Summary
Her præsenteres en protokol om at isolere og transfekte primær iris og retinale pigment epitelceller fra forskellige pattedyr (mus, rotte, kanin, gris og kvæg). Metoden er velegnet til at studere okulære genterapimetoder i forskellige set-ups til ex vivo-analyser og in vivo-studier, der kan overføres til mennesker.
Abstract
Aldersrelateret makuladegeneration (AMD) er den hyppigste årsag til blindhed hos patienter >60 år, der påvirker ~ 30 millioner mennesker på verdensplan. AMD er en multifaktoriel sygdom påvirket af miljømæssige og genetiske faktorer, som fører til funktionel svækkelse af nethinden på grund af retinale pigment epitel (RPE) celledegeneration efterfulgt af fotoreceptor nedbrydning. En ideel behandling ville omfatte transplantation af sunde RPE-celler udskille neuroprotektive faktorer for at forhindre RPE celle død og fotoreceptor degeneration. På grund af de funktionelle og genetiske ligheder og muligheden for en mindre invasiv biopsi blev transplantation af irispigmentepileleceller (IPE) foreslået som erstatning for degenererede RPE. Udskillelse af neuroprotektive faktorer ved et lavt antal subretinally transplanterede celler kan opnås ved Tornerose (SB100X) transposon-medieret transfektion med gener, der koder for pigment epitel-afledt faktor (PEDF) og / eller granulocyt makrofag-koloni stimulerende faktor (GM-CSF). Vi etablerede isolation, kultur og SB100X-medieret transfection af RPE- og IPE-celler fra forskellige arter, herunder gnavere, grise og kvæg. Glober er explanted og hornhinden og linsen fjernes for at få adgang til iris og nethinden. Ved hjælp af en skræddersyet spatel fjernes IPE-celler fra den isolerede iris. For at høste RPE-celler kan en trypsinininkubation være påkrævet, afhængigt af arten. Derefter suspenderes cellerne med RPE-tilpasset spatel med medium. Efter såning overvåges cellerne to gange om ugen og overføres efter sammenløb ved elektroporation. Genintegration, udtryk, proteinsekretion og funktion blev bekræftet af qPCR, WB, ELISA, immunofluorescence og funktionelle analyser. Afhængigt af arten kan 30.000-5 millioner (RPE) og 10.000-1,5 millioner (IPE) celler isoleres pr. Øje. Genetisk modificerede celler udviser betydelig PEDF/GM-CSF-overekspression med kapacitet til at reducere oxidativ stress og tilbyder et fleksibelt system til ex vivo-analyser og in vivo-undersøgelser, der kan overføres til mennesker for at udvikle okulære genterapitilgange.
Introduction
Vores gruppe fokuserer på udvikling af regenerative tilgange til behandling af neuroretinal degeneration, dvs. AMD, ved RPE- og IPE-baseret ikke-viral genterapi. Den prækliniske etablering af sådanne behandlinger kræver in vitro-modeller, der kan overføres til mennesker. Således er målet med undersøgelsen præsenteret her at levere protokoller for isolering, kultur og genteknologi af primære RPE- og IPE-celler. Begrundelsen for at etablere isolering af PE-celler fra flere arter er at bekræfte tilgangens sikkerhed og effektivitet og øge dens reproducerbarhed og overførbarhed. Den tilgængelige menneskelige RPE-cellelinje ARPE-19 adskiller sig fra primære celler (f.eks. er de mindre pigmenterede) og er derfor kun af begrænset værdi for prækliniske analyser1. Derudover kan ikke-menneskelige pattedyrceller købes til mindre omkostninger og i større mængder; human donorvæv kan fås fra forskellige Eye Banks, men tilgængeligheden er begrænset og dyr. Endelig skal nye lægemidler til avanceret terapi (ATMP, dvs. celle-, vævs- eller genterapilægemiddel) anvendes i mindst to forskellige arter, før de testes hos patienter, og disse in vivo-undersøgelser anmoder om forberedelse af allogene celletransplantationer.
Retinal neurodegenerative sygdomme er den hyppigste årsag til blindhed i de industrialiserede lande, der omfatter almindelige sygdomme som AMD, samt sjældne sygdomme som retinitis pigmentosa, hvor nethinden celledød i sidste ende fører til blindhed. RPE celler, fotoreceptor, og retinal ganglion celler (RGC) skader kan i nogle tilfælde bremses, men der er i øjeblikket ingen helbredende behandlinger til rådighed. ATMPs giver mulighed for at korrigere gendefekter, integrere terapeutiske gener eller erstatte degenererede celler, hvilket muliggør udvikling af regenerative og helbredende behandlinger for sygdomme som AMD; 13 genterapier allerede fået markedsføring godkendelse, herunder en behandling til behandling af RPE65 mutation-associerede retinal degeneration2,3. Blandt ældre voksne (>60 år), ~ 30 millioner mennesker verden over er påvirket af enten neovaskulære (nvAMD) eller avaskulære (aAMD) AMD4. Begge former er induceret af aldersrelaterede udløsere, herunder oxidative skader, funktionsnedsættelse og tab af RPE-celler efterfulgt af fotoreceptorforringelse, blandt andre (f.eks. genetisk risiko alleler, rygning, forhøjet blodtryk)5,6. I nvAMD forværres patogenese af en ubalance af angiogene og anti-angiogene faktorer til fordel for den angiogene Vaskulære endotelvækstfaktor (VEGF), der fremkalder choroidal neovascularization (CNV). Til dato kan kun nvAMD behandles ved månedlige intravitreale injektioner af hæmmere af VEGF-proteinet for at undertrykke CNV; der foreligger endnu ingen effektiv behandling for aAMD6,7.
