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Biology

哺乳动物原色素上皮细胞的分离、培养和基因工程用于非病毒基因治疗

Published: February 26, 2021 doi: 10.3791/62145
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1, 3, 4, 1,2
1Experimental Ophthalmology, University of Geneva, 2Department of Ophthalmology, University Hospitals of Geneva, 3Department of Ophthalmology, University Hospital RWTH Aachen, 4Max Delbrück Center for Molecular Medicine
* These authors contributed equally

Summary

在这里，提出了一种从各种哺乳动物（小鼠，大鼠，兔子，猪和牛）中分离和转染原代虹膜和视网膜色素上皮细胞的方案。该方法非常适合在各种设置中研究眼部基因治疗方法，以进行离体分析和可转移到人类的体内研究。

Abstract

年龄相关性黄斑变性（AMD）是60>患者失明的最常见原因，影响全球约3000万人。AMD 是一种受环境和遗传因素影响的多因素疾病，由于视网膜色素上皮 （RPE） 细胞变性，随后出现感光器降解，导致视网膜功能受损。理想的治疗方法包括移植分泌神经保护因子的健康RPE细胞，以防止RPE细胞死亡和光感受器变性。由于功能和遗传相似性以及侵入性较小的活检的可能性，建议移植虹膜色素上皮（IPE）细胞作为退化RPE的替代品。通过睡美人（SB100X）转座子介导的转染，可以实现低数量的视网膜下移植细胞分泌神经保护因子，这些转染体的基因编码色素上皮衍生因子（PEDF）和/或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）。我们建立了来自各种物种（包括啮齿动物，猪和牛）的RPE和IPE细胞的分离，培养和SB100X介导的转染。球体被外植，角膜和晶状体被移除以进入虹膜和视网膜。使用定制的刮刀，从分离的虹膜中取出IPE细胞。为了收获RPE细胞，可能需要胰蛋白酶孵育，具体取决于物种。然后，使用RPE定制的刮刀，将细胞悬浮在培养基中。接种后，每周监测细胞两次，并在达到汇合点后，通过电穿孔转染。通过qPCR、WB、ELISA、免疫荧光和功能测定证实了基因整合、表达、蛋白分泌和功能检测。根据物种的不同，每只眼睛可以分离出30，000-500万（RPE）和10，000-150万（IPE）细胞。基因修饰细胞显示出显着的PEDF / GM-CSF过表达，具有降低氧化应激的能力，并为离体分析和可转移到人类的体内研究提供了灵活的系统，以开发眼部基因治疗方法。

Introduction

我们小组正专注于开发再生方法，通过基于RPE和IPE的非病毒基因疗法来治疗神经视网膜变性，即AMD。这种疗法的临床前建立需要可移植给人类的 体外 模型。因此，这里介绍的研究目标是为原代RPE和IPE细胞的分离，培养和基因工程提供方案。建立从多个物种中分离PE细胞的基本原理是有力地确认该方法的安全性和有效性，并提高其可重复性和可转移性。可用的人RPE细胞系ARPE-19与原代细胞不同（例如，它们的色素较少），因此对于临床前分析的价值有限1。此外，非人类哺乳动物细胞可以以更低的成本和更大的数量购买;人类供体组织可以从各种眼库获得，但可用性有限且昂贵。最后，新的高级治疗药物产品（ATMP，即细胞，组织或基因治疗药物产品）需要在患者中测试之前至少应用于两种不同的物种，并且这些 体内 研究要求制备同种异体细胞移植。

视网膜神经退行性疾病是工业化国家失明的主要原因，包括AMD等常见疾病，以及视网膜色素变性等罕见疾病，其中视网膜细胞死亡最终导致失明。在某些情况下，RPE细胞，光感受器和视网膜神经节细胞（RGC）损伤可以减慢，但目前没有治愈性疗法可用。ATMPs具有纠正基因缺陷，整合治疗基因或替代退化细胞的潜力，从而能够开发针对AMD等疾病的再生和治愈疗法;13种基因疗法已经获得上市批准，包括治疗RPE65突变相关视网膜变性的疗法2，3。在老年人（>60岁）中，全世界约有3000万人受到新生血管（nvAMD）或无血管（aAMD）AMD4的影响。这两种形式都是由年龄相关的触发因素诱导的，包括氧化损伤，功能障碍和RPE细胞的丧失，然后是光感受器降解，除其他外（例如遗传风险等位基因，吸烟，高血压）5，6。在 nvAMD 中，血管生成和抗血管生成因子的不平衡会加重发病机制，而血管生成血管内皮生长因子 （VEGF） 可诱导脉络膜新生血管形成 （CNV）。迄今为止，只有nvAMD可以通过每月玻璃体内注射VEGF蛋白抑制剂来抑制CNV来治疗;尚无有效的治疗方法可用于aAMD6，7。

