Summary
Dit protocol beschrijft een onderzoek naar de vroege interacties tussen viraal geïnfecteerde neusepitheelcellen en aangeboren celactivatie. Individuele subsets van immuuncellen kunnen worden onderscheiden op basis van hun activering als reactie op virale infecties. Ze kunnen vervolgens verder worden onderzocht om hun effecten op vroege antivirale reacties te bepalen.
Abstract
De vroege interacties tussen de neusepitheellaag en de aangeboren immuuncellen tijdens virale infecties blijven een onderbelicht gebied. De betekenis van aangeboren immuniteitssignalering bij virale infecties is aanzienlijk toegenomen naarmate patiënten met luchtweginfecties die een hoge aangeboren T-celactivatie vertonen, een beter ziekteresultaat vertonen. Vandaar dat het ontleden van deze vroege aangeboren immuuninteracties de opheldering mogelijk maakt van de processen die ze beheersen en de ontwikkeling van potentiële therapeutische doelen en strategieën voor het dempen of zelfs voorkomen van vroege progressie van virale infecties kan vergemakkelijken. Dit protocol beschrijft een veelzijdig model dat kan worden gebruikt om vroege overspraak, interacties en activering van aangeboren immuuncellen te bestuderen van factoren die worden uitgescheiden door viraal geïnfecteerde luchtwegepitheelcellen. Met behulp van een H3N2-influenzavirus (A /Aichi / 2/1968) als het representatieve virusmodel, is aangeboren celactivering van co-gekweekte perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC's) geanalyseerd met behulp van flowcytometrie om de subsets van cellen te onderzoeken die worden geactiveerd door de oplosbare factoren die vrijkomen uit het epitheel als reactie op de virale infectie. De resultaten tonen de gating-strategie voor het differentiëren van de subsets van cellen en onthullen de duidelijke verschillen tussen de geactiveerde populaties van PBMC's en hun kruisverwijzing met het controle- en geïnfecteerde epitheel. De geactiveerde subsets kunnen vervolgens verder worden geanalyseerd om hun functies en moleculaire veranderingen specifiek voor de cellen te bepalen. Bevindingen van een dergelijk kruisverwijzingsonderzoek kunnen factoren blootleggen die belangrijk zijn voor de activering van vitale aangeboren celpopulaties, die gunstig zijn bij het beheersen en onderdrukken van de progressie van virale infectie. Bovendien kunnen deze factoren universeel worden toegepast op verschillende virale ziekten, vooral op nieuw opkomende virussen, om de impact van dergelijke virussen te dempen wanneer ze voor het eerst circuleren in naïeve menselijke populaties.
Introduction
Respiratoire virussen behoren misschien wel tot de meest voorkomende ziekteverwekkers die ernstige gezondheids- en economische lasten veroorzaken. Van de periodieke wereldwijde uitbraken van opkomende epidemische stammen (bijv. H1N1, H5N1, H3N2, MERS, COVID-19) tot de seizoensgebonden stammen van influenza elk jaar, virussen vormen een constante bedreiging voor de volksgezondheid. Hoewel vaccins het grootste deel van het antwoord vormen op deze wereldwijde uitdagingen op het gebied van de volksgezondheid, is het ontnuchterend om op te merken dat deze tegenmaatregelen slechts responsief zijn 1,2. Bovendien is een vertraging tussen de opkomst van een nieuwe infectieuze stam en de succesvolle ontwikkeling van het vaccin onvermijdelijk3, wat leidt tot een periode waarin de beschikbare maatregelen om de verspreiding van het virus te beteugelen zeer beperkt zijn.
Deze vertragingen worden verder benadrukt door de kosten die worden toegebracht aan de samenleving - economisch en sociaal. De seizoensgriep alleen al is verantwoordelijk voor ongeveer $ 8 miljard aan indirecte kosten, $ 3,2 miljard aan medische kosten en 36,3 duizend sterfgevallen in de Verenigde Staten van Amerika per jaar4. Dit is voordat rekening wordt gehouden met de onderzoekskosten die nodig zijn om de ontwikkeling van vaccins te financieren. Epidemische uitbraken hebben nog ernstiger gevolgen voor de samenleving, verergerd door de toenemende globalisering elk jaar, zoals blijkt uit de wereldwijde verstoringen veroorzaakt door de opkomst en snelle verspreiding van ernstig acuut respiratoir syndroom coronovirus 2 (SARS-CoV-2)5,6,7.
Recente studies hebben aangetoond dat geïnfecteerde patiënten met een grotere populatie van geactiveerde aangeboren T-cellen de neiging hebben om een beter ziekteresultaat te hebben 8,9,10. Verder is de aangeboren T-celpopulatie onderverdeeld in meerdere subgroepen: de mucosaal-geassocieerde invariante T (MAIT) cellen, Vδ1 γδ T cellen, Vδ2 γδ T cellen en de natural killer T (NKT) cellen. Deze subgroepen van aangeboren T-cellen vertonen ook heterogeniteit binnen hun populaties, waardoor de complexiteit van de interacties tussen de celpopulaties die betrokken zijn bij de aangeboren immuunresponstoeneemt 11. Vandaar dat het mechanisme dat deze aangeboren T-cellen activeert en de kennis van de specifieke subgroepen van aangeboren T-cellen een andere manier van onderzoek kunnen bieden om de infectieuze effecten van deze virussen op de menselijke gastheer te beperken, vooral tijdens de periode van vaccinontwikkeling.
Epitheelcellen geïnfecteerd door influenza produceren factoren die aangeboren T-cellen snel activeren 12,13,14. Voortbouwend op die bevinding heeft dit contactloze Air-Liquid Interface (ALI) co-kweekmodel tot doel de vroege chemische interacties (gemedieerd door oplosbare factoren die vrijkomen door de geïnfecteerde epitheellaag) tussen de geïnfecteerde nasale epitheellaag en de PBMC's na te bootsen tijdens vroege infectie. De fysieke scheiding tussen de nasale epitheellaag (gekweekt op membraaninzetstukken) en de PBMC's (in de kamer eronder) en de epitheliale integriteit voorkomen directe infectie van de PBMC's door het virus, waardoor een gedetailleerde studie mogelijk is van de effecten van epitheliale oplosbare factoren op de PBMC's. De geïdentificeerde factoren kunnen daarom verder worden onderzocht op hun therapeutisch potentieel bij het induceren van de juiste aangeboren T-celpopulatie die kan beschermen tegen influenza-infectie. Dit artikel heeft daarom de methoden beschreven voor het vaststellen van een co-cultuur voor de studie van aangeboren T-celactivatie van epitheel-afgeleide oplosbare factoren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Raadpleeg tabel 1 voor recepten van media die in dit protocol worden gebruikt.
OPMERKING: hNECS gekweekt op 12-well transwell blijken te groeien tot een meer optimale dikte voor oplosbare factoren om de basale kamer gemakkelijk te bereiken wanneer ze zijn geïnfecteerd met het influenzavirus. Daarom wordt het gebruik van transwell van 12-wells formaat voor co-cultuur aanbevolen.
1. Vaststelling van de 3T3-feederlaag
- Inrichting uit bevroren voorraden
- Ontdooi een cryovial van NIH /3T3 fibroblasten uit bevroren voorraden. Voeg de inhoud van het cryoviale toe aan 2 ml complete Dulbecco's Minimal Essential Media (DMEM) en resuspend de cellen.
- Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 × g en kamertemperatuur/druk (rtp) en verwijder het supernatant. Resuspend de cellen in volledige DMEM.
- Tel de cellen met behulp van trypan blauwe kleuring. Voeg 10 μL trypan blue toe aan 10 μL van de geresuspendeerde celsuspensie. Meng grondig en voeg 10 μL van de suspensie toe aan een hemocytometer om de cellen te tellen.
- Zaadcellen met een dichtheid van 1 × 104 cellen/cm2 in een geschikte kweekschaal (bijv. T75-kolf). Incubeer de resulterende kweekkolf gedurende 3 dagen bij 37 °C in een 5% CO2-atmosfeer .
- Mitomycine C behandeling
- Zorg er na 3 dagen voor dat de confluentie 60% -80% is, verwijder het medium en was de cellen met 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS).
