Summary
该协议提出了一种新的实验模型的发炎，退化牛器官培养，以模拟早期椎间盘退化。
Abstract
症状性椎间盘 （IVD） 退化 （IDD） 是一个主要的社会经济负担，其特征是炎症和组织退化。由于缺乏因果疗法，迫切需要创新的实验器官培养模型，以研究疾病进展中涉及的机制，寻找治疗目标，减少对动物模型的需求。我们在这里展示一个新的，三维的器官培养模型协议，模仿发炎和催化微环境，这是在DD期间存在。
最初，牛的静脉注射器在组织培养介质中被解剖、清洁和培养。动态生理或病理负荷应用于定制生物反应器，每天2小时。IVDs被分配给一个对照组（高葡萄糖介质，生理负荷，磷酸盐缓冲盐水注射）和病理组（低葡萄糖介质，病理负荷，肿瘤坏死因子-阿尔法注射）四天。对IVD采集的细胞核细胞进行基因表达分析，对条件器官培养介质进行酶相关免疫分析。
我们的数据表明，与对照组相比，在病理组加载后，炎症标记的表达更高，圆盘高度降低。此协议是可靠的模拟IVD炎症和退化，可以进一步扩大其应用范围。
Introduction
背痛 （LBP） 可以影响所有年龄段的个人，是全世界残疾的主要原因1，2，3.与LBP相关的总成本每年超过1000亿美元4，5。症状性椎间盘 （IVD） 退化 （IDD）， 一种以炎症和组织退化为特征的疾病， 是 LBP6，7的主要原因 .具体来说，IDD 的特点是 IVD 的细胞外基质 （ECM） 逐渐分解，由导致加速病理学、神经紊乱并最终残疾的多种因素诱导和触发。此外，IDD与释放发炎细胞因子、改变脊柱生物力学、血管生成和神经内生有关，这增加了疼痛感，共引起慢性LBP（主动不和谐）6，8。迄今为止，治疗方案包括切除术和随后融合相邻的椎骨，植入IVD假肢，或非手术方法，如非类固醇抗炎药物，阿片类药物，和肌肉松弛剂的IDD9患者。目前的标准治疗方案，外科和非手术，只是部分有效，未能解决潜在的生物学问题9，10。早期退行性椎间盘疾病的特点是初始炎症组织反应，特别是肿瘤坏死因子-阿尔法（TNF-阿尔法）表达11的增加。这些早期的椎间盘变化主要发生在细胞水平，而不会破坏光盘架构，以前可以模仿营养缺乏在亲炎症条件下12。因此，精确模拟体内情况，以调查这些退化机制，并找到合适的治疗目标至关重要。此外，在这些分子特性的模拟中，光盘的机械加载环境在IVD的病理和生理变化中起着关键作用。因此，结合这些方法将使我们向前迈出一步，以模拟体内静脉注射器的复杂微环境。目前没有研究考虑动态加载的方面，以及亲炎症和营养设置，以最好的我们所知。
虽然大型动物模型允许调查潜在的相关体内相互作用，他们是昂贵和工作密集型。此外，由于动物模型在研究中的使用长期以来一直是一个有争议的问题，因此减少回答重要研究问题所需的动物数量是人们非常感兴趣的。最后，目前还没有理想的动物模型模仿IDD在IVD研究13，14。因此，有必要建立一个具有成本效益和可靠的替代方法，例如一种器官培养模型，以模拟 IDD 以及相关的炎症和退行性过程。最近，本议定书的应用，建立一个发炎和退行性器官培养模型，以模拟早期椎间盘疾病，使我们能够研究抗炎药物在DD器官培养15的影响。
在这里，我们描述了如何获得牛椎间盘，并通过直接 α在低营养介质条件下在生物反应器中产生催化和增生微环境诱导早期 IDD 状态。 图1 说明了实验模型，并显示了用于模拟退行性和生理负荷条件的生物反应器。
图1：实验设置的插图。A：牛尾巴： B：解剖牛间椎间盘： C：将光盘转移到具有文化媒介的井板： D：在生物反应器中加载模拟： E：静脉注射技术： F： 注射PBS/三潘蓝色染料后IVD显示分布。IDD：椎间盘退化。 请单击此处查看此图的较大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
实验是使用从当地屠宰场获得的牛尾巴进行的。本研究中使用的生物材料取自食物链，无需瑞士和欧洲法律的道德批准。
1. 牛椎间盘解剖
- 用自来水彻底冲洗整个尾巴，去除表面上的污垢和头发。
注：具有完好的解剖端，每尾最多可使用 9 IVD（共管 1-9）用于实验，具体取决于 IVD 的预期大小。考虑到所需的直径在15-20毫米之间，我们使用12条牛尾，每尾5IVD进行实验。 - 将整个尾巴浸入包含 1% 贝他丁溶液的盒子中 10 分钟。用无菌纱布短暂干燥尾巴，并将其放在无菌窗帘上。
注意：在解剖光盘时，用林格溶液湿纱布加湿尾部，以防止脱水。将用湿纱布包裹的尾部（或剩余部分）存放，直到完成整个解剖过程。 - 使用手术刀（第20号）尽可能从脊柱上完全切除软组织，以方便IVD的识别。用骨去除钳子去除椎骨的旋转和横向过程。
