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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Kontaktfreies Co-Kultur-Modell zur Untersuchung der angeborenen Immunzellaktivierung während einer Infektion mit respiratorischen Viren

Published: February 28, 2021 doi: 10.3791/62115
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 3, 1,4, 1,4, 5, 2,6, 1,2,6, 1,6
1Department of Otolaryngology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2Department of Microbiology and Immunology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 3Haartman Institute, Medicum, University of Helsinki, 4Department of Otolaryngology, Head and Neck Surgery, National University Hospital, National University Health System, 5Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), Singapore Immunology Network (SIgN), 6NUHS Infectious Diseases Translational Research Program, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore
* These authors contributed equally

Summary

Dieses Protokoll beschreibt eine Untersuchung der frühen Wechselwirkungen zwischen viral infizierten Nasenepithelzellen und der angeborenen Zellaktivierung. Einzelne Untergruppen von Immunzellen können anhand ihrer Aktivierung als Reaktion auf Virusinfektionen unterschieden werden. Sie können dann weiter untersucht werden, um ihre Auswirkungen auf frühe antivirale Reaktionen zu bestimmen.

Abstract

Die frühen Wechselwirkungen zwischen der Nasenepithelschicht und den angeborenen Immunzellen während viraler Infektionen bleiben ein wenig erforschtes Gebiet. Die Bedeutung der angeborenen Immunitätssignalisierung bei Virusinfektionen hat erheblich zugenommen, da Patienten mit Atemwegsinfektionen, die eine hohe angeborene T-Zell-Aktivierung aufweisen, ein besseres Krankheitsergebnis zeigen. Daher ermöglicht die Sezierung dieser frühen angeborenen Immuninteraktionen die Aufklärung der Prozesse, die sie steuern, und kann die Entwicklung potenzieller therapeutischer Ziele und Strategien zur Dämpfung oder sogar Verhinderung des frühen Fortschreitens von Virusinfektionen erleichtern. Dieses Protokoll beschreibt ein vielseitiges Modell, mit dem frühe Übersprechen, Interaktionen und die Aktivierung angeborener Immunzellen aus Faktoren, die von viral infizierten Atemwegsepithelzellen abgesondert werden, untersucht werden können. Unter Verwendung eines H3N2-Influenzavirus (A/Aichi/2/1968) als repräsentatives Virusmodell wurde die angeborene Zellaktivierung von kokultivierten mononukleären Zellen im peripheren Blut (PBMCs) mittels Durchflusszytometrie analysiert, um die Untergruppen von Zellen zu untersuchen, die durch die löslichen Faktoren aktiviert werden, die als Reaktion auf die Virusinfektion aus dem Epithel freigesetzt werden. Die Ergebnisse demonstrieren die Gating-Strategie zur Differenzierung der Teilmengen von Zellen und zeigen die deutlichen Unterschiede zwischen den aktivierten Populationen von PBMCs und ihrem Crosstalk mit dem Kontroll- und infizierten Epithel. Die aktivierten Teilmengen können dann weiter analysiert werden, um ihre Funktionen sowie die für die Zellen spezifischen molekularen Veränderungen zu bestimmen. Die Ergebnisse einer solchen Crosstalk-Untersuchung können Faktoren aufdecken, die für die Aktivierung lebenswichtiger angeborener Zellpopulationen wichtig sind und für die Kontrolle und Unterdrückung des Fortschreitens der Virusinfektion von Vorteil sind. Darüber hinaus können diese Faktoren universell auf verschiedene Viruserkrankungen angewendet werden, insbesondere auf neu auftretende Viren, um die Auswirkungen solcher Viren zu dämpfen, wenn sie zum ersten Mal in naiven menschlichen Populationen zirkulieren.

Introduction

Atemwegsviren gehören vielleicht zu den am weitesten verbreiteten Krankheitserregern, die eine schwere Belastung für die Gesundheitsversorgung und die Wirtschaft verursachen. Von den periodischen globalen Ausbrüchen neu auftretender epidemischer Stämme (z. B. H1N1, H5N1, H3N2, MERS, COVID-19) bis hin zu den saisonalen Influenzastämmen jedes Jahr sind Viren eine ständige Bedrohung für die öffentliche Gesundheit. Obwohl Impfstoffe den Hauptteil der Reaktion auf diese globalen Herausforderungen im Bereich der öffentlichen Gesundheit ausmachen, ist es ernüchternd festzustellen, dass diese Gegenmaßnahmen lediglich reaktionsschnellsind 1,2. Darüber hinaus ist eine Verzögerung zwischen dem Auftreten eines neuen infektiösen Stammes und der erfolgreichen Entwicklung seines Impfstoffsunvermeidlich 3, was zu einer Zeit führt, in der die verfügbaren Maßnahmen zur Eindämmung der Ausbreitung des Virus stark begrenzt sind.

Diese Verzögerungen werden durch die Kosten, die der Gesellschaft - wirtschaftlich und sozial - entstehen, noch verstärkt. Allein die saisonale Grippe ist für etwa 8 Milliarden US-Dollar an indirekten Kosten, 3,2 Milliarden US-Dollar an medizinischen Kosten und 36,3.000 Todesfälle in den Vereinigten Staaten von Amerika jährlichverantwortlich 4. Dies geschieht vor der Berücksichtigung der Forschungskosten, die zur Finanzierung der Impfstoffentwicklung erforderlich sind. Epidemieausbrüche haben noch schwerwiegendere Auswirkungen auf die Gesellschaft, verstärkt durch die von Jahr zu Jahr zunehmende Globalisierungsrate, wie die globalen Störungen zeigen, die durch die Entstehung und schnelle Ausbreitung des schweren Coronovirus 2 (SARS-CoV-2) 5,6,7 verursacht werden.

Neuere Studien haben gezeigt, dass infizierte Patienten mit einer größeren Population von aktivierten angeborenen T-Zellen tendenziell ein besseres Krankheitsergebnis haben 8,9,10. Darüber hinaus wird die angeborene T-Zellpopulation in mehrere Untergruppen eingeteilt: die schleimhautassoziierten invarianten T-Zellen (MAIT), Vδ1 γδ T-Zellen, Vδ2 γδ T-Zellen und die natürlichen Killer-T-Zellen (NKT). Diese Untergruppen angeborener T-Zellen weisen auch eine Heterogenität innerhalb ihrer Populationen auf, was die Komplexität der Interaktionen zwischen den Zellpopulationen, die an der angeborenen Immunantwort beteiligt sind, erhöht 11. Daher kann der Mechanismus, der diese angeborenen T-Zellen aktiviert, und das Wissen über die spezifischen Untergruppen angeborener T-Zellen einen anderen Forschungsweg bieten, um die infektiösen Auswirkungen dieser Viren auf den menschlichen Wirt einzudämmen, insbesondere während der Zeit der Impfstoffentwicklung.

Epithelzellen, die mit Influenza infiziert sind, produzieren Faktoren, die angeborene T-Zellen schnell aktivieren12,13,14. Aufbauend auf diesem Befund zielt dieses kontaktlose Luft-Flüssig-Grenzflächenmodell (ALI) darauf ab, die frühen chemischen Wechselwirkungen (vermittelt durch lösliche Faktoren, die von der infizierten Epithelschicht freigesetzt werden) zwischen der infizierten Nasenepithelschicht und den PBMCs während einer frühen Infektion nachzuahmen. Die physikalische Trennung zwischen der Nasenepithelschicht (kultiviert auf Membraneinsätzen) und den PBMCs (in der darunter liegenden Kammer) und der epithelialen Integrität verhindert eine direkte Infektion der PBMCs durch das Virus und ermöglicht eine detaillierte Untersuchung der Auswirkungen von epithelial abgeleiteten löslichen Faktoren auf die PBMCs. Die identifizierten Faktoren können daher hinsichtlich ihres therapeutischen Potenzials bei der Induktion der geeigneten angeborenen T-Zell-Population, die vor einer Influenza-Infektion schützen kann, weiter untersucht werden. Dieses Papier hat daher die Methoden zur Etablierung einer Kokultur für die Untersuchung der angeborenen T-Zell-Aktivierung aus Epithel-abgeleiteten löslichen Faktoren detailliert beschrieben.

