Summary
Hier wordt een protocol gepresenteerd om primaire iris- en retinale pigmentepitheelcellen van verschillende zoogdieren (muizen, ratten, konijnen, varkens en runderen) te isoleren en te transfecteren. De methode is bij uitstek geschikt om oculaire gentherapiebenaderingen te bestuderen in verschillende opstellingen voor ex vivo analyses en in vivo studies die overdraagbaar zijn op mensen.
Abstract
Leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD) is de meest voorkomende oorzaak van blindheid bij patiënten >60 jaar en treft ~ 30 miljoen mensen wereldwijd. AMD is een multifactoriële ziekte die wordt beïnvloed door omgevings- en genetische factoren, die leiden tot functionele stoornissen van het netvlies als gevolg van retinale pigmentepitheel (RPE) celdegeneratie gevolgd door afbraak van fotoreceptoren. Een ideale behandeling zou de transplantatie van gezonde RPE-cellen omvatten die neuroprotectieve factoren afscheiden om RPE-celdood en fotoreceptordegeneratie te voorkomen. Vanwege de functionele en genetische overeenkomsten en de mogelijkheid van een minder invasieve biopsie, werd de transplantatie van irispigmentepitheelcellen (IPE) voorgesteld als vervanging voor de gedegenereerde RPE. Secretie van neuroprotectieve factoren door een laag aantal subretinaal getransplanteerde cellen kan worden bereikt door Doornroosje (SB100X)transposon-gemedieerde transfectie met genen die coderen voor de pigmentepitheel-afgeleide factor (PEDF) en / of de granulocyt macrofaag-kolonie stimulerende factor (GM-CSF). We hebben de isolatie, cultuur en SB100X-gemedieerdetransfectie van RPE- en IPE-cellen van verschillende soorten vastgesteld, waaronder knaagdieren, varkens en runderen. Bollen worden geëxplanteerd en het hoornvlies en de lens worden verwijderd om toegang te krijgen tot de iris en het netvlies. Met behulp van een op maat gemaakte spatel worden IPE-cellen uit de geïsoleerde iris verwijderd. Om RPE-cellen te oogsten, kan een trypsine-incubatie nodig zijn, afhankelijk van de soort. Vervolgens worden met behulp van RPE-aangepaste spatel cellen in medium gesuspendeerd. Na het zaaien worden de cellen twee keer per week gecontroleerd en, na het bereiken van confluentie, getransfecteerd door elektroporatie. Genintegratie, expressie, eiwitsecretie en functie werden bevestigd door qPCR, WB, ELISA, immunofluorescentie en functionele assays. Afhankelijk van de soort kunnen 30.000-5 miljoen (RPE) en 10.000-1,5 miljoen (IPE) cellen per oog worden geïsoleerd. Genetisch gemodificeerde cellen vertonen een significante PEDF/GM-CSF overexpressie met het vermogen om oxidatieve stress te verminderen en bieden een flexibel systeem voor ex vivo analyses en in vivo studies die overdraagbaar zijn op mensen om oculaire gentherapiebenaderingen te ontwikkelen.
Introduction
Onze groep richt zich op de ontwikkeling van regeneratieve benaderingen voor de behandeling van neuroretinale degeneratie, d.w.z. AMD, door RPE- en IPE-gebaseerde niet-virale gentherapie. De preklinische oprichting van dergelijke therapieën vereist in vitro modellen die overdraagbaar zijn op de mens. Het doel van de hier gepresenteerde studie is dus om protocollen te leveren voor de isolatie, cultuur en genetische manipulatie van primaire RPE- en IPE-cellen. De reden om de isolatie van PE-cellen van meerdere soorten vast te stellen, is om de veiligheid en efficiëntie van de aanpak robuust te bevestigen en de reproduceerbaarheid en overdraagbaarheid ervan te vergroten. De beschikbare menselijke RPE-cellijn ARPE-19 verschilt van primaire cellen (ze zijn bijvoorbeeld minder gepigmenteerd) en is daarom slechts van beperkte waarde voor preklinische analyses1. Bovendien kunnen niet-menselijke zoogdiercellen worden gekocht voor minder kosten en in grotere hoeveelheden; menselijk donorweefsel kan worden verkregen bij verschillende oogbanken, maar de beschikbaarheid is beperkt en duur. Ten slotte moeten nieuwe geneesmiddelen voor geavanceerde therapie (ATMP, d.w.z. cel-, weefsel- of gentherapiegeneesmiddel) in ten minste twee verschillende soorten worden toegepast voordat ze bij patiënten worden getest en deze in vivo studies vragen om de voorbereiding van allogene celtransplantaties.
Retinale neurodegeneratieve ziekten zijn de belangrijkste oorzaak van blindheid in geïndustrialiseerde landen, waaronder veel voorkomende ziekten zoals AMD, evenals zeldzame ziekten zoals retinitis pigmentosa, waarbij de retinale celdood uiteindelijk leidt tot blindheid. RPE-cellen, fotoreceptor en retinale ganglioncellen (RGC) schade kan in sommige gevallen worden vertraagd, maar er zijn momenteel geen curatieve therapieën beschikbaar. ATMP's bieden het potentieel om gendefecten te corrigeren, therapeutische genen te integreren of gedegenereerde cellen te vervangen, waardoor de ontwikkeling van regeneratieve en curatieve therapieën voor ziekten zoals AMD mogelijk wordt; 13 gentherapieën kregen al goedkeuring voor het op de markt brengen, waaronder een therapie voor de behandeling van RPE65 mutatie-geassocieerde retinale degeneratie2,3. Onder oudere volwassenen (>60 jaar) worden ~ 30 miljoen mensen wereldwijd getroffen door neovasculaire (nvAMD) of avasculaire (aAMD) AMD4. Beide vormen worden geïnduceerd door leeftijdsgebonden triggers, waaronder oxidatieve schade, functiestoornissen en verlies van RPE-cellen gevolgd door fotoreceptordegradatie, onder andere (bijv. Genetische risico-allelen, roken, hypertensie)5,6. Bij nvAMD wordt de pathogenese verergerd door een onbalans van angiogene en anti-angiogene factoren ten gunste van de angiogene Vasculaire Endotheliale Groeifactor (VEGF) die choroïdale neovascularisatie (CNV) induceert. Tot op heden is alleen nvAMD te behandelen door maandelijkse intravitreale injecties van remmers van het VEGF-eiwit om het CNV te onderdrukken; er is nog geen effectieve behandeling beschikbaar voor aAMD6,7.