OPMERKING: Het is belangrijk dat de 3T3-feederlaag niet de volledige samenvloeiing bereikt; anders zal de behandeling met mitomycine C niet effectief zijn. - Voeg mitomycine C-aangevulde complete DMEM toe aan de kolf en incubeer gedurende 3,5 uur bij 37 °C in een 5% CO2-atmosfeer . Verwijder het mitomycine C-bevattende medium en was de cellen 2x met 1x PBS.
- Zorg er na 3 dagen voor dat de confluentie 60% -80% is, verwijder het medium en was de cellen met 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Zaaien van 3T3 cellen in 6-well platen
- Voeg 3 ml 1x trypsine-EDTA toe aan de kolf gedurende 3-5 minuten om de cellen los te koppelen. Verzamel de gedisassocieerde cellen in een verse buis van 15 ml. Centrifugeer de buis van 15 ml gedurende 5 minuten bij 300 × g, rtp; gooi het supernatant weg. Resuspend de cellen in volledige DMEM.
- Tel de cellen met behulp van trypan blauwe kleuring. Zaai de cellen in een 6-well plaat op 7,5 × 10 5-2,5 × 106 cellen/put. Incubeer de plaat een nacht bij 37 °C in een 5% CO2 atmosfeer.
OPMERKING: De 3T3-feederlaag wordt als gereed beschouwd als de cellen gezond zijn. Op dit punt zaait u de menselijke neusepitheelstam / voorlopercellen (hNESPC's) op de feederlaag voor expansie. - Voeg Complete DMEM toe aan de kolf en incubeer bij 37°C, 5% CO2 gedurende de nacht voor 3T3-cellen om te herstellen van mitomycine C-behandeling.
2. Vestiging van menselijke neusepitheelcel (hNEC) cultuur
OPMERKING: Klinische monsters moeten worden verkregen van patiënten die vrij zijn van symptomen van infectie van de bovenste luchtwegen.
- Nasaal weefsel verwerken tot eencellige suspensie
- Was neusweefsel in 1x Dulbecco's PBS (dPBS) (PBS zonder Mg2+ en Ca2+) met 100 μL/ml van een antibioticum-antimycotisch mengsel. Snijd het weefsel in kleine fragmenten en behandel het monster in 10 mg/ml van een neutraal protease gedurende de nacht bij 4 °C met schudden.
- Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 200 × g en verwijder het supernatant na het centrifugeren. Incubeer de pellet in 1-2 ml 1x trypsine-EDTA (37 °C, 15 min) en blus door een volume foetaal runderserum toe te voegen dat gelijk is aan 10% van het volume in de buis.
- Dissociëer het verteerde weefsel mechanisch in eencellige aggregaten door pipetteren en passeer vervolgens de resulterende suspensie door een celzeef van 70 μm. Resuspend de cellen in volledige DMEM.
OPMERKING: Na deze stap is de celsuspensie een mengsel van terminaal gedifferentieerde cellen en stamcellen die worden aangeduid als menselijke neusepitheelstam / voorlopercellen (hNESPC's). Het doel van de volgende stappen is om de hNESPC-populatie te selecteren en te verrijken uit de mix van verschillende celpopulaties.
- Een eencellige suspensie op de 3T3-feederlaag zaaien voor selectie van hNESPC's
- Centrifugeer de celsuspensie vanaf stap 2.1.3 (300 × g, 5 min, rtp) en verwijder het supernatant. Resuspend de cellen in 3-5 ml medium 3.
OPMERKING: Medium 3 is geformuleerd om de selectieve groei van hNESPC's te bevorderen. - Tel de cellen via trypan blauwe kleuring. Zaad 1 x 106 cellen in 2 ml medium 3 per put op 6-well plaat met voorbereide 3T3 feederlaag na het verwijderen van de media in de 6 well plaat. Incubeer de resulterende co-kweek bij 37 °C in een 5% CO2 atmosfeer.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u na het zaaien de plaat niet roert, omdat dit de bevestiging van de hNESPC's zal beïnvloeden. - Vervang medium 3 (2 ml) om de 2-4 dagen door het oude medium volledig te verwijderen en te vervangen door vers medium 3.
OPMERKING: Medium wordt veranderd om voedingsstoffen aan te vullen en om te voorkomen dat te zure omstandigheden de groei van de hNESPC's negatief beïnvloeden. Het interval tussen elke mediumverandering hangt af van hoe zuur (geel) het medium wordt. Intervallen moeten worden verkort als het medium snel zuur wordt. - Merk na 7-10 dagen op dat hNESPC's zich in een samenvloeiing bevinden die geschikt is om ze over te brengen op membraaninzetstukken. Zie figuur 1 voor representatieve morfologie van hNESPC's op 3 verschillende tijdstippen (2 dagen, 5 dagen en 10 dagen).
- Centrifugeer de celsuspensie vanaf stap 2.1.3 (300 × g, 5 min, rtp) en verwijder het supernatant. Resuspend de cellen in 3-5 ml medium 3.
- HNESPC's overbrengen op membraaninzetstukken
OPMERKING: Als gevolg van de mitomycine C-behandeling zal de 3T3-feederlaag langzaam afbreken gedurende de hNESPC-expansieperiode. Dit zal resulteren in een verzwakte hechting aan het oppervlak van de put, waardoor ze losraken door te spoelen met een pipet, waardoor alleen de gezonde hNESPC's achterblijven.- Verwijder het medium en voeg 500 μL van 1x dPBS toe aan elke put. Spoel de cellen 3x met een micropipette om de 3T3-cellen los te maken en gooi de 1x dPBS weg. Observeer onder de microscoop dat de ronde hNESPC's achterblijven terwijl de spilvormige 3T3-feederlaag wordt losgemaakt.
- Voeg 500 μL van een celdisassociatiereagens per put toe en incubeer bij 37 °C in een 5% CO2-atmosfeer gedurende 5-10 minuten, of totdat de hNESPC's zich van het putoppervlak hebben losgemaakt.
- Verzamel de hNESPC-suspensie, centrifugeer (300 × g, 5 min, rtp) en verwijder het supernatant.
- Resuspend de pellet in medium 3. Tel de cellen via trypan blauwe kleuring. Zaad 3 × 104 cellen in 150 μL medium 3 per membraaninzetstuk (24-putplaat) of 1 × 105 cellen in 300 μL medium 3 per membraaninzetstuk (12-putplaat) (figuur 2). Incubeer de cellen bij 37 °C in een 5% CO2 atmosfeer.
- Verander het medium (medium 3) van de apicale en basale kamers om de 2 dagen. Navigeer een pipetpunt tussen de ondersteunende armen van de membraaninzet om toegang te krijgen tot de basale kamer, verwijder het oude medium en introduceer vervolgens opnieuw vers medium volgens dezelfde methode. Hoewel de apicale kamer gemakkelijk toegankelijk is, moet u ervoor zorgen dat u de groeiende hNESPC-laag niet verstoort.
OPMERKING: Verstoor het medium in de apicale kamer niet gedurende ten minste 2 dagen na het zaaien, omdat de cellen tijd nodig hebben om zich aan het membraan te hechten.
- Differentiatie van hNESPC's in hNEC's
- Wanneer hNESPC's 100% confluentie bereiken (ongeveer 3-7 dagen na het zaaien op het membraaninzetstuk), start u de ALI-cultuur. Verander het basale medium in differentiatiemedium en verwijder het medium uit de apicale kamer. Voeg alleen medium toe aan de basale kamer zonder het toe te voegen aan de apicale kamer wanneer u het medium om de 2-3 dagen ververst, zoals aangegeven in figuur 3 en stap 2.3.5.