Flere undersøgelser evaluerede cellebaserede behandlinger for at erstatte anti-VEGF-behandlingen: undersøgelser foretaget af Binder et al., hvor friskhøstede autologe RPE-celler blev transplanteret til patienter med nAMD8,9,10, viste moderat visuel forbedring, men kun en lille gruppe patienter nåede en endelig synsstyrke høj nok til at muliggøre læsning. For nylig brugte et klinisk fase I-studie et embryonalt stamcelleafledt RPE-plaster til behandling af AMD med lovende resultater; effekt, stabilitet og sikkerhed af RPE-plasteret i op til 12 måneder hos 2 af de 10 patienter, der blev behandlet11. Derudover har flere grupper offentliggjort undersøgelser, hvor autologe RPE-Bruch's membran-choroid patches blev høstet fra den perifere nethinde og transplanteret til macula12,13,14; og inducerede pluripotente stamceller (iPSC)-afledte RPE-patches blev genereret til transplantation15. For aAMD er antistoffer rettet mod komplementvejen blevet testet i kliniske forsøg6,16 og et fase I-studie ved hjælp af en enkelt intravitreal injektion af en adeno-associeret viral (AAV) vektor, der koder genet for faktoren CD59 (AAVCAGsCD59) hos patienter med geografisk atrofi (GA) blev afsluttet17; fase II-studiet startede for nylig og har til formål at rekruttere 132 patienter med avanceret aAMD og at evaluere resultatet ved 2 år efter intervention18. Endelig har FocuS-studiegruppen startet et fase I/II multicenter klinisk forsøg, der evaluerer sikkerheden, dosisresponset og effekten af en rekombinant ikke-replikerende AAV-vektor, der kodning af en menneskelig komplementfaktor19.
Primært er målet med en regenerativ AMD-behandling transplantation af funktionelle RPE-celler, som blev beskadiget eller tabt. IPE- og RPE-celler deler imidlertid mange funktionelle og genetiske ligheder (f.eks. fagocytose og retinolmetabolisme), og fordi IPE-celler er mere feaably høstet, er de blevet foreslået som RPE-erstatning20. Selv om det tidligere er blevet påvist, at IPE-celletransplantationen forsinker fotoreceptordegeneration i dyremodeller21,22 og stabiliserer visuel funktion hos patienter med end-stage nvAMD, blev der ikke observeret nogen signifikant forbedring hos disse patienter23. Den manglende effekt kan skyldes det lave antal transplanterede celler, og / eller ubalancen af neuroprotektive retinale faktorer. En alternativ tilgang ville være at transplantere transfected pigment epitelceller, der overekspresser neuroprotektive faktorer for at genoprette retinale homøostase, opretholde de resterende RPE-celler og beskytte fotoreceptorer og RGCs mod degeneration. Derfor foreslår vi en ny behandling, der omfatter transplantation af funktionelle RPE- eller IPE-celler, der har gennemgået genteknologi for at udskille neuroprotektive og anti-angiogene proteiner, såsom PEDF, GM-CSF eller insulinlignende vækstfaktorer (IGF'er). Fordelen ved at udvikle og analysere denne fremgangsmåde i flere arter i stedet for at bruge en cellelinje, kun én art eller humant væv er: 1) øget reproducerbarhed og overførbarhed af resultaterne som vist ved talrige undersøgelser realiseret i uafhængige laboratorier og forskellige arter1,24,25; 2) svine- eller kvægceller er stort ud til rådighed uden at ofre yderligere dyr; 3) tilgængeligheden af især svine- og kvægceller gør det muligt for store testserier at give solide resultater; 4) viden om at isolere, kultur og genetisk modificere celler fra de mest anvendte modeller muliggør in vivo-analyser hos flere arter24,25,26 og giver således et forbedret risiko-benefit-forhold for de første behandlede patienter; 5) fleksibiliteten i den præsenterede protokol gør det muligt at anvende den i forskellige modeller og eksperimentelle opsætninger og for alle øjencellebaserede behandlinger med og uden genteknologi. I modsætning hertil er alternative teknikker som cellelinjer eller humant væv kun af begrænset overførbarhed og/eller begrænset bortskaffelse. Cellelinjer som ARPE-19 er ideelle til indledende eksperimenter; Lav pigmentering og høj spredning adskiller sig dog betydeligt fraprimærcellerne 1. RPE- og IPE-celler, som er isoleret fra humant donorvæv, udgør en værdifuld kilde til in vitro-forsøg, der kan overføres. men vi får humant væv fra en amerikansk-amerikansk Eye Bank betyder, at vævet er mindst to dage gammel (efter enucleation) og kræver en lang og dyr transport, men lokale donorvæv er ikke tilgængelig i tilstrækkelige mængder til en produktiv forskning. Fordelen ved brugen af primære celler bekræftes af flere undersøgelser fra andre grupper27,28.