Verschillende studies evalueerden celgebaseerde therapieën om de anti-VEGF-therapie te vervangen: studies uitgevoerd door Binder et al., waarbij vers geoogste autologe RPE-cellen werden getransplanteerd in patiënten met nAMD8,9,10, toonden matige visuele verbetering, maar slechts een kleine groep patiënten bereikte een uiteindelijke gezichtsscherpte die hoog genoeg was om lezen mogelijk te maken. Onlangs gebruikte een fase I klinische studie een embryonale stamcel-afgeleide RPE-pleister om AMD te behandelen met veelbelovende resultaten; d.w.z. werkzaamheid, stabiliteit en veiligheid van de RPE-pleister gedurende maximaal 12 maanden bij 2 van de 10 behandelde patiënten11. Daarnaast hebben verschillende groepen studies gepubliceerd waarin autologe RPE-Bruch's membraan-vaatvliespleisters werden geoogst van het perifere netvlies en getransplanteerd naar de macula12,13,14; en geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC)-afgeleide RPE-pleisters werden gegenereerd voortransplantatie 15. Voor aAMD zijn antilichamen gericht op de complementroute getest in klinische onderzoeken6,16 en een fase I-studie met behulp van een enkele intravitreale injectie van een adeno-geassocieerde virale (AAV) vector die codeert voor het gen voor de factor CD59 (AAVCAGsCD59) bij patiënten met geografische atrofie (GA) werd voltooid17; de fase II-studie is onlangs gestart en heeft tot doel 132 patiënten met gevorderde aAMD te werven en de uitkomst 2 jaar na de interventie te evalueren18. Ten slotte is de FocuS-studiegroep begonnen met een fase I / II multicenter klinische studie ter evaluatie van de veiligheid, dosisrespons en werkzaamheid van een recombinante niet-replicerende AAV-vector die codeert voor een humane complementfactor19.
In de eerste plaats is het doel van een regeneratieve AMD-therapie de transplantatie van functionele RPE-cellen, die beschadigd of verloren zijn gegaan. IPE- en RPE-cellen delen echter veel functionele en genetische overeenkomsten (bijv. Fagocytose en retinolmetabolisme), en omdat IPE-cellen haalbaarder worden geoogst, zijn ze voorgesteld als een RPE-substituut20. Hoewel eerder is aangetoond dat de IPE-celtransplantatie de degeneratie van fotoreceptoren in diermodellenvertraagt 21,22 en de visuele functie stabiliseert bij patiënten met nvAMD in het eindstadium, werd bij deze patiënten geen significante verbetering waargenomen23. Het gebrek aan werkzaamheid kan te wijten zijn aan het lage aantal getransplanteerde cellen en / of de onbalans van neuroprotectieve retinale factoren. Een alternatieve benadering zou zijn om getransfecteerde pigmentepitheelcellen te transplanteren die neuroprotectieve factoren overexpressie hebben om retinale homeostase te herstellen, resterende RPE-cellen te behouden en fotoreceptoren en RGC's te beschermen tegen degeneratie. Daarom stellen we een nieuwe therapie voor die de transplantatie omvat van functionele RPE- of IPE-cellen die genetische manipulatie hebben ondergaan om neuroprotectieve en anti-angiogene eiwitten, zoals PEDF, GM-CSF of insuline-achtige groeifactoren (IGF's) uit te scheiden. Het voordeel van het ontwikkelen en analyseren van deze aanpak in verschillende soorten in plaats van het gebruik van een cellijn, slechts één soort of menselijk weefsel is: 1) verhoogde reproduceerbaarheid en overdraagbaarheid van de resultaten zoals aangetoond door talrijke studies gerealiseerd in onafhankelijke laboratoria en verschillende soorten1,24,25; 2) varkens- of rundercellen zijn mogelijk wegwerpbaar zonder dat er extra dieren worden opgeofferd; 3) de beschikbaarheid van met name varkens- en rundercellen maakt het mogelijk grote testreeksen om robuuste resultaten te produceren; 4) de kennis om cellen uit de meest gebruikte modellen te isoleren, te kweken en genetisch te modificeren maakt in vivo analyses in meerdere soorten24,25,26 mogelijk en biedt zo een verbeterde risico-batenverhouding voor de eerste behandelde patiënten; 5) de flexibiliteit van het gepresenteerde protocol maakt het gebruik ervan mogelijk in verschillende modellen en experimentele opstellingen en voor alle op oculaire cellen gebaseerde therapieën met en zonder genetische manipulatie. Alternatieve technieken zoals cellijnen of menselijk weefsel hebben daarentegen slechts een beperkte overdraagbaarheid en/of beperkte disposeerbaarheid. Cellijnen zoals de ARPE-19 zijn ideaal voor voorbereidende experimenten; lage pigmentatie en hoge proliferatie verschillen echter aanzienlijk van primaire cellen1. RPE- en IPE-cellen, die worden geïsoleerd uit menselijk donorweefsel, bieden een kostbare bron voor overdraagbare in vitro experimenten; we verkrijgen echter menselijk weefsel van een Amerikaans-Amerikaanse oogbank, wat betekent dat het weefsel minstens twee dagen oud is (na enucleatie) en een lang en duur transport vereist, maar lokaal donorweefsel is niet in voldoende hoeveelheden beschikbaar voor een productief onderzoek. Het voordeel van het gebruik van primaire cellen wordt bevestigd door meerdere studies uit andere groepen27,28.
Voor de ontwikkeling van een op cellen gebaseerde niet-virale gentherapie met behulp van het SB100X transposonsysteem voor het transfecteren van primaire RPE- en IPE-cellen met de genen die coderen voor PEDF en / of GM-CSF voor de behandeling van nvAMD en aAMD, respectievelijk29,30,31,32, hebben we eerst de transfectie van ARPE-19-cellen vastgesteld1 . Vervolgens werden de isolatie- en transfectieprotocollen vastgesteld in gemakkelijk toegankelijke primaire cellen van runderen en varkens. Nu is de isolatie en transfectie van primaire RPE- en IPE-cellen van vijf verschillende soorten vastgesteld, van kleine (als muis) tot grote zoogdieren (als vee). Het werd bevestigd in primaire RPE- en IPE-cellen afgeleid van menselijke donorogen30. De good manufacturing practices (GMP)-conforme productie van het ATMP werd gevalideerd met behulp van menselijk donorweefsel33. Ten slotte werden zowel de veiligheid als de efficiëntie van de aanpak in vivo beoordeeld bij drie verschillende soorten waarvoor het protocol is aangepast: muis, rat en konijn. In de klinische opstelling zal een irisbiopsie van de patiënt worden geoogst en IPE-cellen zullen worden geïsoleerd en getransfecteerd in de cleanroom, voordat de cellen subretinaal terug in dezelfde patiënt worden getransplanteerd. Het hele proces vindt plaats tijdens een enkele chirurgische sessie die ongeveer 60 minuten duurt. De ontwikkeling van de behandelingsaanpak en de evaluatie van de efficiëntie ervan vroegen om uitstekende in vitro en ex vivo modellen om robuuste en efficiënte genafgiftemethoden te implementeren, om de efficiëntie van genafgifte, therapeutische eiwitproductie en neuroprotectieve effecten te analyseren, en om celtransplantaties te produceren om de aanpak in vivote testen1,24,25,29,30 . Het is vermeldenswaard dat de therapie de ethische goedkeuring heeft voor een klinische fase Ib / IIa-studie van de ethische commissie voor onderzoek van het kanton Genève (nr. 2019-00250) en momenteel worden de laatste preklinische gegevens die door Zwitserse regelgevende instanties om toestemming worden gevraagd, verzameld met behulp van het gepresenteerde protocol. In dit verband toonden preklinische in vivo gegevens een significante vermindering van CNV en uitstekende veiligheid24,25,31.