OPMERKING: Medium wordt veranderd in differentiatiemedium om de differentiatie van de hNESPC's in hNEC's in ALI te bevorderen. De hNESPC's hebben ongeveer 3-4 weken nodig om volledig volwassen te worden om hNEC's in ALI te worden, waarna de cellen zouden zijn uitgegroeid tot een meerlaags met verschillende populaties cellen in elke laag. Trilharen moeten ook worden waargenomen bij een vergroting van 400x (trilharen kunnen worden geïdentificeerd door hun kloppende beweging, waardoor het microscoopveld lijkt te trillen). Op dit punt zijn de cellen klaar om te worden gebruikt voor de co-kweekexperimenten. Zie figuur 4 voor de doorsnede van een volledig gedifferentieerde hNEC-laag. - Na het verkrijgen van volwassen hNEC's, was de cellen in de apicale kamer 3x met 1x dPBS met intervallen van 2-3 dagen gedurende 1 week voorafgaand aan het co-kweekexperiment. Combineer de wasstap met de basale mediumveranderingen en voer de wasbeurten als volgt uit.
- Voeg 50 μL (24-well)/150 μL (12-well) van 1x dPBS toe aan de apicale kamer van het membraaninzetstuk en incubeer de cellen bij 37 °C gedurende 10 minuten. Verwijder de dPBS na 10 minuten incubatie om opgehoopt slijm en dode cellen in de loop van differentiatie te verwijderen.
OPMERKING: Afhankelijk van de aard van het experiment kan natriumbicarbonaatoplossing worden gebruikt om de slijmlaag volledig af te spoelen. Voor virale infectie in co-kweekexperimenten blijft de slijmlaag echter behouden en wordt alleen overtollig slijm verwijderd met dPBS-was. Deze retentie is om de fysiologische slijmlaag na te bootsen die aanwezig is op de nasale epithelia die zal interageren met de binnenkomende virale infectie.
- Voeg 50 μL (24-well)/150 μL (12-well) van 1x dPBS toe aan de apicale kamer van het membraaninzetstuk en incubeer de cellen bij 37 °C gedurende 10 minuten. Verwijder de dPBS na 10 minuten incubatie om opgehoopt slijm en dode cellen in de loop van differentiatie te verwijderen.
- Wanneer hNESPC's 100% confluentie bereiken (ongeveer 3-7 dagen na het zaaien op het membraaninzetstuk), start u de ALI-cultuur. Verander het basale medium in differentiatiemedium en verwijder het medium uit de apicale kamer. Voeg alleen medium toe aan de basale kamer zonder het toe te voegen aan de apicale kamer wanneer u het medium om de 2-3 dagen ververst, zoals aangegeven in figuur 3 en stap 2.3.5.
3. Transepitheliale elektrische weerstand (TEER) meting
OPMERKING: Bevestiging van epitheliale integriteit is belangrijk om ervoor te zorgen dat een intacte en gezonde epitheliale laag wordt verkregen. Een intacte epitheellaag wordt bepaald door teer-meting uitgevoerd op 4 willekeurige putten met behulp van een voltohmmeter.
- Spoel de elektrode af met 70% ethanol en steriliseer deze voor gebruik gedurende 15 minuten met ultraviolet licht om steriliteit te garanderen. Spoel af met 1x dPBS na sterilisatie.
- Voeg 100 μL (voor 24-well) of 300 μL (voor 12-well) van 1x dPBS toe aan de apicale kamer van het membraaninzetstuk. Incubeer de plaat bij 37 °C gedurende 10 minuten; verwijder vervolgens de dPBS.
- Bereid voor elke te meten put een ongebruikte put voor met 1 ml (voor 24-put) of 3 ml (voor 12-put) voorverwarmd (tot 37 °C) differentiatiemedium. Plaats het membraaninzetstuk in de voorbereide put en voeg 200 μL (voor 24-well) of 600 μL (voor 12-well) voorgewarmd differentiatiemedium toe aan de apicale kamer. Equilibrate bij 37 °C (afhankelijk van de incubatietemperatuur van het toegevoegde virustype, bijvoorbeeld 35 °C voor influenza) gedurende 15 minuten.
OPMERKING: Bereid op dezelfde manier een blanco (lege membraaninzetstuk) voor voor de berekening van de TEER. - Breng ook gedurende 15 minuten een buis van 15 ml voorgewarmd differentiatiemedium op dezelfde temperatuur in evenwicht. Plaats de elektroden in de buis van 15 ml en schakel de voltohmmeter in.
OPMERKING: Op dit punt moet de aflezing 0 weerstand zijn, omdat de elektroden zich in hetzelfde medium bevinden. Als een andere meting wordt verkregen, breng de elektrode in de buis van 15 ml in evenwicht totdat de aflezing 0 is. - Plaats de elektroden in elke put zodanig dat de ene elektrode in het apicale kamermedium wordt ondergedompeld en de andere in het basale kamermedium. Noteer de meting alleen wanneer een constante meting wordt verkregen gedurende een periode van ten minste 5 minuten.
- Was na elke meting de elektrode met PBS voor de volgende meting. Voer voor elke geteste put metingen uit voor drie monsters op verschillende posities van het membraan. Om de netto TEER van elk monster te berekenen, trekt u de achtergrondweerstand van de blanco membraaninzet af van elke meting.
- Bereken de totale TEER-waarde voor een put met behulp van de volgende vergelijking:
Epitheliale integriteit (Ωcm2) = Netto TEER (ohm) × gebied van het membraan (cm2)
OPMERKING: De TEER-waarden van hNEC's voor experimenten met virale infecties moeten >1000 Ωcm2 13,15,16 zijn.
4. Isolatie van perifere bloedmonocyten en NK-cellen
OPMERKING: Bloedmonsters moeten worden verkregen van gezonde vrijwilligers en op dezelfde dag van isolatie worden gebruikt.
- Verzamel 30-40 ml volbloed van elke donor in 10 ml bloedafnamebuizen.
- Isoleer PBMC's met behulp van dichtheidsgradiëntcentrifugatie en verkrijg PBMC's uit de buffy coat na de volgende stappen (zie ook de tabel met materialen).
- Meng grondig ~ 10 ml bloed uit de bloedafnamebuis in een vacutainer voordat u verdunt met een gelijk volume gebalanceerde zoutoplossing (PBS).
- Voeg 15 ml dichtheidsgradiëntmedium toe aan de basis van een buis van 50 ml.
OPMERKING: De verhouding tussen dichtheidsgradiëntmedium en verdund bloed moet 2:3-3,5 zijn. - Laag 35 ml verdund bloed op het dichtheidsgradiëntmedium met een pipetpistool (met de doseerinstelling ingesteld op het laagst mogelijke) door de buis 45° te kantelen en het verdunde bloed druppelsgewijs op de binnenwand van de buis te laten vallen, zodat de laag dichtheidsgradiëntmedium niet wordt verstoord.
- Centrifugeer lysaat bij 500 × g, 18-20 °C gedurende 30 minuten (rem: uit). Verwijder en gooi de bovenste plasmalaag voorzichtig weg zonder de onderste laag te verstoren.
- Breng de buffy coat over naar een nieuwe buis zonder de rode bloedcellaag, de mediumlaag met gradiëntdichtheid of de buffy coat te mengen. Zodra de buffy coat is verzameld in een nieuwe buis van 50 ml, vult u het volume aan tot 50 ml met 1x PBS.
- Centrifugeer lysaat bij 800 × g, 18-20 °C, 8 min (rem: uit) en verwijder het supernatant met een pipetpistool. Resuspend de celkorrel met 50 ml 1x PBS en centrifugeer bij 120 × g, 18-20 °C, 10 minuten om bloedplaatjes te verwijderen.
- Gooi het bovennatuurlijk middel weg door te pipetteren, zonder de celkorrel te verstoren.
OPMERKING: Omdat de celkorrel los kan zitten, is het af te raden om het supernatant weg te gooien door te gieten. - Resuspend de celkorrel met volledig RPMI (Roswell Park Memorial Institute) medium. Voer een celtelling uit door 10 μL 3% azijnzuur met methyleenblauw toe te voegen aan 10 μL van de geresuspendeerde celsuspensie. Meng grondig en voeg 10 μL van het mengsel toe aan een hemocytometer om de cellen te tellen.
- Verdun PBMC's met volledig RPMI-medium tot een dichtheid van 2 × 106/ml (voor 24-well) of 4 × 106/mL (voor 12-well).