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Protocol

HINWEIS: In Tabelle 1 finden Sie die Rezepte der in diesem Protokoll verwendeten Medien.
HINWEIS: Es wurde festgestellt, dass hNECS, die auf 12-Well Transwell gezüchtet werden, in eine optimalere Dicke für lösliche Faktoren wachsen, um die Basalkammer leicht zu erreichen, wenn sie mit dem Influenzavirus infiziert sind. Daher wird die Verwendung von 12-Well-Size-Transwell für die Kokultur empfohlen.

1. Aufbau der 3T3-Feederschicht

  1. Betrieb aus Tiefkühlbeständen
    1. Tauen Sie ein Kryovial von NIH/3T3-Fibroblasten aus gefrorenen Beständen auf. Fügen Sie den Inhalt des Kryoviales zu 2 ml vollständigem Dulbecco's Minimal Essential Media (DMEM) hinzu und resuspendieren Sie die Zellen.
    2. Zentrifugieren Sie für 5 min bei 300 × g und Raumtemperatur/-druck (rtp) und entfernen Sie den Überstand. Suspendieren Sie die Zellen im vollständigen DMEM.
    3. Zählen Sie die Zellen mit trypanblauer Färbung. Fügen Sie 10 μL Trypanblau zu 10 μL der resuspendierten Zellsuspension hinzu. Mischen Sie gründlich und fügen Sie 10 μL der Suspension zu einem Hämozytometer hinzu, um die Zellen zu zählen.
    4. Samenzellen mit einer Dichte von 1 × 104 Zellen/cm 2 in einer geeigneten Kulturschale (z.B. T75-Kolben). Inkubieren Sie den resultierenden Kulturkolben für 3 Tage bei 37 °C in einer 5% CO2 -Atmosphäre.
  2. Mitomycin C Behandlung
    1. Stellen Sie nach 3 Tagen sicher, dass die Konfluenz 60% -80% beträgt, entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
      HINWEIS: Es ist wichtig, dass die 3T3-Feederschicht nicht den vollen Zusammenfluss erreicht. Andernfalls ist die Behandlung mit Mitomycin C nicht wirksam.
    2. Mitomycin C-supplementiertes vollständiges DMEM in den Kolben geben und 3,5 h bei 37 °C in einer 5%igen CO2-Atmosphäre inkubieren. Entfernen Sie das Mitomycin C-haltige Medium und waschen Sie die Zellen 2x mit 1x PBS.
  3. Aussaat von 3T3-Zellen in 6-Well-Platten
    1. Fügen Sie 3 ml 1x Trypsin-EDTA für 3-5 Minuten in den Kolben ein, um die Zellen zu dissoziieren. Sammeln Sie die dissoziierten Zellen in einem frischen 15-ml-Röhrchen. Zentrifugieren Sie das 15-ml-Röhrchen für 5 min bei 300 × g, rtp; Verwerfen Sie den Überstand. Suspendieren Sie die Zellen im vollständigen DMEM.
    2. Zählen Sie die Zellen mit trypanblauer Färbung. Samen Sie die Zellen in einer 6-Well-Platte bei 7,5 × 10 5-2,5 × 106 Zellen / Well. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 °C in einer 5% CO2 -Atmosphäre.
      HINWEIS: Die 3T3-Feederschicht gilt als bereit, wenn die Zellen gesund sind. Samen Sie an diesem Punkt die menschlichen nasalen Epithelstamm- / Vorläuferzellen (hNESPCs) auf die Feederschicht zur Expansion.
    3. Vollständiges DMEM in den Kolben geben und bei 37 ° C, 5% CO2 über Nacht inkubieren, damit sich 3T3-Zellen von der Behandlung mit Mitomycin C erholen können.

2. Etablierung der Kultur der menschlichen Nasenepithelzellen (hNEC)

HINWEIS: Klinische Proben sollten von Patienten stammen, die frei von Symptomen einer Infektion der oberen Atemwege sind.

  1. Verarbeitung von Nasengewebe zu Einzelzellsuspension
    1. Waschen Sie das Nasengewebe in 1x Dulbeccos PBS (dPBS) (PBS ohne Mg 2+ und Ca2+), das 100 μL/ml einer antimykotisch-antimykotischen Mischung enthält. Schneiden Sie das Gewebe in kleine Fragmente und behandeln Sie die Probe in 10 mg / ml einer neutralen Protease über Nacht bei 4 ° C mit Schütteln.
    2. Zentrifugieren Sie für 5 min bei 200 × g und entfernen Sie den Überstand nach der Zentrifugation. Das Pellet in 1-2 ml 1x Trypsin-EDTA (37 °C, 15 min) inkubieren und abschrecken, indem man ein Volumen des fetalen Rinderserums hinzufügt, das 10% des Volumens in der Tube entspricht.
    3. Dissoziation des verdauten Gewebes mechanisch in Einzelzellaggregate durch Pipettieren und dann die resultierende Suspension durch ein 70-μm-Zellsieb führen. Suspendieren Sie die Zellen im vollständigen DMEM.
      HINWEIS: Nach diesem Schritt ist die Zellsuspension eine Mischung aus terminaldifferenzierten Zellen und Stammzellen, die als humane nasale Epithelstamm-/Vorläuferzellen (hNESPCs) bezeichnet werden. Ziel der nachfolgenden Schritte ist es, die hNESPC-Population aus der Mischung verschiedener Zellpopulationen auszuwählen und anzureichern.
  2. Aussaat einer Einzelzellsuspension auf die 3T3-Feederschicht zur Auswahl von hNESPCs
    1. Die Zellsuspension aus Schritt 2.1.3 (300 × g, 5 min, rtp) wird zentrifugiert und der Überstand entfernt. Resuspendiert die Zellen in 3-5 ml Medium 3.
      HINWEIS: Medium 3 wurde formuliert, um das selektive Wachstum von hNESPCs zu fördern.
    2. Zählen Sie die Zellen über die trypanblaue Färbung. Samen Sie 1 x 10 6 Zellen in 2 ml Medium 3 pro Vertiefung auf 6-Well-Platte mit vorbereiteter 3T3-Feederschicht nach Entfernen der Medien in der 6-Well-Platte. Inkubieren Sie die resultierende Co-Kultur bei 37 °C in einer 5% CO2 -Atmosphäre.
      HINWEIS: Achten Sie nach der Aussaat darauf, die Platte nicht zu rühren, da dies die Befestigung der hNESPCs beeinträchtigt.
    3. Wechseln Sie das Medium 3 (2 ml) alle 2-4 Tage, indem Sie das alte Medium vollständig entfernen und durch frisches Medium 3 ersetzen.
      HINWEIS: Das Medium wird gewechselt, um Nährstoffe aufzufüllen und zu verhindern, dass übermäßig saure Bedingungen das Wachstum der hNESPCs negativ beeinflussen. Das Intervall zwischen jedem Mediumswechsel hängt davon ab, wie sauer (gelb) das Medium wird. Intervalle sollten verkürzt werden, wenn das Medium schnell sauer wird.
    4. Beobachten Sie nach 7-10 Tagen, dass hNESPCs einen Zusammenfluss haben, der geeignet ist, sie auf Membraneinsätze zu übertragen. Siehe Abbildung 1 für die repräsentative Morphologie von hNESPCs zu 3 verschiedenen Zeitpunkten (2 Tage, 5 Tage und 10 Tage).
  3. Übertragung von hNESPCs auf Membraneinsätze
    HINWEIS: Aufgrund der Behandlung mit Mitomycin C wird die 3T3-Feederschicht im Laufe der hNESPC-Expansionsphase langsam abgebaut. Dies führt zu einer geschwächten Haftung an der Oberfläche des Bohrlochs, die ihre Verdrängung durch Spülen mit einer Pipette ermöglicht, so dass nur die gesunden hNESPCs zurückbleiben.
    1. Entfernen Sie das Medium, und fügen Sie 500 μL 1x dPBS zu jeder Vertiefung hinzu. Spülen Sie die Zellen 3x mit einer Mikropipette, um die 3T3-Zellen zu entfernen, und verwerfen Sie die 1x dPBS. Beobachten Sie unter dem Mikroskop, dass die runden hNESPCs verbleiben, während sich die spindelförmige 3T3-Feederschicht löst.
    2. Fügen Sie 500 μL eines Zelldissoziationsreagenzes pro Vertiefung hinzu und inkubieren Sie bei 37 °C in einer 5% CO2-Atmosphäre für 5-10 min oder bis sich die hNESPCs von der Bohrlochoberfläche gelöst haben.
    3. Sammeln Sie die hNESPC-Suspension, die Zentrifuge (300 × g, 5 min, rtp) und entfernen Sie den Überstand.
    4. Resuspendiert das Pellet in Medium 3. Zählen Sie die Zellen über die trypanblaue Färbung. Seed 3 × 104 Zellen in 150 μL Medium 3 pro Membraneinsatz (24-Well-Platte) oder 1 × 105 Zellen in 300 μL Medium 3 pro Membraneinsatz (12-Well-Platte) (Abbildung 2). Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einer 5% CO2 -Atmosphäre.
    5. Wechseln Sie das Medium (medium 3) der apikalen und basalen Kammern alle 2 Tage. Navigieren Sie durch eine Pipettenspitze zwischen den Stützarmen des Membraneinsatzes, um auf die Basalkammer zuzugreifen, entfernen Sie das alte Medium und führen Sie dann nach der gleichen Methode frisches Medium wieder ein. Obwohl die apikale Kammer leicht zugänglich ist, achten Sie darauf, die wachsende hNESPC-Schicht nicht zu stören.
      HINWEIS: Stören Sie das Medium in der apikalen Kammer für mindestens 2 Tage nach der Aussaat nicht, da die Zellen Zeit benötigen, um sich an der Membran zu befestigen.
  4. Differenzierung von hNESPCs in hNECs
    1. Wenn hNESPCs eine 100%ige Konfluenz erreichen (ca. 3-7 Tage nach der Aussaat auf dem Membraneinsatz), beginnen Sie mit der ALI-Kultur. Ändern Sie das basale Medium in das Differenzierungsmedium und entfernen Sie das Medium aus der apikalen Kammer. Geben Sie der Basalkammer nur Medium, ohne es der apikalen Kammer hinzuzufügen, wenn Sie das Medium alle 2-3 Tage wechseln, wie in Abbildung 3 und Schritt 2.3.5 gezeigt.
      HINWEIS: Medium wird in Differenzierungsmedium geändert, um die Differenzierung der hNESPCs in hNECs in ALI zu fördern. Die hNESPCs benötigen ungefähr 3-4 Wochen, um die volle Reife zu erreichen, um hNECs in ALI zu werden, an welchem Punkt die Zellen zu einer Multischicht mit verschiedenen Zellpopulationen in jeder Schicht gewachsen wären. Zilien sollten auch bei einer Vergrößerung von 400x beobachtet werden (Zilien können durch ihre Schlagbewegung identifiziert werden, die dazu führt, dass das Mikroskopfeld so aussieht, als würde es vibrieren). Zu diesem Zeitpunkt sind die Zellen bereit, für die Co-Kultur-Experimente verwendet zu werden. Den Querschnitt einer vollständig differenzierten hNEC-Schicht finden Sie in Abbildung 4.
    2. Nachdem Sie reife hNECs erhalten haben, waschen Sie die Zellen in der apikalen Kammer 3x mit 1x dPBS in 2-3-tägigen Abständen für 1 Woche vor dem Co-Kultur-Experiment. Synergisieren Sie den Waschschritt mit den basalen Mediumwechseln und führen Sie die Wäschen wie folgt durch.
      1. Geben Sie 50 μL (24-Well)/150 μL (12-Well) von 1x dPBS in die apikale Kammer des Membraneinsatzes und inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C für 10 min. Entfernen Sie das dPBS nach 10 Minuten Inkubation, um angesammelten Schleim und abgestorbene Zellen im Laufe der Differenzierung zu entfernen.
        HINWEIS: Abhängig von der Art des Experiments kann Natriumbicarbonatlösung verwendet werden, um die Schleimschicht vollständig abzuwaschen. Bei einer Virusinfektion in Co-Kultur-Experimenten bleibt die Schleimschicht jedoch erhalten und nur überschüssiger Schleim wird mit dPBS-Wäsche entfernt. Diese Retention soll die physiologische Schleimschicht nachahmen, die auf dem Nasenepithel vorhanden ist und mit der eingehenden Virusinfektion interagiert.