几项研究评估了基于细胞的疗法来取代抗VEGF疗法：Binder等人进行的研究表明，新鲜收获的自体RPE细胞被移植到nAMD8，9，10的患者中，显示出适度的视力改善，但只有一小部分患者达到了最终的视力，足以使阅读成为可能。最近，一项I期临床研究使用胚胎干细胞衍生的RPE贴片治疗AMD，结果很有希望;即，在接受治疗的 10 名患者中，有 2 名患者的 RPE 贴片疗效、稳定性和安全性长达12 个月 11。此外，一些小组已经发表了一些研究，其中自体RPE-Bruch的膜脉络膜贴片从外周视网膜中收获并移植到黄斑12，13，14;并生成诱导多能干细胞（iPSC）衍生的RPE贴片用于移植15。对于aAMD，靶向补体途径的抗体已经在临床试验6，16中进行了测试，并且使用单次玻璃体内注射腺相关病毒（AAV）载体的I期研究，编码地理萎缩（GA）患者中CD59因子（AAVCAGsCD59）的基因17;II期研究最近开始，旨在招募132名晚期aAMD患者，并在干预后2年评估结果18。最后，FocuS研究小组已开始进行I / II期多中心临床试验，评估编码人补体因子19的重组非复制AAV载体的安全性，剂量反应和有效性。

首先，再生AMD治疗的目标是移植功能性RPE细胞，这些细胞受损或丢失。然而，IPE和RPE细胞具有许多功能和遗传相似性（例如，吞噬作用和视黄醇代谢），并且由于IPE细胞更可行，因此它们已被提议作为RPE替代品20。尽管先前已经证明IPE细胞移植延迟了动物模型21，22中的光感受器变性并稳定了终末期nvAMD患者的视觉功能，但这些患者23没有观察到显着改善。缺乏疗效可能是由于移植细胞数量少和/或神经保护性视网膜因子失衡。另一种方法是移植转染的色素上皮细胞，这些细胞过度表达神经保护因子以恢复视网膜稳态，维持剩余的RPE细胞，并保护光感受器和RGC免受变性。因此，我们提出了一种新疗法，包括移植经过基因工程的功能性RPE或IPE细胞，以分泌神经保护和抗血管生成蛋白，如PEDF，GM-CSF或胰岛素样生长因子（IGF）。在多个物种中开发和分析这种方法的优点是，而不是使用一个细胞系，仅一个物种或人体组织：1）增加结果的可重复性和可转移性，如在独立实验室和不同物种中实现的许多研究所证明的那样1，24，25;2）猪或牛的细胞是可行的一次性的，无需牺牲额外的动物;3）特别是猪和牛细胞的可用性允许大型测试系列产生可靠的结果;4）从最常用的模型中分离，培养和遗传修饰细胞的知识使得能够在多个物种24，25，26中进行体内分析，从而为第一批接受治疗的患者提供更高的风险 - 收益比;5）所提出的方案的灵活性允许其用于各种模型和实验设置以及所有基于眼细胞的治疗，有和没有基因工程。相反，细胞系或人体组织等替代技术仅具有有限的可转移性和/或有限的可处置性。ARPE-19等细胞系是初步实验的理想选择。然而，低色素沉着和高增殖与原代细胞1显着不同。从人类供体组织中分离的RPE和IPE细胞为可移植的体外实验提供了宝贵的来源;然而，我们从美国眼库获得人体组织，这意味着该组织至少有两天大（去核后），需要漫长而昂贵的运输，但当地供体组织没有足够的量进行生产性研究。使用原代细胞的优势被来自其他组的多项研究证实，27，28。

