Kontaktfri samodlingsmodell för studier av medfödd immuncellsaktivering under luftvägsvirusinfektion

Summary

Detta protokoll beskriver en undersökning av de tidiga interaktionerna mellan viralt infekterade nasala epitelceller och medfödd cellaktivering. Individuella delmängder av immunceller kan särskiljas baserat på deras aktivering som svar på virusinfektioner. De kan sedan undersökas ytterligare för att bestämma deras effekter på tidiga antivirala svar.

Abstract

De tidiga interaktionerna mellan det nasala epitelskiktet och de medfödda immuncellerna under virusinfektioner är fortfarande ett underutforskat område. Betydelsen av medfödd immunitetssignalering vid virusinfektioner har ökat avsevärt eftersom patienter med luftvägsinfektioner som uppvisar hög medfödd T-cellaktivering visar ett bättre sjukdomsutfall. Därför möjliggör dissekering av dessa tidiga medfödda immuninteraktioner att belysa de processer som styr dem och kan underlätta utvecklingen av potentiella terapeutiska mål och strategier för att dämpa eller till och med förhindra tidig progression av virusinfektioner. Detta protokoll beskriver en mångsidig modell som kan användas för att studera tidig överhörning, interaktioner och aktivering av medfödda immunceller från faktorer som utsöndras av viralt infekterade luftvägsepitelceller. Med hjälp av ett H3N2-influensavirus (A/Aichi/2/1968) som representativ virusmodell har medfödd cellaktivering av samkullade mononukleära blodceller (PBMC) analyserats med hjälp av flödescytometri för att undersöka delmängderna av celler som aktiveras av de lösliga faktorer som frigörs från epitelet som svar på virusinfektionen. Resultaten visar gatingstrategin för att differentiera delmängderna av celler och avslöjar de tydliga skillnaderna mellan de aktiverade populationerna av PBMC och deras överhörning med kontroll- och infekterat epitel. De aktiverade delmängderna kan sedan analyseras ytterligare för att bestämma deras funktioner såväl som molekylära förändringar som är specifika för cellerna. Resultat från en sådan överhörningsundersökning kan avslöja faktorer som är viktiga för aktiveringen av vitala medfödda cellpopulationer, som är fördelaktiga för att kontrollera och undertrycka utvecklingen av virusinfektion. Dessutom kan dessa faktorer universellt tillämpas på olika virussjukdomar, särskilt på nya virus, för att dämpa effekterna av sådana virus när de först cirkulerar i naiva mänskliga populationer.

Introduction

Luftvägsvirus är kanske bland de mest utbredda patogenerna som orsakar allvarlig hälso- och sjukvård och ekonomisk börda. Från de periodiska globala utbrotten av nya epidemiska stammar (t.ex. H1N1, H5N1, H3N2, MERS, COVID-19) till säsongsstammarna av influensa varje år är virus ett ständigt hot mot folkhälsan. Även om vacciner utgör huvuddelen av svaret på dessa globala folkhälsoutmaningar, är det nyktert att notera att dessa motåtgärder bara svarar ^1,2. Dessutom är en fördröjning mellan uppkomsten av en ny smittsam stam och den framgångsrika utvecklingen av dess vaccin oundviklig³, vilket leder till en period då tillgängliga åtgärder för att begränsa spridningen av viruset är mycket begränsade.

Dessa förseningar understryks ytterligare av de kostnader som åsamkas samhället ekonomiskt och socialt. Säsongsinfluensan ensam är ansvarig för cirka 8 miljarder dollar i indirekta kostnader, 3,2 miljarder dollar i medicinska kostnader och 36,3 tusen dödsfall i USA årligen⁴. Detta är före övervägande av de forskningskostnader som är nödvändiga för att finansiera vaccinutveckling. Epidemiska utbrott har ännu allvarligare effekter på samhället, förvärras av den ökande globaliseringstakten varje år, vilket framgår av de globala störningar som orsakas av uppkomsten och den snabba spridningen av allvarligt akut respiratoriskt syndrom coronovirus 2 (SARS-CoV-2) ^5,6,7.

Nya studier har visat att infekterade patienter med en större population av aktiverade medfödda T-celler tenderar att ha ett bättre sjukdomsutfall ^8,9,10. Vidare kategoriseras den medfödda T-cellpopulationen i flera undergrupper: de slemhinneassocierade invarianta T-cellerna (MAIT), Vδ1 γδ T-celler, Vδ2 γδ T-celler och de naturliga mördar-T-cellerna (NKT). Dessa undergrupper av medfödda T-celler uppvisar också heterogenitet inom sina populationer, vilket ökar komplexiteten i interaktionerna mellan cellpopulationerna som är involverade i det medfödda immunsvaret¹¹. Därför kan mekanismen som aktiverar dessa medfödda T-celler och kunskapen om de specifika undergrupperna av medfödda T-celler ge en annan forskningsväg för att begränsa de infektiösa effekterna av dessa virus på den mänskliga värden, särskilt under perioden med vaccinutveckling.

Epitelceller infekterade av influensa producerar faktorer som aktiverar medfödda T-celler snabbt 12,13,14. Med utgångspunkt i detta resultat syftar denna kontaktfria air-liquid interface (ALI) samodlingsmodell till att efterlikna de tidiga kemiska interaktionerna (medierade av lösliga faktorer som frigörs av det infekterade epitelskiktet) mellan det infekterade nasala epitelskiktet och PBMC under tidig infektion. Den fysiska separationen mellan det nasala epitelskiktet (odlat på membraninsatser) och PBMC (i kammaren under) och epitelintegriteten förhindrar direkt infektion av PBMC av viruset, vilket möjliggör en detaljerad studie av effekterna av epitel-härledda lösliga faktorer på PBMC: erna. De identifierade faktorerna kan därför undersökas ytterligare för deras terapeutiska potential att inducera lämplig medfödd T-cellspopulation som kan skydda mot influensainfektion. Detta dokument har därför detaljerat metoderna för att upprätta en samkultur för studier av medfödd T-cellaktivering från epitel-härledda lösliga faktorer.

Protocol

OBS: Se tabell 1 för recept av media som används i detta protokoll.
OBS: hNECS som odlas på 12-brunns transwell har visat sig växa till mer optimal tjocklek för lösliga faktorer för att lätt nå basalkammaren när de smittas med influensavirus. Därför rekommenderas användning av 12-välstor transwell för samkultur.