Til udvikling af en cellebaseret ikke-viral genterapi ved hjælp af SB100X transposon-systemet til transfecting af primære RPE- og IPE-celler med generne, der koder for PEDF og/eller GM-CSF til behandling af henholdsvis nvAMD og aAMD,henholdsvis 29,30,31,32, etablerede vi først transfektionen af ARPE-19-celler1 . Dernæst blev isolations- og transfectionprotokollerne etableret i lettilgængelige kvæg- og svin primære celler. Nu er isolation og transfektion af primære RPE- og IPE-celler fra fem forskellige arter blevet etableret, fra små (som mus) til store pattedyr (som kvæg). Det blev bekræftet i primære RPE- og IPE-celler afledt af menneskelige donorøjne30. Den gode fremstillingspraksis (GMP)-kompatibel produktion af ATMP blev valideret ved hjælp af humant donorvæv samt33. Endelig blev både sikkerheden og effektiviteten af tilgangen vurderet in vivo i tre forskellige arter, for hvilke protokollen er blevet tilpasset: mus, rotte og kanin. I det kliniske set-up vil en irisbiopsi blive høstet fra patienten, og IPE-celler vil blive isoleret og transfected i renrummet, før cellerne vil blive transplanteret subretinally tilbage til den samme patient. Hele processen vil finde sted under en enkelt kirurgisk session, der varer cirka 60 minutter. Udviklingen af behandlingsmetoden og evalueringen af dens effektivitet anmodede om fremragende in vitro- og ex vivo-modeller til at implementere robuste og effektive genleveringsmetoder, analysere effektiviteten af genlevering, terapeutisk proteinproduktion og neuroprotektive virkninger og til at producere celletransplantationer for at teste tilgangen in vivo1,24,25,29,30 . Det er værd at nævne, at behandlingen har den etiske godkendelse til et klinisk fase Ib / IIa-forsøg fra den etiske kommission for forskning i Kantonen Genève (nr. 2019-00250), og i øjeblikket indsamles sidste prækliniske data, der anmodes om tilladelse af schweiziske tilsynsmyndigheder, ved hjælp af den præsenterede protokol. I den forbindelse viste prækliniske in vivodata en signifikant reduktion i CNV og fremragende sikkerhed24,25,31.
Her beskrives isoleringen og kulturen af RPE/IPE-celler fra kvæg, gris, kanin, rotte og mus og brugen af det integrative SB100X transposonsystem kombineret med elektroporation som en effektiv genleveringsmetode. Især blev primære PE-celler overført til at overekspressere PEDF og GM-CSF. Indsamlingen af disse protokoller gør det muligt at udføre in vitro- og in vivo-studierne i alle prækliniske faser af ATMP-udviklingen. Desuden har set-up potentiale til at blive tilpasset andre gener af interesse og sygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De protokoller, hvori dyrene var involveret, blev udført af certificeret personale og efter tilladelse fra det kantonale departement de la sécurité, de l'emploi et de la santé (DSES), Domaine de l'expérimentation animale i Genève, Schweiz, og i henhold til ARVO-erklæringen om anvendelse af dyr i oftalmisk og visionsforskning (godkendelse nr. GE/94/17). Voksne sunde Brown Norway rotter, C57BL/6 mus, og New Zealand hvide kaniner blev aflivet af en overdosis af Pentobarbital (150 mg/kg) fortyndet i 0,9% NaCl injiceres intraperitoneal og øjnene blev induceret umiddelbart efter ofring. Porcine og kvæg øjne blev opnået fra et lokalt slagteri inden for 6 timer efter ofring og blev transporteret til laboratoriet på is.
1. Før tilberedning
- Klargør komplet medium (DMEM/Hams F12 suppleret med 10% fosterkvægsserum (FBS), 80 U/mL penicillin / 80 μg/mL streptomycin og 2,5 μg/mL amphotericin B). Varm mediet, 1x PBS og 0,25% trypsin (hvis det er nødvendigt) i et 37 °C vandbad.
- Sæt en steril drapering i hætten for at forberede en aseptisk arbejdsplads. Indfør alle nødvendige sterile instrumenter og materialer inde i emhætten.
BEMÆRK: Kun indsendelse af øjnene og rengøring af resterende muskelvæv og hud er de procedurer, der udføres uden for hætten, resten af trinene skal udføres inde i hætten.
2. Isolering af rotte/mus PE-celler
- Brug buet saks og Colibri-sammenkværn til at indlede øjnene efter aflivningen af dyret. Rengør det resterende muskelvæv og huden fra øjnene ved hjælp af saks og sammenkøjninger (ikke-sterile).
