente, l'applicazione del presente protocollo sull'istituzione di un modello di coltura proinfiammatoria e degenerativa degli organi per simulare la malattia del disco intervertebrale in fase iniziale ci ha permesso di indagare l'effetto dei farmaci antinfiammatori nella coltura di organi IDD15.
Qui descriviamo come ottenere dischi intervertebrali bovini e induciamo lo stato di IDD in fase iniziale attraverso un microambiente catabolico e proinfiammatorio causato dall'iniezione intradiscale diretta di fattore alfa della necrosi tumorale (TNF-α) e dal carico degenerativo in un bioreattore in condizioni medie nutritive basse. La figura 1 illustra il modello sperimentale e mostra il bioreattore utilizzato per simulare le condizioni di carico degenerative e fisiologiche.
Figura 1: Illustrazione dell'impostazione sperimentale. A: coda bovina; B: dischi intervertebrali bovini sezionati; C: trasferimento del disco su una piastra di pozzo con mezzo di coltura; D: caricamento della simulazione in un bioreattore; E: tecnica di iniezione intradiscale; F: IVD dopo iniezione di pbs/tripano colorante blu per rivelare la distribuzione. IDD: degenerazione del disco intervertebrale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Protocol
Gli esperimenti sono stati eseguiti utilizzando code bovine ottenute da mattatoi locali. I materiali biologici utilizzati nell'attuale studio sono prelevati dalla catena alimentare e non richiedono alcuna approvazione etica nel diritto svizzero ed europeo.
1. Dissezione del disco intervertebrale bovino
- Risciacquare accuratamente l'intera coda con acqua del rubinetto per rimuovere sporco e capelli sulla superficie.
NOTA: Con estremità distali intatte, è possibile utilizzare un massimo di 9 IVD (coccigeo 1-9) per coda per gli esperimenti a seconda della dimensione desiderata degli IVD. Considerando il diametro desiderato tra 15-20 mm, abbiamo usato 12 code bovine con 5 IVD per coda per gli esperimenti. - Immergere l'intera coda in una scatola contenente l'1% di soluzione di betadina per 10 minuti. Asciugare brevemente la coda con garza sterile e posizionarla su un drappo sterile.
NOTA: Durante la dissezione del disco, umidificare le code con la garza bagnata della soluzione di Ringer per prevenire la disidratazione. Conservare le code (o segmenti a sinistra) avvolte in garza bagnata fino al completamento dell'intera procedura di dissezione. - Utilizzare un bisturi (n. 20) per rimuovere il tessuto molle nel modo più completo possibile dalla colonna vertebrale caudale per facilitare l'identificazione degli IVD. Rimuovere i processi spinosi e trasversali delle vertebre con pinze di rimozione ossea.
NOTA: selezionare gli IVD con il diametro desiderato. Nello studio attuale sono stati utilizzati IVD con un diametro di 15-20 mm. - Tagliare trasversalmente con pinze ossee attraverso il centro di ogni corpo vertebrale per ottenere singoli segmenti di movimento. Metti i segmenti di movimento in una piastra di Petri con garza bagnata con la soluzione di Ringer.
- Individuare l'IVD e la vertebra palpando e spostando delicatamente i segmenti di movimento. Effettuare due tagli paralleli con la sega a banda nella piastra di crescita degli IVD, uno su ciascun lato dell'IVD. Identificare la posizione della piastra di crescita toccando e trovando il sito convesso della parte ossea della piastra finale (dura) adiacente al disco (morbida) con una distanza di sicurezza di circa 0,5-1 mm dall'IVD verso la vertebra. Assicurarsi che la lama della sega a nastro sia raffreddata con la soluzione di Ringer durante il taglio delle vertebre.
- Trasferire gli IVD in una piastra di Petri pulita con garza pulita bagnata con la soluzione di Ringer.
NOTA: La garza deve essere inumidita e non troppo bagnata per evitare il gonfiore degli IVD, - Utilizzare la lama bisturi per raschiare il corpo vertebrale (osso rosso / rosa), piastra di crescita (cartilagine bianca), lasciare intatta la piastra finale (giallo-rosa). Rendere le due superfici piatte e parallele per la procedura di caricamento. Trasferire gli IVD raschiati in una piastra di Petri fresca con garza bagnata con la soluzione di Ringer.