注：选择直径所需的 IVD。在目前的研究中使用了直径为15-20毫米的IVD。 - 用骨钳横向切割，穿过每个椎体的中间，以获得单独的运动段。将运动段放入带纱布的培养皿中，用林格的溶液湿润。
- 通过触觉定位IVD和椎骨，并通过轻轻地移动运动段。与 IVD 生长板中的带锯平行切割，IVD 每侧各一个。通过触摸和查找与圆盘（软）相邻的骨端板部分（硬）的凸形部位（从 IVD 向椎骨方向的安全距离约为 0.5-1 mm），确定生长板的位置。在切割椎骨时，确保带锯的叶片用林格的溶液冷却。
- 将IVD转移到干净的培养皿中，用干净的纱布与林格的溶液湿润。
注意：纱布应保湿，不要太湿，以防止IVD肿胀， - 使用手术刀刀片刮掉椎体（红/粉骨）、生长板（白色软骨），使末板完好无损（黄粉色）。使两个表面平整并行，用于加载过程。将刮过的 IVD 转移到新鲜的培养皿中，用林格的溶液将纱布弄湿。
注意：戴上链式邮件手套，在握住 IVD 和刮擦时保护手。 - 用卡钳测量圆盘的高度和直径。使用喷气式熔岩系统使用林格溶液清洁椎骨中的血块。
- 将 IVD 转移到 50 mL 塑料管，每管一个 IVD。每 IVD 添加 25 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） + 10% 青霉素/链霉素 （P/S），在室温下在轨道摇床上摇晃 15 分钟。
- 吸气超自然，并添加10毫升的PBS +1%P/S每IVD2分钟冲洗IVD。
2. IVD 培养和装载
- 将光盘转移到 IVD 腔室并添加 IVD 培养介质（杜尔贝科的改性鹰介质（ DMEM ， 4 . 5 g / L 高血糖 DMEM 用于生理组和 2 g / L 低血糖 DMEM 用于病理组） = 1% P / S = 2% 胎儿小腿血清 + 1% ITS （包含 5 μg / mL 胰岛素， 6 微克 / mL 转移素和 5 微克 / mL 酸） + 50 微克 / mL 阿斯焦酸盐 - 2 - 磷酸盐 + 1% 非必需氨基酸 + 50 微克 / mL 抗菌剂用于原细胞），并放置在孵化器中，在37°C， 85% 湿度和 5% CO2 。
- 根据实验组16，在生物反应器系统内培养光盘4天。在病理组中，将退行性装载条件维持在 0.32-0.5 MPa，5 Hz 为 2 小时/天。在生理控制组中，使用 0.02-0.2 MPa 的加载协议，0.2 Hz 为 2 小时/天。
注意：在装载过程中将 IVD 放置在包含 5 mL IVD 介质的腔室中。体积取决于生物反应器装载室的大小。在加载程序之间，将 IVD 放在六井板中，并配有 7 mL IVD 培养介质，以进行自由膨胀恢复。 - 用于分析实验期间光盘高度的变化，请在 IVD 解剖（基线）后用卡钳测量光盘高度，然后在自由膨胀期后和实验持续时间的动态加载后每天测量光盘高度。
3. 内分膜肿瘤坏死因子-阿尔法（TNF-α）注射
- 在第 1 天的第一个动态加载周期之后，将 IVD 放在垂直位置的培养皿中，然后用钳子稳定 IVD。
- 用30口径胰岛素针将重组TNF-α（每IVD70μL中的100 ng）注射到病理组17的细胞核纸浆组织中。在1分钟内以大约70μL的速度缓慢注射。
- 注射后，将注射器拉回 IVD 的中途，然后拉注射器柱塞，以创建一个真空，防止注射溶液向后泄漏，然后从 IVD 中完全取出针头和注射器。
注意：通过注射含有试锅蓝色染料的PBS进行试验，以评估加载后和隔夜培养后注射溶液的分布。
4. 基因表达
- 在第4天收获试管婴儿。用活检冲床收集细胞核纸浆 （NP） 组织（IVD 中间的凝胶部分）。用手术刀刀片（第20号）收集外环纤维（AF）。
注意：对于第 0 天的基线参考，解剖后立即收集组织以提取 RNA。 - 根据实验设计，使用基因表达分析所需的NP或AF组织量。
注：在目前的实验中，使用了大约150毫克的组织。RNA 分离溶液与组织质量的比例应至少为每 100-150 毫克组织 2 mL，以便高效提取。 - 用消化溶液（DMEM中的 0.2% 蛋白酶，过滤灭菌）消化 NP 或 AF 组织，在 37 °C 处孵育 1 小时，磁搅拌18。
- 使用液氮将组织样本闪冻，粉碎成细粉末。将粉碎的组织粉末均等地分成两个 2 mL 管，每个管子在单相溶液（RNA 隔离溶液）中含有 1 mL 的瓜尼丁硫氰酸酯和酚。
- 在包含RNA隔离溶液和粉碎组织粉的2mL管中执行均质化。将组织粉末同质化 5 倍，使用 8 毫米不锈钢球和 30 Hz 的组织解压器 3 分钟。离心机在12，000 x g，4 °C 10 分钟，并将超自然体转移到一个新的管子.超自然人可以储存在-80°C至少一个月。