1. Upprättande av matarskiktet 3T3

1. Etablering från frysta lager
   1. Tina en kryovial av NIH / 3T3 fibroblaster från frysta lager. Tillsätt innehållet i kryovialen till 2 ml komplett Dulbeccos Minimal Essential Media (DMEM) och återsuspendera cellerna.
   2. Centrifug i 5 min vid 300 × g och rumstemperatur/tryck (rtp) och ta bort supernatanten. Resuspendera cellerna i fullständig DMEM.
   3. Räkna cellerna med trypanblå färgning. Tillsätt 10 μL trypanblått till 10 μL av den återsuspenderade cellsuspensionen. Blanda noggrant och tillsätt 10 μL av suspensionen till en hemocytometer för att räkna cellerna.
   4. Fröceller med en densitet av 1 × 10⁴ celler/cm² i en lämplig odlingsskål (t.ex. T75-kolv). Inkubera den resulterande odlingskolven i 3 dagar vid 37 °C i en 5 %_{CO2-atmosfär} .
2. Mitomycin C-behandling
   1. Vid 3 dagar, se till att sammanflödet är 60% -80%, ta bort mediet och tvätta cellerna med 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
      OBS: Det är viktigt att 3T3-matarskiktet inte når full sammanflöde; Annars kommer mitomycin C-behandlingen inte att vara effektiv.
   2. Tillsätt mitomycin C-kompletterat komplett DMEM i kolven och inkubera i 3,5 timmar vid 37 °C i en 5 %_{CO2-atmosfär} . Ta bort det mitomycin C-innehållande mediet och tvätta cellerna 2x med 1x PBS.
3. Sådd av 3T3-celler i 6-brunnsplattor
   1. Tillsätt 3 ml 1x trypsin-EDTA till kolven i 3-5 minuter för att koppla bort cellerna. Samla de disassocierade cellerna i ett nytt 15 ml rör. Centrifugera 15 ml-röret i 5 minuter vid 300 × g, rtp; kassera supernatanten. Resuspendera cellerna i fullständig DMEM.
   2. Räkna cellerna med trypanblå färgning. Frö cellerna i en 6-brunnsplatta vid 7,5 × 10 5-2,5 × 10⁶ celler / brunn. Inkubera plattan över natten vid 37 ° C i en 5% CO_2-atmosfär.
      OBS: 3T3-matarskiktet anses vara klart om cellerna är friska. Vid denna tidpunkt frö de mänskliga nasala epiteliala stam- / stamcellerna (hNESPC) på matarskiktet för expansion.
   3. Tillsätt komplett DMEM i kolven och inkubera vid 37 ° C, 5% CO² över natten för 3T3-celler för att återhämta sig från mitomycin C-behandling.

2. Etablering av human nasal epitelcellskultur (hNEC)

OBS: Kliniska prover ska erhållas från patienter som är fria från symtom på övre luftvägsinfektion.

1. Bearbetning av näsvävnad till encellssuspension
   1. Tvätta näsvävnad i 1x Dulbeccos PBS (dPBS) (PBS utan Mg²⁺ och Ca²⁺) innehållande 100 μL/ml av en antibiotika-antimykotisk blandning. Skär vävnaden i små fragment och behandla provet i 10 mg/ml av ett neutralt proteas över natten vid 4 °C med skakningar.
   2. Centrifug i 5 min vid 200 × g och avlägsna supernatanten efter centrifugering. Inkubera pelletsen i 1-2 ml 1x trypsin-EDTA (37 ° C, 15 min) och släck genom att tillsätta en volym fetalt bovint serum lika med 10% av volymen i röret.
   3. Mekaniskt dissociera den smälta vävnaden i encellsaggregat genom pipettering och passera sedan den resulterande suspensionen genom en 70 μm cellsil. Resuspendera cellerna i fullständig DMEM.
      OBS: Efter detta steg är cellsuspensionen en blandning av terminalt differentierade celler och stamceller som kallas humana nasala epiteliala stam- / stamceller (hNESPC). Målet med de efterföljande stegen är att välja ut och berika hNESPC-populationen från blandningen av olika cellpopulationer.
2. Sådd av en encellig suspension på 3T3-matarskiktet för val av hNESPC
   1. Centrifugera cellsuspensionen från steg 2.1.3 (300 × g, 5 min, rtp) och ta bort supernatanten. Resuspendera cellerna i 3-5 ml medium 3.
      OBS: Medium 3 är formulerad för att främja den selektiva tillväxten av hNESPC.
   2. Räkna cellerna via trypanblå färgning. Frö 1 x 10⁶ celler i 2 ml medium 3 per brunn på 6-brunnsplatta innehållande beredd 3T3 matarskikt efter avlägsnande av mediet i 6-brunnsplattan. Inkubera den resulterande samkulturen vid 37 ° C i en 5% CO_2-atmosfär .
      OBS: Efter sådd, var försiktig så att du inte agiterar plattan eftersom det kommer att påverka fastsättningen av hNESPC: erna.
   3. Byt medium 3 (2 ml) var 2-4: e dag genom att ta bort det gamla mediet helt och ersätta det med färskt medium 3.
      OBS: Medium ändras för att fylla på näringsämnen och för att förhindra alltför sura förhållanden från att negativt påverka tillväxten av hNESPC. Intervallet mellan varje mediumförändring beror på hur surt (gult) mediet blir. Intervallen bör förkortas om mediet snabbt blir surt.
   4. Efter 7-10 dagar, observera att hNESPC har en sammanflöde som är lämplig för överföring av dem till membraninsatser. Se figur 1 för representativ morfologi för hNESPC vid 3 olika tidpunkter (2 dagar, 5 dagar och 10 dagar).
3. Överföring av hNESPC till membraninsatser
   OBS: På grund av mitomycin C-behandlingen kommer 3T3-matarskiktet långsamt att brytas ned under hNESPC-expansionsperioden. Detta kommer att resultera i en försvagad vidhäftning till brunnens yta, vilket gör att de lossnar genom att spola med en pipett och lämnar endast de friska hNESPC: erna.
   1. Ta bort mediet och tillsätt 500 μL 1x dPBS till varje brunn. Spola cellerna 3x med en mikropipett för att lossa 3T3-cellerna och kassera 1x dPBS. Observera under mikroskopet att de runda hNESPC: erna förblir medan det spindelformade 3T3-matarskiktet lossnar.
   2. Tillsätt 500 μL av ett celldisassociationsreagens per brunn och inkubera vid 37 °C i en 5 %_{CO2-atmosfär} i 5–10 minuter, eller tills hNESPC:erna har lossnat från brunnsytan.
   3. Samla hNESPC-suspensionen, centrifugen (300 × g, 5 min, rtp) och ta bort supernatanten.
   4. Resuspend pelletsen i medium 3. Räkna cellerna via trypanblå färgning. Frö 3 × 10⁴ celler i 150 μL medium 3 per membraninsats (24-brunnsplatta) eller 1 × 10⁵ celler i 300 μL medium 3 per membraninsats (12-brunnsplatta) (Figur 2). Inkubera cellerna vid 37 ° C i en 5% CO_2-atmosfär .
   5. Byt mediet (medium 3) i apikala och basala kamrarna varannan dag. Navigera i en pipettspets mellan membranets stödarmar för att komma åt basalkammaren, ta bort det gamla mediet och återinför sedan nytt medium med samma metod. Även om apikalkammaren är lättillgänglig, var försiktig så att du inte stör det växande hNESPC-skiktet.
      OBS: Stör inte mediet i apikalkammaren i minst 2 dagar efter sådd eftersom cellerna behöver tid att fästa vid membranet.
4. Differentiering av hNESPC i hNC
   1. När hNESPC når 100% sammanflöde (cirka 3-7 dagar från sådd på membraninsatsen), starta ALI-kulturen. Byt basalmediet till differentieringsmedium och ta bort mediet från apikalkammaren. Tillsätt endast medium till basalkammaren utan att lägga till det i apikalkammaren när du byter medium var 2-3: e dag, vilket anges i figur 3 och steg 2.3.5.
      OBS: Medium ändras till differentieringsmedium för att främja differentieringen av hNESPC till hNECs i ALI. HNESPC: erna tar ungefär 3-4 veckor att nå full mognad för att bli hNECs i ALI, vid vilken tidpunkt cellerna skulle ha vuxit till ett flerskikt med olika populationer av celler i varje lager. Cilia bör också observeras vid en förstoring av 400x (cilia kan identifieras genom deras slagrörelse, vilket gör att mikroskopfältet verkar som om det vibrerar). Vid denna tidpunkt är cellerna redo att användas för samodlingsexperimenten. Se figur 4 för tvärsnittet av ett helt differentierat hNEC-skikt.
   2. Efter att ha erhållit mogna hNC, tvätta cellerna i apikalkammaren 3x med 1x dPBS med 2-3 dagars mellanrum i 1 vecka före samodlingsexperimentet. Synergisera tvättsteget med de basala medieförändringarna och utför tvättarna enligt följande.
      1. Tillsätt 50 μL (24-brunn)/150 μL (12-brunn) 1x dPBS i den apikala kammaren i membraninsatsen och inkubera cellerna vid 37 °C i 10 min. Ta bort dPBS efter 10 minuters inkubation för att avlägsna ackumulerat slem och döda celler under differentieringsförloppet.
         OBS: Beroende på experimentets natur kan natriumbikarbonatlösning användas för att tvätta bort slemskiktet helt. För virusinfektion i samodlingsexperiment behålls emellertid slemskiktet och endast överskott av slem avlägsnas med dPBS-tvätt. Denna retention är att efterlikna det fysiologiska slemskiktet som finns på näsepitelia som kommer att interagera med den inkommande virusinfektionen.