为了开发一种基于细胞的非病毒基因疗法，使用SB100X转座子系统转染原代RPE和IPE细胞，这些细胞的基因编码为PEDF和/或GM-CSF，分别用于治疗nvAMD和aAMD，分别为29，30，31，32，我们首先建立了ARPE-19细胞的转染1.接下来，在易于接近的牛和猪原代细胞中建立了分离和转染方案。现在，已经建立了来自五个不同物种的原代RPE和IPE细胞的分离和转染，从小型（如小鼠）到大型哺乳动物（如牛）。在源自人类供体眼睛的原代RPE和IPE细胞中得到证实30。符合良好生产规范（GMP）的ATMP生产也使用人类供体组织进行了验证33。最后，在体内评估了该方法在三种不同物种中的有效性，这些物种已经适应了该协议：小鼠，大鼠和兔子。在临床设置中，将从患者身上采集虹膜活检，IPE细胞将在洁净室中分离和转染，然后将细胞网膜下移植回同一患者体内。整个过程将在持续约60分钟的单次手术过程中进行。治疗方法的开发和对其效率的评估要求优秀的体外和离体模型来实现稳健有效的基因递送方法，分析基因递送效率，治疗性蛋白质产生和神经保护作用，并产生细胞移植以在体内测试该方法1，24，25，29，30 .值得一提的是，该疗法已获得日内瓦州研究伦理委员会（编号：2019-00250）对临床Ib / IIa期试验的伦理批准，目前瑞士监管机构要求授权的最后临床前数据是使用所提出的协议收集的。在这方面，临床前体内数据显示CNV显著降低，安全性优良24、25、31。

本文介绍了从牛、猪、兔、大鼠和小鼠中分离和培养RPE/IPE细胞，以及使用整合 SB100X 转座子系统与电穿孔相结合作为有效的基因递送方法。特别是，转染原代PE细胞以过表达PEDF和GM-CSF。这些方案的收集使得 体外 和 体内 研究能够在ATMP开发的所有临床前阶段进行。此外，该设置有可能适应其他感兴趣的基因和疾病。

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Protocol

涉及动物的协议由经过认证的人员执行，并经瑞士日内瓦州安全，安全和健康省（DSES），Domaine de l'expérimentation animale授权，并根据ARVO关于在眼科和视觉研究中使用动物的声明（批准号：GE/94/17）。成年健康的布朗挪威大鼠，C57BL / 6小鼠和新西兰白兔通过过量的戊巴比妥（150mg / kg）稀释在0.9%NaCl腹腔内注射安乐死，并在牺牲后立即对眼睛进行去核。猪眼和牛眼在牺牲后6小时内从当地屠宰场获得，并在冰上运送到实验室。

1. 准备前

  1. 准备完整的培养基（DMEM / Ham的F12补充10%胎牛血清（FBS），80 U / mL青霉素/ 80μg/ mL链霉素和2.5μg/ mL两性霉素B）。在37°C水浴中加热培养基，1x PBS和0.25%胰蛋白酶（如有必要）。
  2. 将无菌悬垂物放入抽油烟机中，以准备无菌工作场所。在烟罩内引入所有需要的无菌器械和材料。
    注意：只有眼睛的去核和剩余肌肉组织和皮肤的清洁是在罩外进行的手术，其余的步骤必须在罩内进行。

2. 大鼠/小鼠PE细胞的分离

  1. 在对动物实施安乐死后，使用弯曲的剪刀和Colibri镊子对眼睛进行去核。使用剪刀和镊子（非无菌）清洁眼睛上剩余的肌肉组织和皮肤。
    注意：用于眼睛去核和清洁的剪刀和镊子的大小取决于物种（例如，对于大鼠和小鼠，仪器将小于用于猪和牛的器械）（见图S1）。
    1. 将眼睛收集在充满非无菌PBS的50 mL管中，并将管转移到层流罩中。通过浸没在碘基溶液中2分钟来消毒眼睛，然后将其转移到装有无菌PBS的培养皿中。
  2. 灯泡的打开
    1. 将眼睛转移到无菌培养皿后，用Colibri或尖镊子将眼睛牢牢地靠近视神经。用18 G针在虹膜极限附近（在pars plana和ora serrata之间）打一个洞。将小剪刀插入孔中，并在虹膜周围切割。取出前段（角膜、晶状体和虹膜），然后将其放入培养皿中。将球茎与玻璃体一起放置，直到分离出RPE细胞。
  3. 分离IPE细胞
    1. 取下晶状体，用细镊子小心地拉出含有IPE细胞的虹膜。将虹膜放入培养皿中，用无菌PBS清洗，然后将其留在PBS中，直到准备好更多的虹膜。
    2. 重复步骤2.2.1至2.3.1，让当天所有眼睛都做好准备。
    3. 每片虹膜加入50μL0.25%胰蛋白酶，并在37°C下孵育10分钟。 除去胰蛋白酶，每虹膜加入150μL完整培养基，并用扁平的火抛光巴斯德移液管精细刮擦IPE;使用细镊子固定组织。收集细胞悬浮液并放入1.5 mL管中。使用10μL细胞悬浮液以1：3稀释，用台盼蓝对Neubauer室中的细胞进行计数34，35。
    4. 如果不立即转染，则在1mL完全培养基（10%FBS）中将200，000个细胞/孔接种在24孔板（100，000个细胞/ cm2）中（接种见 表1）。将板置于培养箱中，并在37°C，5%CO2下培养。
      注意：可能需要将几只眼睛聚集在一起，以便有足够的细胞进行接种。
  4. RPE细胞的分离
    1. 用薄镊子从后段去除玻璃体和视网膜。避免损害视网膜色素上皮。
    2. 用#10手术刀将球段切成两半，使地球完全打开并用无菌PBS清洗。
    3. 每只眼睛加入50μL0.25%胰蛋白酶，并在37°C下孵育10分钟。 除去胰蛋白酶，每球加入150μL完整培养基，并用圆形手术刀细腻地刮擦RPE细胞;使用细镊子固定组织。收集细胞悬浮液并将其放入1.5 mL管中。取10μL细胞悬浮液;用台盼蓝以1：4稀释，以计数Neubauer室中的细胞。
    4. 请参阅步骤 2.3.4。
      注意：可能需要将几只眼睛聚集在一起，以便有足够的细胞进行接种。