- 每 1 mL RNA 隔离溶液添加 0.1 mL 的 1-溴-3-氯氯烷 （BCP），并大力摇动 15 秒。在室温下将产生的混合物存放在轨道摇床上15分钟，在4°C时将离心机储存在12，000 x g 上15分钟。
注：RNA仅停留在上部注明阶段。 - 将水相转移到一个新的管子中，用0.25毫升的异丙酚和0.25mL的高盐降水溶液沉淀RNA沉淀RNA，每1mLRNA隔离溶液用于初始同质化。在室温下将样品存放在轨道摇床和离心机上 15 分钟，在 4 °C 下 储存 8 分钟。
注：或者，使用基于列的RNA提取方法，通常会导致RNA纯度更高，但RNA产量较低。 - 去除超自然体，用用于初始同质化的 1 mL 75% 乙醇洗净 RNA 颗粒。离心机在7，500 x g 5分钟在4°C。
- 取出乙醇洗涤，并短暂地空气干燥RNA颗粒3-5分钟。通过几次通过移液器尖端传递溶液，并在 55-60 °C 下孵育 10-15 分钟，将 RNA 溶解在 20μL 的二乙基碳酸氢酸酯 （DEPC） 处理水中。
- 测量吸收度分别为230纳米、260纳米和280纳米（A230、A260和A280）。1.0 的 A260 对应于 40μg/mL RNA。预计A260/A280比为1.6-1.9，而污染导致A260/A280比<1.6。
- 为 20 μL 反应量准备反向转录酶 （RT） 反应组合。该混合物包含RT酶混合物、核糖核蛋白（RgCl）和0.4μg的RNA样品。
- 简要离心机 RT 管混合管底部的所有组件。
- 将样品放在恒温器仪器中。为 RT 选择适当的程序。 在 25 °C 下运行 RT 10 分钟，然后在 42 °C 时反向转录步骤 120 分钟，在 85 °C 时停止使用反向转录酶 5 分钟，最后冷却至 4 °C。
- 用三聚氰胺（羟基甲基）氨基甲烷（三聚氰胺）-乙酰胺乙酰酸（EDTA）缓冲（10米三聚氰胺和1m EDTA）稀释产生的cDNA，最终浓度为0.4微克RNA，用于每100μL cDNA溶液的RT。将 cDNA 样品存储在 -20 °C。
- 使用 10 μL 反应量执行实时聚合酶链反应 （PCR）。反应量包含主混合物（包含DNA聚合酶、尿素-DNA糖酶、 dNTP 具有 dUTP、被动参考和优化缓冲组件）、前置物 45μM、反向引物 45 μM、探头 12.5 μM（包含与探头 5' 端相连的记者染料、探头 3' 端的轻微凹槽粘合剂以及探头 3' 端的无荧光淬火器），2μL cDNA和DEPC处理的水。
- 使用 2-ΔΔCT 方法19运行内源控制 （RPLP0） 进行相对定量。
- 将样品添加重复，通过添加TE缓冲区而不是cDNA运行无模板控制。在标准条件下运行 PCR（2 分钟在 50 °C，10 分钟在 95 °C，40 周期 15 秒在 95 °C，1 分钟在 60 °C）。
- 按照比较CT方法对mRNA目标进行相对定量。将mRNA规范化到基线样本的量计算为2-ΔΔCT，而ΔΔCT是样本的ΔCT（CT靶点-CT内源性控制）与基线样本的ΔCT（CT靶点和CT内源性控制）之间的差值。
5. IVD介质中蛋白质含量的定量
- 收集由 IVD 样本调节的介质，以测量介质中的蛋白质含量。根据目标蛋白质的协议执行酶相关免疫分析 （ELISA）。
- 根据制造商的指示，牛间白血病-8 （IL-8） 由抗牛 IL8 ELISA 套件进行量化。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
低血糖介质的退行性负荷与TNF-α注射相结合，导致蛋白标记物的基因表达显著增加，白细胞介质6（IL-6）和白细胞介质8（IL-8）与NP细胞中的生理对照组相比，经过4天的培养（图2）。相比之下，我们没有观察到NP细胞中蛋白1+（IL-1+）和TNF-α的发炎基因发生显著变化（未显示数据）。此外，退化培养条件并没有改变IL-6和IL-8在AF细胞中的基因表达。
图2：细胞核（NP）组织中的基因表达水平和环状纤维化（AF）组织。 这些是在生理或病理文化条件下经过4天的培养后测量的，并正常化为基线（第0天）。意味着± 95% 的置信区间 n=8，**p<0.01。这个数字已经从20个修改。 请单击此处查看此图的较大版本。
与基因表达结果一致，介质中的IL-8蛋白质含量在2天4天后与生理状况（图3）相比明显增加。然而，在第3天（自由膨胀或加载后）的测量显示，研究组之间没有显著差异，尽管结果表明退化组的值较高。
图3：自由肿胀培养 （FS） 和动态加载 （负载） 后，IVD 培养介质中刺激蛋白 IL-8 释放的量化。 结果显示为未正常化的介质中 ng/mL 中的原始浓度。平均± 95% 置信区间，n=8，**p<0.01。这个数字已经从20个修改。 请单击此处查看此图的较大版本。