3. Mätning av transepitelial elektriskt motstånd (TEER)

OBS: Bekräftelse av epitelintegritet är viktigt för att säkerställa att ett intakt och hälsosamt epitelskikt erhålls. Ett intakt epitelskikt bestäms genom TEER-mätning utförd på 4 slumpmässiga brunnar med användning av en voltohmmeter.

1. Skölj elektroden med 70% etanol och sterilisera den med ultraviolett ljus i 15 minuter före användning för att säkerställa sterilitet. Skölj med 1x dPBS efter sterilisering.
2. Tillsätt 100 μL (för 24-brunn) eller 300 μL (för 12-brunn) 1x dPBS till den apikala kammaren i membraninsatsen. Inkubera plattan vid 37 ° C i 10 minuter; ta sedan bort dPBS.
3. För varje brunn som ska mätas, förbered en oanvänd brunn med 1 ml (för 24 brunn) eller 3 ml (för 12 brunn) förvärmt (till 37 ° C) differentieringsmedium. Placera membraninsatsen i den beredda brunnen och tillsätt 200 μL (för 24-brunn) eller 600 μL (för 12-brunn) förvärmt differentieringsmedium till apikalkammaren. Jämvikt vid 37 °C (med förbehåll för inkubationstemperaturen för den typ av virus som tillsätts, t.ex. 35 °C för influensa) i 15 minuter.
   OBS: Förbered ett ämne (tomt membraninsats) på samma sätt för beräkning av TEER.
4. Balansera ett 15 ml rör av förvärmt differentieringsmedium vid samma temperatur i 15 minuter också. Placera elektroderna i 15 ml-röret och slå på voltohmmetern.
   OBS: Vid denna tidpunkt bör avläsningen vara 0 motstånd, eftersom elektroderna är i samma medium. Om någon annan avläsning erhålls, balansera elektroden i 15 ml-röret tills avläsningen är 0.
5. Börja från ämnet, placera elektroderna i varje brunn så att en elektrod är nedsänkt i apikalt kammarmedium och den andra i basalkammarmediet. Spela in avläsningen endast när en konstant avläsning erhålls under en period av minst 5 minuter.
6. Tvätta elektroden med PBS före nästa mätning efter varje mätning. För varje brunn testad, gör mätningar för tre prover vid olika positioner i membranet. För att beräkna netto TEER för varje prov, subtrahera bakgrundsmotståndet, som ges av den tomma membraninsatsen, från varje mätning.
7. Beräkna den totala TEER-avläsningen för en brunn med hjälp av följande ekvation:
   Epitelintegritet (Ωcm²) = Net TEER(ohm) × Area of membrane (cm²)
   TEER-värdena för hNOC för virusinfektionsexperiment bör vara >1000 Ωcm² 13,15,16. 

4. Isolering av perifera blodmonocyter och NK-celler

OBS: Blodprover ska erhållas från friska frivilliga och användas samma dag som isoleringen.