Hier wordt de isolatie en kweek van RPE/IPE-cellen van runderen, varkens, konijnen, ratten en muizen en het gebruik van het integratieve SB100X transposonsysteem in combinatie met elektroporatie als een efficiënte genafgiftemethode beschreven. Met name primaire PE-cellen werden getransfecteerd om PEDF en GM-CSF te overexpressie te maken. De verzameling van deze protocollen maakt het mogelijk om de in vitro en in vivo studies uit te voeren in alle preklinische fasen van ATMP-ontwikkeling. Bovendien heeft de opstelling de potentie om aangepast te worden aan andere genen en ziekten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De protocollen waarbij dieren betrokken waren, werden uitgevoerd door gecertificeerd personeel en na toestemming van het kantonnale Département de la sécurité, de l'emploi et de la santé (DSES), Domaine de l'expérimentation animale uit Genève, Zwitserland, en volgens de ARVO-verklaring voor het gebruik van dieren in oogheelkundig en visionair onderzoek (goedkeuringsnr. GE/94/17). Volwassen gezonde bruine fijnratten, C57BL /6-muizen en Nieuw-Zeelandse witte konijnen werden geëuthanaseerd door een overdosis Pentobarbital (150 mg / kg) verdund in 0,9% NaCl geïnjecteerd intraperitoneaal en de ogen werden onmiddellijk na het offer geënucleeerd. Varkens- en runderogen werden binnen 6 uur na het offer uit een lokaal slachthuis gehaald en op ijs naar het laboratorium vervoerd.
1. Voor de voorbereiding
- Bereid het volledige medium voor (DMEM/Ham's F12 aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 80 E/ml penicilline / 80 μg/ml streptomycine en 2,5 μg/ml amfotericine B). Verwarm het medium, 1x PBS en 0,25% trypsine (indien nodig) in een waterbad van 37 °C.
- Doe een steriel gordijn in de kap om een aseptische werkplek voor te bereiden. Introduceer alle benodigde steriele instrumenten en materialen in de kap.
OPMERKING: Alleen de enucleatie van de ogen en het reinigen van het resterende spierweefsel en de huid zijn de procedures die buiten de kap worden uitgevoerd, de rest van de stappen moet in de kap worden uitgevoerd.
2. Isolatie van PE-cellen van ratten/muizen
- Gebruik een gebogen schaar en Colibri-tang om de ogen te enucleeren na het euthanaseren van het dier. Reinig het resterende spierweefsel en de huid van de ogen met een schaar en een tang (niet steriel).
OPMERKING: De grootte van de schaar en tang die worden gebruikt voor de enucleatie en reiniging van de ogen hangt af van de soort (bijvoorbeeld voor ratten en muizen zullen de instrumenten kleiner zijn dan die voor varkens en runderen) (zie figuur S1).- Verzamel de ogen in een buis van 50 ml gevuld met niet-steriel PBS en breng de buis over naar de laminaire stroomkap. Desinfecteer de ogen door ze gedurende 2 minuten onder te dompelen in een oplossing op basis van jodium en breng ze vervolgens over in een petrischaal gevuld met steriel PBS.
- Openen van de lamp
- Nadat u de ogen naar een steriele petrischaal hebt overgebracht, houdt u er een stevig dicht bij de oogzenuw met Colibri of puntige tang. Prik een gat in de buurt van de grens van de iris (tussen pars plana en ora serrata) met een naald van 18 G. Steek een kleine schaar in het gat en knip rond de iris. Verwijder het voorste segment (hoornvlies, lens en iris) en doe het in een petrischaaltje. Laat de bol met het glasvocht totdat RPE-cellen zijn geïsoleerd.
- Isolatie van IPE-cellen
- Verwijder de lens en trek met een fijne tang voorzichtig de iris met de IPE-cellen eruit. Leg de iris in een petrischaaltje, was met steriel PBS en laat hem in PBS staan tot er meer iris klaar is.
- Herhaal stap 2.2.1 tot en met 2.3.1 zodat alle ogen die dag voorbereid zijn.
- Voeg 50 μL 0,25% trypsine per iris toe en incubeer gedurende 10 min bij 37 °C. Verwijder trypsine, voeg 150 μL volledig medium per iris toe en schraap de IPE voorzichtig met een platte, vuurgepolijste Pasteurpipet; gebruik een fijne tang om het weefsel te immobiliseren. Verzamel de celsuspensie en doe in een buis van 1,5 ml. Gebruik 10 μL van de celsuspensie verdund 1:3 met trypan blauw om de cellen in de Neubauer kamer34,35te tellen.
- Indien niet onmiddellijk getransfecteerd, zaai dan 200.000 cellen/put in een 24-well plaat (100.000 cellen/cm2) in 1 ml volledig medium (10% FBS) (voor zaaien zie tabel 1). Plaats de plaat in een couveuse en kweek deze bij 37 °C, 5% CO2.
OPMERKING: Het kan nodig zijn om meerdere ogen samen te voegen om voldoende cellen te hebben om te zaaien.
- Isolatie van RPE-cellen
- Verwijder glasvochthumor en netvlies uit het achterste segment met een dunne tang. Vermijd beschadiging van het retinale pigmentepitheel.
- Snijd het segment doormidden met een #10 scalpel om de wereldbol volledig open te hebben en was met steriel PBS.
- Voeg 50 μL 0,25% trypsine per oog toe en incubeer gedurende 10 min bij 37 °C. Verwijder trypsine en voeg 150 μL volledig medium per bol toe en schraap de RPE-cellen voorzichtig met een rond scalpel; gebruik een fijne tang om het weefsel te immobiliseren. Verzamel de celsuspensie en doe deze in een buis van 1,5 ml. Neem 10 μL van de celsuspensie; verdun 1:4 met trypan blauw om de cellen in de Neubauer-kamer te tellen.
- Zie stap 2.3.4.
OPMERKING: Het kan nodig zijn om meerdere ogen samen te voegen om voldoende cellen te hebben om te zaaien.
3. Isolatie van pe-cellen van konijnen
- Voer reiniging en desinfectie uit zoals beschreven in de stappen 2.1 tot en met 2.1.1.
- Plaats één oog op een steriel gaaskompres en houd het stevig dicht bij de oogzenuw. Open het oog met het scalpel #11 en schaar ongeveer 2 mm onder de limbus. Verwijder het voorste segment (hoornvlies, lens en iris) en doe het in een petrischaaltje. Laat de bol met het glasvocht totdat RPE-cellen zijn geïsoleerd.
- Isolatie van IPE-cellen
- Voer stap 2.3.1 uit. Verwijder het ciliaire lichaam van de iris door te snijden met een scalpel #10.
- Na de bereiding van 2 irissen, incuberen met 1 ml 0,25 % trypsine bij 37 °C gedurende 10 minuten; gedurende deze tijd kunnen de RPE-cellen worden geïsoleerd (zie stap 3.4). Verwijder de trypsine en voeg 1 ml volledig medium toe aan de iris en isoleer de cellen door voorzichtig te krabben met een platte, vuurgepolijste Pasteurpipet. Resuspend de cellen zorgvuldig door te pipetteren en breng de celsuspensie over in een buis van 1,5 ml. Neem 10 μL van de celsuspensie en verdun 1:3 met trypan blauw om de cellen in de Neubauer-kamer te tellen.