BEMÆRK: Størrelsen af den saks og de kræfter, der anvendes til indsendelse og rensning af øjnene, afhænger af arten (f.eks. for rotter og mus vil instrumenterne være mindre end dem, der anvendes til svin og kvæg) (se figur S1).- Saml øjnene i et 50 mL rør fyldt med ikke-steril PBS og overfør røret til laminar flow hætte. Desinficer øjnene ved at nedsænke i 2 min i jodbaseret opløsning, og overfør dem derefter til en petriskål fyldt med steril PBS.
- Åbning af pæren
- Efter overførsel af øjnene til en steril Petriskål, hold en fast tæt på synsnerven med Colibri eller spidse pincet. Punch et hul nær grænsen for iris (mellem pars plana og ora serrata) med en 18 G nål. Indsæt lille saks i hullet og skær rundt om iris. Fjern det forreste segment (hornhinde, linse og iris) og læg det i en petriskål. Lad pæren stå med glaslegemet, indtil RPE-cellerne er isoleret.
- Isolering af IPE-celler
- Fjern linsen og med fine sammentrækninger forsigtigt trække ud iris, der indeholder IPE celler. Placer iris i en Petri fad, vask med steril PBS og lad det i PBS, indtil mere iris er forberedt.
- Gentag trin 2.2.1 til 2.3.1 for at alle øjne kan forberedes den dag.
- Der tilsættes 50 μL på 0,25 % trypsin pr. iris og inkuberes i 10 min ved 37 °C. Fjern trypsin, tilsæt 150 μL komplet medium pr. iris og skrab IPE fint med en flad brandpoleret Pasteur-pipette; brug fine sammentak til at immobilisere vævet. Saml celleaffjedringen og læg et 1,5 mL rør i. Brug 10 μL af celleaffjedringen fortyndet 1:3 med trypan blå til at tælle cellerne i Neubauer kammer34,35.
- Hvis det ikke straks transfected, sås 200.000 celler/brønd i en 24-brøndsplade (100.000 celler/cm2) i 1 mL komplet medium (10% FBS) (til såning se tabel 1). Anbring pladen i en inkubator, og kultur den ved 37 °C, 5 % CO2.
BEMÆRK: Det kan være nødvendigt at samle flere øjne sammen for at have nok celler til såning.
- Isolering af RPE-celler
- Fjern glasagtig humor og nethinde fra det bageste segment med tynde sammentak. Undgå at beskadige nethinden pigment epitel.
- Skær segmentet i halve med en # 10 skalpel for at have kloden helt åben og vask med steril PBS.
- Der tilsættes 50 μL på 0,25 % trypsin pr. øje og inkuberes i 10 min ved 37 °C. Fjern trypsin og tilsæt 150 μL komplet medium pr. globus og skrab RPE-cellerne fint med en rund skalpel; brug fine sammentak til at immobilisere vævet. Saml celleaffjedringen og læg den i et 1,5 ML rør. Tag 10 μL af celleaffjedringen; fortynd 1:4 med trypan blå til at tælle cellerne i Neubauer kammer.
- Se trin 2.3.4.
BEMÆRK: Det kan være nødvendigt at samle flere øjne sammen for at have nok celler til såning.
3. Isolering af kanin PE celler
- Rengøring og desinfektion som beskrevet i trin 2.1 til 2.1.1.
- Sæt det ene øje på en steril gaze komprimere og hold det fast tæt på synsnerven. Åbn øjet med skalpel #11 og saks ca. 2 mm under limbus. Fjern det forreste segment (hornhinde, linse og iris) og læg det i en petriskål. Lad pæren stå med glaslegemet, indtil RPE-cellerne er isoleret.
- Isolering af IPE-celler
- Udfør trin 2.3.1. Fjern ciliary kroppen fra iris ved at skære med en skalpel # 10.
- Efter fremstilling af 2 iris inkuberes med 1 mL på 0,25 % trypsin ved 37 °C i 10 min. I løbet af denne tid kan RPE-cellerne isoleres (se trin 3.4). Fjern trypsin og tilsæt 1 ML komplet medium til iris og isolere cellerne ved omhyggeligt at ridse med en flad brand-poleret Pasteur pipette. Brug cellerne forsigtigt ved at pipettere og overføre celleaffjedringen til et 1,5 mL rør. Tag 10 μL af celleaffjedringen og fortynd 1:3 med trypanblå for at tælle cellerne i Neubauer-kammeret.
- Se trin 2.3.4.
- Isolering af RPE-celler
- Udfør trin 2.4.1.
- Sæt en steril gaze i en 12 brøndplade og læg pæren over gasbindet.
- Vask med PBS og udfør trin 2.4.3.
BEMÆRK: Brug en buet brandpoleret Pasteur-pipette. - Centrifuge cellerne 10 min ved 120 x g.
- Se trin 2.3.4.
4. Isolering af svine PE-celler
- Udfør rengøring som beskrevet i trin 2.1. Vask med PBS og desinficer øjnene ved at nedsænke i 2 min i jodbaseret opløsning, skyl med PBS. Fortsæt med trin 3.2.