1. Samla 30-40 ml helblod från varje givare i 10 ml bloduppsamlingsrör.
2. Isolera PBMC med hjälp av densitetsgradientcentrifugering och erhåll PBMC från buffybeläggningen efter följande steg (se även materialförteckningen).
   1. Blanda noggrant ~ 10 ml blod från bloduppsamlingsröret i en vacutainer innan du späder med en lika stor volym balanserad saltlösning (PBS).
   2. Tillsätt 15 ml densitetsgradientmedium till basen av ett 50 ml rör.
      OBS: Förhållandet mellan densitetsgradientmedium och utspätt blod bör vara 2: 3-3,5.
   3. Skikt 35 ml utspätt blod på densitetsgradientmediet med en pipettpistol (med dispenseringsinställningen inställd på lägsta möjliga) genom att luta röret med 45 ° och låta det utspädda blodet falla droppvis på rörets innervägg så att skiktet av densitetsgradientmedium inte störs.
   4. Centrifuglysat vid 500 × g, 18–20 °C i 30 min (broms: av). Ta försiktigt bort och kassera det övre plasmaskiktet utan att störa det nedre lagret.
   5. Överför buffybeläggningen till ett nytt rör utan att blanda det röda blodkroppsskiktet, gradientdensitetsmediumskiktet eller buffybeläggningen. När buffybeläggningen har samlats i ett nytt 50 ml rör, fyll på volymen till 50 ml med 1x PBS.
   6. Centrifuglysat vid 800 × g, 18-20 °C, 8 min (broms: av) och ta bort supernatanten med en pipettpistol. Resuspendera cellpelleten med 50 ml 1x PBS och centrifugen vid 120 × g, 18-20 ° C, 10 min för att avlägsna blodplättar.
   7. Kassera supernatanten genom pipettering utan att störa cellpelleten.
      OBS: Eftersom cellpelleten kan vara lös är det inte tillrådligt att kasta supernatanten genom att hälla.
   8. Resuspend cellpelleten med komplett RPMI (Roswell Park Memorial Institute) medium. Utför ett cellantal genom att tillsätta 10 μL 3% ättiksyra med metylenblått till 10 μL av den resuspenderade cellsuspensionen. Blanda noggrant och tillsätt 10 μL av blandningen till en hemocytometer för att räkna cellerna.
3. Späd PBMC med komplett RPMI-medium till en densitet av 2 × 10⁶/ml (för 24-brunn) eller 4 × 10⁶/ml (för 12-brunn).

5. hNEC Virusinfektion och övergång till hNEC: PBMC samodling

OBS: H3N2 (A / Aichi / 2 / 1968) används som den representativa infektionsstammen i detta protokoll. Multiplicitet av infektion (MOI) på 0,1 används som representativ MOI i detta protokoll.

1. Dag 0 (Infektion av hNECs)
   OBS: En brunn från hNECs odlade från samma givare används för att erhålla ett representativt cellantal för varje brunn som används i experimentet.
   1. I den representativa brunnen tillsätt 150 μL 1x trypsin-EDTA till den apikala kammaren i membraninsatsen och 350 μL 1x trypsin-EDTA till basalkammaren och inkubera vid 37 ° C i 10 minuter eller tills cellerna lossnar från membranet.
   2. Spola cellerna på membranet genom pipettering upp och ner och samla suspensionen i ett 1,5 ml centrifugrör. Tillsätt 200 μL fullständig DMEM för att släcka trypsinaktiviteten. Räkna celler via trypanblå färgning för att få cellantalet per brunn.
   3. Beräkna den erforderliga MOI för viruset baserat på cellräkningen per brunn och späd virusstocken i enlighet därefter med fullständig RPMI på is.
      OBS: MOI 0,1 av 1,26 × 10⁶ hNOC per brunn = 1,26 × 10⁵ H3N2-viruspartiklar per brunn i 30 μL (för 24-brunn)/100 μL (för 12-brunn)
   4. För de återstående brunnarna för infektionsexperimentet, tillsätt 50 μL (för 24-brunn)/150 μL (för 12-brunn) 1x dPBS i de apikala kamrarna i membraninsatserna, inkubera vid 37 ° C i 10 min och ta bort 1x dPBS.
   5. Byt basalmediet i membraninsatserna till komplett RPMI-medium genom att överföra skären till en ny platta med komplett RPMI tillsatt till brunnarna (350 μL (för 24-brunn)/700 μL (för 12-brunn)).
      OBS: När hNESPC helt har differentierats till hNECs är de toleranta / tillåtande mot olika medier i upp till 72 timmar, utan några förändringar i morfologi eller organisation när mediet byts till RPMI¹². RPMI används för att stödja tillväxten och underhållet av PBMC-befolkningen.
   6. Tillsätt den beredda 30 μL (för 24-brunn)/100 μL (för 12-brunn) av virusympningen i membraninsatsens apikala kammare, inkubera vid 35 °C i en 5%_{CO2-atmosfär} i 1 timme och avlägsna virusokulumet från apikalkammaren.
   7. Byt basalmediet för membraninsats till färskt komplett RPMI-medium och inkubera vid 35 °C i en 5 %_{CO2-atmosfär} i 24 timmar.
2. Dag 1 (etablering av hNC + PBMC samkultur)
   1. Frö det erforderliga antalet PBMC i 150 μL (för 24-brunn)/300 μL (för 12-brunn) av komplett RPMI-medium genom att direkt tillsätta PBMC-suspensionen i basalkammaren i varje brunn av oinfekterade eller infekterade hNEC från dag 0 (1,5 × 10⁶ för 24-brunnsplattor och 3 × 10⁶ för 12-brunnsplattor). Inkubera vid 37 ° C i 24/48 timmar.
      OBS: Den slutliga volymen i basalkammaren efter upprättandet av samkulturen är 500 μL (för 24-brunn)/1000 μL (för 12-brunn).
3. Dag 2-3 (skörd av PBMC 48/72 h postviral infektion)
   1. Samling av apikala supernatanter (48/72 h postviral infektion)
      1. Tillsätt 50 μL (för 24-brunn)/150 μL (för 12-brunn) 1x dPBS till varje apikal kammare och inkubera vid 37 °C i 10 min. Samla 1x dPBS i 1,5 ml rör. Alikvot 25 μL (för 24-brunn)/50 μL (för 12-brunn) av supernatanten för plackanalys i ett nytt 1,5 ml rör och frys omedelbart både beståndet och alikvoterna vid -80 °C.
   2. Insamling av cellulärt RNA från hNC (48/72 h postviral infektion)
      1. Överför membraninsatsen till en ren brunn, tillsätt 300 μL (för 24-brunn)/600 μL (för 12-brunn) RNA-lysbuffert till apikalkammaren och inkubera vid rtp i 5 min. Samla supernatanten i ett 1,5 ml centrifugrör och förvara den vid -80 ° C tills RNA-extraktion för molekylär analys.
   3. Skörd av PBMC (48/72 h postviral infektion)
      1. Skrapa försiktigt brunnens yta med den breda basen av en steril pipettspets för att lossa de aktiverade PBMC: erna som kan vara vidhäftande mot brunnsytan. Samla basalmediet som innehåller PBMC i ett 2 ml centrifugrör.
      2. Spola brunnarna 2x med 300 μL 1x dPBS och samla tvätten i samma 2 ml rör. Centrifugera 2 ml-röret (500 × g, 5 min, rtp) och samla supernatanten i ett nytt 2 ml rör utan att störa cellpelleten. Förvara supernatanten vid -80 °C för cytokin- och kemokinanalys. återsuspendera cellpelleten i 200 μL 1x dPBS.

6. Flödescytometri

OBS: Detta avsnitt av protokollet fortsätter direkt från föregående avsnitt med PBMC-cellsuspensionen från steg 5.3.3.2. Säkerställ minimal ljusexponering under följande steg i det här avsnittet. En provpanel med ytfärgningsmarkörer finns i tabell 2.