- Zie stap 2.3.4.
- Isolatie van RPE-cellen
- Voer stap 2.4.1 uit.
- Doe een steriel gaasje in een 12 putjesplaat en leg de bol over het gaasje.
- Was met PBS en voer stap 2.4.3 uit.
OPMERKING: Gebruik een gebogen vuurgepolijste Pasteur pipet. - Centrifugeer de cellen 10 min bij 120 x g.
- Zie stap 2.3.4.
4. Isolatie van PE-cellen van varkens
- Voer reiniging uit zoals beschreven in stap 2.1. Was met PBS en desinfecteer de ogen door ze gedurende 2 minuten onder te dompelen in een oplossing op basis van jodium, spoel met PBS. Ga verder met stap 3.2.
- Isolatie van IPE-cellen
- Voer stap 3.3.1 uit. Voeg na de bereiding van 2 irissen 1 ml volledig medium toe en isoleer de cellen door voorzichtig te krabben met een platte, vuurgepolijste Pasteur-pipet. Breng de celsuspensie over in een buis van 1,5 ml. Neem 10 μL van de celsuspensie en verdun 1:4 met trypan blauw om de cellen in de Neubauer-kamer te tellen.
- Zie stap 2.3.4.
- Isolatie van RPE-cellen
- Voer stap 2.4.1 uit. Leg de bol in een petrischaaltje en was met PBS. Vul de lamp met 1 ml volledig medium.
- Gebruik een gebogen vuurgepolijste Pasteur-pipet om RPE-cellen voorzichtig te verwijderen. Zorg ervoor dat u van de onderkant naar de bovenkant schraapt om te voorkomen dat u van het membraancomplex van het vaatvlies van de vaatvlies van De Vaat van Bruch naar beneden glijdt. Verzamel de celsuspensie in de lamp met behulp van een pipet van 1.000 μL en breng over in een buis van 1,5 ml voor resuspensie. Neem 10 μL van de celsuspensie en verdun 1:8 met trypan blauw om de cellen in de Neubauer-kamer te tellen.
- Zie stap 2.3.4.
5. Isolatie van PE-cellen van runderen
- Voer reiniging uit zoals beschreven in stap 2.1. Was met PBS en desinfecteer de ogen door ze gedurende 2 minuten onder te dompelen in een oplossing op basis van jodium, spoel met PBS. Ga verder met stap 3.2.
- Isolatie van IPE-cellen
- Voer stap 3.3.1 uit. Na de bereiding van twee irissen, incuberen met 2 ml van 0,25% trypsine bij 37 °C gedurende 10 minuten. Gedurende deze tijd kunnen de RPE-cellen worden geïsoleerd (zie stap 5.3).
- Verwijder de trypsine en voeg 2 ml volledig medium toe aan de iris en isoleer de cellen door voorzichtig te krabben met een platte, vuurgepolijste Pasteurpipet. Breng de celsuspensie over in een buis van 15 ml. Centrifugeer de cellen 10 min bij 120 x g. Neem 10 μL van de celsuspensie en verdun 1:4 met trypan blauw om de cellen in de Neubauer-kamer te tellen.
- Indien niet onmiddellijk getransfecteerd, zaai dan 320.000 cellen/put in een 6-well plaat in 3 ml volledig medium (10% FBS) (voor zaaien zie tabel 1). Plaats de plaat in een couveuse en kweek deze bij 37 °C, 5% CO2.
- Isolatie van RPE-cellen
- Volg stap 2.4.1. Leg de bol in een petrischaaltje en was met PBS. Na bereiding van 2 ogen vult u de bol ongeveer 3/4 met trypsine en incubeert u gedurende 25 minuten bij 37 °C met het deksel van de petrischaal bovenop de bulbi.
- Verwijder de trypsine en voeg 1 ml volledig medium toe. Voer stap 4.3.2 uit. Centrifugeer de cellen 10 min bij 120 x g.
- Zie stap 5.2.3.
6. Teelt - medium verandering
- Kweek de cellen in DMEM/Ham's F12, aangevuld met 10% FBS, 80 E/ml penicilline / 80 μg/ml streptomycine en 2,5 μg/ml amfotericine B, bij 37°C en 5% CO2 in een bevochtigde incubator. Pipetteer na 3-4 dagen op en neer om niet-hechtende cellen te verzamelen en doe de helft van het volume in een andere put. Vul tot 1 ml met volledig medium.
OPMERKING: Dit maakt het mogelijk om een oppervlak te hebben dat groot genoeg is voor alle cellen die geïsoleerd zijn om de uitvoer te bevestigen en te maximaliseren. - Herhaal na nog eens 3-4 dagen de celverzameling, maar deze keer door de niet-hechtende cellen uit twee putten in één put te bundelen (bijv. A1 + B1 in C1). Voeg medium toe aan alle putten. Observeer de cellen en verander het medium 2 keer per week (voor 6 en 24-well platen respectievelijk 3 en 1 ml / put gebruiken). Wanneer cellen samenvloeiing bereiken, schakel dan over naar een volledig medium met 1% FBS of gebruik de cellen voor experimenten (bijv. Transfectie).
OPMERKING: RPE- en IPE-cellen zijn respectievelijk confluent na 3-4 en 4-5 weken na isolatie. De celkweekzuiverheid werd bevestigd door de celmorfologie (gepigmenteerde cellen) en specifieke markers te controleren zoals beschreven door Johnen en collega's36.
7. Elektroporatie van primaire PE-cellen
- Voer elektroporatie uit zoals beschreven vóór1,37.
- Gebruik, afhankelijk van het aantal getransfecteerde cellen, 6-, 24- of 48-putplaten (zie tabel 2)om de cellen in medium te zaaien zonder antibiotica of antimycotica. Voeg gedurende de volgende 2 weken tweemaal per week druppels toe met medium dat penicilline (80 E / ml), streptomycine (80 μg / ml) en amfotericine B (2,5 μg / ml) bevat. Wissel het medium volledig om 2 weken na transfectie.
- Om celgroei, transfectie-efficiëntie en eiwitsecretie te bepalen, controleert u de cellen wekelijks door microscopie en analyseert u het celkweeksupernatant door western blot. Neem vóór beëindiging van de kweek een 24-uurs celkweeksupernatant om de eiwitsecretie per ELISA te kwantificeren, tel de cellen, meet fluorescentie met beeldgebaseerde cytometrie (in het geval van Venus-getransfecteerde cellen) volgens de instructies van de fabrikant (zie Tabel met materialen) en verzamel de celkorrel voor RT-qPCR-gebaseerde genexpressieanalyse.