5. hNEC Virale infectie en overgang naar hNEC: PBMC co-cultuur
OPMERKING: H3N2 (A/Aichi/2/1968) wordt gebruikt als de representatieve infectiestam in dit protocol. Multiplicity of infection (MOI) van 0,1 wordt gebruikt als de representatieve MOI in dit protocol.
- Dag 0 (Infectie van hNECs)
OPMERKING: Een put uit de hNEC's gekweekt uit dezelfde donor wordt gebruikt om een representatief celgetal te verkrijgen voor elke put die in het experiment wordt gebruikt.- Voeg in de representatieve put 150 μL 1x trypsine-EDTA toe aan de apicale kamer van het membraaninzetstuk en 350 μL 1x trypsine-EDTA aan de basale kamer en incubeer bij 37 °C gedurende 10 minuten, of totdat de cellen loskomen van het membraan.
- Spoel de cellen op het membraan door op en neer te pipetteren en verzamel de suspensie in een centrifugebuis van 1,5 ml. Voeg 200 μL volledige DMEM toe om de trypsine-activiteit te dempen. Tel cellen via trypan blue staining om het celgetal per putje te verkrijgen.
- Bereken de vereiste MOI van het virus op basis van het celgetal per put en verdun de virusvoorraad dienovereenkomstig met volledige RPMI op ijs.
OPMERKING: MOI 0,1 van 1,26 × 106 hNECs per put = 1,26 × 105 H3N2 virale deeltjes per put in 30 μL (voor 24-well) / 100 μL (voor 12-well) - Voeg voor de resterende putten voor het infectie-experiment 50 μL (voor 24-well)/150 μL (voor 12-well) van 1x dPBS toe aan de apicale kamers van de membraaninzetstukken, incubeer bij 37 °C gedurende 10 minuten en verwijder de 1x dPBS.
- Verander het basale medium in de membraaninzetstukken om het RPMI-medium te voltooien door de inserts over te brengen naar een nieuwe plaat met volledige RPMI toegevoegd aan de putten (350 μL (voor 24-well)/700 μL (voor 12-well)).
OPMERKING: Wanneer hNESPC's volledig zijn gedifferentieerd naar hNEC's, zijn ze tolerant /tolerant voor verschillende media gedurende maximaal 72 uur, zonder wijzigingen in morfologie of organisatie wanneer het medium wordt overgeschakeld naar RPMI12. RPMI wordt gebruikt om de groei en het onderhoud van de PBMC-populatie te ondersteunen. - Voeg de bereide 30 μL (voor 24-well)/100 μL (voor 12-well) van het virus-entmateriaal toe aan de apicale kamer van de membraaninzet, incubeer bij 35 °C in een 5% CO2-atmosfeer gedurende 1 uur en verwijder het virale entmateriaal uit de apicale kamer.
- Verander het basale medium van de membraaninzet in vers volledig RPMI-medium en incubeer gedurende 24 uur bij 35 °C in een 5% CO2-atmosfeer .
- Dag 1 (oprichting van hNECs + PBMC's co-cultuur)
- Zaai het vereiste aantal PBMC's in 150 μL (voor 24-well)/300 μL (voor 12-well) van het volledige RPMI-medium door de PBMC-suspensie rechtstreeks toe te voegen aan de basale kamer van elke put met niet-geïnfecteerde of geïnfecteerde hNECs vanaf dag 0 (1,5 × 106 voor 24-well-platen en 3 × 106 voor 12-well-platen). Incubeer bij 37 °C gedurende 24/48 uur.
OPMERKING: Het uiteindelijke volume in de basale kamer na de vaststelling van de co-kweek is 500 μL (voor 24-well)/1000 μL (voor 12-well).
- Zaai het vereiste aantal PBMC's in 150 μL (voor 24-well)/300 μL (voor 12-well) van het volledige RPMI-medium door de PBMC-suspensie rechtstreeks toe te voegen aan de basale kamer van elke put met niet-geïnfecteerde of geïnfecteerde hNECs vanaf dag 0 (1,5 × 106 voor 24-well-platen en 3 × 106 voor 12-well-platen). Incubeer bij 37 °C gedurende 24/48 uur.
- Dag 2-3 (oogsten van PBMC's 48/72 h post-virale infectie)
- Verzameling apicale supernatanten (48/72 h post-virale infectie)
- Voeg 50 μL (voor 24-well)/150 μL (voor 12-well) van 1x dPBS toe aan elke apicale kamer en incubeer bij 37 °C gedurende 10 min. Verzamel de 1x dPBS in buizen van 1,5 ml. Aliquot 25 μL (voor 24-well)/50 μL (voor 12-well) van het supernatant voor plaque-assay in een nieuwe buis van 1,5 ml, en vries zowel de bouillon als de aliquots onmiddellijk in bij -80 °C.
- Verzameling van cellulair RNA van hNECs (48/72 h post-virale infectie)
- Breng de membraaninzet over naar een schone put, voeg 300 μL (voor 24-well)/600 μL (voor 12-well) RNA-lysisbuffer toe aan de apicale kamer en incubeer bij rtp gedurende 5 minuten. Verzamel het supernatant in een centrifugebuis van 1,5 ml en bewaar het bij -80 °C tot RNA-extractie voor moleculaire analyse.
- Oogsten van PBMC's (48/72 h post-virale infectie)
- Schraap met de brede basis van een steriele pipetpunt voorzichtig het oppervlak van de put om de geactiveerde PBMC's los te maken die zich aan het putoppervlak kunnen hechten. Verzamel het basale medium met PBMC's in een centrifugebuis van 2 ml.
- Spoel de putjes 2x door met 300 μL 1x dPBS en vang de was op in dezelfde buis van 2 ml. Centrifugeer de buis van 2 ml (500 × g, 5 min, rtp) en verzamel het supernatant in een verse buis van 2 ml zonder de celkorrel te storen. Bewaar het supernatant bij -80 °C voor cytokine- en chemokineanalyse; resuspend de celkorrel in 200 μL van 1x dPBS.
- Verzameling apicale supernatanten (48/72 h post-virale infectie)
6. Flowcytometrie
OPMERKING: Dit gedeelte van het protocol wordt rechtstreeks vanuit de vorige sectie voortgezet met behulp van de PBMC-celsuspensie uit stap 5.3.3.2. Zorg voor minimale blootstelling aan licht tijdens de volgende stappen in deze sectie. Een voorbeeldpaneel van oppervlaktekleuringsmarkers is te vinden in tabel 2.
- Oppervlaktekleuring
- Breng de geresuspendeerde PBMC-celkorrel over in een 96-V bodemputplaat. Centrifugeer lysaat op 800 × g gedurende 3 minuten en verwijder het supernatant.
- Incubeer alle PBMC's (behalve de "niet-gekleurde") met 100 μL van een levensvatbaarheidsvlek gedurende 15 minuten bij rtp. Vul aan tot 200 μL met 150 μL magnetisch geactiveerde celsorteerbuffer (MACS). Centrifugeer lysaat op 800 × g gedurende 3 minuten en gooi het supernatant weg.
- Bereid een panel van relevante oppervlaktekleuringsantistoffen voor met geschikte verdunningsverhoudingen en een eindvolume van 50 μL per reactie (bijvullen met MACS-buffer om het uiteindelijke volume te verkrijgen). Voer oppervlaktekleuring uit door 50 μL van het bereide antilichaammengsel aan de cellen toe te voegen met behulp van een meerkanaalspipet. Incubeer bij 4 °C gedurende 15 minuten in het donker.
- Was door 150 μL MACS-buffer toe te voegen. Centrifugeer lysaat op 800 × g gedurende 3 minuten en gooi het supernatant weg. Als intracellulaire kleuring niet nodig is, ga dan direct over tot de incubatie van 15 minuten in stap 6.3.
- Intracellulaire kleuring (indien nodig)
- Voeg 100 μL van een fixatie- en permeabilisatieoplossing toe aan elke put. Incubeer bij 4 °C gedurende 20 minuten in het donker. Vul de putten aan met 100 μL 1x MACS-buffer.
- Centrifugeer (800 × g, 3 min, 25 °C) en verwijder het supernatant. Herhaal de was door 200 μL 1x permeabilisatie wasbuffer toe te voegen. Centrifugeer (500 × g, 3 min, 25 °C) en verwijder het supernatant.