3. Messung des transepithelialen elektrischen Widerstands (TEER)

HINWEIS: Die Bestätigung der epithelialen Integrität ist wichtig, um sicherzustellen, dass eine intakte und gesunde Epithelschicht erhalten wird. Eine intakte Epithelschicht wird durch TEER-Messung bestimmt, die an 4 zufälligen Bohrlöchern mit einem Voltrohmmeter durchgeführt wird.

  1. Spülen Sie die Elektrode mit 70% Ethanol aus und sterilisieren Sie sie vor Gebrauch 15 Minuten lang mit ultraviolettem Licht, um die Sterilität zu gewährleisten. Nach der Sterilisation mit 1x dPBS abspülen.
  2. Geben Sie 100 μL (für 24-Well) oder 300 μL (für 12-Well) von 1x dPBS in die apikale Kammer des Membraneinsatzes. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für 10 min; Entfernen Sie dann die dPBS.
  3. Für jede zu messende Vertiefung ist eine ungenutzte Vertiefung mit 1 ml (für 24-Well) oder 3 mL (für 12-Well) vorgewärmtem (bis 37 °C) Differenzierungsmedium vorzubereiten. Legen Sie den Membraneinsatz in die vorbereitete Vertiefung und fügen Sie 200 μL (für 24-Well) oder 600 μL (für 12-Well) vorgewärmtes Differenzierungsmedium in die apikale Kammer hinzu. Bei 37 °C (abhängig von der Inkubationstemperatur der zugesetzten Virusart, z. B. 35 °C für Influenza) für 15 min ausgleichen.
    HINWEIS: Bereiten Sie einen Rohling (leerer Membraneinsatz) auf die gleiche Weise für die Berechnung des TEER vor.
  4. Quilibrieren Sie ein 15-ml-Röhrchen vorgewärmten Differenzierungsmediums bei gleicher Temperatur für 15 Minuten. Legen Sie die Elektroden in die 15-ml-Röhre und schalten Sie das Voltohmmeter ein.
    HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt sollte der Messwert 0 Widerstand betragen, da sich die Elektroden im selben Medium befinden. Wenn ein anderer Messwert erhalten wird, gleichen Sie die Elektrode in der 15-ml-Röhre aus, bis der Messwert 0 ist.
  5. Ausgehend vom Rohling positionieren Sie die Elektroden in jeder Vertiefung so, dass eine Elektrode in das apikale Kammermedium und die andere in das Basalkammermedium eingetaucht wird. Notieren Sie den Messwert nur, wenn ein konstanter Messwert für einen Zeitraum von mindestens 5 Minuten erreicht wird.
  6. Nach jeder Messung die Elektrode vor der nächsten Messung mit PBS waschen. Nehmen Sie für jeden gut getesteten Test Messungen für drei Proben an verschiedenen Positionen der Membran vor. Um den Netto-TEER jeder Probe zu berechnen, subtrahieren Sie den Hintergrundwiderstand, der durch den leeren Membraneinsatz gegeben ist, von jeder Messung.
  7. Berechnen Sie den Gesamt-TER-Wert für ein Bohrloch mit der folgenden Gleichung:
    Epithelintegrität (ωcm 2) = Netto-TEER (Ohm) × Membranbereich (cm2)
    HINWEIS: Die TEER-Werte von hNECs für Virusinfektionsexperimente sollten >1000 Ωcm213,15,16 betragen. 

4. Isolierung von peripheren Blutmonozyten und NK-Zellen

HINWEIS: Blutproben sollten von gesunden Freiwilligen entnommen und am selben Tag der Isolierung verwendet werden.