OPMERKING: Deze methoden zijn niet opgenomen in dit artikel, omdat het niet de bedoeling is om de analyse van de cellen in detail uit te leggen, maar eerder hun isolatie. De celzaaidichtheid is voor alle soorten hetzelfde (100.000 cellen/cm2) maar omdat het aantal geïsoleerde cellen varieert, zijn er verschillende platen gebruikt. Bovendien kan het voor muizen, ratten en konijnen nodig zijn om 2-3 ogen te bundelen om voldoende cellen te hebben om te zaaien.
| Soort | Trypsine behandeling | Aantal IPE-cellen | N° RPE cellen | Plaat voor zaaien (100.000 cellen/cm2) |
| Muis/rat | Ja | ~50.000 | ~150.000 | 24-well platen |
| Konijn | Ja | ~350.000 | ~2.500.000 | 24-well platen |
| Varken | Nee | ~1.000.000 | ~3.000.000 | 24-well platen |
| Rund | Ja | ~1.700.000 | ~5.000.000 | 6-well platen |
Tabel 1: Aantal primaire PE-cellen geïsoleerd uit ogen van verschillende soorten.
| Naam | Gebied | Volume medium | Trypsine | Volumemedium om de werking van trypsine te stoppen | Zaaidichtheid |
| 6-goed bord | 9,6 cm² | 3,0 ml | 0,5 ml | 1,0 ml | 3x105 |
| 24-wells plaat | 2,0 cm² | 1,0 ml | 0,2 ml | 0,8 ml | 5x104 |
| 48-well plaat | 1,1 cm² | 0,5 ml | 0,1 ml | 0,4 ml | 0,5-1x104 |
Tabel 2: Celkweekvolumes en zaaidichtheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PE-isolatie van verschillende zoogdiersoorten
Met behulp van de bovengenoemde protocollen werden IPE- en RPE-cellen met succes geïsoleerd en gekweekt van vijf verschillende soorten. Het aantal cellen dat bij elke procedure wordt verkregen, is afhankelijk van de soort en de grootte van het oog(tabel 1). Zoals weergegeven in figuur 1,vertonen cellen typische PE-celmorfologie en pigmentatie (behalve voor getoonde konijnencellen, afgeleid van albino New Zealand White (NZW) konijnen). Na 21 dagen na de isolatie zijn de cellen confluent, klaar om te worden gebruikt voor verdere experimenten (bijv. Transfecties). Opgemerkt moet worden dat culturen van alle soorten verder worden gemonitord en gecontroleerd tot 2 jaar, wat de normale morfologie en stabiele transgenexpressie bevestigt (gegevens niet weergegeven).
Dedifferentiatie, cellulaire stress en veranderingen in genexpressie werden uitgesloten door RT-qPCR en immunohistochemie. Een panel van genen (VEGF, CRALBP, CATD, ZO-1, KRT8) geanalyseerd in getransfecteerde menselijke RPE-cellen (ARPE-19 cellen) bevestigde normaal RPE-expressiepatroon1; die in primaire IPE-cellen van runderen zou kunnen worden bevestigd door immunofluorescentie voor RPE65 (figuur 2). Bovendien bevestigden Johnen en collega's de ZO-1-immunostaining in primaire varkens IPE- en RPE-cellen36.
Figuur 1: Microfoto's van PE-cellen van verschillende zoogdieren 21 dagen na isolatie. IPE- en RPE-cellen van muis, konijn (albino NZW-konijn), varken en rund worden getoond op dag 21 na isolatie. Voor alle soorten geldt dat de getoonde culturen samenvloeiend zijn. Merk op dat de PE-cellen van het konijn niet gepigmenteerd zijn (oorspronkelijke vergroting, 50x). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: RPE65 immunostaining van primaire IPE-cellen. RPE65 (groene) kleuring van runder IPE cellen getransfecteerd met de pFAR4-CMV-PEDF transposon plasmide met behulp van een initieel celnummer van 1 x 104 cellen in vergelijking met niet-getransfecteerde controlecellen (oorspronkelijke vergroting, 200x). Kernen waren gekleurd met DAPI (blauw). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Levensvatbaarheid van getransfecteerde primaire RPE
De levensvatbaarheid van cellen is weergegeven in figuur 3. Om een potentiële toxiciteit van de buffer die voor het elektroporatieproces wordt gebruikt uit te sluiten, werden voorgekweekte primaire RPE-cellen gesuspendeerd in elektroporatiebuffer uit een in de handel verkrijgbare kit, of in een voedingsbuffer ontwikkeld door een farmaceutisch bedrijf (vertrouwelijke samenstelling) en geëlektroporated (E) (zonder toevoeging van plasmide) zoals beschreven in stap 7 van het protocol. De levensvatbaarheid van de cel werd 3 ± 1 dagen na de transfectie bestudeerd met behulp van een in de handel verkrijgbare cytotoxiciteitstestkit (zie Materiaaltabel) volgens de instructies van de fabrikant. De testen werden altijd uitgevoerd met een controle zonder vermogen (Co-P) (niet geëlektropoteerd). Er werd geen effect op de levensvatbaarheid van cellen waargenomen voor een van de geteste buffers(figuur 3).
Figuur 3: Levensvatbaarheid van primaire RPE-cellen gesuspendeerd in verschillende buffers. 1 x 104 cellen werden gesuspendeerd in elektroporatiebuffer uit een in de handel verkrijgbare kit of in een voedingsbuffer. De levensvatbaarheid van de cel werd 3 ± 1 dagen na de transfectie gemeten met behulp van een in de handel verkrijgbare cytotoxiciteitstestkit. Er werden geen verschillen in levensvatbaarheid waargenomen tussen de verschillende buffers; gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD (n=2 donors, 3 replicates/donor). E: geëlektroporated cellen, Co-P: controle zonder stroom. AU: willekeurige eenheden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Transfecties van voorgekweekte PE-cellen met het Venus reporter-gen
50.000-100.000 voorgekweekte PE-cellen van verschillende soorten werden getransfecteerd met het gele fluorescerende Venus-eiwit (pT2-CAGGS-Venus) met behulp van het hyperactieve SB100X transposon-genafgiftesysteem. Microfoto's in figuur 4 bevestigen dat de cellen met succes werden getransfecteerd (fluorescerende cellen 21 dagen na transfectie). Figuur 5 toont de kwantificering van de transfectie-efficiëntie in voorgekweekte varkens-RPE-cellen (n=6 donoren, 50.000 cellen/transfectie) getransfecteerd met Venus (pT2-CAGGS-Venus). Het percentage fluorescerende cellen en MFI werd gemeten met behulp van beeldgebaseerde cytometrie volgens de instructies van de fabrikant op de dag van beëindiging van de celkweek (30 ± 5 dagen na transfectie). Het gemiddelde percentage fluorescerende cellen was 50 ± 30%, maar variabel variërend van 95 ± 6% (donor 2) tot 28 ± 1% (donor 4) (figuur 5). In alle experimenten werden getransfecteerde ARPE-19-cellen gebruikt als positieve controle. Bovendien werd de transfectie-efficiëntie altijd vergeleken met de negatieve controles: Co-P (controle zonder vermogen [niet geëlektropotificeerd]) en Co +P (regeling met vermogen [geëlektroporated maar zonder toevoeging van plasmiden]). Het experiment is ook uitgevoerd met IPE-cellen (gegevens niet getoond).