- Bereid de verdunningen voor op het betreffende antilichaampanel om een eindvolume van 50 μL te bereiken met behulp van 1x permeabilisatiewasbuffer. Incubeer op ijs gedurende 30 minuten in het donker. Voeg 200 μL 1x Permeabilisatie Wasbuffer toe.
- Centrifugeer de cellen (800 × g, 3 min, 4 °C) en verwijder het supernatant. Resuspend de cellen in 100 μL fluorescentie-geactiveerde celsorteerbuffer.
- Pipetteer 200 μL van een lysing-oplossing in elke put. Incubeer gedurende 15 minuten bij rtp. Centrifugeer lysaat op 800 × g gedurende 3 minuten en gooi het supernatant weg.
- Resuspend de celkorrels in 200 μL MACS-buffer. Voer flowcytometrie uit in overeenstemming met de eerder beschreven instellingen13, of bewaar bij 4 °C in het donker.
7. Bepaling van cytokine- en chemokinespiegels
- Proces 25 μL van het basale kamer supernatant met behulp van een immunologische multiplextest volgens het protocol van de fabrikant18.
- Bereken de concentratie van elke analyt met behulp van multiplexmanagersoftware met behulp van een curve-fitting algoritme (5 parameters) voor de standaardcurve.
8. Beoordeling van virale besmetting
- Extract viraal RNA met behulp van een extractiekit op 4 sets oplossingen: de voorraad H3N2-oplossing, de MOI 0,1-verdunning voor infectie, de 10x seriële verdunningen van de MOI 0,1 en het basale medium uit de monsters (zowel 48 als 72 uur post-virale infectie)12.
- Selecteer niet-structureel gen (NS1) en matrix (M1) als doelwitten voor polymerasekettingreactie (PCR) (zie de tabel met materialen voor primers die in het representatieve experiment zijn gebruikt).
- Voer reverse-transcription-PCR (RT-PCR) uit (42 °C, 60 min) om het virale RNA om te zetten in cDNA voordat kwantitatieve PCR (qPCR) wordt uitgevoerd om NS1- en M1-niveaus te meten als proxy voor virale aanwezigheid, en correleer de niveaus met de standaardcurve verkregen uit de RT-qPCR uitgevoerd op de 10x seriële verdunning van de MOI 0,1 aliquot. Raadpleeg tabel 3 voor de samenstelling van de reactiemengsels en gebruik de volgende voorwaarden: preïncubatie bij 95 °C gedurende 10 minuten, gevolgd door een 3-staps versterking gedurende 40 cycli: 95 °C voor 10 s, 60 °C voor 10 s, 72 °C voor 30 s; smeltcurve: 95 °C voor 10 s, 65 °C voor 60 s en 97 °C voor 1 s.
9. Plaque-test
- Dag 0: mdck (Madin Darby Canine Kidney) zaaien in 24-well platen
- Verwijder het medium uit een T75-kolf met samenvloeiende MDCK-cellen. Was 2x met 1x PBS om alle sporen van serum te verwijderen. Trypsiniseren van de MDCK-cellen door 10 ml trypsine toe te voegen en te incuberen bij 37 °C in een 5% CO2-atmosfeer gedurende 20-30 minuten totdat de cellen loskomen.
OPMERKING: Tik niet op de kolf, omdat dit kan leiden tot klonteren. - Pipetteer de celsuspensie in een buis van 15 ml met 2 ml complete Eagle's Minimal Essential Medium (EMEM). Centrifugeer (300 × g, 5 min, rtp) en verwijder het supernatant.
- Resuspend de cellen in 6 ml volledige EMEM. Tel de cellen door trypan blauwe kleuring.
- Verdun de MDCK-celsuspensie tot een concentratie van 1 × 105 cellen/ml en zaai 1 ml van de verdunde suspensie in elke put van een steriele 24-putplaat. Incubeer bij 37 °C in een 5% CO2-atmosfeer gedurende 24 uur om in elke put een samenvloeiende monolaag van MDCK-cellen te verkrijgen.
- Verwijder het medium uit een T75-kolf met samenvloeiende MDCK-cellen. Was 2x met 1x PBS om alle sporen van serum te verwijderen. Trypsiniseren van de MDCK-cellen door 10 ml trypsine toe te voegen en te incuberen bij 37 °C in een 5% CO2-atmosfeer gedurende 20-30 minuten totdat de cellen loskomen.
- Dag 1: infectie van MDCK-cellen
- Bereid het infectiemedium voor. Verwijder het medium uit de MDCK monolaag in de 24-well plaat en was 2x met 1x dPBS. Laat voor de tweede wasbeurt de PBS in de putten terwijl u seriële verdunningen van het virus voorbereidt.
- Ontdooi de virusmonsters op ijs en verdun ze serieel in een 24-putplaat om seriële verdunningen van 10-1 tot 10-6 te bereiken.
OPMERKING: Vul bijvoorbeeld elke put in een 24-well plaat met 270 μL infectiemedium. - Voeg 30 μL van het virusmonster toe aan de eerste put in de rij. Meng met een nieuwe pipetpunt goed en breng over naar de volgende put in de rij om het monster 10x te verdunnen. Ga door totdat 10-6 verdunning is bereikt; voer stappen 9.2.1-9.2.3 uit voor alle virusmonsters.
- Verwijder PBS uit de MDCK-plaat en infecteer in tweevoud met 100 μL van de bereide virale verdunningen. Voeg voor controleputten 100 μL van het infectiemedium toe (zonder het virale monster). Incubeer bij 35 °C in een 5% CO2-atmosfeer gedurende 1 uur en schud de plaat om droge plekken elke 15 minuten te verwijderen.
- Verwijder het virale entmateriaal en voeg 1 ml vloeibare overlay toe voor elk putje. Incubeer bij 35 °C in een 5% CO2 atmosfeer gedurende 72 uur.
- Dag 4 (72 uur na infectie): plaquevisualisatie
- Verwijder de vloeibare overlay en fixeer de cellen met 4% formaldehyde in 1x PBS gedurende 1 uur. Verwijder de formaldehyde-oplossing en was eenmaal met 1x PBS of gedestilleerd water.
- Kleur de vaste cellen door gedurende 15 minuten 1% kristalvioletoplossing toe te voegen. Verwijder de kristalviolette kleurstof en was de cellen met stromend water. Droog het bord bij rtp.
- Eenmaal droog, tel plaques en bereken de virale titer volgens de volgende formule:
Aantal plaques × verdunningsfactor = aantal plaque - vormende eenheden in 100 μL
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hoewel conventionele T-cellen het belangrijkste repertoire vormen van adaptieve immuunrespons tegen virale infectie om virale klaring te vergemakkelijken, werkt de aangeboren T-celpopulatie over een breder spectrum om de virale lading te onderdrukken voor effectieve klaring in een later stadium. Daarom creëert dit protocol specifiek een robuuste voorwaarde om aangeboren T-cellen, hun activering en hun functionele populatie na influenza-infectie te bestuderen, zonder epitheliale en immuuncelmonsters van dezelfde donor nodig te hebben. Dit protocol kan ook worden toegepast op andere virussen, hoewel het beperkt kan zijn tot virussen met apicale afgifte, d.w.z. dat er geen virus de basale laag mag binnendringen om in contact te komen met het PBMC-compartiment.
Op basis van de representatieve resultaten in figuur 1 kan dit protocol helpen om hNESPC-populaties te verkrijgen die zijn gegroeid uit een primaire celsuspensie in een 3T3-feederlaag. Figuur 1 geeft een voorbeeld van de verwachte progressie van de hNESPC's terwijl ze groeien op de 3T3-feederlaag. Deze cellen zullen worden gebruikt voor differentiatie in de ALI-cultuur om meerlagige hNEC's te verkrijgen, compleet met functionele trilhaar- en gobletcellen (figuur 4). Met behulp van de hNECs kan aangeboren T-celactivering worden onderzocht met behulp van flowcytometrie. De resultaten in figuur 5 tonen de detectie van MAIT-cel-, γδ-T-cel- en NK-celpopulaties, die significant waren toegenomen in co-cultuur met hNEC's geïnfecteerd met influenzavirus. Deze opstelling kan vervolgens worden toegepast op andere stammen van het influenzavirus om de universele populatie over stammen heen te plagen, evenals andere virussen en hun vermogen om aangeboren T-celpopulaties te activeren. Bovendien kan het detectiepaneel ook worden aangepast aan de aangeboren immuuncelpopulatie van belang om hun respectieve activering onder co-kweekomstandigheden met geïnfecteerde epitheelcellen te observeren.