  1. Sammeln Sie 30-40 ml Vollblut von jedem Spender in 10 ml Blutentnahmeröhrchen.
  2. Isolieren Sie PBMCs mittels Dichtegradientenzentrifugation und erhalten Sie PBMCs aus der Buffycoat nach den folgenden Schritten (siehe auch die Materialtabelle).
    1. Mischen Sie gründlich ~ 10 ml Blut aus dem Blutentnahmeröhrchen in einem Vakutainer, bevor Sie es mit einem gleichen Volumen ausgewogener Salzlösung (PBS) verdünnen.
    2. Fügen Sie 15 ml Dichtegradientenmedium zur Basis einer 50-ml-Röhre hinzu.
      HINWEIS: Das Verhältnis von Dichtegradientenmedium zu verdünntem Blut sollte 2: 3-3,5 betragen.
    3. Schichten Sie 35 ml verdünntes Blut auf das Dichtegradientenmedium mit einer Pipettenpistole (wobei die Dosiereinstellung auf die niedrigstmögliche Einstellung eingestellt ist), indem Sie das Rohr um 45° neigen und das verdünnte Blut tropfenweise auf die Innenwand des Röhrchens fallen lassen, so dass die Schicht des Dichtegradientenmediums nicht gestört wird.
    4. Zentrifugenlysat bei 500 × g, 18-20 °C für 30 min (Bremse: aus). Entfernen und verwerfen Sie vorsichtig die obere Plasmaschicht, ohne die untere Schicht zu stören.
    5. Übertragen Sie das Buffy-Fell auf ein neues Röhrchen, ohne die rote Blutkörperchenschicht, die mittlere Schicht der Gradientendichte oder das Buffy-Fell zu mischen. Sobald der Buffy-Mantel in einer neuen 50-ml-Röhre gesammelt wurde, füllen Sie das Volumen mit 1x PBS auf 50 ml auf.
    6. Zentrifugieren Sie Lysat bei 800 × g, 18-20 °C, 8 min (Bremse: aus) und entfernen Sie den Überstand mit einer Pipettenpistole. Resuspendiert das Zellpellet mit 50 ml 1x PBS und zentrifugiert bei 120 × g, 18-20 °C, 10 min, um Blutplättchen zu entfernen.
    7. Verwerfen Sie den Überstand durch Pipettieren, ohne das Zellpellet zu stören.
      HINWEIS: Da das Zellpellet möglicherweise locker ist, ist es nicht ratsam, den Überstand durch Gießen zu entsorgen.
    8. Resuspendiert das Zellpellet mit vollständigem RPMI-Medium (Roswell Park Memorial Institute). Führen Sie eine Zellzählung durch, indem Sie 10 μL 3% Essigsäure mit Methylenblau zu 10 μL der resuspendierten Zellsuspension hinzufügen. Mischen Sie gründlich und fügen Sie 10 μL der Mischung zu einem Hämozytometer hinzu, um die Zellen zu zählen.
  3. Verdünnen Sie PBMCs mit vollständigem RPMI-Medium auf eine Dichte von 2 × 10 6/ml (für 24-Well) oder 4 × 106/mL (für 12-Well).

5. hNEC Virusinfektion und Übergang zur hNEC:PBMC-Kokultur

HINWEIS: H3N2 (A/Aichi/2/1968) wird in diesem Protokoll als repräsentativer Infektionsstamm verwendet. Multiplicity of Infection (MOI) von 0,1 wird als repräsentativer MOI in diesem Protokoll verwendet.

  1. Tag 0 (Infektion von hNECs)
    HINWEIS: Ein Well aus den hNECs, die aus demselben Spender gewonnen wurden, wird verwendet, um eine repräsentative Zellzahl für jedes im Experiment verwendete Well zu erhalten.
    1. In der repräsentativen Vertiefung 150 μL 1x Trypsin-EDTA in die apikale Kammer des Membraneinsatzes und 350 μL 1x Trypsin-EDTA in die Basalkammer geben und bei 37 °C für 10 min inkubieren, oder bis sich die Zellen von der Membran lösen.
    2. Spülen Sie die Zellen auf der Membran durch Auf- und Abpipettieren und sammeln Sie die Suspension in einem 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen. Fügen Sie 200 μL vollständiges DMEM hinzu, um die Trypsinaktivität zu löschen. Zählen Sie Zellen über Trypan Blue Färbelung, um die Zellzahl pro Well zu erhalten.
    3. Berechnen Sie das erforderliche MOI des Virus basierend auf der Zellzahl pro Vertiefung und verdünnen Sie den Virusbestand entsprechend mit vollständigem RPMI auf Eis.
      HINWEIS: MOI 0,1 von 1,26 × 106 hNECs pro Well = 1,26 × 105 H3N2 Viruspartikel pro Well in 30 μL (für 24-Well)/100 μL (für 12-Well)
    4. Für die verbleibenden Vertiefungen für das Infektionsexperiment 50 μL (für 24-Well)/150 μL (für 12-Well) 1x dPBS in die apikalen Kammern der Membraneinsätze geben, bei 37 °C für 10 min inkubieren und das 1x dPBS entfernen.
    5. Ändern Sie das Basalmedium in den Membraneinsätzen in ein vollständiges RPMI-Medium, indem Sie die Einsätze auf eine neue Platte mit vollständigem RPMI übertragen, das den Vertiefungen hinzugefügt wird (350 μL (für 24-Well)/700 μL (für 12-Well)).
      HINWEIS: Wenn sich hNESPCs vollständig von hNECs unterschieden haben, sind sie bis zu 72 h tolerant / permissiv gegenüber verschiedenen Medien, ohne Änderungen an Morphologie oder Organisation, wenn das Medium auf RPMI12 umgestellt wird. RPMI wird verwendet, um das Wachstum und die Aufrechterhaltung der PBMC-Bevölkerung zu unterstützen.
    6. Die vorbereiteten 30 μL (für 24-Well)/100 μL (für 12-Well) des Virus-Inokulums in die apikale Kammer des Membraneinsatzes geben, bei 35 °C in einer 5%igenCO2-Atmosphäre für 1 h inkubieren und das virale Inokulum aus der apikalen Kammer entfernen.
    7. Wechseln Sie das basale Medium des Membraneinsatzes in frisches vollständiges RPMI-Medium und inkubieren Sie bei 35 °C in einer 5% CO2 -Atmosphäre für 24 h.
  2. Tag 1 (Etablierung von hNECs + PBMCs Co-Kultur)
    1. Saatgut der erforderlichen Anzahl von PBMCs in 150 μL (für 24-Well)/300 μL (für 12-Well) des vollständigen RPMI-Mediums, indem die PBMC-Suspension ab Tag 0 direkt in die Basalkammer jeder Vertiefung von nicht infizierten oder infizierten hNECs gegeben wird (1,5 × 10 6 für 24-Well-Platten und 3 × 106 für 12-Well-Platten). Bei 37 °C für 24/48 h inkubieren.
      HINWEIS: Das endgültige Volumen in der Basalkammer nach der Etablierung der Kokultur beträgt 500 μL (für 24-Well)/1000 μL (für 12-Well).
  3. Tage 2-3 (Ernte von PBMCs 48/72 h postvirale Infektion)
    1. Sammlung apikaler Überstände (48/72 h postvirale Infektion)
      1. 50 μL (für 24-Well)/150 μL (für 12-Well) von 1x dPBS in jede apikale Kammer geben und bei 37 °C für 10 min inkubieren. Sammeln Sie die 1x dPBS in 1,5 ml Röhren. Aliquot 25 μL (für 24-Well)/50 μL (für 12-Well) des Überstands für den Plaque-Assay in einem neuen 1,5-ml-Röhrchen und frieren sofort sowohl den Bestand als auch die Aliquots bei -80 °C ein.
    2. Sammlung zellulärer RNA aus hNECs (48/72 h postvirale Infektion)
      1. Übertragen Sie den Membraneinsatz in eine saubere Vertiefung, fügen Sie 300 μL (für 24-Well) / 600 μL (für 12-Well) RNA-Lysepuffer in die apikale Kammer hinzu und inkubieren Sie bei rtp für 5 min. Sammeln Sie den Überstand in einem 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen und lagern Sie ihn bei -80 ° C bis zur RNA-Extraktion für die molekulare Analyse.
    3. Ernte von PBMCs (48/72 h postvirale Infektion)
      1. Mit der breiten Basis einer sterilen Pipettenspitze die Oberfläche des Bohrlochs vorsichtig abkratzen, um die aktivierten PBMCs zu entfernen, die an der Bohrlochoberfläche haften können. Sammeln Sie das PBMCs enthaltende Basalmedium in einem 2-ml-Zentrifugenröhrchen.
      2. Spülen Sie die Vertiefungen 2x mit 300 μL 1x dPBS und sammeln Sie die Wäsche im selben 2 ml Rohr. Das 2-ml-Röhrchen (500 × g, 5 min, rtp) zentrifugieren und den Überstand in einem frischen 2-ml-Röhrchen sammeln, ohne das Zellpellet zu stören. Lagern Sie den Überstand bei -80 °C für die Zytokin- und Chemokinanalyse; resuspendiert das Zellpellet in 200 μL von 1x dPBS.