3. 兔PE细胞的分离

  1. 按照步骤 2.1 至 2.1.1 中所述执行清洁和消毒。
  2. 将一只眼睛放在无菌纱布敷上，并将其牢固地靠近视神经。用手术刀#11和剪刀在边缘下约2毫米处睁开眼睛。取出前段（角膜、晶状体和虹膜），然后将其放入培养皿中。将球茎与玻璃体一起放置，直到分离出RPE细胞。
  3. 分离IPE细胞
    1. 执行步骤 2.3.1。用手术刀#10切割，从虹膜上取出睫状体。
    2. 制备2个鸢尾花后，用1mL的0.25%胰蛋白酶在37°C孵育10分钟;在此期间，可以分离RPE细胞（参见步骤3.4）。除去胰蛋白酶，将1 mL完整培养基加入虹膜中，并用扁平的火抛光巴斯德移液管仔细刮擦分离细胞。通过移液小心地重悬细胞，并将细胞悬浮液转移到1.5mL管中。取10μL细胞悬浮液，用台盼蓝稀释1：3以计数Neubauer室中的细胞。
    3. 请参阅步骤 2.3.4。
  4. RPE细胞的分离
    1. 执行步骤 2.4.1。
    2. 将无菌纱布放入12孔板中，并将灯泡放在纱布上。
    3. 用PBS清洗并执行步骤2.4.3。
      注：使用弯曲的火抛光巴斯德移液器。
    4. 在120×g下离心细胞10分钟。
    5. 请参阅步骤 2.3.4。

4. 猪PE细胞的分离

  1. 按照步骤 2.1 中所述执行清洁。用PBS清洗，在碘基溶液中浸泡2分钟，用PBS冲洗眼睛。继续执行步骤 3.2。
  2. 分离IPE细胞
    1. 执行步骤 3.3.1。制备2个虹膜后，加入1mL完整培养基，并通过用扁平的火抛光巴斯德移液管仔细刮擦来分离细胞。将细胞悬浮液转移到1.5mL管中。取10μL细胞悬浮液，用台盼蓝稀释1：4以计数Neubauer室中的细胞。
    2. 请参阅步骤 2.3.4。
  3. RPE细胞的分离
    1. 执行步骤 2.4.1。将灯泡放入培养皿中，用PBS清洗。用 1 mL 完整培养基填充灯泡。
    2. 使用弯曲的火抛光巴斯德移液器，小心地去除RPE细胞。确保从底部刮到顶部，以避免脉络膜 - 布鲁赫膜复合物滑落。使用1，000μL移液管收集灯泡内的细胞悬浮液，然后转移到1.5mL管中进行重悬。取10μL细胞悬浮液，用台盼蓝稀释1：8以计数Neubauer室中的细胞。
    3. 请参阅步骤 2.3.4。

5. 牛PE细胞的分离

  1. 按照步骤 2.1 中所述执行清洁。用PBS清洗，在碘基溶液中浸泡2分钟，用PBS冲洗眼睛。继续执行步骤 3.2。
  2. 分离IPE细胞
    1. 执行步骤 3.3.1。制备两个鸢尾花后，用2mL 0.25%胰蛋白酶在37°C孵育10分钟。在此期间，可以分离RPE细胞（参见步骤5.3）。
    2. 除去胰蛋白酶，向虹膜中加入2 mL完整培养基，并用扁平的火抛光巴斯德移液管仔细刮擦分离细胞。将细胞悬浮液转移到15 mL管中。在120×g下离心细胞10分钟。 取10μL细胞悬浮液，用台盼蓝稀释1：4以计数Neubauer室中的细胞。
    3. 如果不立即转染，则在3mL完整培养基（10%FBS）的6孔板中接种320，000个细胞/孔（接种见 表1）。将板置于培养箱中，并在37°C，5%CO2下培养。
  3. RPE细胞的分离
    1. 按照步骤 2.4.1 操作。将灯泡放入培养皿中，用PBS清洗。准备2只眼睛后，用胰蛋白酶填充灯泡约3/4，并在37°C下孵育25分钟，将培养皿的盖子放在球茎顶部。
    2. 除去胰蛋白酶，加入1 mL完整培养基。执行步骤 4.3.2。在120×g下离心细胞10分钟。
    3. 请参阅步骤 5.2.3。