- Isolering af IPE-celler
- Udfør trin 3.3.1. Efter forberedelsen af 2 iris tilsættes 1 mL komplet medium og isolerer cellerne ved omhyggeligt at ridse med en flad brandpoleret Pasteur-pipette. Celleaffjedringen overføres til et 1,5 ML rør. Tag 10 μL af celleaffjedringen og fortynd 1:4 med trypan blå for at tælle cellerne i Neubauer-kammeret.
- Se trin 2.3.4.
- Isolering af RPE-celler
- Udfør trin 2.4.1. Placer pæren i et petriskål og vask med PBS. Fyld pæren med 1 mL komplet medium.
- Fjern forsigtigt RPE-celler ved hjælp af en buet firepoleret Pasteur-pipette. Sørg for at skrabe fra bunden til toppen for at undgå at glide ned af choroid-Bruchs membrankompleks. Celleaffjedringen opsamles i pæren ved hjælp af en 1.000 μL-pipette, og den overføres til et 1,5 mL rør til resuspension. Tag 10 μL af celleaffjedringen og fortynd 1:8 med trypan blå for at tælle cellerne i Neubauer-kammeret.
- Se trin 2.3.4.
5. Isolering af pe-celler fra kvæg
- Udfør rengøring som beskrevet i trin 2.1. Vask med PBS og desinficer øjnene ved at nedsænke i 2 min i jodbaseret opløsning, skyl med PBS. Fortsæt med trin 3.2.
- Isolering af IPE-celler
- Udfør trin 3.3.1. Efter fremstilling af to iris inkuberes med 2 mL på 0,25% trypsin ved 37 °C i 10 min. I løbet af denne tid kan RPE-cellerne isoleres (se trin 5.3).
- Fjern trypsin og tilsæt 2 mL komplet medium til iris og isolere cellerne ved omhyggeligt at ridse med en flad brand-poleret Pasteur pipette. Overfør celleaffjedringen til et 15 ML rør. Centrifuge cellerne 10 min ved 120 x g. Tag 10 μL af celleaffjedringen og fortynd 1:4 med trypan blå for at tælle cellerne i Neubauer-kammeret.
- Hvis den ikke straks transfected, sås 320.000 celler/brønd i en 6-brønds plade i 3 mL komplet medium (10% FBS) (til såning se tabel 1). Anbring pladen i en inkubator, og kultur den ved 37 °C, 5 % CO2.
- Isolering af RPE-celler
- Følg trin 2.4.1. Placer pæren i et petriskål og vask med PBS. Efter tilberedning af 2 øjne fyldes pæren ca. 3/4 med trypsin og inkuberes i 25 min ved 37 °C med låget på petriskålen oven på bulbi.
- Fjern trypsin og tilsæt 1 mL komplet medium. Udfør trin 4.3.2. Centrifuge cellerne 10 min ved 120 x g.
- Se trin 5.2.3.
6. Dyrkning - medium forandring
- Kultur cellerne i DMEM/Skinke's F12, suppleret med 10% FBS, 80 U/mL penicillin / 80 μg/mL streptomycin, og 2,5 μg/mL amphotericin B, ved 37 °C og 5% CO2 i en befugtet inkubator. Efter 3-4 dage pipette op og ned for at indsamle ikke-klæbende celler og sætte halvdelen af volumen i en anden brønd. Fyld op til 1 mL med komplet medium.
BEMÆRK: Dette gør det muligt at have en overflade, der er stor nok til, at alle celler er isoleret til at vedhæfte og maksimere outputtet. - Efter yderligere 3-4 dage gentages cellesamlingen, men denne gang ved at samle de ikke-klæbende celler fra to brønde i en brønd (f.eks. A1+B1 i C1). Tilføj medium til alle brønde. Overhold cellerne og skift mediet 2 gange om ugen (for henholdsvis 6 og 24 brøndplader bruger 3 og 1 mL/brønd). Når cellerne når sammenløb, skal du skifte til komplet medium med 1% FBS eller bruge cellerne til eksperimenter (f.eks. transfection).
BEMÆRK: RPE- og IPE-celler er sammenflydende efter henholdsvis 3-4 og 4-5 uger efter isolation. Cellekulturens renhed blev bekræftet ved at kontrollere cellemorfologien (pigmenterede celler) og specifikke markører som beskrevet af Johnen og kolleger36.
7. Elektroporering af primære PE-celler
- Udfør elektroporering som beskrevet før1,37.
- Afhængigt af antallet af celler transfected bruge 6-, 24- eller 48-brønd plader (se tabel 2) til at så cellerne i medium uden antibiotika eller antimykotika. I de følgende 2 uger tilsættes dråber med medium indeholdende penicillin (80 U/mL), streptomycin (80 μg/mL) og amphotericin B (2,5 μg/mL) to gange om ugen. Ombyt mediet helt 2 uger efter transfektion.
- For at bestemme cellevækst, transfection effektivitet, og protein sekretion, overvåge cellerne ugentligt ved mikroskopi og analysere cellekultur supernatant ved vestlige blot. Før afslutningen af kulturen, tage en 24 timers celle kultur supernatant at kvantificere protein sekretion af ELISA, tælle cellerne, måle fluorescens ved billedbaseret cytometri (i tilfælde af Venus-transfected celler) efter fremstiller instruktioner (se tabel over materialer), og indsamle celle pellet for RT-qPCR-baserede genekspression analyse.