1. Ytfärgning
   1. Överför den återsuspenderade PBMC-cellpelleten till en 96-V bottenbrunnsplatta. Centrifuglysat vid 800 × g i 3 min och ta bort supernatanten.
   2. Inkubera alla PBMC (förutom de "ofärgade") med 100 μL av en livskraftsfläck i 15 min vid rtp. Fyll på upp till 200 μL med 150 μL magnetisk aktiverad cellsorteringsbuffert (MACS). Centrifuglysat vid 800 × g i 3 minuter och kassera supernatanten.
   3. Förbered en panel med ytfärgningsantikroppar av intresse med lämpliga utspädningsförhållanden och en slutlig volym på 50 μL per reaktion (fyll på med MACS-buffert för att erhålla den slutliga volymen). Utför ytfärgning genom att tillsätta 50 μL av den beredda antikroppsblandningen till cellerna med hjälp av en flerkanalig pipett. Inkubera vid 4 ° C i 15 min i mörkret.
   4. Tvätta genom att tillsätta 150 μL MACS-buffert. Centrifuglysat vid 800 × g i 3 minuter och kassera supernatanten. Om intracellulär färgning inte krävs, fortsätt direkt till 15 minuters inkubation i steg 6.3.
2. Intracellulär färgning (vid behov)
   1. Tillsätt 100 μL av en fixerings- och permeabiliseringslösning till varje brunn. Inkubera vid 4 ° C i 20 min i mörkret. Fyll på brunnarna med 100 μL 1x MACS-buffert.
   2. Centrifug (800 × g, 3 min, 25 °C) och ta bort supernatanten. Upprepa tvätten genom att tillsätta 200 μL 1x Permeabilization Wash buffert. Centrifug (500 × g, 3 min, 25 °C) och avlägsna supernatanten.
   3. Förbered utspädningarna för antikroppspanelen av intresse för att uppnå en slutlig volym på 50 μL med 1x Permeabilization Wash buffert. Inkubera på is i 30 min i mörkret. Tillsätt 200 μL 1x permeabiliseringstvättbuffert.
   4. Centrifugera cellerna (800 × g, 3 min, 4 ° C) och ta bort supernatanten. Resuspendera cellerna i 100 μL fluorescensaktiverad cellsorteringsbuffert.
3. Pipett 200 μL av en lyslösning i varje brunn. Inkubera i 15 min vid rtp. Centrifuglysat vid 800 × g i 3 min och kassera supernatanten.
4. Resuspend cellpellets i 200 μL MACS-buffert. Utför flödescytometri i enlighet med de inställningar som beskrivits tidigare¹³, eller förvara vid 4 ° C i mörkret.

7. Bestämning av cytokin- och kemokinnivåer

1. Bearbeta 25 μL av basalkammarsupernatanten med användning av en immunologimultipelanalys enligt tillverkarens protokoll¹⁸.
2. Beräkna koncentrationen av varje analyt med hjälp av multiplexhanteringsprogramvara med hjälp av en kurvpassningsalgoritm (5 parametrar) för standardkurvan.

8. Bedömning av viruskontaminering

1. Extrahera viralt RNA med användning av ett extraktionssats på 4 uppsättningar lösningar: stam H3N2-lösningen, MOI 0,1-utspädningen för infektion, 10x seriella utspädningar av MOI 0,1 och basalmediet från proverna (både 48 och 72 h postvirinfektion)¹².
2. Välj icke-strukturell gen (NS1) och matris (M1) som mål för polymeraskedjereaktion (PCR) (se materialförteckningen för primers som används i det representativa experimentet).
3. Utför omvänd transkription-PCR (RT-PCR) (42 ° C, 60 min) för att konvertera viralt RNA till cDNA innan du utför kvantitativ PCR (qPCR) för att mäta NS1- och M1-nivåer som en proxy för viral närvaro och korrelera nivåerna med standardkurvan erhållen från RT-qPCR utförd på 10x seriell utspädning av MOI 0.1 alikvoten. Se tabell 3 för reaktionsblandningarnas sammansättning och använd följande villkor: förinkubation vid 95 °C i 10 minuter, följt av en trestegsförstärkning i 40 cykler: 95 °C för 10 s, 60 °C för 10 s, 72 °C för 30 s. smältkurva: 95 °C för 10 s, 65 °C för 60 s och 97 °C för 1 s.

9. Plackanalys

1. Dag 0: sådd MDCK (Madin Darby Canine Kidney) i 24-brunnsplattor
   1. Ta bort mediet från en T75-kolv med sammanflytande MDCK-celler. Tvätta 2x med 1x PBS för att ta bort alla spår av serum. Trypsinisera MDCK-cellerna genom att tillsätta 10 ml trypsin och inkubera vid 37 ° C i en 5% CO_2-atmosfär i 20-30 minuter tills cellerna lossnar.
      OBS: Knacka inte på kolven eftersom det kan leda till klumpning.
   2. Pipettera cellsuspensionen i ett 15 ml rör innehållande 2 ml komplett Eagle's Minimal Essential Medium (EMEM). Centrifug (300 × g, 5 min, rtp) och ta bort supernatanten.
   3. Resuspendera cellerna i 6 ml komplett EMEM. Räkna cellerna med trypanblå färgning.
   4. Späd MDCK-cellsuspensionen till en koncentration av 1 × 10⁵ celler/ml och frö 1 ml av den utspädda suspensionen i varje brunn av en steril 24-brunnsplatta. Inkubera vid 37 °C i en 5 %_{CO2-atmosfär} i 24 timmar för att erhålla ett sammanflytande monolager av MDCK-celler i varje brunn.
2. Dag 1: infektion av MDCK-celler
   1. Förbered infektionsmediet. Ta bort mediet från MDCK-monolagret i 24-brunnsplattan och tvätta 2x med 1x dPBS. För den andra tvätten, lämna PBS i brunnarna medan du förbereder seriella utspädningar av viruset.
   2. Tina virusproverna på is och späd dem seriellt i en 24-brunnsplatta för att uppnå seriella utspädningar från ^10-1 till ^10-6.
      OBS: Som ett exempel, fyll varje brunn i en 24-brunnsplatta med 270 μL infektionsmedium.
   3. Tillsätt 30 μL av virusprovet till den första brunnen i raden. Blanda väl med en ny pipettspets och överför till nästa brunn i raden för att späda provet med 10x. Fortsätt tills ^10-6 utspädning har uppnåtts; utföra steg 9.2.1-9.2.3 för alla virusprover.
   4. Ta bort PBS från MDCK-plattan och infektera i två exemplar med 100 μL av de beredda virusutspädningarna. För kontrollbrunnar, tillsätt 100 μL av infektionsmediet (utan virusprovet). Inkubera vid 35 ° C i en 5% CO_2-atmosfär i 1 timme, skaka plattan för att eliminera torra fläckar var 15: e minut.
   5. Ta bort virusokulumet och tillsätt 1 ml flytande överlägg för varje brunn. Inkubera vid 35 °C i en 5 %_{CO2-atmosfär} i 72 timmar.
3. Dag 4 (72 timmar efter infektion): plackvisualisering
   1. Ta bort vätskeöverlägget och fixera cellerna med 4% formaldehyd i 1x PBS i 1 timme. Ta bort formaldehydlösningen och tvätta en gång med 1x PBS eller destillerat vatten.
   2. Fläcka de fasta cellerna genom att tillsätta 1% kristallviolett lösning i 15 min. Ta bort det kristallvioletta färgämnet och tvätta cellerna med rinnande vatten. Torka plattan vid rtp.
   3. När det är torrt, räkna plack och beräkna virustitern enligt följande formel:
      Antal plack × utspädningsfaktor = Antal plackbildande enheter i 100 μL