Figuur 1: hNESPC's gekweekt op een 3T3 feederlaag 2/5/10 dagen na het zaaien. Dag 2: Let op de eilandjes van hNESPC's (een voorbeeld is afgebakend met een witte pijl) die 2 dagen na het zaaien op de 3T3-feederlaag moeten worden waargenomen. Dag 5: De eilandjes die op dag 2 zijn waargenomen, moeten nu groter zijn (voorbeelden van eilanden van hNESPC's worden afgebakend door groene cirkels) en de 3T3-laag moet worden waargenomen als degenererend. Dag 10: De hNECPSs moeten de hele plaat domineren met weinig of geen 3T3-cellen zichtbaar. Schaalbalken voor dag 2 en dag 5 = 50 μm op basis van een vergroting van 200x, schaalbalk voor dag 10 = 100 μm op basis van een vergroting van 100x. Afkorting: hNESPC's = humane neusepitheel stam/voorlopercellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Putdiagrammen voor membraaninzetstukken in 24-put- en 12-putplaten. Let op het medium volume dat voor elk compartiment moet worden gebruikt. hNESPC's worden gezaaid in de apicale kamers van de membraaninzetstukken. Afkorting: hNESPC's = humane neusepitheel stam/voorlopercellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Putdiagrammen voor membraaninzetstukken in 24-puts en 12-putplaten voor ALI-co-culture establishment. Let op het medium volume dat voor elk compartiment moet worden gebruikt. Let op de verschillen in gemiddeld volume die moeten worden gebruikt voor de verschillende intervallen (2 dagen/3 dagen) tussen mediumveranderingen. Afkorting: ALI = air-liquid interface. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: β4-Tubuline en MUC5AC co-vlek van een hNEC-laag. β4-Tubuline is groen gekleurd, terwijl MUC5AC rood gekleurd is. De kernen zijn blauw gekleurd met DAPI. MUC5AC duidt op de aanwezigheid van slijmproducerende gobletcellen, terwijl β4-tubuline de aanwezigheid van trilharen op trilhaarcellen aangeeft. Schaalbalk = 20 μm op basis van 600x vergroting. Afkortingen: hNEC = humane nasale epitheelcel; MUC5AC = mucine 5AC; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindool. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Representatieve resultaten van PBMC's geïncubeerd met of zonder neusepitheel of met influenza geïnfecteerd epitheel gedurende 24 uur. Activering van MAIT-, Vδ1 T-cellen, Vδ2 T-cellen en NK-cellen werd bepaald door celtypespecifieke markers, waaronder Vα 7.2 TCR, Vδ1 TCR, Vδ2 TCR, CD56 en CD69-kleuring. De waarden boven de poorten geven het percentage CD69-positieve cellen aan. Afkortingen: PBMC's = perifere mononucleaire bloedcellen; Epith = neusepitheel; FLU-Epith = influenza-geïnfecteerd epitheel; MAIT = mucosaal-geassocieerde invariante T-cellen; NK = natuurmoordenaar; TCR = T-cel receptor; CD = cluster van differentiatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Gemiddeld | Recept | Compositie | Opmerkingen |
| Gemiddeld 3 | DMEM/Voedingsmengsel F-12 | 500 ml | |
| Menselijke epitheliale groeifactor | 5 ng/ml | ||
| Insuline | 2,5 μg/ml | ||
| Cholera Toxine | 0,1 nM | ||
| Hydrocortison | 0,5 μg/ml | ||
| 3,3',5-triiodo-l-thyronine | 2 nM | ||
| N-2 aanvulling | 5 ml | 10 μL/ml | |
| Antibioticum-Antimycotisch | 5 ml | ||
| Differentiatie Media | PneumaCult-ALI Basaal Medium | 441 ml | |
| PneumaCult-ALI 10x Supplement | 50 ml | ||
| Hydrocortison Oplossing (200x) | 2,5 ml | ||
| 0,2% (2 mg/ml; 1000 IE/ml) heparinenatriumzout in fosfaat-gebufferde zoutoplossing | 1 ml | ||
| Antibioticum-Antimycotisch (100x) | 5 ml | ||
| PneumaCult-ALI Onderhoudssupplement (100x) | 500 μL | Alleen toe te voegen vlak voor gebruik | |
| Complete Dulbecco's Minimal Essential Medium (DMEM) | DMEM/Hoge Glucose | 450 ml | |
| Warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum | 50 ml | ||
| Antibioticum-Antimycotisch (100x) | 5 ml | ||
| Compleet Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Medium | RPMI 1640 (w L-Glutamine) | 445 ml | |
| Warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum | 50 ml | ||
| Antibioticum-Antimycotisch (100x) | 5 ml | ||
| Complete Eagle's Minimal Essential Medium (EMEM) | EMEM (w L-Glutamine) | 450 ml | |
| Warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum | 50 ml | ||
| Infectie Medium | EMEM (w L-Glutamine) | 4 ml | |
| TPCK trypsine (500 μg/ml) | 8 μL | Uiteindelijke TPCK Trypsine concentratie van 1 μg/ml | |
| Magnetisch geactiveerde celsorteerbuffer | 1x pbs | 498 ml | |
| 0,5 M EDTA | 2 ml | ||
| BSA (Tissue Culture Grade) | 2,5 g | ||
| Mitomycine C-Supplemented Complete DMEM | Volledige DMEM | 10 ml | |
| Mitomycine C | 500 μL | Mitomycine C (10 μg/ml) |
Tabel 1: Recept voor gebruikte media.
| Markering van het celoppervlak | Fluorofoor |
| Vδ1 T-cel receptor (TCR) | Fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) |
| Vδ2 TCR | Peridinine-cholorphyll-eiwit (PerCP) |
| cd3 | V500 |
| cd8 | Allophycocyanine-Cyanine 7 kleurstof (APC-Cy7) |
| cd14 | Phycoerythrin (PE)-CF594 |
| cd56 | Phycoerythrin (PE)-Cyanine 7 (Cy7) |
| cd69 | Briljant Violet 421 (BV421) |
| cd83 | Allophycocyanine (APC) |
| cd161 | Briljant Violet 605 (BV605) |
| Vα 7,2 | Phycoerythrin (PE) |
| cd38 | Briljante UltraViolet 395 (BUV395) |
Tabel 2: Kleuringsmarkeringen voor het oppervlak van het monster.
| qPCR Reactie Mix | qPCR Master Mix | | 5 μl |
| Nucleasevrij water | 3 μL | |
| Voorwaartse primer (1 mM) | 0,5 μL | |
| Omgekeerde Primer (1 mM) | 0,5 μL | |
| cDNA (12,5 ng/μL) | 1 μl | |
| Totaal reactievolume | 10 μl | |
| RT-PCR reactie mix | RT-PCR 5x Buffer | 2,5 μL |
| Willekeurige primers (500 ng/μL) | 0,2 μL | |
| RNase-remmer | 0,625 μL | |
| dNTP-mix | 2,5 μL | |
| Omgekeerde transcriptase | 0,5 μL | |
| RNA (200 ng/μL) | 1 μl | |
| Nucleasevrij water | 12,675 μL | |
| Totaal reactievolume | 20 μL |
Tabel 3: Recept voor reactiemixen van reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) en kwantitatieve PCR (qPCR).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aangeboren immuunresponsen tegen virussen zijn een onderbelicht vakgebied in antivirale management. De luchtwegepitheelcellen en aangeboren immuuncellen werken samen om virale replicatie tijdens een infectie te onderdrukken, naast het dienen als een determinant van overactieve adaptieve respons als de virale lading niet onder controle wordt gehouden 12,13,17. De ontwikkeling van een relevant menselijk model voor de studie van epitheliaal-aangeboren immuunoverspraak om de activering van aangeboren immuuncellen te onderzoeken om een geschikte antivirale respons te verlenen, blijft echter een uitdaging. Vandaar dat dit ALI-co-cultuurmodel een veelzijdige techniek vertegenwoordigt die kan worden gebruikt om een hele reeks interacties tussen de neusepitheellaag en de immuuncellen te beoordelen. Omdat dit model in-vitro-gedifferentieerde hNEC's, PBMC-activeringsanalyse via flowcytometrie en virale infectie combineert, zijn veel van de cruciale stappen duidelijk afgebakend om het succes van dit protocol te garanderen. Bovendien kan ook verdere modificatie worden gedaan aan het deel van de luchtweg dat betrokken is waar in-vitro-gedifferentieerde cellen uit zowel de bovenste als de onderste luchtwegen kunnen worden gebruikt, waardoor een extra laag veelzijdigheid aan het protocol wordt toegevoegd.