BEMÆRK: Disse metoder er ikke medtaget i nærværende papir, da det ikke er formålet at forklare detaljeret analysen af cellerne, men snarere deres isolation. Cellesåningstætheden er den samme for alle arter (100.000 celler/cm2), men fordi antallet af isolerede celler varierer, blev der anvendt forskellige plader. Derudover kan det for mus, rotte og kanin være nødvendigt at samle 2-3 øjne for at have nok celler til såning.
| Art | Trypsin behandling | N° IPE-celler | N° RPE-celler | Plade til såning (100.000 celler/cm2) |
| Mus/rotte | Ja | ~50.000 | ~150.000 | 24-brøndsplader |
| Kanin | Ja | ~350.000 | ~2.500.000 | 24-brøndsplader |
| Svin | Nej | ~1.000.000 | ~3.000.000 | 24-brøndsplader |
| Kvæg | Ja | ~1.700.000 | ~5.000.000 | 6-brønds plader |
Tabel 1: Antal primære PE-celler isoleret fra øjne fra forskellige arter.
| Navn | Område | Volumenmedium | Trypsin | Volumen medium til at stoppe virkningen af trypsin | Såningstæthed |
| 6-brønds plade | 9,6 cm² | 3,0 mL | 0,5 mL | 1,0 mL | 3x105 |
| 24-brønds plade | 2,0 cm² | 1,0 mL | 0,2 mL | 0,8 mL | 5x104 |
| 48-brønds plade | 1,1 cm² | 0,5 mL | 0,1 mL | 0,4 mL | 0,5-1x104 |
Tabel 2: Cellekulturmængder og såningstætheder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PE isolation fra forskellige pattedyr arter
Ved hjælp af ovennævnte protokoller blev IPE- og RPE-celler med succes isoleret og kultiveret fra fem forskellige arter. Antallet af celler, der er fremstillet ved hver procedure, afhænger af øjets art og størrelse (tabel 1). Som vist i figur 1, celler viser typisk PE celle morfologi og pigmentering (bortset fra kaninceller vist, afledt af albino New Zealand White (NZW) kaniner). Efter 21 dage efter isolationen er cellerne sammenflyttede, klar til at blive brugt til yderligere forsøg (f.eks. transinfektioner). Det skal bemærkes, at kulturer fra alle arter overvåges og kontrolleres yderligere op til 2 år, hvilket bekræfter normal morfologi og stabilt transgeneudtryk (data, der ikke er vist).
Dedifferentiation, cellulær stress, og ændringer i genekspression blev udelukket af RT-qPCR og immunohistochemistry. Et panel af gener (VEGF, CRALBP, CATD, ZO-1, KRT8) analyseret i transfected human rpe celler (ARPE-19 celler) bekræftede normal RPE udtryk mønster1; som kan bekræftes i primære IPE-celler af immunfluorescence for RPE65 (figur 2). Derudover bekræftede Johnen og kolleger ZO-1-immunstaining i primære svin IPE- og RPE-celler36.
Figur 1: Mikrografer af PE-celler fra forskellige pattedyr efter 21 dage efter isolation. IPE- og RPE-celler fra mus, kanin (albino NZW kanin), gris og kvæg vises på dag 21 efter isolation. For alle arter er de viste kulturer sammenflyttede. Bemærk, at kanin PE-cellerne ikke pigmenterer (original forstørrelse, 50x). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: RPE65 immunstaining af primære IPE-celler. RPE65 (grøn) farvning af IPE-celler af kvæg transfected med pFAR4-CMV-PEDF transposon plasmid ved hjælp af et indledende celletal på 1 x 104 celler sammenlignet med ikke-transfected kontrolceller (original forstørrelse, 200x). Kerner var plettet med DAPI (blå). Klik her for at se en større version af dette tal.
Levedygtigheden af transfected primære RPE
Celle levedygtighed er vist i figur 3. For at udelukke en potentiel toksicitet af den buffer, der anvendes til elektroporeringsprocessen, blev prækulturerede primære RPE-celler suspenderet i elektroporeringsbuffer fra et kommercielt tilgængeligt sæt eller i en næringsbuffer udviklet af et lægemiddelfirma (fortrolig sammensætning) og elektroporated (E) (uden tilsætning af plasmid) som beskrevet i trin 7 i protokollen. Cellens levedygtighed blev undersøgt 3 ± 1 dag efter transfektion ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt cytotoksicitetsanalysesæt (se Materialetabel)efter fabrikantens anvisninger. Analyserne blev altid udført med en kontrol uden effekt (Co-P) (ikke elektroporated). Der blev ikke observeret nogen indvirkning på celle levedygtigheden for nogen af de testede buffere (figur 3).