6. Durchflusszytometrie

HINWEIS: Dieser Abschnitt des Protokolls wird direkt aus dem vorherigen Abschnitt mit der PBMC-Zellsuspension aus Schritt 5.3.3.2 fortgesetzt. Stellen Sie bei den folgenden Schritten in diesem Abschnitt eine minimale Lichteinwirkung sicher. Eine Mustertafel mit Oberflächenfärbemarkern ist in Tabelle 2 zu finden.

  1. Oberflächenfärbung
    1. Übertragen Sie das resuspendierte PBMC-Zellpellet in eine 96-V-Bodenvertiefungsplatte. Zentrifugieren Sie Lysat bei 800 × g für 3 min und entfernen Sie den Überstand.
    2. Inkubieren Sie alle PBMCs (mit Ausnahme der "unbefleckten") mit 100 μL eines Lebensfähigkeitsflecks für 15 Minuten bei rtp. Füllen Sie bis zu 200 μL mit 150 μL Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) Puffer. Zentrifugieren Sie Lysat bei 800 × g für 3 min und entsorgen Sie den Überstand.
    3. Bereiten Sie eine Platte mit interessanten Oberflächenfärbeantikörpern mit geeigneten Verdünnungsverhältnissen und einem Endvolumen von 50 μL pro Reaktion vor (Auffüllen mit MACS-Puffer, um das endgültige Volumen zu erhalten). Führen Sie eine Oberflächenfärbung durch, indem Sie den Zellen mit einer Mehrkanalpipette 50 μL der vorbereiteten Antikörpermischung hinzufügen. 15 min im Dunkeln bei 4 °C inkubieren.
    4. Waschen Sie durch Zugabe von 150 μL MACS-Puffer. Zentrifugieren Sie Lysat bei 800 × g für 3 min und entsorgen Sie den Überstand. Wenn keine intrazelluläre Färbung erforderlich ist, fahren Sie direkt mit der 15-minütigen Inkubation in Schritt 6.3 fort.
  2. Intrazelluläre Färbung (falls erforderlich)
    1. Fügen Sie 100 μL einer Fixations- und Permeabilisierungslösung zu jeder Vertiefung hinzu. 20 min im Dunkeln bei 4 °C inkubieren. Laden Sie die Bohrlöcher mit 100 μL 1x MACS-Puffer auf.
    2. Zentrifuge (800 × g, 3 min, 25 °C) und entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie die Wäsche, indem Sie 200 μL 1x Permeabilisierungs-Waschpuffer hinzufügen. Zentrifugieren (500 × g, 3 min, 25 °C) und den Überstand entfernen.
    3. Bereiten Sie die Verdünnungen für das interessierende Antikörperpanel vor, um ein Endvolumen von 50 μL mit 1x Permeabilization Wash-Puffer zu erreichen. 30 min im Dunkeln auf Eis inkubieren. Fügen Sie 200 μL 1x Permeabilisierungs-Waschpuffer hinzu.
    4. Zentrifugieren Sie die Zellen (800 × g, 3 min, 4 °C) und entfernen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie die Zellen in 100 μL fluoreszenzaktiviertem Zellsortierpuffer.
  3. Pipette 200 μL einer Lysinglösung in jedes Well. Inkubiere für 15 min bei rtp. Zentrifugieren Sie Lysat bei 800 × g für 3 min und entsorgen Sie den Überstand.
  4. Resuspendieren Sie die Zellpellets in 200 μL MACS-Puffer. Führen Sie die Durchflusszytometrie gemäß den zuvorbeschriebenen Einstellungen 13 durch oder lagern Sie sie bei 4 ° C im Dunkeln.

7. Bestimmung des Zytokin- und Chemokinspiegels

  1. Verarbeiten Sie 25 μL des Basalkammerüberstands mit einem immunologischen Multiplex-Assay gemäß dem Protokoll18 des Herstellers.
  2. Berechnen Sie die Konzentration jedes Analyten mit der Multiplex-Manager-Software unter Verwendung eines Kurvenanpassungsalgorithmus (5 Parameter) für die Standardkurve.

8. Beurteilung der Viruskontamination

  1. Extrahieren Sie virale RNA mit einem Extraktionskit auf 4 Lösungssätzen: die H3N2-Stammlösung, die MOI 0.1-Verdünnung für die Infektion, die 10-fache serielle Verdünnung des MOI 0,1 und das Basalmedium aus den Proben (sowohl 48 als auch 72 h postvirale Infektion)12.
  2. Wählen Sie nicht-strukturelles Gen (NS1) und Matrix (M1) als Ziele für die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) (siehe die Materialtabelle für Primer, die im repräsentativen Experiment verwendet wurden).
  3. Reverse-Transkriptions-PCR (RT-PCR) (42 °C, 60 min) durchführen, um die virale RNA in cDNA umzuwandeln, bevor eine quantitative PCR (qPCR) durchgeführt wird, um NS1- und M1-Spiegel als Proxy für die virale Präsenz zu messen, und korrelieren Sie die Spiegel mit der Standardkurve, die aus der RT-qPCR erhalten wurde, die bei der 10-fachen seriellen Verdünnung des MOI 0,1-Aliquot durchgeführt wurde. Die Zusammensetzung der Reaktionsmischungen ist Tabelle 3 zu entnehmen und die folgenden Bedingungen zu verwenden: Vorinkubation bei 95 °C für 10 min, gefolgt von einer 3-stufigen Verstärkung für 40 Zyklen: 95 °C für 10 s, 60 °C für 10 s, 72 °C für 30 s; Schmelzkurve: 95 °C für 10 s, 65 °C für 60 s und 97 °C für 1 s.

9. Plaque-Assay

  1. Tag 0: Aussaat MDCK (Madin Darby Canine Niere) in 24-Well-Platten
    1. Entfernen Sie das Medium aus einem T75-Kolben konfluenter MDCK-Zellen. 2x mit 1x PBS waschen, um alle Serumspuren zu entfernen. Trypsinisieren Sie die MDCK-Zellen, indem Sie 10 ml Trypsin hinzufügen und bei 37 ° C in einer 5% CO2-Atmosphäre für 20-30 min inkubieren, bis sich die Zellen lösen.
      HINWEIS: Tippen Sie nicht auf den Kolben, da dies zu Verklumpungen führen kann.
    2. Pipette die Zellsuspension in eine 15-ml-Röhre, die 2 ml vollständiges Eagle's Minimal Essential Medium (EMEM) enthält. Zentrifüchten (300 × g, 5 min, rtp) und den Überstand entfernen.
    3. Resuspendieren Sie die Zellen in 6 ml vollständigem EMEM. Zählen Sie die Zellen durch Trypan-Blaufärbung.
    4. Verdünnen Sie die MDCK-Zellsuspension auf eine Konzentration von 1 × 10 5 Zellen/ml und säen Sie 1 ml der verdünnten Suspension in jeder Vertiefung einer sterilen 24-Well-Platte. Inkubieren Sie bei 37 °C in einer 5% CO2 -Atmosphäre für 24 h, um eine konfluierende Monoschicht von MDCK-Zellen in jedem Bohrloch zu erhalten.
  2. Tag 1: Infektion von MDCK-Zellen
    1. Bereiten Sie das Infektionsmedium vor. Entfernen Sie das Medium von der MDCK-Monoschicht in der 24-Well-Platte und waschen Sie 2x mit 1x dPBS. Lassen Sie für die zweite Wäsche das PBS in den Vertiefungen, während Sie serielle Verdünnungen des Virus vorbereiten.
    2. Tauen Sie die Virusproben auf Eis auf und verdünnen Sie sie seriell in einer 24-Well-Platte, um serielle Verdünnungen von 10-1 auf 10-6 zu erreichen.
      HINWEIS: Füllen Sie beispielsweise jede Vertiefung in eine 24-Well-Platte mit 270 μL Infektionsmedium.
    3. 30 μL der Virusprobe in die erste Vertiefung in der Reihe geben. Mit einer neuen Pipettenspitze gut mischen und zur nächsten Vertiefung in der Reihe überführen, um die Probe um das 10-fache zu verdünnen. Fahren Sie fort, bis eine Verdünnung von 10-6 erreicht wurde; Führen Sie die Schritte 9.2.1-9.2.3 für alle Virenbeispiele aus.
    4. Entfernen Sie PBS von der MDCK-Platte und infizieren Sie es doppelt mit 100 μL der vorbereiteten viralen Verdünnungen. Für Kontrollbrunnen fügen Sie 100 μL des Infektionsmediums (ohne die Virusprobe) hinzu. Bei 35 °C in einer 5%igenCO2-Atmosphäre für 1 h inkubieren und die Platte alle 15 min schütteln, um trockene Stellen zu beseitigen.
    5. Entfernen Sie das virale Inokulum und fügen Sie 1 ml Flüssigkeitsüberlagerung für jede Vertiefung hinzu. Bei 35 °C in einer CO2 -Atmosphäre von 5 % für 72 h inkubieren.
  3. Tag 4 (72 h nach der Infektion): Plaque-Visualisierung
    1. Entfernen Sie das flüssige Overlay und fixieren Sie die Zellen mit 4% Formaldehyd in 1x PBS für 1 h. Entfernen Sie die Formaldehydlösung und waschen Sie sie einmal mit 1x PBS oder destilliertem Wasser.
    2. Färben Sie die fixierten Zellen durch Zugabe von 1% kristallvioletter Lösung für 15 min. Entfernen Sie den kristallvioletten Farbstoff und waschen Sie die Zellen mit fließendem Wasser. Trocknen Sie die Platte bei rtp.
    3. Zählen Sie nach dem Trocknen Plaques und berechnen Sie den viralen Titer nach der folgenden Formel:
      Anzahl der Plaques × Verdünnungsfaktor = Anzahl der Plaques - Formeinheiten in 100 μL