解剖后，光盘高度（DH）变化正常化为DH，如 图4所示。与生理组相比，装载后DH的减少显示退行性组的值更高（即高度降低更多），而自由膨胀期后盘面高度增益没有差异。这表明加载过程后病理组和生理组之间的椎间盘高度变化差异较大。此外，与第2天和第3天的测量结果相比，1天后差异不那么明显，表明退行性和炎症性疾病的渐进效应。
图4：光盘高度更改为基线值正常化（解剖后）。 平均± 95% 的置信区间。FS：自由肿胀。N=10，***p<0.001。这个数字已经从20个修改。 请单击此处查看此图的较大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
我们在这里提供了一个详细的协议，以模拟退行性和炎症性IVDD。此协议可用于对导致对光盘的破坏性影响的炎症通路进行详细检查。此外，该协议可以帮助确定在疾病进展中涉及的有希望的治疗目标。
我们最近发现，人类重组TNF-α可诱发牛和人类NP细胞21的炎症，这是根据该领域的其他研究证实，TNF-α可用于炎症模拟IVD细胞22，23。在本研究中，每试管婴儿服用100ng TNF-α用于诱发炎症。这种剂量显示有效诱导炎症标记时，结合退行性负荷和有限的营养15，20。在最近一项以TNF-α为IVD退化的唯一启动因子的研究中，确定100ng TNF-α/cm3盘积的阈值为诱导IVD21炎症和退行性变化的有效剂量。建议将用于诱发炎症的TNF-α剂量正常化到光盘的体积，以产生可重复的效果。此外，应确保IVD中注射材料的分布良好，并且这种注射在随后的实验中将得到充分的重复。由于注射压力可能因人而异，因此在不同的实验中，同一研究组之间可能有不同的材料分布。我们选择检查等分布的方法之一是使用 PBS 稀释的尝试潘蓝色注射。建议标准化注射技术，例如注射泵和预先定义和可重复的注射率。如前所述，一针穿刺22个量表，25个量表，或30个量表针进入IVD并没有造成与研究结果相互作用的影响20，21，24，25。建议考虑注射物质体积的圆盘大小和用于注射的针头大小。此外，建议使用单次注射，以避免诱导由多个环形注射21，26造成的潜在退行性影响。
需要解决当前模型的某些限制。IVD 的加载需要获得生物反应器，而生物反应器目前在许多研究 IDD 的实验室中并不广泛。然而，对前CIVD退化模型的需求正在上升。器官培养模型为减少对动物模型的需求带来了道德上的好处，考虑到退行性刺激的可重复性以及动物实验相关成本的降低，对生物反应器成本的一次性投资是负担得起的。然而，一些体内相互作用，如免疫系统的作用，不能与所提供的器官培养模型进行模拟。此外，目前不能用目前的模型来考虑对动物模型中可能出现的神经信号的测量和对疼痛的评估。有人担心尾部IVDs的机械特性能否与人类IVD相媲美，因为直立脊柱位置在人类中是独一无二的。牛尾IVD的解剖和分子特性，如细胞密度、缺乏鼻腔细胞、生化成分29、30，以及牛尾IVD的机械特性，如弯曲、延伸、躯干、弯曲31的运动范围等，都与人类IVD非常相似。值得注意的是，人类IVD最近越来越受到器官培养模型28的关注。人类尸体IVD在前活体模型被认为是高效的，因为他们可以避免物种差异，这是更临床相关的32。与屠宰场获得的牛IVD尾巴相比，这需要在死后24小时移植人类IVD，因此，根据当地器官移植法28，需要伦理批准。目前的方法也可以很容易地适应其他物种。
与其他活体培养方法相比，该技术的一个主要优点是结合了内分泌注射、病理介质条件和有害负荷，以更好地模拟退行性光盘的早期阶段。Walter等人23在动态加载牛IVD的介质中使用TNF-alpha，而不是注射到IVD中，并且显示TNF-alpha从介质到细胞核的输送量比环状纤维瘤（符合我们的结果）有所增加。当我们旨在模拟 IDD 的早期阶段（在细胞水平上发生，而不会对光盘架构12造成重大干扰）时，我们根据先前的器官培养研究选择了 TNF-alpha 浓度，在介质中使用 TNF-alpha 来模拟 IDD12、22、23的早期阶段。可以测试使用其他炎症性兴奋剂和更高浓度的TNF-alpha，以模拟所需的退行性光盘状态，具体取决于研究问题。TNF-alpha浓度较高可以更好地补偿庞纳潘等人提出的在椎间盘退化期间缺乏全身免疫调节反馈的情况。使用低葡萄糖的有害中等条件是基于先前的工作表明，营养限制介质和接触TNF-alpha模拟分子变化特征，这些特征在早期椎间盘退化状态12，27可用。因此，该方法结合了先前研究对早期退行性椎间盘疾病的一种前体内器官培养模型提供的证据。