6. 栽培 - 介质变化

  1. 在37°C和5%CO 2的湿润培养箱中，在DMEM / Ham的F12中培养细胞，补充有10%FBS，80 U / mL青霉素/ 80μg/ mL链霉素和2.5μg/ mL两性霉素B。3-4天后，上下移液以收集非贴壁细胞，并将一半体积放入另一个孔中。用完整的培养基填充多达 1 mL。
    注意：这允许具有足够大的表面，以便隔离所有细胞以附着并最大化输出。
  2. 再过3-4天后重复细胞收集，但这次是将两个孔中的非贴壁细胞汇集到一个孔中（例如，C1中的A1 + B1）。向所有孔中加入培养基。观察细胞并每周更换培养基2次（对于6和24孔板，分别使用3和1mL /孔）。当细胞达到汇合时，切换到具有1%FBS的完整培养基或使用细胞进行实验（例如，转染）。
    注意：RPE和IPE细胞分别在分离后3-4周和4-5周后汇合。证实了细胞培养物纯度，检查了Johnen及其同事所描述的细胞形态（色素沉着细胞）和特异性标记物36。

7. 原代聚乙烯细胞的电穿孔

  1. 如前1、37所述进行电穿孔。
  2. 根据转染的细胞数量，使用6孔，24孔或48孔板（见 表2）将细胞接种在没有抗生素或抗真菌剂的培养基中。在接下来的2周内，用含有青霉素（80 U / mL），链霉素（80μg / mL）和两性霉素B（2.5μg/ mL）的培养基加入滴剂，每周两次。转染后2周完全交换培养基。
  3. 为了确定细胞生长，转染效率和蛋白质分泌，每周通过显微镜监测细胞并通过蛋白质印迹分析细胞培养物上清液。在终止培养之前，取24小时细胞培养上清液以通过ELISA定量蛋白质分泌，计数细胞，按照制造商的说明（参见材料表）通过基于图像的细胞术测量荧光（如果是Venus转染的细胞），并收集细胞沉淀以进行基于RT-qPCR的基因表达分析。
    注：这些方法不包括在本文中，因为它的目的不是详细解释细胞的分析，而是它们的分离。所有物种的细胞接种密度都是相同的（100，000个细胞/ cm2），但由于分离的细胞数量不同，因此使用不同的板。此外，对于小鼠，大鼠和兔子，可能需要汇集2-3只眼睛以有足够的细胞进行接种。
物种 胰蛋白酶治疗 N° IPE 电池 N° RPE 电池 接种板（100，000个细胞/cm2）
小鼠/大鼠 是的 ~50，000 ~150，000 24 孔板
兔 是的 ~350，000 ~2，500，000 24 孔板
猪 不 ~1，000，000 ~3，000，000 24 孔板
牛 是的 ~1，700，000 ~5，000，000 6 孔板

表1：从不同物种的眼睛中分离出的原代PE细胞的数量。

名字 面积 容积介质 胰蛋白酶 用于停止胰蛋白酶作用的容量培养基 播种密度
6 孔板 9.6 平方厘米 3.0 毫升 0.5 毫升 1.0 毫升 3x105
24孔板 2.0 平方厘米 1.0 毫升 0.2 毫升 0.8 毫升 5x104
48孔板 1.1 平方厘米 0.5 毫升 0.1 毫升 0.4 毫升 0.5-1x104

表2：细胞培养体积和接种密度。

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Representative Results

从不同哺乳动物物种中分离PE
使用上述方案，IPE和RPE细胞成功从五种不同物种中分离和培养。从每个程序中获得的细胞数量取决于眼睛的种类和大小（表1）。如图 1所示，细胞显示出典型的PE细胞形态和色素沉着（除了显示的兔细胞，来自新西兰白化（NZW）兔）。在分离后21天，细胞汇合，准备用于进一步的实验（例如，转染）。必须注意的是，对所有物种的培养物进行进一步监测和控制长达2年，以确认正常的形态和稳定的转基因表达（数据未显示）。