Bij het werken met epitheliaal-immuunceloverspraak bij virale infectie is het echter van cruciaal belang dat de virussen niet rechtstreeks interageren met de PBMC's om vroege lokale epitheliale afgeleide oplosbare factoren te identificeren die door de hNEC's worden vrijgegeven. Daarom is dit model meer geschikt voor het onderzoeken van virussen met gepolariseerde virale afgifte, waarbij virussen alleen uit het apicale oppervlak in de apicale kamer uitkomen, bijvoorbeeld influenzavirussen12 en SARS-CoV-2-virus19. Om te voorkomen dat virussen met apicale afgifte in de basale kamer lekken die het experiment in gevaar brengen, is een intacte epitheellaag van voldoende dikte bovendien van vitaal belang. Daarom is het belangrijk dat TEER-meting en virale RNA-kwantificering worden uitgevoerd om ervoor te zorgen dat de resultaten vrij zijn van virale lekkages in de basale kamer 13,16,20. Een TEER-meting van >1000 impliceert een intacte meerlaag van cellen die geschikt zijn voor virussen met gepolariseerde afgifte; de basale media moeten vrij zijn van virale RNA-besmetting 13,15,16. Het nut van het model voor bidirectionele releasevirussen, zoals rhinovirussen, moet echter nog worden onderzocht16. Dergelijke virussen zijn niet beperkt tot het vrijgeven van hun nageslacht op een gepolariseerde manier en kunnen bidirectioneel nieuwe virussen vrijgeven in zowel apicale als basale gebieden van het epitheel. Verdere optimalisatie is nodig voordat dit model kan worden toegepast op virussen met niet-gepolariseerde afgifte.
Aangezien dit protocol betrekking heeft op het werken met menselijke monsters van verschillende individuen, zullen geen twee monsters van hNEC's dezelfde eigenschappen en reacties vertonen12,16. De viscositeit van het slijm dat door de terminaal gedifferentieerde hNEC-laag wordt geproduceerd, kan bijvoorbeeld sterk verschillen. De snelheid van de ontwikkeling van trilharen kan ook anders zijn. Het is daarom belangrijk om een zekere mate van flexibiliteit aan de dag te leggen bij het naleven van de richtlijnen in dit protocol. Hoewel het zeker mogelijk is om epitheelcellijnen te gebruiken, zou dit de complexiteit (slijm, interacties tussen verschillende celtypen) van de interacties tussen de verschillende celtypen van de epitheellaag wegnemen, wat ideaal zou zijn voor onderzoek naar hoe epitheliale overspraak de reacties van de PBMC's beïnvloedt. Een primaire cellijn is nodig om de fysiologie van de neusweefsels na te bootsen, waarbij de cellen meerlagig zijn en de verschillende celtypen gelokaliseerd zijn in hun eigen individuele niche, hoewel variabiliteit een probleem kan zijn. Variabiliteit in dit opzicht kan worden overwonnen door gebruik te maken van single-cell RNA sequencing om de heterogene populatie van cellen te differentiëren en te scheiden.
De soorten interacties die kunnen worden beoordeeld, worden inderdaad beperkt door de oorsprong van de PBMC's en de hNEC's. Wanneer de PBMC's en hNEC's worden verkregen van verschillende donoren, is het waarborgen van epitheliale integriteit en scheiding cruciaal. Wanneer PBMC's in contact komen met hNECs, kunnen allogene immuunreacties optreden. Daarom zijn de enige interacties die relevant zijn interacties gemedieerd door oplosbare factoren die door de membraaninzetstukken kunnen gaan, zoals is beschreven in het bovenstaande protocol. Wanneer beide populaties van cellen echter afkomstig zijn van hetzelfde individu, heeft dit model een extra laag nut omdat conventionele immuuncelreacties tussen de hNEC's en de PBMC-populatie nu kunnen worden beoordeeld, inclusief T-cel-gemedieerde cytotoxiciteit en antilichaam-gemedieerde responsen. Daarnaast kunnen epigenetische studies ook worden uitgevoerd om te onderzoeken hoe wijzigingen in het genoom de cytokinegen / eiwitexpressie / secretie kunnen beïnvloeden.
Bovendien kunnen verschillende celpopulaties aan de basale kamer worden toegevoegd om een specifieke populatie verder te onderzoeken. Dit kan worden uitgevoerd door de celpopulaties van belang (T-cellen, NK-cellen, monocyten) te isoleren en ze in de basale kamer te introduceren in plaats van de PBMC's. Dit model kan echter niet worden gebruikt om cellulaire interacties te onderzoeken die direct contact vereisen vanwege de scheiding van de twee celpopulaties door het membraan. Als zodanig kan het onderzoek naar adaptieve immuunresponsen worden beperkt door dit detail. Kortom, dit ALI-co-kweekmodel biedt een veelzijdig startpunt voor het in vitro onderzoek van de overspraak tussen neusweefsels en immuuncellen. Het protocol dat in dit manuscript wordt beschreven, probeert een richtlijn te bieden die nuttig zal zijn, zelfs als de populaties / omstandigheden worden gewijzigd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle auteurs verklaren geen belangenverstrengeling.
Acknowledgments
We willen de onderzoeksmedewerkers van de NUS-afdeling Otolaryngologie en de afdeling Microbiologie en Immunologie bedanken voor hun hulp bij het hNEC-cultuur- en virale cultuurgerelateerde werk. We willen ook de chirurgen en het chirurgische team in het National University Hospital, Department of Otolaryngology, bedanken voor hun hulp bij het verstrekken van de cel- en bloedmonsters die nodig zijn voor de studie.