NOTA: Indossare un guanto a catena per proteggere la mano tenendo premuto l'IVD e raschiando. - Misurare l'altezza e il diametro del disco con una pinza. Pulire i coaguli di sangue nell'osso delle vertebre con la soluzione di Ringer utilizzando un sistema di lavanda a getto.
- Trasferire gli IVD su tubi di plastica da 50 ml, un IVD per tubo. Aggiungere 25 mL di salina tamponata da fosfati (PBS) + 10% penicillina/streptomicina (P/S) per IVD e lasciarla tremare per 15 minuti su uno shaker orbitale a temperatura ambiente.
- Aspirare il supernatante e aggiungere 10 mL di PBS + 1% P/S per IVD per 2 minuti per risciacquare gli IVD.
2. Cultura e carico IVD
- Trasferire dischi in camere IVD e aggiungere il mezzo di coltura IVD (Modified Eagle Medium (DMEM di Dulbecco, DMEM ad alto glucosio 4,5 g/L per il gruppo fisiologico e 2 g/L di DMEM a basso glucosio per il gruppo patologico) + 1% P/S + 2% siero fetale di vitello + 1% ITS (contiene 5 μg/mL di insulina, 6 μg/mL transferrina e 5 ng/mL acido selenioso) + 50 μg/mL ascorbato-2-fosfato + 1% amminoacido non essenziale + 50 μg/mL agente antimicrobico per le cellule primarie) e posto in un'incubatrice a 37 °C, umidità dell'85% e 5% CO2.
- Coltura dei dischi per 4 giorni all'interno di un sistema bioreattore secondo i gruppisperimentali 16. Nel gruppo patologico, mantenere condizioni di carico degenerative a 0,32-0,5 MPa, 5 Hz per 2 h /giorno. Nel gruppo di controllo fisiologico utilizzare un protocollo di carico di 0,02-0,2 MPa, 0,2 Hz per 2 h/giorno.
NOTA: Posizionare gli IVD in camere contenenti 5 mL di supporto IVD durante le procedure di carico. Il volume dipende dalle dimensioni delle camere di carico del bioreattore. Tra le procedure di carico, posizionare gli IVD in piastre a sei potte con 7 mL di mezzo di coltura IVD per il recupero a gonfiore libero. - Per analizzare le variazioni dell'altezza del disco durante il periodo sperimentale, misurare l'altezza del disco con una pinza dopo la dissezione IVD (linea di base) e quindi giornalmente dopo il periodo di gonfiore libero e dopo il caricamento dinamico per la durata sperimentale.
3. Iniezione del fattore alfa della necrosi tumorale intradiscale (TNF-α)
- Subito dopo il primo ciclo di caricamento dinamico il primo giorno, posizionare gli IVD in una piastra di Petri in posizione verticale e stabilizzare gli IVD con una pinzetta.
- Iniettare TNF-α ricombinante (100 ng in 70 μL di PBS per IVD) con un ago di insulina calibro 30 nel tessuto pulposo del nucleo del gruppo patologico17. Iniettare lentamente ad una velocità di circa 70 μL in 1 min.
- Dopo l'iniezione, tirare la siringa a metà strada all'interno dell'IVD e tirare lo stantuffo della siringa per creare un vuoto che impedisce alla soluzione iniettata di fuoriuscire, prima di rimuovere completamente l'ago e la siringa dall'IVD.
NOTA: Eseguire un esperimento pilota iniettando PBS contenente colorante blu trypan per valutare la distribuzione della soluzione iniettata dopo il carico e la coltura notturna.
4. Espressione genica
- Raccogli gli IVD il giorno 4. Raccogliere il tessuto del nucleo pulposo (NP) (parte gelosa nel mezzo dell'IVD) con un punzone di biopsia. Raccogliere il fibroso annulus esterno (AF) con una lama bisturi (n. 20).
NOTA: Per il riferimento di base al giorno 0, raccogliere i tessuti immediatamente dopo la dissezione per l'estrazione dell'RNA. - Utilizzare la quantità di tessuto NP o AF necessaria per l'analisi dell'espressione genica, a seconda del progetto sperimentale.
NOTA: Per gli esperimenti attuali è stato utilizzato circa 150 mg di tessuto. Il rapporto tra la soluzione di isolamento dell'RNA e la massa tissutale dovrebbe essere di almeno 2 mL per 100-150 mg di tessuto per un'estrazione efficiente. - Digerire il tessuto NP o AF con la soluzione di digestione (0,2% di pronasi in DMEM, filtro sterilizzato) e incubare per 1 h a 37 °C con agitazione magnetica18.