Representative Results

Även om konventionella T-celler utgör huvudrepertoaren för adaptivt immunsvar mot virusinfektion för att underlätta viral clearance, arbetar den medfödda T-cellpopulationen över ett bredare spektrum för att undertrycka virusbelastningen för effektiv clearance i ett senare skede. Därför skapar detta protokoll specifikt ett robust tillstånd för att studera medfödda T-celler, deras aktivering och deras funktionella population efter influensainfektion, utan att behöva epitel- och immuncellsprover från samma givare. Detta protokoll kan också tillämpas på andra virus, även om det kan vara begränsat till virus med apikal frisättning, dvs inget virus bör komma in i basalskiktet för att komma i kontakt med PBMC-facket.

Baserat på de representativa resultaten i figur 1 kan detta protokoll hjälpa till att erhålla hNESPC-populationer odlade från en primär cellsuspension i ett 3T3-matarskikt. Figur 1 ger ett urval av den förväntade utvecklingen av hNESPC: erna när de växer på 3T3-matarskiktet. Dessa celler kommer att användas för differentiering i ALI-kulturen för att erhålla flerskiktade hNC, komplett med funktionella cilierade och bägare celler (Figur 4). Med hjälp av hNECs kan medfödd T-cellaktivering undersökas med hjälp av flödescytometri. Resultaten som visas i figur 5 visar detektionen av MAIT-cell-, γδ-T-cell- och NK-cellpopulationer, som ökade signifikant i samodling som involverade hNEC infekterade med influensavirus. Denna inställning kan sedan tillämpas på andra stammar av influensaviruset för att reta ut den universella befolkningen över stammar, liksom andra virus och deras förmåga att aktivera medfödda T-cellpopulationer. Dessutom kan detektionspanelen också anpassas enligt den medfödda immuncellpopulationen av intresse för att observera deras respektive aktivering under samodlingsförhållanden med infekterade epitelceller.

Figur 1: hNESPC odlas på ett 3T3-matarskikt 2/5/10 dagar från sådd. Dag 2: Observera öarna av hNESPC (ett exempel avgränsas med en vit pil) som bör observeras 2 dagar efter sådd på 3T3-matarskiktet. Dag 5: Öarna som observerades på dag 2 bör nu vara större (exempel på öar av hNESPC avgränsas av gröna cirklar), och 3T3-skiktet bör observeras vara degenererande. Dag 10: HNECPS bör dominera hela plattan med små eller inga 3T3-celler synliga. Skalstänger för dag 2 och dag 5 = 50 μm baserat på en förstoring på 200x, skalstång för dag 10 = 100 μm baserat på en förstoring på 100x. Förkortning: hNESPC = humana nasala epitelstam/stamceller. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 2: Brunnsdiagram för membraninsatser i 24-brunns- och 12-brunnsplattor. Notera den medelstora volymen som ska användas för varje fack. hNESPC såddas i de apikala kamrarna i membraninsatserna. Förkortning: hNESPC = humana nasala epitelstam/stamceller. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 3: Brunnsdiagram för membraninsatser i 24-brunns- och 12-brunnsplattor för ALI-samodlingsanläggning. Notera den medelstora volymen som ska användas för varje fack. Observera skillnaderna i medelvolym som ska användas för de olika intervallen (2 dagar/3 dagar) mellan medelstora förändringar. Förkortning: ALI = luft-vätskegränssnitt. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 4: β4-Tubulin och MUC5AC samfläck av ett hNEC-lager. β4-Tubulin är färgat i grönt, medan MUC5AC är färgat i rött. Kärnorna är färgade i blått med DAPI. MUC5AC indikerar närvaron av slemproducerande bägareceller, medan β4-tubulin indikerar närvaron av cilia på cilierade celler. Skalstång = 20 μm baserat på 600x förstoring. Förkortningar: hNEC = human nasal epitelcell; MUC5AC = mucin 5AC; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 5: Representativa resultat av PBMC inkuberade med eller utan nasal epitel eller influensainfekterat epitel i 24 timmar. Aktivering av MAIT-, Vδ1 T-celler, Vδ2 T-celler och NK-celler bestämdes av celltypsspecifika markörer inklusive Vα 7.2 TCR, Vδ1 TCR, Vδ2 TCR, CD56 och CD69-färgning. Värdena ovanför grindarna anger procentandelen CD69-positiva celler. Förkortningar: PBMC = mononukleära celler i perifert blod; Epith = nasal epitel; FLU-Epith = influensainfekterat epitel; MAIT = slemhinneassocierade invarianta T-celler; NK = naturlig mördare; TCR = T-cellreceptor; CD = kluster av differentiering. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Medium	Recept	Sammansättning	Kommentarer
Medel 3	DMEM/näringsblandning F-12	500 ml
	Mänsklig epiteltillväxtfaktor	5 ng/ml
	Insulin	2,5 μg/ml
	Koleratoxin	0,1 nM
	Hydrokortison	0,5 μg/ml
	3,3',5-triiodo-l-tyronin	2 nM
	N-2 tillägg	5 ml	10 μL/ml
	Antibiotisk-antimykotisk	5 ml
Differentiering Media	PneumaCult-ALI basalt medium	441 ml
	PneumaCult-ALI 10x Tillägg	50 ml
	Hydrokortisonlösning (200x)	2,5 ml
	0,2% (2 mg / ml; 1000 IE / ml) heparinnatriumsalt i fosfatbuffrad saltlösning	1 ml
	Antibiotisk-antimykotisk (100x)	5 ml
	PneumaCult-ALI underhållstillägg (100x)	500 μL	Endast för att läggas till strax före användning
Komplett Dulbeccos Minimal Essential Medium (DMEM)	DMEM/Hög glukos	450 ml
	Värmeinaktiverat serum från nötkreatur från fostret	50 ml
	Antibiotisk-antimykotisk (100x)	5 ml
Komplett Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Medium	RPMI 1640 (w L-glutamin)	445 ml
	Värmeinaktiverat serum från nötkreatur från fostret	50 ml
	Antibiotisk-antimykotisk (100x)	5 ml
Komplett Eagles Minimal Essential Medium (EMEM)	EMEM (w L-glutamin)	450 ml
	Värmeinaktiverat serum från nötkreatur från fostret	50 ml
Infektion Medium	EMEM (w L-glutamin)	4 ml
	TPCK Trypsin (500 μg/ml)	8 μL	Slutlig TPCK-trypsinkoncentration på 1 μg/ml
Magnetisk aktiverad cellsorteringsbuffert	1x PBS	498 ml
	0,5 M EDTA	2 ml
	BSA (vävnadsodlingskvalitet)	2,5 g
Mitomycin C-kompletterad komplett DMEM	Komplett DMEM	10 ml
	Mitomycin C	500 μL	Mitomycin C (10 μg/ml)