Deze studie werd gefinancierd door de National Medical Research Council, Singapore No. NMRC/CIRG/1458/2016 (aan De Yun Wang) en MOH-OFYIRG19may-0007 (aan Kai Sen Tan). Kai Sen Tan is een ontvanger van fellowship-ondersteuning van European Allergy and Clinical Immunology (EAACI) Research Fellowship 2019.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0, RNase-free | Thermofisher | AM9260G | 0.5M EDTA |
| 1.5 mL SafeLock Tubes | Eppendorf | 0030120086 | 1.5mL Centrifuge Tube |
| 10 mL K3EDTA Vacutainer Tubes | BD | 366643 | 10mL Blood Collection Tubes |
| 10x dPBS | Gibco | 14200-075 | |
| 10x PBS | Vivantis | PC0711 | |
| 12-well Plate | Corning | 3513 | |
| 12-well Transwell Insert | Corning | 3460 | membrane insert |
| 1x FACS Lysing Solution | BD | 349202 | |
| 2.0 mL SafeLock Tubes | Eppendorf | 0030120094 | 2 mL centrifuge tube |
| 24-well Plate | Corning | 3524 | |
| 24-well Transwell Insert | Corning | 3470 | |
| 3% Acetic Acid with Methylene Blue | STEMCELL Technologies | 07060 | |
| 3,3',5-triiodo-l-thyronine | Sigma | T-074 | |
| 37% Formaldehyde Solution w 15% Methanol as Stabilizer in H2O | Sigma | 533998 | |
| 5810R Centrifuge | Eppendorf | 5811000320 | |
| 5 mL polypropylene tubes (flow tubes) | BD | 352058 | |
| 70 µm Cell Strainer | Corning | 431751 | |
| A-4-62 Rotor | Eppendorf | 5810709008 | |
| Accutase | Gibco | A1110501 | Cell Dissociation Reagent |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| Avicel CL-611 | FMC Biopolymer | NA | Liquid Overlay |
| Bio-Plex Manager 6.2 Standard Software | Bio-Rad Laboratories, Inc | 171STND01 | Multiplex Manager Software |
| Butterfly Needle 21 G | BD | 367287 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| Crystal Violet | Merck | C6158 | |
| Cytofix/Cytoperm Solution | BD | 554722 | Fixation and Permeabilization Solution |
| Dispase II | Sigma | D4693 | Neutral Protease |
| DMEM/High Glucose | GE Healthcare Life Sciences | SH30243.01 | |
| DMEM/Nutrient Mixture F-12 | Gibco-Invitrogen | 11320033 | |
| dNTP Mix | Promega | U1515 | dNTP Mix |
| EMEM (w L-Glutamine) | ATCC | 30-2003 | |
| EVOM voltohmmeter device | WPI, Sarasota, FL, USA | 300523 | |
| FACS Lysing Solution | BD | 349202 | 1x Lysing Solution |
| Falcon tube 15 mL | CellStar | 188271 | 15 mL tube |
| Falcon tube 50 mL | CellStar | 227261 | 50 mL Tube |
| Fast Start Essential DNA Probes Master | Roche | 6402682001 | qPCR Master Mix |
| Ficoll Paque Premium | Research Instruments | 17544203 | Density Gradient Media |
| H3N2 (A/Aichi/2/1968) | ATCC | VR547 | |
| H3N2 M1 Forward Primer Sequence | Sigma | 5'- ATGGTTCTGGCCAGCACTAC-3' | |
| H3N2 M1 Reverse Primer Sequence | Sigma | 5'- ATCTGCACCCCCATTCGTTT-3' | |
| H3N2 NS1 Forward Primer Sequence | Sigma | 5'- ACCCGTGTTGGAAAGCAGAT-3' | |
| H3N2 NS1 Reverse Primer Sequence | Sigma | 5'- CCTCTTCGGTGAAAGCCCTT-3' | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500-064 | |
| hNESPCs | Human Donors | NA | |
| Human Epithelial Growth Factor | Gibco-Invitrogen | PHG0314 | |
| Hydrocortisone | STEMCELL Techonologies | 7925 | Collected from nasal biopsies during septal deviation surgeries |
| Insulin | Sigma | I3536 | |
| Lightcycler 96 | Roche | 5815916001 | qPCR Instrument |
| Live/DEAD Blue Cell Stain Kit *for UV Excitation | Thermofisher | L23105 | Viability Stain |
| MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel II - Premixed 23 Plex | Merck Pte Ltd | HCP2MAG-62K-PX23 | Immunology Multiplex Assay |
| Mitomycin C | Sigma | M4287 | |
| M-MLV 5x Buffer | Promega | M1705 | RT-PCR 5x Buffer |
| M-MLV Reverse Transcriptase | Promega | M1706 | Reverse Transcriptase |
| N-2 supplement | Gibco-Invitrogen | 17502-048 | |
| NIH/3T3 | ATCC | CRL1658 | |
| Perm/Wash Buffer | BD | 554723 | Permeabilization Wash Buffer |
| PneumaCult-ALI 10x Supplement | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
| PneumaCult-ALI Basal Medium | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
| PneumaCult-ALI Maintenance Supplement (100x) | STEMCELL Techonologies | 5001 | |
| Random Primers | Promega | C1181 | Random Primers |
| Recombinant Rnasin Rnase Inhibitor | Promega | N2511 | RNase Inhibitor |
| RNA Lysis Buffer | Qiagen | Part of 52904 | |
| RPMI 1640 (w L-Glutamine) | ATCC | 30-2001 | |
| STX2 electrodes | WPI, Sarasota, FL, USA | STX2 | Electrode |
| T25 Flask | Corning | 430639 | |
| T75 Flask | Corning | 430641U | |
| TPCK Trypsin | Sigma | T1426 | |
| Trypan Blue | Hyclone | SV30084.01 | |
| Viral RNA Extraction Kit | Qiagen | 52904 | Viral RNA Extraction Kit |
| V-Shaped 96-well Plate | Corning | 3894 |
References
- Monto, A. S. Vaccines and antiviral drugs in pandemic preparedness. Emerging Infectious Diseases. 12 (1), 55-60 (2006).
- Lightfoot, N., Rweyemamu, M., Heymann, D. L.
- Gerdil, C. The annual production cycle for influenza vaccine. Vaccine. 21 (16), 1776-1779 (2003).
- Putri, W., Muscatello, D. J., Stockwell, M. S., Newall, A. T. Economic burden of seasonal influenza in the United States. Vaccine. 36 (27), 3960-3966 (2018).
- Mas-Coma, S., Jones, M. K., Marty, A. M.
- Guo, Y. R., et al. The origin, transmission and clinical therapies on coronavirus disease 2019 (COVID-19) outbreak - an update on the status. Military Medical Research. 7 (1), 11 (2020).
- Guan, W. J., et al. Clinical characteristics of coronavirus disease 2019 in China. New England Journal of Medicine. 382, 1708-1720 (2020).
- van Wilgenburg, B., et al. MAIT cells are activated during human viral infections. Nature Communications. 7, 11653 (2016).
- Chien, Y. H., Meyer, C., Bonneville, M. Gammadelta T cells: first line of defense and beyond. Annual Review of Immunology. 32, 121-155 (2014).
- van Wilgenburg, B., et al. MAIT cells contribute to protection against lethal influenza infection in vivo. Nature Communications. 9 (1), 4706 (2018).
- Dias, J., Leeansyah, E., Sandberg, J. K. Multiple layers of heterogeneity and subset diversity in human MAIT cell responses to distinct microorganisms and to innate cytokines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (27), 5434-5443 (2017).
- Yan, Y., et al. Human nasal epithelial cells derived from multiple individuals exhibit differential responses to H3N2 influenza virus infection in vitro. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (1), 276-281 (2016).
- Luukkainen, A., et al. A co-culture model of PBMC and stem cell derived human nasal epithelium reveals rapid activation of NK and innate T cells upon Influenza A virus infection of the nasal epithelium. Frontiers in Immunology. 9, 2514 (2018).
- Tan, K. S., et al. RNA sequencing of H3N2 influenza virus-infected human nasal epithelial cells from multiple subjects reveals molecular pathways associated with tissue injury and complications. Cells. 8 (9), 986 (2019).
- Kim, N., et al. Effect of lipopolysaccharide on diesel exhaust particle-induced junctional dysfunction in primary human nasal epithelial cells. Environmental Pollution. 248, 736-742 (2019).
- Tan, K., et al. In vitro model of fully differentiated human nasal epithelial cells infected with rhinovirus reveals epithelium-initiated immune responses. Journal of Infectious Diseases. 217 (6), 906-915 (2018).
- Tan, K. S., et al. Comparative transcriptomic and metagenomic analyses of influenza virus-infected nasal epithelial cells from multiple individuals reveal specific nasal-initiated signatures. Frontiers in Microbiology. 9, 2685 (2018).
- Cytokine /Chemokine Panel II 96 Well Plate Assay. Millipore Corporation. , Available from: https://www.merckmillipore.com/SG/en/product/MILLIPLEX-MAP-Human-Cytokine-Chemokine-Magnetic-Bead-Panel-II-Premixed-23-Plex-Immunology-Multiplex-Assay,MM_NF-HCP2MAG-62K-PX23?#documentation (2020).
- Gamage, A. M., et al. Infection of human nasal epithelial cells with SARS-CoV-2 and a 382-nt deletion isolate lacking ORF8 reveals similar viral kinetics and host transcriptional profiles. PLoS Pathogens. 16 (12), 1009130 (2020).
- Zhao, X. N., et al. The use of nasal epithelial stem/progenitor cells to produce functioning ciliated cells in vitro. American Journal of Rhinology & Allergy. 26 (5), 345-350 (2012).