- Congelare flash i campioni di tessuto utilizzando azoto liquido e polverizzare in una polvere fine. Dividere equamente la polvere di tessuto polverizzato in due tubi da 2 ml ciascuno contenenti 1 ml di tiocianato di guanidina e fenolo in una soluzione monofase (soluzione di isolamento dell'RNA).
- Eseguire l'omogeneizzazione in tubi da 2 ml contenenti la soluzione di isolamento dell'RNA e la polvere di tessuto polverizzato. Omogeneizzare la polvere di tessuto 5x con una sfera di acciaio inossidabile da 8 mm e un tissutale a 30 Hz per 3 min. Centrifugare a 12.000 x g,4 °C per 10 min e trasferire il supernatante in un tubo fresco. I supernatanti possono essere conservati a -80 °C per almeno un mese.
- Aggiungere 0,1 mL di 1-bromo-3-cloropropano (BCP) per 1 mL di soluzione di isolamento dell'RNA e agitare vigorosamente per 15 s. Conservare la miscela risultante a temperatura ambiente su uno shaker orbitale per 15 minuti e centrifugare a 12.000 x g per 15 min a 4 °C.
NOTA: L'RNA rimane esclusivamente nella fase acquosa superiore. - Trasferire la fase acquosa in un tubo fresco e precipitare l'RNA con 0,25 mL di isopropanolo e 0,25 ml di soluzione ad alta precipitazione del sale per 1 ml di soluzione di isolamento dell'RNA utilizzata per l'omogeneizzazione iniziale. Conservare i campioni a temperatura ambiente per 15 minuti su uno shaker orbitale e centrifugare a 12.000 x g per 8 min a 4 °C.
NOTA: In alternativa, utilizzare il metodo di estrazione dell'RNA basato su colonne che generalmente porta a una maggiore purezza dell'RNA ma a una minore resa dell'RNA. - Rimuovere il supernatante e lavare il pellet di RNA con 1 mL di 75% di etanolo per 1 mL di soluzione di isolamento dell'RNA utilizzato per l'omogeneizzazione iniziale. Centrifuga a 7.500 x g per 5 min a 4 °C.
- Rimuovere il lavaggio dell'etanolo e asciugare brevemente il pellet di RNA ad aria compressa per 3-5 minuti. Sciogliere l'RNA in 20 μL di acqua trattata con dietilpirocarbonato (DEPC) passando la soluzione alcune volte attraverso una punta di pipetta e incubando per 10-15 min a 55-60 °C.
- Misurare l'assorbanza a 230 nm, 260 nm e 280 nm (rispettivamente A230, A260 e A280). A260 di 1,0 corrisponde a 40 μg/mL RNA. Si prevede un rapporto A260/A280 di 1,6-1,9, mentre la contaminazione si traduce in un rapporto A260/A280 di <1,6.
- Preparare una miscela di reazione inversa transcriptasi (RT) per un volume di reazione di 20 μL. La miscela contiene miscela enzimatica RT, inibitore della ribonucleasi, proteina aiutante, primer, dNTP, MgCl2, acqua libera di RNasi e 0,4 μg di campione di RNA.
- Centrifugare brevemente i tubi RT per mescolare tutti i componenti nella parte inferiore del tubo.
- Posizionare i campioni nello strumento termociclo. Selezionare il programma appropriato per l'RT. Eseguire l'RT per 10 min a 25 °C, seguito dalla fase di trascrizione inversa per 120 min a 42 °C e dall'inattivazione della transcriptasi inversa per 5 minuti a 85 °C, raffreddandola fino a 4 °C alla fine.
- Diluire il cDNA risultante con acido tris(idrossimetil)amminometano (Tris)-etilendiamminatetraacetico (EDTA) (TE) tampone (10 mM Tris con 1 mM EDTA) ad una concentrazione finale di 0,4 μg di RNA utilizzato per RT per soluzione di cDNA da 100 μL. Conservare i campioni di cDNA a -20 °C.