RT-qPCR和免疫组织化学排除了去分化、细胞应激和基因表达的变化。在转染的人RPE细胞（ARPE-19细胞）中分析的一组基因（VEGF，CRALBP，CATD，ZO-1，KRT8）证实了正常的RPE表达模式1;这可以通过RPE65的免疫荧光在原代牛IPE细胞中确认（图2）。此外，Johnen及其同事证实了原代猪IPE和RPE细胞中的ZO-1免疫染色36。

Figure 1
图1：分离后21天来自各种哺乳动物的PE细胞的显微照片。 来自小鼠、兔子（白化NZW兔）、猪和牛的IPE和RPE细胞在分离后的第21天显示。对于所有物种，显示的培养物是汇合的。请注意，兔PE细胞没有色素（原始放大倍率，50x）。 请点击此处查看此图的放大版本。

Figure 2
图2：原代IPE细胞的RPE65免疫染色。 RPE65（绿色）染色转染用pFAR4-CMV-PEDF转座子质粒的牛IPE细胞，初始细胞数为1×104 个细胞，与未转染的对照细胞相比（原始放大倍率，200x）。细胞核被DAPI（蓝色）染色。 请点击此处查看此图的放大版本。

转染原发性 RPE 的可行性
细胞活力如图3所示。为了排除用于电穿孔过程的缓冲液的潜在毒性，将预培养的原代RPE细胞悬浮在市售试剂盒的电穿孔缓冲液中，或悬浮在制药公司开发的营养缓冲液（机密组合物）和电穿孔（E）（不添加质粒）中，如方案步骤7所述。按照制造商的说明，在转染后3±1天使用市售的细胞毒性测定试剂盒（见材料表）研究细胞活力。测定总是在没有功率的对照（Co-P）（非电穿孔）下进行。对于任何测试的缓冲液，均未观察到对细胞活力的影响（图3）。

Figure 3
图3：悬浮在不同缓冲液中的原代RPE细胞的活力。1×10 4 个细胞悬浮在市售试剂盒的电穿孔缓冲液或营养缓冲液中。使用市售的细胞毒性测定试剂盒在转染后3±1天测量细胞活力。不同缓冲液之间未观察到生存能力的差异;数据表示为SD±平均值（n = 2个供体，3个重复项/供体）。E：电穿孔电池，Co-P：无电源控制。AU：任意单位。 请点击此处查看此图的放大版本。

用Venus报告基因转染预培养的PE细胞
使用高活性的SB100X转座子基因递送系统，用黄色荧光Venus蛋白（pT2-CAGGS-Venus）转染来自不同物种的50，000-100，000个预培养的PE细胞。图4所示的显微照片证实细胞已成功转染（转染后21天的荧光细胞）。图5显示了用Venus（pT2-CAGGS-Venus）转染的预培养猪RPE细胞（n = 6个供体，50，000个细胞/转染）的转染效率的定量。在细胞培养终止当天（转染后30±5天）按照制造商的说明使用基于图像的细胞术测量荧光细胞和MFI的百分比。荧光细胞的平均百分比为50±30%，但范围从95±6%（供体2）到28±1%（供体4）不等（图5）。在所有实验中，转染的ARPE-19细胞被用作阳性对照。此外，始终将转染效率与阴性对照进行比较：Co-P（无功率[非电穿孔]的对照）和Co+P（带功率的对照[电穿孔但不添加质粒]）。该实验也是用IPE细胞进行的（数据未显示）。

Figure 4
图4：用pT2-CAGGS-Venus转染的预培养PE细胞的显微照片。金星转染的兔（A）、牛（B）和猪（C）PE细胞在转染后21天显示。作为阳性对照，50，000个ARPE-19细胞被金星（D）转染。左显微照片：明场，右显微照片：GFP（480 nm）滤光片（原始放大倍率，50倍）。转染一式三份进行，阴性对照包括：Co-P（无功率对照[非电穿孔]）和Co+P（功率对照[电穿孔但不添加质粒]）（未显示）。请点击此处查看此图的放大版本。

Figure 5
图5：转染金星报告基因的猪RPE细胞的转染效率。（A）50，000个原代猪RPE细胞转染pT2-CAGGS-Venus，总体平均转染效率为50±30%，平均MFI为2712±197在细胞培养终止当天（转染后30±5天）。该图显示了6种不同动物的平均±SD（n = 3次重复）。（B）用作阳性对照的Venus+ ARPE-19细胞的百分比为98±6%，并且在随访细胞的138天内保持稳定。平均荧光强度（MFI）为5，785±1，255。该图显示了每天平均±SD（n = 3次重复）。Co-P（无功率对照[非电穿孔]）和Co+P（带功率对照[电穿孔但不添加质粒]）包含在所有转染实验中（未显示）。请点击此处查看此图的放大版本。