Tabell 1: Recept för media som används.

Markör för cellyta	Fluorofor
Vδ1 T-cellsreceptor (TCR)	Fluoresceinisotiocyanat (FITC)
Vδ2 TCR	Peridinin-kolorfyll-protein (PerCP)
CD3	V500
CD8	Allophycocyanin-Cyanine 7 färgämne (APC-Cy7)
CD14	Fycoerytrin (PE)-CF594
CD56	Phycoerythrin (PE)-Cyanin 7 (Cy7)
CD69	Lysande violett 421 (BV421)
CD83	Allophycocyanin (APC)
CD161	Lysande violett 605 (BV605)
Vα 7.2	Fycoerytrin (PE)
CD38	Lysande UltraViolet 395 (BUV395)

Tabell 2: Prov på ytfärgningsmarkörer.

qPCR-reaktionsblandning	qPCR Master Mix	5 μL
	Nukleasfritt vatten	3 μL
	Primer framåt (1 mM)	0,5 μL
	Omvänd primer (1 mM)	0,5 μL
	cDNA (12,5 ng/μL)	1 μL
	Total reaktionsvolym	10 μL
RT-PCR-reaktionsblandning	RT-PCR 5x buffert	2,5 μL
	Slumpmässiga primrar (500 ng/μL)	0,2 μL
	RNas-hämmare	0,625 μL
	dNTP-blandning	2,5 μL
	Omvänd transkriptas	0,5 μL
	RNA (200 ng/μL)	1 μL
	Nukleasfritt vatten	12.675 μL
	Total reaktionsvolym	20 μL

Tabell 3: Recept för reaktionsblandningar av omvänd transkriptionspolymeraskedjereaktion (RT-PCR) och kvantitativ PCR (qPCR).

Discussion

Medfödda immunsvar mot virus är ett underunderstuderat studieområde inom antiviral hantering. Luftvägarnas epitelceller och medfödda immunceller arbetar i samförstånd för att undertrycka viral replikation under en infektion, förutom att fungera som en determinant för överaktivt adaptivt svar om virusbelastningen inte hålls i schack 12,13,17. Utvecklingen av en relevant mänsklig modell för studier av epitel-medfödd immunöverhörning för att undersöka aktiveringen av medfödda immunceller för att ge ett lämpligt antiviralt svar är dock fortfarande en utmaning. Därför representerar denna ALI-samodlingsmodell en mångsidig teknik som kan användas för att bedöma en hel mängd interaktioner mellan det nasala epitelskiktet och immuncellerna. Eftersom denna modell kombinerar in vitro-differentierade hNC, PBMC-aktiveringsanalys via flödescytometri och virusinfektion, har många av de avgörande stegen tydligt avgränsats för att säkerställa framgången för detta protokoll. Dessutom kan ytterligare modifiering också göras på den del av luftvägarna som är inblandad där in vitro-differentierade celler från både de övre och nedre luftvägarna kan användas, vilket ger ytterligare ett lager av mångsidighet till protokollet.

Men när man arbetar med epitel-immuncellöverhörning vid virusinfektion är det viktigt att virusen inte interagerar direkt med PBMC: erna för att identifiera tidiga lokala epitel-härledda lösliga faktorer som frigörs av hNC: erna. Därför är denna modell mer lämpad för att undersöka virus med polariserad virusfrisättning, där virus endast knoppas ut från den apikala ytan in i apikalkammaren, t.ex. influensavirus¹² och SARS-CoV-2-virus¹⁹. För att förhindra läckage av apikala frisättningsvirus i basalkammaren som äventyrar experimentet är dessutom ett intakt epitelskikt med tillräcklig tjocklek avgörande. Därför är det viktigt att TEER-mätning och viral RNA-kvantifiering utförs för att säkerställa att resultaten är fria från virusläckage i basalkammaren 13,16,20. En TEER-avläsning av >1000 innebär ett intakt flerskikt av celler som är lämpliga för virus med polariserad frisättning; basalmediet bör vara fritt från viral RNA-kontaminering 13,15,16. Nyttan av modellen för dubbelriktad frisättningsvirus, såsom rhinovirus, återstår dock att undersöka¹⁶. Sådana virus är inte begränsade till att frigöra sin avkomma på ett polariserat sätt och kan dubbelriktat frigöra nya virus i både apikala och basala regioner i epitelet. Ytterligare optimering krävs innan denna modell kan tillämpas på virus med icke-polariserad frisättning.

Eftersom detta protokoll innebär att man arbetar med mänskliga prover från olika individer, kommer inga två prover av hNEC att uppvisa samma egenskaper och svar^12,16. Till exempel kan viskositeten hos slem som produceras av det terminalt differentierade hNEC-skiktet skilja sig mycket. Hastigheten på cilia-utvecklingen kan också vara annorlunda. Det är därför viktigt att utöva en viss flexibilitet när man följer riktlinjerna i detta protokoll. Även om det verkligen är möjligt att använda epitelcellinjer, skulle detta ta bort komplexiteten (slem, interaktioner mellan olika celltyper) av interaktionerna mellan de olika celltyperna i epitelskiktet, vilket skulle vara idealiskt för undersökning av hur epitelöverhörning påverkar PBMC: s svar. En primär cellinje är nödvändig för att efterlikna näsvävnadernas fysiologi, där cellerna är flerskiktade och de olika celltyperna är lokaliserade till sin egen individuella nisch, även om variation kan vara ett problem. Variabilitet i detta avseende kan övervinnas genom att använda encellig RNA-sekvensering för att differentiera och separera den heterogena populationen av celler.