- Eseguire la reazione a catena della polimerasi in tempo reale (PCR) utilizzando un volume di reazione di 10 μL. Il volume di reazione contiene il mix principale (contenente DNA polimerasi, glicosilasi uracil-DNA, dNTP con dUTP, riferimento passivo e componenti tampone ottimizzati), primer in avanti 45 μM, primer inverso 45 μM, sonda 12,5 μM (contenente un colorante reporter collegato all'estremità 5 ' della sonda, un legante di scanalatura minore all'estremità 3 ' della sonda e un quencher non fluorescente all'estremità 3 ' della sonda) , 2 μL cDNA e acqua trattata con DEPC.
- Eseguire un controllo endogeno (RPLP0) per la quantificazione relativa con il metodo 2-ΔΔCT 19.
- Aggiungere esempi in duplicati ed eseguire un controllo senza modello aggiungendo TE-buffer anziché cDNA. Eseguire PCR in condizioni standard (2 min a 50 °C, 10 min a 95 °C, 40 cicli di 15 s a 95 °C e 1 min a 60 °C).
- Eseguire la quantificazione relativa degli obiettivi di mRNA seguendo il metodo ct comparativo. La quantità di mRNA normalizzata al campione di base è calcolata come 2-ΔΔCT, mentre ΔΔCT è la differenza tra il ΔCT (CT target- CT endogeno control) del campione e ΔCT (CT target e CT endogeno control) del campione di base.
5. Quantificazione del contenuto proteico nel mezzo IVD
- Raccogliere il mezzo condizionato dai campioni IVD per misurare il contenuto proteico nel mezzo. Eseguire test immunoassorbenti legati all'enzima (ELISA) secondo il protocollo della proteina bersaglio.
- L'interleuchina bovina-8 (IL-8) è quantificata con kit ELISA IL8 anti bovino secondo le istruzioni del produttore.
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Representative Results
Il carico degenerativo in mezzo a basso glucosio combinato con l'iniezione di TNF-α ha causato un aumento significativo dell'espressione genica dei marcatori proinfiammatori interleuchina 6 (IL-6) e interleuchina 8 (IL-8) rispetto al gruppo di controllo fisiologico nelle cellule NP dopo 4 giorni dicoltura (Figura 2). Al contrario, non abbiamo osservato cambiamenti significativi per i geni proinflammatori interleuchina 1β (IL-1β) e TNF-α nelle cellule NP (dati non mostrati). Inoltre, le condizioni di coltura degenerativa non alterarono l'espressione genica di IL-6 e IL-8 nelle cellule AF.
Figura 2: Livelli di espressione genica nel tessuto del nucleo pulposo (NP) e nei tessuti fibrosi annulus (AF). Questi sono stati misurati dopo 4 giorni di coltura in condizioni fisiologiche o patologiche di coltura, normalizzate al basale (giorno 0). Significa ± intervallo di confidenza del 95% n=8, **p<0,01. Questa cifra è stata modificata da20. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Coerentemente con i risultati dell'espressione genica, il contenuto proteico il-8 nel mezzo ha mostrato un marcato aumento dopo 2 giorni e 4 giorni rispetto allacondizione fisiologica (figura 3). Tuttavia, le misurazioni del giorno 3 (dopo il gonfiore libero o il carico) non hanno rivelato differenze significative tra i gruppi di studio, sebbene i risultati indicavano valori più elevati per il gruppo degenerativo.
Figura 3: Quantificazione della proteina pronfiammatoria IL-8 nel mezzo di coltura IVD dopo coltura di gonfiore libero (FS) e carico dinamico (Carico). I risultati sono mostrati come le concentrazioni originali in ng/mL nel mezzo senza normalizzazione. Media ± intervallo di confidenza del 95%, n=8, **p<0,01. Questa cifra è stata modificata da20. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
L'altezza del disco (DH) cambia normalizzata nel DH dopo che la dissezione è illustrata nella figura 4. Mentre le riduzioni del DH dopo il carico hanno rivelato valori più elevati (cioè una maggiore riduzione dell'altezza) per il gruppo degenerativo rispetto ai gruppi fisiologici, non sono state osservate differenze nei guadagni di altezza del disco dopo il periodo di gonfiore libero tra i gruppi di studio. Ciò ha indicato che la differenza di altezza del disco tra il gruppo patologico e quello fisiologico era più elevata dopo la procedura di carico. Inoltre, le differenze sono state meno pronunciate dopo 1 giorno rispetto alle misurazioni nei giorni 2 e 3, indicando un effetto progressivo delle condizioni degenerative e infiammatorie.