用Venus报告基因转染新鲜PE细胞
用黄色荧光蛋白Venus（pFAR4-CMV-Venus）转染从兔子中新鲜分离的10，000-50，000个PE细胞，并通过显微镜监测细胞培养物。在 图6 中，可以在转染后的第21天观察到荧光细胞。通过基于图像的细胞术测量的荧光细胞百分比为IPE细胞的53±29%，RPE细胞为28±23%（数据未显示）。

Figure 6
图6：从兔子中分离出的新鲜转染的PE细胞的显微照片， 从兔子中转染了50，000个IPE和RPE细胞，用pFAR4-CMV-Venus转染。荧光在转染后第21天显示。左显微照片：明场，右显微照片：GFP（480 nm）滤光片。在所有情况下，转染均一式三份进行（原始放大倍率，50倍）。 请点击此处查看此图的放大版本。

用治疗基因PEDF和GM-CSF转染PE细胞
用 PEDF 转染50，000个PE细胞，并通过WB监测蛋白质分泌（图7）。与所有研究物种和天数的未转染细胞相比，转染细胞的WB信号更高;在此期间没有观察到蛋白质分泌的减少。

Figure 7
图7：转染PE细胞PEDF分泌的WB分析。对来自猪（预培养）（A）和牛（新鲜）（B）PEDF转染的PE细胞的上清液的WB分析显示，与对照组（非转染细胞）相比，PEDF分泌更高且随时间稳定。请点击此处查看此图的放大版本。

图S1：根据物种用于PE分离的 仪器（A）用于眼睛去核和清洁剩余肌肉组织和皮肤的非无菌仪器。集合 1 用于大鼠、小鼠和兔子，集合 2 用于猪和牛的眼睛。（B）用于PE隔离的无菌器械。请注意根据眼睛的大小使用的不同尺寸的剪刀和镊子。圆形和扁平的火抛光巴斯德移液器分别用于刮擦RPE和IPE。请点击此处下载此文件。

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Discussion

拥有分离和培养PE细胞的标准化方法是开发视网膜退行性疾病新治疗方法的基础。通过这里提出的方案，PE细胞可以从不同物种中成功分离并长期培养（到目前为止，最长的培养物维持了2年1，38）;观察到典型的PE细胞形态、色素沉着和功能（图1、图2）。请注意，特别是对于纯RPE培养物，重要的是完全提取视网膜以避免被神经视网膜细胞污染;对于IPE细胞，睫状体应从虹膜中移除，如方案中所述。细胞的汇合在相对较短的时间内（约21天）实现，之后细胞准备好用治疗基因转染或用于其他实验（例如，暴露于有毒物质，蛋白质等）。此外，这些方案不仅对临床前体外和体内测试至关重要，而且对人类应用也很重要，即转染PE细胞移植的验证;特别是对于我们小组正在开发的AMD治疗，其中IPE细胞将从虹膜活检中分离出来，立即转染，并在一次手术会话中视网膜下移植给同一患者。在兔39和患者23中建立了自体IPE细胞的分离和视网膜下移植。由于自体IPE细胞的移植成功但不足以恢复视力，因此已将细胞转染以过度表达神经保护因子，例如PEDF和GM-CSF，已被添加到该方法中，并在另外三个物种（小鼠，大鼠和牛）中建立。使用这里描述的用于PE细胞的分离，培养和遗传修饰的方法，现在可以从各种物种制备相应的细胞移植，以测试体内方法的毒性和效率。

结果表明，使用超活性SB100X转座子系统，可以有效地修饰来自不同来源的PE细胞以过表达PEDF（图7）;使用大鼠IPE和RPE24以及人RPE细胞29，30的类似结果已经发表。PEDF转染已被提出通过抑制VEGF介导的新生血管形成和保护RPE细胞和视网膜神经元免受谷氨酸和氧化应激以及缺血来治疗nvAMD40，41。稳定的长期蛋白质分泌证实（图7）证实PE细胞是一种可靠的生物"药物递送系统"。在这方面，用报告基因Venus（图4，图5，图6）研究的转染效率证实了Johnen等人报道的〜20-100%的高转染效率（物种和供体依赖性）。1.