此协议可以通过多种方式进一步改进。加载和自由膨胀期的持续时间和范围可根据所需的研究计划选择。炎症或退行性刺激对椎间盘退化的长期影响具有很高的临床意义，可以通过当前协议来实现。我们只使用了被认为与IDD11早期状态高度相关的选定基因。对该模型的其他验证可能包括对基因和蛋白质（如经济学方法）的加宽评估。因此，其他炎症因素可以与退行性负荷相结合进行调查，具体取决于所需的退行状态。例如，脂糖注射已被证明刺激IVD33的炎症。不同的炎症兴奋剂的比较可以完成与本协议，以找到最合适的炎症兴奋剂所需的研究问题。我们评估了选定的炎症标记（IL-6，IL-8），合成代谢标记（阿格雷肯，胶原蛋白）和催化剂标记（矩阵金属脱脂，一种与血栓蓬丁图案的脱霉素和金属蛋白酶）与本议定书20的变化。由于整个基因表达特征可能会发生变化，未来的检查可能包括下一代RNA测序技术，以确定用于盘变性诊断的新生物标志物和早期生物干预的治疗目标。此外，还可以执行其他方法，如组织学、免疫化学染色、细胞外基质成分（如糖核糖核素、GAG）的生化测量以及动态压缩测试，以进一步分析IVD的生物、生化和生物力学特性。另一种可能的分析方法是使用 bCol1a1、Col1a2、CD146、SM22® 和 MKX 作为外部 AF34、35的基因表达标记，单独分析对外部 AF 和 NP 组织的影响。脊柱研究兴趣小组在新奥尔良举行的2014年ORS年会上建议采用健康的NP表型标记：HIF-1alpha、GLUT-1、阿格雷坎/胶原蛋白II比>20、什、布拉丘里、KRT18/19、CA12和CD2436。NP标记基因bBrachyury/T和bSecred与毛刺相关的蛋白质2是牛IVD34中最令人信服的分离NP与内外部AF组织。此外，据报道，NP的sGAG含量明显高于外部AF34。
总之，这种新型的催生和退化IVD器官培养模型为在高度相关的3D微环境下模拟早期IDD提供了相关条件。当然，根据调查员的目标可以进一步修改本议定书。此外，我们的模型能够减少所需的研究动物的数量，从而完全反映了减少，更换，提炼的3R原则。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了 AO 基金会和 AO 斯平国际的支持。巴巴克·萨拉维得到了德国脊柱基金会和德国骨关节炎基金会的奖学金支持。格诺特·朗得到了德国弗赖堡大学医学院高级临床科学家贝尔塔-奥滕斯坦方案的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Bromo-3-chloropropane(BCP) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | B9673 | |
| Ascorbate-2-phosphate | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | A8960 | |
| Band saw | Exakt Apparatebau, Norderstedt, Germany | model 30/833 | |
| Betadine | Munndipharma, Frankfurt, Germany | ||
| Bovine IL-8 Do.it-Yourself ELISA | Kingfisher Biotech, St. Paul, USA | DIY1028B-003 | |
| Corning ITS Premix | Corning Inc., New York, USA | 354350 | |
| DMEM high glucose | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 10741574 | |
| DMEM low glucose | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 11564446 | |
| Ethanol for molecular biology | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 09-0851 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | A4766801 | |
| Non-essential amino acid solution | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 11140050 | |
| Penicillin/Streptomycin(P/S) | gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 11548876 | |