Figuur 4: Microfoto's van voorgekweekte PE-cellen getransfecteerd met pT2-CAGGS-Venus. Venus-getransfecteerd konijn (A), runder (B) en varkens (C) PE-cellen worden getoond op 21 dagen na transfectie. Als positieve controle werden 50.000 ARPE-19 cellen getransfecteerd met Venus (D). Linker micrograaf: helder veld, rechter micrograaf: GFP (480 nm) filter (originele vergroting, 50x). Transfecties werden uitgevoerd in drievoud en negatieve controles werden opgenomen: Co-P (controle zonder vermogen [niet geëlektroporated]) en Co + P (controle met vermogen [geëlektroporated maar zonder toevoeging van plasmiden]) (niet getoond). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Transfectie-efficiëntie in varkens RPE-cellen getransfecteerd met het Venus reporter-gen. (A)50.000 primaire varkens RPE-cellen werden getransfecteerd met pT2-CAGGS-Venus, de totale gemiddelde transfectie-efficiëntie was 50 ± 30% en de gemiddelde MFI was 2712 ± 197 op de dag van beëindiging van de celculturen (30±5 dagen na transfectie). De grafiek toont de gemiddelde ± SD (n=3 replicaties) van 6 verschillende dieren. (B)Het percentage Venus+ ARPE-19 cellen gebruikt als een positieve controle, was 98±6% en was stabiel gedurende de 138 dagen dat de cellen werden gevolgd. De gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) was 5.785 ± 1.255. De grafiek toont de gemiddelde ± SD (n=3 replicaties) voor elke dag. Co-P (controle zonder vermogen [niet geëlektroporated]) en Co+P (controle met vermogen [geëlektroporated maar zonder toevoeging van plasmiden]) werden opgenomen in alle transfectie-experimenten (niet getoond). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Transfecties van verse PE-cellen met Venus reporter gen
10.000-50.000 PE-cellen vers geïsoleerd van konijnen werden getransfecteerd met het gele fluorescerende eiwit Venus (pFAR4-CMV-Venus) en celculturen werden gevolgd door microscopie. In figuur 6 kunnen fluorescerende cellen worden waargenomen op dag 21 na transfectie. Het percentage fluorescerende cellen gemeten door beeldgebaseerde cytometrie was 53 ± 29% voor IPE-cellen en 28 ± 23% voor RPE-cellen (gegevens niet weergegeven).
Figuur 6: Micrografieën van vers getransfecteerde PE-cellen geïsoleerd uit konijn. 50.000 IPE- en RPE-cellen van konijn werden getransfecteerd met pFAR4-CMV-Venus. De fluorescentie wordt getoond op dag 21 na transfectie. Linker micrograaf: helder veld, rechter micrograaf: GFP (480 nm) filter. In alle gevallen werden transfecties in drievoud uitgevoerd (oorspronkelijke vergroting, 50x). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Transfecties van PE-cellen met de therapeutische genen PEDF en GM-CSF
50.000 PE-cellen werden getransfecteerd met PEDF en eiwitsecretie werd gecontroleerd door WB(figuur 7). Het WB-signaal voor getransfecteerde cellen was hoger in vergelijking met de niet-getransfecteerde cellen voor alle bestudeerde soorten en dagen; binnen deze tijd werd geen afname van de eiwitsecretie waargenomen.
Figuur 7: WB-analyse van PEDF-secretie van getransfecteerde PE-cellen. WB-analyse van supernatanten van varkens (voorgekweekt) (A) en runderen (vers) (B) PEDF-getransfecteerde PE-cellen vertonen een hogere PEDF-secretie in vergelijking met de controle (niet-getransfecteerde cellen) en stabiel in de tijd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur S1: Instrumenten die worden gebruikt voor PE-isolatie, afhankelijk van de soort. (A) Niet-steriele instrumenten die worden gebruikt voor de enucleatie van de ogen en het reinigen van het resterende spierweefsel en de huid. Set 1 wordt gebruikt voor rat, muis en konijn en set 2 wordt gebruikt voor varkens- en rundveeogen. (B) Steriele instrumenten die worden gebruikt voor PE-isolatie. Let op de verschillende grootte van de gebruikte schaar en tang, afhankelijk van de ooggrootte. Ronde en platte vuurgepolijste Pasteur pipetten worden gebruikt voor het schrapen van respectievelijk RPE en IPE. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het hebben van gestandaardiseerde methoden om PE-cellen te isoleren en te kweken is van fundamenteel belang bij het ontwikkelen van nieuwe therapiebenaderingen voor retinale degeneratieve ziekten. Met de hier gepresenteerde protocollen kunnen PE-cellen met succes worden geïsoleerd van verschillende soorten en gedurende lange perioden worden gekweekt (tot nu toe werd de langste cultuur gedurende 2 jaargehandhaafd 1,38); typische PE-celmorfologie, pigmentatie en functie werd waargenomen(figuur 1, figuur 2). Merk op dat het met name voor pure RPE-culturen belangrijk is om het netvlies volledig te extraheren om besmetting met neurale retinale cellen te voorkomen; voor IPE-cellen moet het ciliaire lichaam van de iris worden verwijderd zoals uitgelegd in het protocol. Confluentie van de cellen wordt bereikt in een relatief korte tijd (~ 21 dagen), waarna de cellen klaar zijn voor transfectie met therapeutische genen of voor gebruik in andere experimenten (bijv. Blootstelling aan toxische stoffen, eiwitten, enz.). Bovendien zijn de protocollen niet alleen cruciaal voor preklinische in vitro en in vivo testen, maar ook belangrijk voor toepassing op de mens, d.w.z. de validatie van getransfecteerde PE-celtransplantaties; in het bijzonder voor de behandeling van LMD zoals in ontwikkeling door onze groep, waar IPE-cellen worden geïsoleerd uit een irisbiopsie, onmiddellijk getransfecteerd en subretinaal getransplanteerd naar dezelfde patiënt binnen één chirurgische sessie. De isolatie en subretinale transplantatie van autologe IPE-cellen werd vastgesteld bij konijnen39 en patiënten23. Omdat de transplantatie van autologe IPE-cellen succesvol was, maar niet voldoende om het gezichtsvermogen te herstellen, was transfectie van de cellen om neuroprotectieve factoren, zoals PEDF en GM-CSF, overexpressie te geven, aan de aanpak toegevoegd en vastgesteld in nog drie soorten (muis, rat en vee). Met de hier beschreven methoden voor de isolatie, kweek en genetische modificatie van PE-cellen kunnen nu respectieve celtransplantaties van verschillende soorten worden bereid om de toxiciteit en efficiëntie van de aanpak in vivote testen .
Er werd aangetoond dat, met behulp van het hyperactieve SB100X transposonsysteem, PE-cellen van verschillende oorsprong efficiënt kunnen worden gewijzigd om PEDF te overexpressie(figuur 7); vergelijkbare resultaten met rat IPE en RPE24 en menselijke RPE-cellen29,30 zijn gepubliceerd. De transfectie met PEDF is voorgesteld om nvAMD te behandelen door remming van VEGF-gemedieerde neovascularisatie en bescherming van RPE-cellen en retinale neuronen tegen glutamaat en oxidatieve stress, evenals ischemie40,41. Bevestiging van stabiele eiwitsecretie op lange termijn (figuur 7) bevestigde PE-cellen als een betrouwbaar biologisch "medicijnafgiftesysteem". In dit opzicht bevestigde transfectie-efficiëntie bestudeerd met het reportergen Venus (Figuur 4, Figuur 5, Figuur 6) hoge transfectie-efficiënties van ~ 20-100% (soort- en donorafhankelijk) zoals gerapporteerd in Johnen et al. 1.