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Representative Results

Obwohl konventionelle T-Zellen das Hauptrepertoire der adaptiven Immunantwort gegen Virusinfektionen bilden, um die virale Clearance zu erleichtern, arbeitet die angeborene T-Zell-Population über ein breiteres Spektrum, um die Viruslast für eine effektive Clearance in einem späteren Stadium zu unterdrücken. Daher schafft dieses Protokoll speziell eine robuste Bedingung, um angeborene T-Zellen, ihre Aktivierung und ihre funktionelle Population nach einer Influenza-Infektion zu untersuchen, ohne dass Epithel- und Immunzellproben desselben Spenders benötigt werden. Dieses Protokoll kann auch auf andere Viren angewendet werden, obwohl es auf Viren mit apikaler Freisetzung beschränkt sein kann, d.h. kein Virus sollte in die Basalschicht eindringen, um mit dem PBMC-Kompartiment in Kontakt zu kommen.

Basierend auf den repräsentativen Ergebnissen in Abbildung 1 kann dieses Protokoll dazu beitragen, hNESPC-Populationen zu erhalten, die aus einer primären Zellsuspension in einer 3T3-Feederschicht gezüchtet wurden. Abbildung 1 zeigt eine Stichprobe der erwarteten Progression der hNESPCs, wenn sie auf der 3T3-Feederschicht wachsen. Diese Zellen werden zur Differenzierung in der ALI-Kultur verwendet, um mehrschichtige hNECs mit funktionellen Flimmer- und Becherzellen zu erhalten (Abbildung 4). Mit Hilfe der hNECs kann die angeborene T-Zell-Aktivierung mittels Durchflusszytometrie untersucht werden. Die in Abbildung 5 gezeigten Ergebnisse zeigen den Nachweis von MAIT-Zell-, γδ-T-Zell- und NK-Zellpopulationen, die in der Kokultur mit mit dem Influenzavirus infizierten hNECs signifikant erhöht waren. Dieses Setup kann dann auf andere Stämme des Influenzavirus angewendet werden, um die universelle Population über Stämme hinweg sowie andere Viren und ihre Fähigkeit, angeborene T-Zell-Populationen zu aktivieren, herauszukitzeln. Darüber hinaus kann das Nachweispanel auch entsprechend der angeborenen Immunzellpopulation von Interesse angepasst werden, um ihre jeweilige Aktivierung unter Co-Kulturbedingungen mit infizierten Epithelzellen zu beobachten.

Figure 1
Abbildung 1: hNESPCs, die 2/5/10 Tage nach der Aussaat auf einer 3T3-Feederschicht gezüchtet werden. Tag 2: Beachten Sie die Inseln von hNESPCs (ein Beispiel ist mit einem weißen Pfeil abgegrenzt), die 2 Tage nach der Aussaat auf der 3T3-Feederschicht beobachtet werden sollten. Tag 5: Die an Tag 2 beobachteten Inseln sollten jetzt größer sein (Beispiele für Inseln von hNESPCs sind durch grüne Kreise abgegrenzt), und die 3T3-Schicht sollte als degeneriert beobachtet werden. Tag 10: Die hNECPS sollten die gesamte Platte dominieren, wobei wenig oder keine 3T3-Zellen sichtbar sind. Skalenbalken für Tag 2 und Tag 5 = 50 μm basierend auf einer Vergrößerung von 200x, Skalenbalken für Tag 10 = 100 μm basierend auf einer Vergrößerung von 100x. Abkürzung: hNESPCs = humane Nasenepithelstamm-/Vorläuferzellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Bohrlochdiagramme für Membraneinsätze in 24-Well- und 12-Well-Platten. Notieren Sie sich das mittlere Volumen, das für jedes Fach verwendet werden soll. hNESPCs werden in den apikalen Kammern der Membraneinsätze ausgesät. Abkürzung: hNESPCs = humane Nasenepithelstamm-/Vorläuferzellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Bohrlochdiagramme für Membraneinsätze in 24-Well- und 12-Well-Platten für die ALI-Kokultur-Etablierung. Notieren Sie sich das mittlere Volumen, das für jedes Fach verwendet werden soll. Beachten Sie die Unterschiede im mittleren Volumen, die für die verschiedenen Intervalle (2 Tage/3 Tage) zwischen den mittleren Änderungen zu verwenden sind. Abkürzung: ALI = Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: β4-Tubulin und MUC5AC ko-Färbung einer hNEC-Schicht. β4-Tubulin ist grün gefärbt, während MUC5AC rot gefärbt ist. Die Kerne sind mit DAPI blau gefärbt. MUC5AC zeigt das Vorhandensein von schleimproduzierenden Kelchzellen an, während β4-Tubulin das Vorhandensein von Zilien auf Flimmerzellen anzeigt. Maßstabsleiste = 20 μm basierend auf 600-facher Vergrößerung. Abkürzungen: hNEC = humane Nasenepithelzelle; MUC5AC = Mucin 5AC; DAPI = 4′,6-Diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5: Repräsentative Ergebnisse von PBMCs, die mit oder ohne Nasenepithel oder Influenza-infiziertes Epithel für 24 h inkubiert wurden. Die Aktivierung von MAIT-, Vδ1-T-Zellen, Vδ2-T-Zellen und NK-Zellen wurde durch zelltypspezifische Marker bestimmt, einschließlich Vα 7.2 TCR, Vδ1 TCR, Vδ2 TCR, CD56 und CD69-Färbung. Die Werte über den Toren geben den Prozentsatz der CD69-positiven Zellen an. Abkürzungen: PBMCs = periphere mononukleäre Blutzellen; Epith = Nasenepithel; FLU-Epith = Influenza-infiziertes Epithel; MAIT = mukosal-assoziierte invariante T-Zellen; NK = natürlicher Killer; TCR = T-Zell-Rezeptor; CD = Cluster der Differenzierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Mittel Rezept Zusammensetzung Kommentare
Mittel 3 DMEM/Nährstoffmischung F-12 500 ml
Menschlicher epithelialer Wachstumsfaktor 5 ng/ml
Insulin 2,5 μg/ml
Cholera-Toxin 0,1 nM
Hydrocortison 0,5 μg/ml
3,3',5-Trijod-L-Thyronin 2 nM
N-2 Ergänzung 5 ml 10 μL/ml
Antibiotikum-Antimykotikum 5 ml
Differenzierungsmedien PneumaCult-ALI Basalmedium 441 ml
PneumaCult-ALI 10x Ergänzung 50 ml
Hydrocortison-Lösung (200x) 2,5 ml
0,2% (2 mg/ml; 1000 I.E./ml) Heparin-Natriumsalz in phosphatgepufferter Kochsalzlösung 1 ml
Antibiotika-Antimykotikum (100x) 5 ml
PneumaCult-ALI Erhaltungsergänzung (100x) 500 μL Nur direkt vor Gebrauch hinzuzufügen
Vervollständigen Sie das Minimal Essential Medium (DMEM) von Dulbecco DMEM/Hohe Glukose 450 ml
Hitzeinaktiviertes fetales Rinderserum 50 ml
Antibiotika-Antimykotikum (100x) 5 ml
Komplettes Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Mittel RPMI 1640 (w L-Glutamin) 445 ml
Hitzeinaktiviertes fetales Rinderserum 50 ml
Antibiotika-Antimykotikum (100x) 5 ml
Komplettes Eagle's Minimal Essential Medium (EMEM) EMEM (w L-Glutamin) 450 ml
Hitzeinaktiviertes fetales Rinderserum 50 ml
Infektionsmedium EMEM (w L-Glutamin) 4 ml
TPCK Trypsin (500 μg/ml) 8 μL Endgültige TPCK-Trypsinkonzentration von 1 μg/ml
Magnetisch aktivierter Zellsortierpuffer 1x PBS 498 ml
0,5 Mio. EDTA 2 ml
BSA (Tissue Culture Grade) 2,5 g
Mitomycin C-Supplementiertes vollständiges DMEM Komplettes DMEM 10 ml
Mitomycin C 500 μL Mitomycin C (10 μg/ml)