| Phosphate Buffer Solution, tablet | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P4417 | |
| Pronase | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 10165921001 | |
| Primocin | InvivoGen, Sandiego, USA | ant-pm-05 | |
| Pulsavac Jet Lavage System | Zimmer, IN,USA | ||
| TissueLyser II | Quiagen, Venlo, Netherlands | 85300 | |
| Streptavidinn-HRP | Kingfisher Biotech, St. Paul, USA | AR0068-001 | |
| Superscript VILO | Invitrogen by life Technologies, Carlsbad, USA | 10704274 | |
| cDNA Synthesis Kit | Applied Biosystems by life technologies | 10400745 | |
| TaqMan Universal Master Mix | Applied Biosystems by life technologies | ||
| TNF-alpha, recombinant human protein | R&D systems, Minnesota, USA | 210-TA-005 | |
| TRI Reagent | Molecular Research Center, Cincinnati, USA | TR 118 | |
| Tris-EDTA buffer solution | sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 93283 | |
| Gene bIL-6 | Applied Biosystems by life technologies | Custom made probes | Primer fw (5′–3′) TTC CAA AAA TGG AGG AAA AGG A Primer rev (5′–3′) TCC AGA AGA CCA GCA GTG GTT Probe (5′FAM/3′TAMRA) CTT CCA ATC TGG GTT CAA TCA GGC GATT |
| Gene bIL8 | Applied Biosystems by life technologies | Bt03211906_m1 | |
| Gene bTNF-alpha | Applied Biosystems by life technologies | Custom made probes | Primer fw (5′–3′) CCT CTT CTC AAG CCT CAA GTA ACA A Primer rev (5′–3′) GAG CTG CCC CGG AGA GTT Probe (5′FAM/3′TAMRA) ATG TCG GCT ACA ACG TGG GCT ACC G |
| GENE bIL1beta | Applied Biosystems by life technologies | Custom made probes | Primer fw (5′–3′) TTA CTA CAG TGA CGA GAA TGA GCT GTT Primer rev (5′–3′) GGT CCA GGT GTT GGA TGC A Probe (5′FAM/3′TAMRA) CTC TTC ATC TGT TTA GGG TCA TCA GCC TCA A |
| RPLP0 | Applied Biosystems by life technologies | Bt03218086_m1 |
References
- Vos, T., et al. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 328 diseases and injuries for 195 countries, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet. 390 (10100), 1211-1259 (2017).