Figura 4: L'altezza del disco viene normalizzata ai valori di base (dopo la dissezione). Intervallo ± confidenza del 95%. FS: gonfiore libero. N=10, ***p<0,001. Questa cifra è stata modificata da20. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui abbiamo fornito un protocollo dettagliato per simulare l'IVDD degenerativo e infiammatorio. Questo protocollo può essere applicato per esami dettagliati delle vie infiammatorie che portano agli effetti distruttivi sul disco. Inoltre, il protocollo può aiutare a determinare obiettivi terapeutici promettenti coinvolti nella progressione della malattia.
Recentemente abbiamo dimostrato che il TNF-α ricombinante umano potrebbe indurre infiammazione nelle cellule NP sia bovine che umane21, che è in conformità con altri studi sul campo che confermano che il TNF-α può essere utilizzato per la simulazione dell'infiammazione nelle cellule IVD22,23. Nel presente studio, una dose di 100 ng TNF-α per IVD è stata utilizzata per indurre l'infiammazione. Questa dose ha mostrato un'efficace induzione di marcatori infiammatori se applicata in combinazione con carico degenerativo e nutrizionelimitata 15,20. In un recente studio che utilizza TNF-α come unico fattore di iniziazione della degenerazione IVD, è stata determinata una soglia di 100 ng TNF-α / cm3 volume del disco come dose efficace per l'induzione di cambiamenti infiammatori e degenerativi nell'IVD21. Si suggerisce che la dose di TNF-α utilizzata per indurre l'infiammazione dovrebbe essere normalizzata al volume del disco per effetti riproducibili. Inoltre, si dovrebbe garantire una buona distribuzione del materiale di iniezione nell'IVD e che tale iniezione sarà adeguatamente riproducibile negli esperimenti successivi. Poiché la pressione di iniezione può variare da uno individuo all'altro, potrebbero esserci diverse distribuzioni del materiale tra gli stessi gruppi di studio in diversi esperimenti. Un approccio che abbiamo scelto per esaminare la distribuzione uguale è stato l'utilizzo di iniezioni blu trypan diluite PBS. Si consiglia di standardizzare la tecnica di iniezione, ad esempio con pompe di iniezione e tassi di iniezione predefiniti e riproducibili. Come mostrato in precedenza, una singola puntura di ago con aghi calibro 22, 25 o calibro 30 nell'IVD non ha causato un effetto che ha interagito con i risultatidello studio 20,21,24,25. Si raccomanda di considerare la dimensione del disco per il volume della sostanza da iniettare e per le dimensioni dell'ago utilizzate per l'iniezione. Inoltre, si consiglia di utilizzare una singola iniezione per evitare di indurre potenziali effetti degenerativi causati da iniezioni anulari multiple21,26.
Alcune limitazioni del modello attuale devono essere affrontate. Il caricamento degli IVD richiede l'accesso ai bioreattori, che attualmente non sono ampiamente disponibili in molti laboratori che lavorano sull'IDD. Tuttavia, la necessità di modelli di degenerazione IVD preclinici è in aumento. I modelli di coltura degli organi apportano benefici etici alla riduzione della necessità di modelli animali e l'investimento una volta sui costi dei bioreattori potrebbe essere accessibile considerando la riproducibilità della stimolazione degenerativa e la riduzione dei costi associati agli esperimenti sugli animali. Tuttavia, alcune interazioni in vivo, come il ruolo del sistema immunitario, non possono essere simulate con il modello di coltura degli organi fornito. Inoltre, la misurazione dei segnali nervosi e la valutazione del dolore che sarebbe possibile nei modelli animali non possono attualmente essere considerate con il modello attuale. Sono state sollevate alcune preoccupazioni sul fatto che le proprietà meccaniche degli IVD di coda potessero essere paragonabili agli IVD umani in quanto la posizione verticale della colonna vertebrale è unicanell'uomo 28. Le proprietà anatomiche e molecolari degli IVD della coda bovina, come la densità cellulare, la mancanza di cellule notocrodali, la composizione biochimica29,30e le proprietà meccaniche degli IVD caudali bovini, come la gamma di movimento in flessione, estensione, torsione epiegatura 31 sono molto simili ai D IVD umani. In particolare, gli IVD umani acquisiscono sempre più attenzione di recente per i modelli di cultura degliorgani 28. Gli IVD cadaverici umani nei modelli ex vivo sono considerati altamente efficienti in quanto possono evitare differenze di specie che sono più clinicamente rilevanti32. A differenza delle code iVD bovine ottenute dai mattatoi, ciò richiederebbe il trapianto di IVD umani 24 h post mortem e, quindi, l'approvazione etica a seguito delle leggi locali sul trapianto diorgani 28. Il metodo attuale può anche essere facilmente adattato ad altre specie.