Tabelle 1: Rezept für verwendete Medien.

Marker für Zelloberflächen Fluorophor
Vδ1-T-Zell-Rezeptor (TCR) Fluoresceinisothiocyanat (FITC)
Vδ2 TCR Peridinin-Cholorphyll-Protein (PerCP)
CD3 V500
CD8 Allophycocyanin-Cyanin 7 Farbstoff (APC-Cy7)
CD14 Phycoerythrin (PE)-CF594
CD56 Phycoerythrin (PE)-Cyanin 7 (Cy7)
CD69 Brillantes Violett 421 (BV421)
CD83 Allophycocyanin (APC)
CD161 Brilliant Violet 605 (BV605)
Vα 7,2 Phycoerythrin (PE)
CD38 Brilliant UltraViolet 395 (BUV395)

Tabelle 2: Marker für die Probenoberflächenfärbung

qPCR-Reaktionsmischung qPCR Master Mix 5 μL
Nukleasefreies Wasser 3 μL
Vorwärts-Primer (1 mM) 0,5 μL
Reverse Primer (1 mM) 0,5 μL
cDNA (12,5 ng/μL) 1 μL
Gesamtes Reaktionsvolumen 10 μL
RT-PCR-Reaktionsmischung RT-PCR 5x Puffer 2,5 μL
Zufällige Primer (500 ng/μL) 0,2 μL
RNase-Inhibitor 0,625 μL
dNTP-Mischung 2,5 μL
Reverse Transkriptase 0,5 μL
RNA (200 ng/μL) 1 μL
Nukleasefreies Wasser 12,675 μL
Gesamtes Reaktionsvolumen 20 μL

Tabelle 3: Rezeptur für Reaktionsmischungen der Reverse-Transkriptionspolymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) und der quantitativen PCR (qPCR).

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Discussion

Angeborene Immunantworten gegen Viren sind ein wenig erforschtes Forschungsgebiet im antiviralen Management. Die Epithelzellen der Atemwege und die angeborenen Immunzellen arbeiten zusammen, um die Virusreplikation während einer Infektion zu unterdrücken, und dienen nicht nur als Determinante der überaktiven adaptiven Reaktion, wenn die Viruslast nicht in Schach gehaltenwird 12,13,17. Die Entwicklung eines relevanten Humanmodells für die Untersuchung des epithelial-angeborenen Immun-Crosstalks zur Untersuchung der Aktivierung angeborener Immunzellen zur Vermittlung einer angemessenen antiviralen Reaktion bleibt jedoch eine Herausforderung. Daher stellt dieses ALI-Kokulturmodell eine vielseitige Technik dar, mit der eine ganze Reihe von Wechselwirkungen zwischen der Nasenepithelschicht und den Immunzellen beurteilt werden können. Da dieses Modell in-vitro-differenzierte hNECs, PBMC-Aktivierungsanalyse über Durchflusszytometrie und Virusinfektionen kombiniert, wurden viele der entscheidenden Schritte klar abgegrenzt, um den Erfolg dieses Protokolls sicherzustellen. Darüber hinaus können auch weitere Modifikationen an dem Teil der Atemwege vorgenommen werden, an dem In-vitro-differenzierte Zellen sowohl aus den oberen als auch aus den unteren Atemwegen verwendet werden können, was dem Protokoll eine weitere Vielseitigkeitsebene verleiht.

Bei der Arbeit mit Epithel-Immunzell-Crosstalk bei Virusinfektionen ist es jedoch wichtig, dass die Viren nicht direkt mit den PBMCs interagieren, um frühe lokale epitheliale lösliche Faktoren zu identifizieren, die von den hNECs freigesetzt werden. Daher eignet sich dieses Modell besser für die Untersuchung von Viren mit polarisierter Virusfreisetzung, wobei Viren nur aus der apikalen Oberfläche in die apikale Kammer austreten, z.B. Influenzaviren12 und SARS-CoV-2-Virus19. Um das Austreten von apikalfreisetzenden Viren in die Basalkammer zu verhindern, die das Experiment beeinträchtigt, ist eine intakte Epithelschicht von ausreichender Dicke unerlässlich. Daher ist es wichtig, dass TEER-Messung und virale RNA-Quantifizierung durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass die Ergebnisse frei von viralen Leckagen in die Basalkammer13,16,20 sind. Ein TEER-Wert von >1000 impliziert eine intakte Multischicht von Zellen, die für Viren mit polarisierter Freisetzung geeignet sind; die basalen Medien sollten frei von viraler RNA-Kontaminationsein 13,15,16. Der Nutzen des Modells für bidirektionale Freisetzungsviren, wie Rhinoviren, muss jedoch noch untersuchtwerden 16. Solche Viren sind nicht darauf beschränkt, ihre Nachkommen polarisiert freizusetzen und können bidirektional neue Viren sowohl in apikale als auch in basale Regionen des Epithels freisetzen. Weitere Optimierungen sind erforderlich, bevor dieses Modell auf Viren mit nicht polarisierter Freisetzung angewendet werden kann.

Da dieses Protokoll die Arbeit mit menschlichen Proben von verschiedenen Individuen beinhaltet, zeigen keine zwei Proben von hNECs die gleichen Eigenschaften und Reaktionen12,16. Beispielsweise könnte sich die Viskosität des Schleims, der durch die enddifferenzierte hNEC-Schicht erzeugt wird, stark unterscheiden. Die Geschwindigkeit der Zilienentwicklung kann auch unterschiedlich sein. Es ist daher wichtig, bei der Einhaltung der in diesem Protokoll festgelegten Leitlinien ein gewisses Maß an Flexibilität walten zu lassen. Während es sicherlich möglich ist, Epithelzelllinien zu verwenden, würde dies die Komplexität (Schleim, Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Zelltypen) der Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen Zelltypen der Epithelschicht beseitigen, was ideal für die Untersuchung wäre, wie epitheliales Übersprechen die Reaktionen der PBMCs beeinflusst. Eine primäre Zelllinie ist notwendig, um die Physiologie des Nasengewebes nachzuahmen, wo die Zellen mehrschichtig sind und die verschiedenen Zelltypen in ihrer eigenen individuellen Nische lokalisiert sind, obwohl Variabilität ein Problem sein könnte. Die Variabilität in dieser Hinsicht kann durch die Verwendung der Einzelzell-RNA-Sequenzierung zur Differenzierung und Trennung der heterogenen Zellpopulation überwunden werden.