- Hoy, D., et al. Measuring the global burden of low back pain. Best Practice & Research Clinical Rheumatology. 24 (2), 155-165 (2010).
- Thiese, M. S., et al. Prevalence of low back pain by anatomic location and intensity in an occupational population. BMC Musculoskeletal Disorders. 15 (1), 283 (2014).
- Katz, J. N. Lumbar Disc Disorders and Low-Back Pain: Socioeconomic Factors and Consequences. The Journal of Bone and Joint Surgery (American). 88, suppl_2 21 (2006).
- Vlaeyen, J. W. S., et al. Low back pain. Nature Reviews Disease Primers. 4 (1), 52 (2018).
- Khan, A. N., et al. Inflammatory biomarkers of low back pain and disc degeneration: a review: Biomarkers of disc degeneration and back pain. Annals of the New York Academy of Sciences. 1410 (1), 68-84 (2017).
- Kim, H. S., Wu, P. H., Jang, I. T. Lumbar Degenerative Disease Part 1: Anatomy and Pathophysiology of Intervertebral Discogenic Pain and Radiofrequency Ablation of Basivertebral and Sinuvertebral Nerve Treatment for Chronic Discogenic Back Pain: A Prospective Case Series and Review of Literature. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1483 (2020).
- Adams, M. A., Roughley, P. J. What is Intervertebral Disc Degeneration, and What Causes It. Spine. 31 (18), 2151-2161 (2006).
- Wu, P. H., Kim, H. S., Jang, I. T. Intervertebral Disc Diseases Part 2: A Review of the Current Diagnostic and Treatment Strategies for Intervertebral Disc Disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (6), 2135 (2020).
- Lurie, J. D., et al. Surgical Versus Nonoperative Treatment for Lumbar Disc Herniation: Eight-Year Results for the Spine Patient Outcomes Research Trial. Spine. 39 (1), 3-16 (2014).
- Risbud, M. V., Shapiro, I. M. Role of cytokines in intervertebral disc degeneration: pain and disc content. Nature Reviews Rheumatology. 10 (1), 44-56 (2014).
- Ponnappan, R. K., et al. An organ culture system to model early degenerative changes of the intervertebral disc. Arthritis Research & Therapy. 13 (5), 171 (2011).
- O'Connell, G. D., Vresilovic, E. J., Elliott, D. M. Comparison of Animals Used in Disc Research to Human Lumbar Disc Geometry. Spine. 32 (3), 328-333 (2007).
- Stannard, J. T., et al. Development of a whole organ culture model for intervertebral disc disease. Journal of Orthopaedic Translation. 5, 1-8 (2016).
- Li, Z., et al. Preclinical ex-vivo Testing of Anti-inflammatory Drugs in a Bovine Intervertebral Degenerative Disc Model. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 583 (2020).
- Li, Z., et al. Development of an ex vivo cavity model to study repair strategies in loaded intervertebral discs. European Spine Journal. 25 (9), 2898-2908 (2016).
- Kazezian, Z., Li, Z., Alini, M., Grad, S., Pandit, A. Injectable hyaluronic acid down-regulates interferon signaling molecules, IGFBP3 and IFIT3 in the bovine intervertebral disc. Acta Biomaterialia. 52, 118-129 (2017).
- Caprez, S., Menzel, U., Li, Z., Grad, S., Alini, M., Peroglio, M. Isolation of high-quality RNA from intervertebral disc tissue via pronase predigestion and tissue pulverization. JOR Spine. 1 (2), 1017 (2018).