Figur 3: Levedygtigheden af primære RPE-celler ophængt i forskellige buffere. 1 x 104 celler blev suspenderet i elektroporeringsbuffer fra et kommercielt tilgængeligt sæt eller i en næringsstofbuffer. Celle levedygtighed blev målt 3 ± 1 dage efter transfection ved hjælp af en kommercielt tilgængelige cytotoksicitet assay kit. Der blev ikke observeret forskelle i levedygtighed mellem de forskellige buffere. data er repræsenteret som gennemsnitlige ± SD (n=2 donorer, 3 replikter/donor). E: elektroporated celler, Co-P: kontrol uden strøm. AU: vilkårlige enheder. Klik her for at se en større version af dette tal.
Transfekt af prækulturelle PE-celler med Venus reporter genet
50.000-100.000 prækulturerede PE-celler fra forskellige arter blev overført med det gule fluorescerende Venus-protein (pT2-CAGGS-Venus) ved hjælp af det hyperaktive SB100X transposon genleveringssystem. Mikrografer vist i figur 4 bekræfter, at cellerne med succes blev overført (fluorescerende celler ved 21 dage efter transfektion). Figur 5 viser kvantificeringen af transfectioneffektiviteten i prækulturelle RPE-celler af svin (n=6 donorer, 50.000 celler/transfection), der er transfected med Venus (pT2-CAGGS-Venus). Procentdelen af fluorescerende celler og MFI blev målt ved hjælp af billedbaseret cytometri efter fabrikantens anvisninger på dagen for cellekulturens afslutning (30 ± 5 dage efter transfektion). Den gennemsnitlige procentdel af fluorescerende celler var 50 ± 30%, men variabel fra 95 ± 6% (donor 2) til 28 ± 1% (donor 4) (Figur 5). I alle forsøg blev transfected ARPE-19 celler brugt som positiv kontrol. Derudover blev transfektionseffektivitet altid sammenlignet med de negative kontroller: Co-P (kontrol uden strøm [ikke elektroporated]) og Co + P (kontrol med effekt [electroporated men uden tilsætning af plasmid]). Eksperimentet er også udført med IPE-celler (data, der ikke er vist).
Figur 4: Mikrografer af prækulturelle PE-celler transfected med pT2-CAGGS-Venus. Venustransfectedkanin (A), kvæg (B) og svin (C) PE celler er vist på 21 dage efter transfection. Som en positiv kontrol blev 50.000 ARPE-19-celler overført med Venus (D). Venstre mikrograf: lyst felt, højre mikrograf: GFP (480 nm) filter (original forstørrelse, 50x). Transfekt blev udført i tredotel, og negative kontroller blev inkluderet: Co-P (kontrol uden strøm [ikke elektroporated]) og Co + P (kontrol med effekt [elektroporated men uden tilsætning af plasmid]) (ikke vist). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Transfection effektivitet i svin RPE celler transfected med Venus reporter genet. (A) 50.000 primære svin RPE celler blev transfected med pT2-CAGGS-Venus, den samlede gennemsnitlige transfection effektivitet var 50 ± 30%, og den gennemsnitlige MFI var 2712 ± 197 på dagen for opsigelsen af cellekulturer (30±5 dage efter transfection). Grafen viser den gennemsnitlige ± SD (n = 3 replikationer) af 6 forskellige dyr. (B) Procentdelen af Venus+ ARPE-19 celler, der anvendes som en positiv kontrol, var 98±6% og var stabil for de 138 dage cellerne blev fulgt. Den gennemsnitlige fluorescensintensitet (MFI) var 5.785 ± 1.255. Grafen viser den gennemsnitlige ± SD (n = 3 replikerer) for hver dag. Co-P (kontrol uden effekt [ikke elektroporated]) og Co +P (kontrol med effekt [elektroporated men uden tilsætning af plasmid]) blev inkluderet i alle transfection eksperimenter (ikke vist). Klik her for at se en større version af dette tal.
Transfekt af frisk PE celler med Venus reporter gen
10.000-50.000 PE-celler frisk isoleret fra kaniner blev transfected med den gule fluorescerende protein Venus (pFAR4-CMV-Venus), og cellekulturer blev overvåget af mikroskopi. I figur 6 kan fluorescerende celler observeres på dag 21 efter transfektion. Procentdelen af fluorescerende celler målt ved billedbaseret cytometri var 53 ± 29% for IPE-celler og 28 ± 23% for RPE-celler (data, der ikke er vist).
Figur 6: Mikrografer af nytransfected PE-celler isoleret fra kanin. Fluorescensen vises på dag 21 efter transfektion. Venstre mikrograf: lyst felt, højre mikrograf: GFP (480 nm) filter. I alle tilfælde blev transinfektioner udført i tredotel (original forstørrelse, 50x). Klik her for at se en større version af dette tal.
Transfekt af PE-celler med de terapeutiske gener PEDF og GM-CSF
50.000 PE-celler blev overført med PEDF, og proteinsekretion blev overvåget af WB (figur 7). WB-signalet for transfected celler var højere sammenlignet med de ikke-transfected celler for alle arter og dage undersøgt; der ikke blev observeret et fald i proteinsekretion inden for denne tid.