Die Arten von Interaktionen, die bewertet werden können, sind in der Tat durch die Herkunft der PBMCs und der hNECs begrenzt. Wenn die PBMCs und hNECs von verschiedenen Spendern bezogen werden, ist die Gewährleistung der epithelialen Integrität und Trennung von entscheidender Bedeutung. Wenn PBMCs mit hNECs in Kontakt kommen, können allogene Immunreaktionen auftreten. Daher sind die einzigen Wechselwirkungen, die relevant sind, Wechselwirkungen, die durch lösliche Faktoren vermittelt werden, die die Membraneinsätze passieren können, wie im obigen Protokoll beschrieben. Wenn jedoch beide Zellpopulationen von demselben Individuum stammen, hat dieses Modell eine zusätzliche Nutzenschicht, da konventionelle Immunzellreaktionen zwischen den hNECs und der PBMC-Population nun bewertet werden können, einschließlich T-Zell-vermittelter Zytotoxizität und Antikörper-vermittelter Reaktionen. Darüber hinaus können epigenetische Studien durchgeführt werden, um zu untersuchen, wie sich Modifikationen am Genom auf Zytokingen/Proteinexpression/Sekretion auswirken können.

Darüber hinaus können der Basalkammer verschiedene Zellpopulationen hinzugefügt werden, um eine bestimmte Population weiter zu untersuchen. Dies kann erreicht werden, indem die interessierenden Zellpopulationen (T-Zellen, NK-Zellen, Monozyten) isoliert und anstelle der PBMCs in die Basalkammer eingeführt werden. Dieses Modell kann jedoch nicht verwendet werden, um zelluläre Interaktionen zu untersuchen, die aufgrund der Trennung der beiden Zellpopulationen durch die Membran einen direkten Kontakt erfordern. Daher kann die Untersuchung adaptiver Immunantworten durch dieses Detail eingeschränkt sein. Zusammenfassend bietet dieses ALI-Co-Kultur-Modell einen vielseitigen Ausgangspunkt für die In-vitro-Untersuchung des Crosstalks zwischen Nasengewebe und Immunzellen. Das in diesem Manuskript beschriebene Protokoll versucht, eine Richtlinie bereitzustellen, die auch dann hilfreich ist, wenn die Populationen / Bedingungen geändert werden.

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Disclosures

Alle Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

Acknowledgments

Wir danken den wissenschaftlichen Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern der NUS Abteilung für Hals-Nasen-Ohrenheilkunde und der Abteilung für Mikrobiologie und Immunologie für ihre Hilfe bei der hNEC-Kultur- und Viruskultur-bezogenen Arbeit. Wir möchten auch den Chirurgen und dem chirurgischen Team des National University Hospital, Abteilung für HNO-Heilkunde, für ihre Unterstützung bei der Bereitstellung der für die Studie erforderlichen Zell- und Blutproben danken.
Diese Studie wurde vom National Medical Research Council, Singapore No. NMRC/CIRG/1458/2016 (an De Yun Wang) und MOH-OFYIRG19may-0007 (an Kai Sen Tan). Kai Sen Tan erhält Stipendien im Rahmen des European Allergy and Clinical Immunology (EAACI) Research Fellowship 2019.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5% Trypsin-EDTA Gibco 15400-054
0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0, RNase-free Thermofisher AM9260G 0.5M EDTA
1.5 mL SafeLock Tubes Eppendorf 0030120086 1.5mL Centrifuge Tube
10 mL K3EDTA Vacutainer Tubes BD 366643 10mL Blood Collection Tubes
10x dPBS Gibco 14200-075
10x PBS Vivantis PC0711
12-well Plate Corning  3513
12-well Transwell Insert Corning  3460 membrane insert
1x FACS Lysing Solution BD 349202
2.0 mL SafeLock Tubes Eppendorf 0030120094 2 mL centrifuge tube
24-well Plate Corning  3524
24-well Transwell Insert Corning  3470
3% Acetic Acid with Methylene Blue STEMCELL Technologies 07060
3,3',5-triiodo-l-thyronine Sigma T-074
37% Formaldehyde Solution w 15% Methanol as Stabilizer in H2O Sigma 533998
5810R Centrifuge Eppendorf 5811000320
5 mL polypropylene tubes (flow tubes) BD 352058
70 µm Cell Strainer Corning  431751
A-4-62 Rotor Eppendorf 5810709008
Accutase Gibco A1110501 Cell Dissociation Reagent
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240-062
Avicel CL-611 FMC Biopolymer NA Liquid Overlay
Bio-Plex Manager 6.2 Standard Software Bio-Rad Laboratories, Inc 171STND01 Multiplex Manager Software
Butterfly Needle 21 G BD 367287
Cholera Toxin Sigma C8052
Crystal Violet  Merck C6158
Cytofix/Cytoperm Solution BD 554722 Fixation and Permeabilization Solution
Dispase II Sigma D4693 Neutral Protease
DMEM/High Glucose GE Healthcare Life Sciences SH30243.01
DMEM/Nutrient Mixture F-12 Gibco-Invitrogen 11320033
dNTP Mix Promega U1515 dNTP Mix
EMEM (w L-Glutamine) ATCC 30-2003
EVOM voltohmmeter device WPI, Sarasota, FL, USA 300523
FACS Lysing Solution BD 349202 1x Lysing Solution
Falcon tube 15 mL CellStar 188271 15 mL tube
Falcon tube 50 mL CellStar 227261 50 mL Tube
Fast Start Essential DNA Probes Master Roche 6402682001 qPCR Master Mix
Ficoll Paque Premium Research Instruments 17544203 Density Gradient Media
H3N2 (A/Aichi/2/1968)  ATCC VR547
H3N2 M1 Forward Primer Sequence Sigma 5'- ATGGTTCTGGCCAGCACTAC-3'
H3N2 M1 Reverse Primer Sequence Sigma 5'- ATCTGCACCCCCATTCGTTT-3'
H3N2 NS1 Forward Primer Sequence Sigma 5'- ACCCGTGTTGGAAAGCAGAT-3'
H3N2 NS1 Reverse Primer Sequence Sigma 5'- CCTCTTCGGTGAAAGCCCTT-3'
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Gibco 10500-064
hNESPCs Human Donors NA
Human Epithelial Growth Factor Gibco-Invitrogen PHG0314
Hydrocortisone STEMCELL Techonologies 7925 Collected from nasal biopsies during septal deviation surgeries
Insulin Sigma I3536
Lightcycler 96 Roche 5815916001 qPCR Instrument
Live/DEAD Blue Cell Stain Kit *for UV Excitation Thermofisher L23105 Viability Stain
MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel II - Premixed 23 Plex Merck Pte Ltd HCP2MAG-62K-PX23 Immunology Multiplex Assay
Mitomycin C Sigma M4287
M-MLV 5x Buffer Promega M1705 RT-PCR 5x Buffer
M-MLV Reverse Transcriptase Promega M1706 Reverse Transcriptase
N-2 supplement Gibco-Invitrogen 17502-048
NIH/3T3 ATCC CRL1658
Perm/Wash Buffer BD 554723 Permeabilization Wash Buffer
PneumaCult-ALI 10x Supplement STEMCELL Techonologies 5001
PneumaCult-ALI Basal Medium STEMCELL Techonologies 5001
PneumaCult-ALI Maintenance Supplement (100x) STEMCELL Techonologies 5001
Random Primers Promega C1181 Random Primers
Recombinant Rnasin Rnase Inhibitor Promega N2511 RNase Inhibitor
RNA Lysis Buffer Qiagen Part of 52904
RPMI 1640 (w L-Glutamine) ATCC 30-2001
STX2 electrodes WPI, Sarasota, FL, USA STX2 Electrode
T25 Flask Corning 430639
T75 Flask Corning 430641U
TPCK Trypsin Sigma T1426
Trypan Blue Hyclone SV30084.01
Viral RNA Extraction Kit Qiagen 52904 Viral RNA Extraction Kit
V-Shaped 96-well Plate Corning 3894

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Immunologie und Infektion Ausgabe 168 Co-Kultur menschliche Nasenepithelzellen angeborene Immunzellen angeborene T-Zellen Atemwegsvirus Influenza Zytokine Durchflusszytometrie
Kontaktfreies Co-Kultur-Modell zur Untersuchung der angeborenen Immunzellaktivierung während einer Infektion mit respiratorischen Viren
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