De typer av interaktioner som kan bedömas begränsas faktiskt av ursprunget till PBMC och hNC. När PBMC och hNC erhålls från olika givare är det viktigt att säkerställa epitelintegritet och separation. När PBMC kommer i kontakt med hNC kan allogena immunreaktioner uppstå. Därför är de enda interaktioner som är relevanta interaktioner medierade av lösliga faktorer som kan passera genom membraninsatserna, vilket har beskrivits i protokollet ovan. Men när båda populationerna av celler härstammar från samma individ har denna modell ett extra lager av användbarhet eftersom konventionella immuncellsreaktioner mellan hNOC och PBMC-populationen nu kan bedömas, inklusive T-cellmedierad cytotoxicitet och antikroppsmedierade svar. Dessutom kan epigenetiska studier också utföras för att undersöka hur modifieringar av genomet kan påverka cytokingenen/proteinuttryck/sekretion.

Dessutom kan olika cellpopulationer läggas till basalkammaren för att ytterligare undersöka en specifik population. Detta kan utföras genom att isolera cellpopulationerna av intresse (T-celler, NK-celler, monocyter) och införa dem i basalkammaren istället för PBMC: erna. Denna modell kan emellertid inte användas för att undersöka cellulära interaktioner som kräver direktkontakt på grund av separationen av de två cellpopulationerna av membranet. Som sådan kan undersökningen av adaptiva immunsvar begränsas av denna detalj. Sammanfattningsvis erbjuder denna ALI-samodlingsmodell en mångsidig utgångspunkt för in vitro-undersökningen av överhörningen mellan näsvävnader och immunceller. Protokollet som beskrivs i detta manuskript försöker ge en riktlinje som kommer att vara till hjälp även om populationerna / förhållandena ändras.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% Trypsin-EDTA	Gibco	15400-054
0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0, RNase-free	Thermofisher	AM9260G	0.5M EDTA
1.5 mL SafeLock Tubes	Eppendorf	0030120086	1.5mL Centrifuge Tube
10 mL K3EDTA Vacutainer Tubes	BD	366643	10mL Blood Collection Tubes
10x dPBS	Gibco	14200-075
10x PBS	Vivantis	PC0711
12-well Plate	Corning	3513
12-well Transwell Insert	Corning	3460	membrane insert
1x FACS Lysing Solution	BD	349202
2.0 mL SafeLock Tubes	Eppendorf	0030120094	2 mL centrifuge tube
24-well Plate	Corning	3524
24-well Transwell Insert	Corning	3470
3% Acetic Acid with Methylene Blue	STEMCELL Technologies	07060
3,3',5-triiodo-l-thyronine	Sigma	T-074
37% Formaldehyde Solution w 15% Methanol as Stabilizer in H2O	Sigma	533998
5810R Centrifuge	Eppendorf	5811000320
5 mL polypropylene tubes (flow tubes)	BD	352058
70 µm Cell Strainer	Corning	431751
A-4-62 Rotor	Eppendorf	5810709008
Accutase	Gibco	A1110501	Cell Dissociation Reagent
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240-062
Avicel CL-611	FMC Biopolymer	NA	Liquid Overlay
Bio-Plex Manager 6.2 Standard Software	Bio-Rad Laboratories, Inc	171STND01	Multiplex Manager Software
Butterfly Needle 21 G	BD	367287
Cholera Toxin	Sigma	C8052
Crystal Violet	Merck	C6158
Cytofix/Cytoperm Solution	BD	554722	Fixation and Permeabilization Solution
Dispase II	Sigma	D4693	Neutral Protease
DMEM/High Glucose	GE Healthcare Life Sciences	SH30243.01
DMEM/Nutrient Mixture F-12	Gibco-Invitrogen	11320033
dNTP Mix	Promega	U1515	dNTP Mix
EMEM (w L-Glutamine)	ATCC	30-2003
EVOM voltohmmeter device	WPI, Sarasota, FL, USA	300523
FACS Lysing Solution	BD	349202	1x Lysing Solution
Falcon tube 15 mL	CellStar	188271	15 mL tube
Falcon tube 50 mL	CellStar	227261	50 mL Tube
Fast Start Essential DNA Probes Master	Roche	6402682001	qPCR Master Mix
Ficoll Paque Premium	Research Instruments	17544203	Density Gradient Media
H3N2 (A/Aichi/2/1968)	ATCC	VR547
H3N2 M1 Forward Primer Sequence	Sigma	5'- ATGGTTCTGGCCAGCACTAC-3'
H3N2 M1 Reverse Primer Sequence	Sigma	5'- ATCTGCACCCCCATTCGTTT-3'
H3N2 NS1 Forward Primer Sequence	Sigma	5'- ACCCGTGTTGGAAAGCAGAT-3'
H3N2 NS1 Reverse Primer Sequence	Sigma	5'- CCTCTTCGGTGAAAGCCCTT-3'
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum	Gibco	10500-064
hNESPCs	Human Donors	NA
Human Epithelial Growth Factor	Gibco-Invitrogen	PHG0314
Hydrocortisone	STEMCELL Techonologies	7925	Collected from nasal biopsies during septal deviation surgeries
Insulin	Sigma	I3536
Lightcycler 96	Roche	5815916001	qPCR Instrument
Live/DEAD Blue Cell Stain Kit *for UV Excitation	Thermofisher	L23105	Viability Stain
MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel II - Premixed 23 Plex	Merck Pte Ltd	HCP2MAG-62K-PX23	Immunology Multiplex Assay
Mitomycin C	Sigma	M4287
M-MLV 5x Buffer	Promega	M1705	RT-PCR 5x Buffer
M-MLV Reverse Transcriptase	Promega	M1706	Reverse Transcriptase
N-2 supplement	Gibco-Invitrogen	17502-048
NIH/3T3	ATCC	CRL1658
Perm/Wash Buffer	BD	554723	Permeabilization Wash Buffer
PneumaCult-ALI 10x Supplement	STEMCELL Techonologies	5001
PneumaCult-ALI Basal Medium	STEMCELL Techonologies	5001
PneumaCult-ALI Maintenance Supplement (100x)	STEMCELL Techonologies	5001
Random Primers	Promega	C1181	Random Primers
Recombinant Rnasin Rnase Inhibitor	Promega	N2511	RNase Inhibitor
RNA Lysis Buffer	Qiagen	Part of 52904
RPMI 1640 (w L-Glutamine)	ATCC	30-2001
STX2 electrodes	WPI, Sarasota, FL, USA	STX2	Electrode
T25 Flask	Corning	430639
T75 Flask	Corning	430641U
TPCK Trypsin	Sigma	T1426
Trypan Blue	Hyclone	SV30084.01
Viral RNA Extraction Kit	Qiagen	52904	Viral RNA Extraction Kit
V-Shaped 96-well Plate	Corning	3894