- Lopa, S., Ceriani, C., Cecchinato, R., Zagra, L., Moretti, M., Colombini, A. Stability of housekeeping genes in human intervertebral disc, endplate and articular cartilage cells in multiple conditions for reliable transcriptional analysis. European Cells & Materials. 31, 395-406 (2016).
- Lang, G., et al. An intervertebral disc whole organ culture system to investigate proinflammatory and degenerative disc disease condition. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (4), 2051-2061 (2018).
- Du, J., et al. Proinflammatory intervertebral disc cell and organ culture models induced by tumor necrosis factor alpha. JOR Spine. 3, 1104 (2020).
- Purmessur, D., Walter, B. A., Roughley, P. J., Laudier, D. M., Hecht, A. C., Iatridis, J. A role for TNFα in intervertebral disc degeneration: A non-recoverable catabolic shift. Biochemical and Biophysical Research Communications. 433 (1), 151-156 (2013).
- Walter, B. A., Likhitpanichkul, M., Illien-Junger, S., Roughley, P. J., Hecht, A. C., Iatridis, J. C. TNFα Transport Induced by Dynamic Loading Alters Biomechanics of Intact Intervertebral Discs. PLOS One. 10 (3), 0118358 (2015).
- Gullbrand, S. E., et al. A large animal model that recapitulates the spectrum of human intervertebral disc degeneration. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (1), 146-156 (2017).
- Willems, N., et al. Safety of intradiscal injection and biocompatibility of polyester amide microspheres in a canine model predisposed to intervertebral disc degeneration: intradiscal application of pea microspheres. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 105 (4), 707-714 (2017).
- Michalek, A. J., Buckley, M. R., Bonassar, L. J., Cohen, I., Iatridis, J. C. The effects of needle puncture injury on microscale shear strain in the intervertebral disc annulus fibrosus. The Spine Journal. 10 (12), 1098-1105 (2010).
- Illien-Jünger, S., et al. The combined effects of limited nutrition and high-frequency loading on intervertebral discs with endplates. Spine. 35 (19), 1744-1752 (2010).
- Gantenbein, B., et al. Organ culture bioreactors--platforms to study human intervertebral disc degeneration and regenerative therapy. Current Stem Cell Research & Therapy. 10 (4), 339-352 (2015).
- Boubriak, O. A., Watson, N., Sivan, S. S., Stubbens, N., Urban, J. P. G. Factors regulating viable cell density in the intervertebral disc: blood supply in relation to disc height. Journal of Anatomy. 222 (3), 341-348 (2013).
- Maroudas, A., Stockwell, R. A., Nachemson, A., Urban, J. Factors involved in the nutrition of the human lumbar intervertebral disc: cellularity and diffusion of glucose in vitro. Journal of Anatomy. 120, Pt 1 113-130 (1975).
- Beckstein, J. C., Sen, S., Schaer, T. P., Vresilovic, E. J., Elliott, D. M. Comparison of Animal Discs Used in Disc Research to Human Lumbar Disc: Axial Compression Mechanics and Glycosaminoglycan Content. Spine. 33 (6), 166-173 (2008).
- Walter, B. A., Illien-Jünger, S., Nasser, P. R., Hecht, A. C., Iatridis, J. C. Development and validation of a bioreactor system for dynamic loading and mechanical characterization of whole human intervertebral discs in organ culture. Journal of Biomechanics. 47 (9), 2095-2101 (2014).
- Rajan, N. E., et al. Toll-Like Receptor 4 (TLR4) Expression and Stimulation in a Model of Intervertebral Disc Inflammation and Degeneration. Spine. 38 (16), 1343-1351 (2013).
- vanden Akker, G. G., Rorije, A. J., Davidson, E. N. B., vander Kraan, P. M. Phenotypic marker genes distinguish inner and outer annulus fibrosus from nucleus pulposus tissue in the bovine intervertebral disc. Osteoarthritis and Cartilage. 25, 402 (2017).
- Du, J., et al. Functional cell phenotype induction with TGF-β1 and collagen-polyurethane scaffold for annulus fibrosus rupture repair. European Cells & Materials. 39, 1-17 (2020).
- Risbud, M. V., et al. Defining the phenotype of young healthy nucleus pulposus cells: recommendations of the Spine Research Interest Group at the 2014 annual ORS meeting. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 33 (3), 283-293 (2015).