Opgemerkt moet worden dat hoewel de grootte van de gebruikte plasmiden variabel was, van pFAR-miniplasmiden (~ 3.000 bp) tot plasmiden met een pT2-backbone (~ 5.000 bp)30, transfectie-efficiënties vergelijkbaar hoog waren. Verschillen gezien in transfectie-efficiëntie zijn waarschijnlijk te wijten aan variabiliteit in de tijd van enucleatie tot celisolatie en in weefselbehoud, maar veranderden de celmorfologie niet, noch de tijd dat de cellen samenvloeiing bereikten (~ 21 dagen na isolatie), of tijd dat de cellen werden gevolgd na transfectie. Over het algemeen is een belangrijke overweging om een succesvolle transfectie te bereiken dat de bron van PE-cellen zo vers mogelijk moet zijn; dit is vooral belangrijk voor transfecties met vers geïsoleerde PE-cellen.
In vergelijking met celbladtransplantaties is de therapie die onze groep ontwikkelt (getransfecteerde cellen die subretinaal worden getransplanteerd als celsuspensie) minder invasief omdat de eerste grote retinotomieën vereist met de bijbehorende risico's van proliferatieve vitreoretinopathie en subretinale fibrose42. Bovendien wordt bij plaattransplantaten voor natte AMD het gebied van CNV samen met het aangrenzende vaatvlies verwijderd en daarom kan de overleving van het transplantaat in gevaar worden gebracht43. Ten slotte is het idee om een celpleister te gebruiken niet compatibel met de voorgestelde procedure, waarbij de isolatie, wijziging en transplantatie van de cellen wordt gedaan tijdens een enkele chirurgische sessie. Aan de andere kant zijn inherente problemen van PE-cellen getransplanteerd als celsuspensies potentiële celdood tijdens de bevalling, gebrek aan adhesie en variantie in cellulaire distributie; maar deze nadelen kunnen worden ondervangen door tissue engineering-benaderingen42; bovendien kan de celoverleving worden verbeterd door het gebruik van pro-overlevingsmiddelen44,45,46,47. Wij geloven dat de transplantatie van primaire PE-cellen die neuroprotectieve factoren zoals PEDF en GM-CSF als celsuspensie overexpressie geven, een veelbelovende benadering is om AMD te behandelen, en om deze therapie te ontwikkelen, zijn de hier gepresenteerde protocollen cruciaal omdat ze de standaardisatie van de isolatie, kweek en analyse van de primaire PE-cellen mogelijk maken.
Samenvattend levert het protocol een geavanceerd modelsysteem voor de ontwikkeling en preklinische in vitro en in vivo testen van oculaire geavanceerde medicinale therapieën in vijf verschillende soorten, robuust genoeg om individuele variaties in celkwaliteit van de verschillende bronnen te compenseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Een bedankje verdient Gregg Sealy en Alain Conti voor hun uitstekende technische assistentie. Dit werk werd ondersteund door de Europese Commissie in het kader van het zevende kaderprogramma, de Zwitserse National Sciences Foundation en de Schmieder-Bohrisch Foundation. Z.I. ontving financiering van de European Research Council, ERC Advanced [ERC-2011-ADG 294742] en B.M.W. van een Fulbright Research Grant en Swiss Government Excellence Scholarship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plates | Corning | 353043 | |
| 24-well plates | Corning | 353047 | |
| 48-well plates | ThermoFisher Scientific | 150687 | |
| 6-well plate | Greiner | 7657160 | |
| Betadine | Mundipharma | ||
| Bonn micro forceps flat | |||
| Colibri forceps (sterile) | |||
| CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay | Promega | G9291 | |
| DMEM/Ham`s F12 | Sigma-Aldrich | D8062 | |
| Drape (sterile) | Mölnlycke Health Care | 800530 | |
| Electroporation buffer 3P.14 | 3P Pharmaceutical | ||
| FBS | Brunschwig | P40-37500 | |
| Forceps (different size) (sterile) | |||
| Gauze compress | PROMEDICAL AG | 25403 | |
| NaCl (0.9%) | Laboratorium Dr. Bichsel AG | 1000090 | |
| Needle (18G) | Terumo | TER-NN1838R | |
| Neon Transfection kit 10 µL | ThermoFisher Scientific | MPK1096 | |
| Neon Transfection System | ThermoFisher Scientific | MPK5000S | |
| Neubauer chamber | Marienfeld-superior | 640010 | |
| Pasteur pipette (fire-polish) | Witeg | 4100150 | |
| PBS 1X | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781-100 | |
| Pentobarbital (Thiopental Inresa) | Ospedalia AG | 31408025 | |
| Petri dish | ThermoFisher Scientific | 150288 | |
| pFAR4-PEDF | |||
| pFAR4-SB100X | |||
| pFAR4-Venus | Pastor et al., 2018. Kindly provided by Prof. Scherman and Prof. Marie | ||
| pSB100X (250 ng/µL) | Mátés et al., 2009. Provide by Prof. Izsvak | ||
| pT2-CAGGS-Venus | Johnen et al., 2012 | ||
| pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/µL) | Cloned in our lab | ||
| pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/µL) | Pastor et al., 2018 | ||
| scarpel no. 10 | Swann-Morton | 501 | |
| scarpel no. 11 | Swann-Morton | 503 | |
| Sharp-sharp tip curved Extra Fine Bonn Scissors (sterile) | |||
| Sharp-sharp tip straight Extra Fine Bonn Scissors (sterile) | |||
| Tali Image-Based Cytometer | ThermoFisher Scientific | T10796 | |
| Trypsin 0.25% | ThermoFisher Scientific | 25050014 | |
| Trypsin 5%/EDTA 2% | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| Vannas spring scissors curved (sterile) |
References
- Johnen, S., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (8), 4787-4796 (2012).
- Prado, D. A., Acosta-Acero, M., Maldonado, R. S. Gene therapy beyond luxturna: A new horizon of the treatment for inherited retinal disease. Current Opinion in Ophthalmology. 31 (3), 147-154 (2020).
- Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. The Lancet. 390, 849-860 (2017).
- Age Related Macular Degeneration and Data and Statistics. NIH. , Available from: https://nei.nih.gov/learn-about-eye-health/resources-for-health-educators/eye-health-data-and-statistics/age-related-macular-degeneration-amd-data-and-statistics (2020).
- Al-Zamil, W. M., Yassin, S. A. Recent developments in age-related macular degeneration: A review. Clinical Interventions in Aging. 12, 1313-1330 (2017).
- Stahl, A. The diagnosis and treatment of age-related macular degeneration. Deutsches Arzteblatt International. 117, 513-520 (2020).
- Mitchell, P., Liew, G., Gopinath, B., Wong, T. Y.
- Binder, S., et al. Transplantation of autologous retinal pigment epithelium in eyes with foveal neovascularization resulting from age-related macular degeneration: a pilot study. American Journal of Ophthalmology. 133 (2), 215-225 (2002).
- Binder, S., et al. Outcome of transplantation of autologous retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: a prospective trial. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 45 (11), 4151-4160 (2004).