应该注意的是，尽管所用质粒的大小是可变的，从pFAR小质粒（~3，000 bp）到具有pT2骨架（~5，000bp）30的质粒，转染效率相对较高。转染效率的差异可能是由于从去核到细胞分离和组织保存的时间的可变性，但并没有改变细胞形态，也没有改变细胞达到汇合的时间（分离后〜21天），也没有改变转染后细胞随访的时间。一般来说，成功转染的一个重要考虑因素是PE细胞的来源应尽可能新鲜;这对于新鲜分离的PE细胞转染尤为重要。

与细胞片移植相比，我们小组正在开发的疗法（转染细胞作为细胞悬浮液移植在视网膜下）侵入性较小，因为第一个需要大视网膜切开术，并具有增殖性玻璃体视网膜病变和视网膜下纤维化相关的风险42。此外，在用于湿AMD的片状移植物中，CNV的区域与相邻的脉络膜一起被移除，因此，移植物存活率可能会受到影响43。最后，使用细胞贴片的想法与提出的程序不兼容，其中细胞的分离，修饰和移植是在单个手术过程中完成的。另一方面，移植为细胞悬浮液的PE细胞的固有问题是递送过程中潜在的细胞死亡，缺乏粘附和细胞分布的差异;但这些缺点可以通过组织工程方法42来克服;此外，通过使用促存活剂44、45、46、47可以提高细胞存活率。我们认为，移植原代PE细胞过度表达神经保护因子（如PEDF和GM-CSF）作为细胞悬浮液是治疗AMD的一种有前途的方法，为了开发这种疗法，这里提出的方案至关重要，因为它们允许原代PE细胞的分离，培养和分析的标准化。

总之，该协议提供了一个先进的模型系统，用于五个不同物种的眼部高级药物治疗的开发和临床前 体外 和 体内 测试，足够强大，可以补偿来自不同来源的细胞质量的个体差异。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

感谢Gregg Sealy和Alain Conti的出色技术援助。这项工作得到了欧盟委员会在第七框架计划，瑞士国家科学基金会和Schmieder-Bohrisch基金会的背景下的支持。Z.I.获得了欧洲研究委员会，ERC Advanced [ERC-2011-ADG 294742]和B.M.W.的资助，获得了富布赖特研究资助和瑞士政府卓越奖学金。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well plates Corning 353043
24-well plates Corning 353047
48-well plates ThermoFisher Scientific 150687
6-well plate Greiner 7657160
Betadine Mundipharma
Bonn micro forceps flat
Colibri forceps (sterile)
CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay Promega G9291
DMEM/Ham`s F12 Sigma-Aldrich D8062
Drape (sterile) Mölnlycke Health Care 800530
Electroporation buffer 3P.14 3P Pharmaceutical
FBS Brunschwig P40-37500
Forceps (different size) (sterile)
Gauze compress PROMEDICAL AG 25403
NaCl (0.9%) Laboratorium Dr. Bichsel AG 1000090
Needle (18G)  Terumo TER-NN1838R
Neon Transfection kit 10 µL ThermoFisher Scientific MPK1096
Neon Transfection System ThermoFisher Scientific MPK5000S
Neubauer chamber Marienfeld-superior 640010
Pasteur pipette (fire-polish) Witeg 4100150
PBS 1X Sigma-Aldrich D8537
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich P0781-100
Pentobarbital (Thiopental Inresa) Ospedalia AG 31408025
Petri dish ThermoFisher Scientific 150288
pFAR4-PEDF
pFAR4-SB100X
pFAR4-Venus Pastor et al., 2018. Kindly provided by Prof. Scherman and Prof. Marie
pSB100X (250 ng/µL) Mátés et al., 2009. Provide by Prof. Izsvak
pT2-CAGGS-Venus Johnen et al., 2012
pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/µL) Cloned in our lab
pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/µL) Pastor et al., 2018
scarpel no. 10 Swann-Morton 501
scarpel no. 11 Swann-Morton 503
Sharp-sharp tip curved Extra Fine Bonn Scissors (sterile) 
Sharp-sharp tip straight Extra Fine Bonn Scissors (sterile)
Tali Image-Based Cytometer ThermoFisher Scientific T10796
Trypsin 0.25%  ThermoFisher Scientific 25050014
Trypsin 5%/EDTA 2% Sigma-Aldrich T4174
Vannas spring scissors curved (sterile)

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References

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生物学，第168期，眼部基因治疗，视网膜变性，RPE细胞，IPE细胞，细胞分离， 睡美人 转座子，非病毒基因治疗，PEDF，GM-CSF
哺乳动物原色素上皮细胞的分离、培养和基因工程用于非病毒基因治疗
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Bascuas, T., Kropp, M., Harmening, N., Wong, B. M., Johnen, S., Izsvák, Z., Thumann, G. Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy. J. Vis. Exp. (168), e62145, doi:10.3791/62145 (2021).

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