Uno dei principali vantaggi della tecnica rispetto ad altri metodi di colture ex vivo è la combinazione di iniezione intradiscale, condizioni medie patologiche e carico dannoso per simulare meglio la fase iniziale dei dischi degenerativi. 23 hanno usato TNF-alfa nel mezzo di IVD bovini caricati dinamicamente invece di iniezione negli IVD e hanno mostrato un aumento del trasporto di TNF-alfa dal mezzo nel nucleo pulposo rispetto al fibroso annulus, che è in conformità con i nostri risultati. Mentre miravamo a simulare le prime fasi dell'IDD, che si verifica a livello cellulare senza gravi interruzioni dell'architettura dei dischi12,abbiamo scelto le concentrazioni TNF-alfa basate su precedenti studi di coltura di organi utilizzando TNF-alfa nel mezzo per simulare le prime fasi di IDD12,22,23. L'uso di altri stimolanti infiammatori e concentrazioni più elevate di TNF-alfa potrebbe essere testato per simulare lo stato degenerativo del disco desiderato a seconda della domanda di studio. Concentrazioni più elevate di TNF-alfapossono compensare meglio la mancanza di feedback regolatori immunitari sistemici presenti durante la degenerazione del disco come proposto da Ponnappan et al. Pertanto, l'approccio combina le prove fornite da studi precedenti in un modello di coltura di organi ex vivo della malattia degenerativa precoce del disco.
Questo protocollo può essere ulteriormente migliorato in diversi modi. La durata e l'estensione del periodo di carico e gonfiore libero possono essere scelte in base al piano di studio desiderato. Gli effetti a lungo termine delle stimolazioni infiammatorie o degenerative sulla degenerazione del disco sono di alto interesse clinico e possono essere realizzati con il protocollo attuale. Abbiamo utilizzato solo geni selezionati considerati altamente rilevanti per lo stato iniziale di IDD11. Un'ulteriore convalida di questo modello potrebbe includere una valutazione più approfondita di geni e proteine, come gli approcci omici. Di conseguenza, altri fattori infiammatori potrebbero essere studiati in combinazione con il carico degenerativo, a seconda dello stato degenerativo desiderato. Ad esempio, le iniezioni di lipoaccarido hanno dimostrato di stimolare l'infiammazione nell'IVD33. Un confronto di diversi stimolanti infiammatori può essere realizzato con il presente protocollo per trovare lo stimolante infiammatorio più appropriato per la domanda di studio desiderata. Abbiamo valutato i cambiamenti di marcatori infiammatori selezionati (IL-6, IL-8), marcatori anabolizzanti (aggrecan, collagene) e marcatori catabolici (metallopeptidasi matriciale, disintegrina e metalloproteinasi con motivi trombospondina) con il presente protocollo20. Poiché l'intero profilo di espressione genica potrebbe cambiare, gli esami futuri potrebbero includere tecniche di sequenziamento dell'RNA di nuova generazione per determinare nuovi biomarcatori per la diagnostica della degenerazione del disco e obiettivi terapeutici per l'intervento biologico precoce. Inoltre, altre metodologie, come l'istologia, la colorazione immunoistochimica, le misurazioni biochimiche dei componenti della matrice extracellulare (come glicosaminoglicani, GAG) e i test di compressione dinamica possono essere eseguite per analizzare ulteriormente le proprietà biologiche, biochimiche e biomeccaniche degli IVD con il presente modello. Un altro possibile modo analitico sarebbe quello di analizzare separatamente l'impatto sul tessuto esterno AF e NP utilizzando bCol1a1, Col1a2, CD146, SM22α e MKX come marcatori di espressione genica per l'AFesterno 34,35. Il Spine Research Interest Group all'Annual ORS Meeting 2014 di New Orleans ha raccomandato di seguire marcatori fenotipico NP sani: HIF-1alpha, GLUT-1, rapporto aggrecan / collagene II >20, Shh, Brachyury, KRT18/19, CA12 e CD2436. I geni marcatori NP bBrachyury/T e bProte proteina correlata al frizzledsecreted 2 sono stati i più convincenti che separano NP dal tessuto AF interno ed esterno nell'IVD34 bovino. Inoltre, il contenuto sGAG dell'NP è stato segnalato per essere significativamente più elevato rispetto all'AF34 esterno.