- Binder, S. The Macula. Diagnosis, treatment and future trends. , Springer-VerlaglWien. New York. 7985-7987 (2004).
- da Cruz, L., et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nature Biotechnology. 36 (4), 1-10 (2018).
- Stanga, P. E., et al. Retinal pigment epithelium translocation after choroidal neovascular membrane removal in age-related macular degeneration. Ophthalmology. 109 (8), 1492-1498 (2002).
- Van Zeeburg, E. J. T., Maaijwee, K. J. M., Missotten, T. O. A. R., Heimann, H., Van Meurs, J. C. A free retinal pigment epitheliumchoroid graft in patients with exudative age-related macular degeneration: Results up to 7 years. American Journal of Ophthalmology. 153 (1), 120-127 (2012).
- Chen, F. K., et al. Long-term visual and microperimetry outcomes following autologous retinal pigment epithelium choroid graft for neovascular age-related macular degeneration. Clinical and Experimental Ophthalmology. 37 (3), 275-285 (2009).
- Mandai, M., et al. Autologous induced stem-cell-derived retinal cells for macular degeneration. New England Journal of Medicine. 376 (11), 1038-1046 (2017).
- Akyol, E., Lotery, A. Gene, cell and antibody-based therapies for the treatment of age-related macular degeneration. Biologics: Targets and Therapy. 14, 83-94 (2020).
- Hemera Biosciences. Treatment of advanced dry age related macular degeneration with AAVCAGsCD59. ClinicalTrialsgov. , NCT03144999 (2019).
- , Hemera Biosciences. Intravitreal AAVCAGsCD59 for advanced dry age-related macular degeneration (AMD) with geographic atrophy (GA). ClinicalTrialsgov. , NCT04358471 (2020).
- Gyroscope Therapeutics. First in human study to evaluate the safety and efficacy of GT005 administered in subjects with dry AMD. ClinicalTrialsgov. , NCT03846193 (2019).
- Thumann, G., et al. Transplantation of autologous iris pigment epithelium after removal of choroidal neovascular membranes. Archives of Ophthalmology. 118 (10), 1350-1355 (2000).
- Thumann, G., Salz, A. K., Walter, P., Johnen, S. Preservation of photoreceptors in dystrophic RCS rats following allo- and xenotransplantation of IPE cells. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 247 (3), 363-369 (2009).
- Crafoord, S., Geng, L., Seregard, S., Algvere, P. V. Photoreceptor survival in transplantation of autologous iris pigment epithelial cells to the subretinal space. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 80 (4), 387-394 (2002).
- Aisenbrey, S., et al. Iris pigment epithelial translocation in the treatment of exudative macular degeneration: A 3-year follow-up. Archives of Ophthalmology. 124 (2), 183-188 (2006).
- Garcia-Garcia, L., et al. Long-term PEDF release in rat iris and retinal epithelial cells after sleeping beauty transposon-mediated gene delivery. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 9, 1-11 (2017).
- Kropp, M., et al. Results of a biodistribution study of Venus transfected pigment epithelial cells transplanted subretinally in rabbits. Association for Research in Vision and Ophthalmology. , (2016).
- Kropp, M., et al. Improved transferability of a disease model for avascular age-related macular degeneration (AMD) to evaluate cell-based gene therapies using aged mice. ISSCR Annual Meeting. , Boston, USA. Meeting Abstract: MDD228. Poster (2020).
- Uebersax, E. D., Grindstaff, R. D., Defoe, D. M. Survival of the retinal pigment epithelium in vitro: Comparison of freshly isolated and subcultured cells. Experimental Eye Research. 70 (3), 381-390 (2000).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
- Thumann, G., et al. Engineering of PEDF-expressing primary pigment epithelial cells by the sb transposon system delivered by pFAR4 plasmids. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 6, 302-314 (2017).
- Pastor, M., et al. The antibiotic-free pFAR4 vector paired with the sleeping beauty transposon system mediates efficient transgene delivery in human cells. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 11, 57-67 (2018).
- Hernández-Pinto, A., et al. PEDF peptides promote photoreceptor survival in rd10 retina models. Experimental Eye Research. 184, 24-29 (2019).
- Bascuas, T., et al. Non-virally transfected primary human pigment epithelium cells overexpressing the oxidative stress reduction factors PEDF and GM-CSF to treat retinal neurodegeneration neurodegenerationl. Human Gene Therapy. 30 (11), (2019).
- Kropp, M., et al. Development of GMP-compliant production of freshly isolated and transfected iris pigment epithelial (IPE) cells to treat age-related macular degeneration (AMD). Human Gene Therapy. Meeting abstract: P371 Poster. , (2017).
- Marienfeld. Marienfeld Technical information Neubauer-improved. , Available from: https://www.marienfeld-superior.com/information-about-our-counting-chambers.html (2020).
- Electron Microscopy Sciences. Neubauer Haemocytometry. , Available from: https://www.emsdiasum.com/microscopy/technical/datasheet/68052-14.aspx (2020).
- Johnen, S., Wickert, L., Meier, M., Salz, A. K., Walter, P., Thumann, G. Presence of xenogenic mouse RNA in RPE and IPE cells cultured on mitotically inhibited 3T3 fibroblasts. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (5), 2817-2824 (2011).
- Bascuas, T., et al. Induction and analysis of oxidative stress in sleeping beauty transposon-transfected human retinal pigment epithelial cells. Journal of Visualized Experiments. , e61957 (2020).
- Thumann, G., et al. High efficiency non-viral transfection of retinal and iris pigment epithelial cells with pigment epithelium-derived factor. Gene Therapy. 17, 181-189 (2010).
- Thumann, G., et al. Transplantation of autologous iris pigment epithelium to the subretinal space in rabbits. Transplantation. 68, 195-201 (1999).
- Bilak, M. M., et al. Pigment epithelium-derived factor (PEDF) protects motor neurons from chronic glutamate-mediated neurodegeneration. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 58, 719-728 (1999).
- Duh, E. J., et al. Pigment epithelium-derived factor suppresses ischemia-induced retinal neovascularization and VEGF-induced migration and growth. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 43, 821-829 (2002).
- Chichagova, V., et al. Cellular regeneration strategies for macular degeneration: Past, present and future. Eye. 32 (5), 946-971 (2018).
- Veckeneer, M., et al. angiography documented reperfusion of translocated autologous full thickness RPE-choroid graft for complicated neovascular age-related macular degeneration. Eye. 31, 1274-1283 (2017).
- Afshari, F. T., et al. Integrin activation or alpha9 expression allows retinal pigmented epithelial cell adhesion on Bruch's membrane in wet age-related macular degeneration. Brain. 133, 448-464 (2010).
- Tezel, T. H., Kaplan, H. J., Del Priore, L. V. Fate of human retinal pigment epithelial cells seeded onto layers of human Bruch's membrane. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 40 (2), 467-476 (1999).
- Tezel, T. H., Del Priore, L. V., Kaplan, H. J. Reengineering of aged Bruch's membrane to enhance retinal pigment epithelium repopulation. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 45 (9), 3337-3348 (2004).
- Tezel, T. H., Del Priore, L. V. Repopulation of different layers of host human Bruch's membrane by retinal pigment epithelial cell grafts. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 40 (3), 767-774 (1999).