In conclusione, questo nuovo modello proinflammatorio e degenerativo di coltura di organi IVD fornisce condizioni rilevanti per simulare l'IDD in fase iniziale in un microambiente 3D altamente rilevante. Certamente, il presente protocollo può essere ulteriormente modificato in base agli obiettivi dello sperimentatore. Inoltre, il nostro modello è in grado di ridurre il numero di animali da studio necessari e quindi riflette totalmente i principi 3R di ridurre, sostituire, perfezionare.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da AO Foundation e AOSpine International. Babak Saravi ha ricevuto il sostegno della Fondazione tedesca Spine e della Fondazione tedesca per l'osteoartrite. Gernot Lang è stato sostenuto dal Programma Berta-Ottenstein per scienziati clinici avanzati, Facoltà di Medicina, Università di Friburgo, Germania.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Bromo-3-chloropropane(BCP) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | B9673 | |
| Ascorbate-2-phosphate | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | A8960 | |
| Band saw | Exakt Apparatebau, Norderstedt, Germany | model 30/833 | |
| Betadine | Munndipharma, Frankfurt, Germany | ||
| Bovine IL-8 Do.it-Yourself ELISA | Kingfisher Biotech, St. Paul, USA | DIY1028B-003 | |
| Corning ITS Premix | Corning Inc., New York, USA | 354350 | |
| DMEM high glucose | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 10741574 | |
| DMEM low glucose | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 11564446 | |
| Ethanol for molecular biology | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 09-0851 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | A4766801 | |
| Non-essential amino acid solution | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 11140050 | |
| Penicillin/Streptomycin(P/S) | gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 11548876 | |
| Phosphate Buffer Solution, tablet | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P4417 | |
| Pronase | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 10165921001 | |
| Primocin | InvivoGen, Sandiego, USA | ant-pm-05 | |
| Pulsavac Jet Lavage System | Zimmer, IN,USA | ||
| TissueLyser II | Quiagen, Venlo, Netherlands | 85300 | |
| Streptavidinn-HRP | Kingfisher Biotech, St. Paul, USA | AR0068-001 | |
| Superscript VILO | Invitrogen by life Technologies, Carlsbad, USA | 10704274 | |
| cDNA Synthesis Kit | Applied Biosystems by life technologies | 10400745 | |
| TaqMan Universal Master Mix | Applied Biosystems by life technologies | ||
| TNF-alpha, recombinant human protein | R&D systems, Minnesota, USA | 210-TA-005 | |
| TRI Reagent | Molecular Research Center, Cincinnati, USA | TR 118 | |
| Tris-EDTA buffer solution | sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 93283 | |
| Gene bIL-6 | Applied Biosystems by life technologies | Custom made probes | Primer fw (5′–3′) TTC CAA AAA TGG AGG AAA AGG A Primer rev (5′–3′) TCC AGA AGA CCA GCA GTG GTT Probe (5′FAM/3′TAMRA) CTT CCA ATC TGG GTT CAA TCA GGC GATT |
| Gene bIL8 | Applied Biosystems by life technologies | Bt03211906_m1 | |
| Gene bTNF-alpha | Applied Biosystems by life technologies | Custom made probes | Primer fw (5′–3′) CCT CTT CTC AAG CCT CAA GTA ACA A Primer rev (5′–3′) GAG CTG CCC CGG AGA GTT Probe (5′FAM/3′TAMRA) ATG TCG GCT ACA ACG TGG GCT ACC G |
| GENE bIL1beta | Applied Biosystems by life technologies | Custom made probes | Primer fw (5′–3′) TTA CTA CAG TGA CGA GAA TGA GCT GTT Primer rev (5′–3′) GGT CCA GGT GTT GGA TGC A Probe (5′FAM/3′TAMRA) CTC TTC ATC TGT TTA GGG TCA TCA GCC TCA A |
| RPLP0 | Applied Biosystems by life technologies | Bt03218086_m1 |
References
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