Figur 7: WB analyse af PEDF sekretion af transfected PE celler. WB-analyse af supernatanter fra svin (forkulturelle) (A) og kvæg (frisk) (B) PEDF-transfected PE-celler viser en højere PEDF sekretion sammenlignet med kontrol (ikke-transfected celler) og stabile over tid. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur S1: Instrumenter, der anvendes til PE-isolering afhængigt af arten. (A) Ikke-sterile instrumenter, der anvendes til indsendelse af øjnene, og rengøring af resterende muskelvæv og hud. Sæt 1 bruges til rotte, mus og kanin, og sæt 2 bruges til grise- og kvægøjne. (B) Sterile instrumenter, der anvendes til PE-isolering. Bemærk den forskellige størrelse af saks og sammentak, der anvendes afhængigt af øjets størrelse. Runde og flade brandpolerede Pasteur pipetter anvendes til skrabe af henholdsvis RPE og IPE. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Under standardiserede metoder til at isolere og kultur PE celler er afgørende i udviklingen af nye behandlingsmetoder for retinale degenerative sygdomme. Med de protokoller, der præsenteres her, kan PE-celler med succes isoleres fra forskellige arter og dyrkes i lange perioder (indtil nu blev den længste kultur opretholdt i 2 år1,38); typisk PE-cellemorfologi, pigmentering og funktion blev observeret (Figur 1, Figur 2). Bemærk, at især for rene RPE kulturer, Er det vigtigt at udtrække helt nethinden for at undgå forurening med neurale retinale celler; for IPE-celler skal ciliarykroppen fjernes fra iris som forklaret i protokollen. Sammenløb af cellerne opnås på relativt kort tid (~ 21 dage), hvorefter cellerne er klar til transfektion med terapeutiske gener eller til brug i andre eksperimenter (f.eks. eksponering for giftige stoffer, proteiner osv.). Desuden er protokollerne ikke kun afgørende for prækliniske in vitro- og in vivo-test, men også vigtige for human anvendelse, dvs. validering af transfected PE-celletransplantationer; især til behandling af AMD som under udvikling af vores gruppe, hvor IPE-celler vil blive isoleret fra en irisbiopsi, straks transfected og transplanteret subretinally til den samme patient inden for en kirurgisk session. Isolation og subretinal transplantation af autologe IPE-celler blev etableret hos kaniner39 og patienter23. Da transplantationen af autologe IPE-celler var vellykket, men ikke tilstrækkelig til at genoprette synet, var transfektion af cellerne for at overekspressere neuroprotektive faktorer, såsom PEDF og GM-CSF, blevet tilføjet til tilgangen og etableret i yderligere tre arter (mus, rotte og kvæg). Med de metoder, der er beskrevet her til isolering, kultur og genetisk modifikation af PE-celler, kan respektive celletransplantationer nu fremstilles fra forskellige arter for at teste toksicitet og effektivitet af tilgangen in vivo.
Det blev påvist, at pe-celler fra forskellige oprindelser ved hjælp af det hyperaktive SB100X transposonsystem effektivt kan ændres for at overekspressere PEDF (figur 7); lignende resultater ved hjælp af rotte IPE og RPE24 og humane RPE-celler29,30 er blevet offentliggjort. Transfektionen med PEDF er blevet foreslået at behandle nvAMD ved hæmning af VEGF-medieret neovascularization og beskyttelse af RPE celler og retinale neuroner fra glutamat og oxidativ stress samt iskæmi40,41. Bekræftelse af stabil langsigtet proteinsekretion (Figur 7) bekræftede PE-celler som et pålideligt biologisk "lægemiddelleveringssystem". I denne henseende bekræftede transfection effektivitet undersøgt med reporter genet Venus (Figur 4, Figur 5, Figur 6) bekræftet høj transfection effektivitetsgevinster på ~ 20-100% (arter- og donor-afhængige) som rapporteret i Johnen et al. 1.
Det skal bemærkes, at selv om størrelsen af plasmider anvendes var variabel, fra pFAR miniplasmid (~ 3.000 bp) til plasmider med en pT2-rygrad (~ 5.000 bp)30, transfection effektivitetsgevinster var sammenligneligt høj. Forskelle set i transfection effektivitet skyldes sandsynligvis variabilitet i tiden fra enucleation til celle isolation og i vævsbevarelse, men ændrede ikke cellemorfologi hverken den tid, hvor cellerne når sammenløb (~ 21 dage efter isolation), eller tid, at cellerne blev fulgt efter transfektion. Generelt er en vigtig overvejelse for at opnå en vellykket transfektion, at kilden til PE-celler skal være så frisk som muligt; Dette er især vigtigt for transinfektioner med nyisolerede PE-celler.
Sammenligning med celle ark transplantationer, den behandling, vores gruppe er ved at udvikle (transfected celler transplanteret subretinally som en celle suspension) er mindre invasiv, da den første kræver store retinotomies med de tilhørende risici for proliferative vitreoretinopati og subretinal fibrose42. Hertil kommer, i arktransplantationer til våd AMD området CNV fjernes sammen med den tilstødende choroid og derfor, graft overlevelse kunne kompromitteres43. Endelig er ideen om at bruge en celle patch ikke kompatibel med den foreslåede procedure, hvor isolering, ændring og transplantation af cellerne sker under en enkelt kirurgisk session. På den anden side er iboende spørgsmål om PE-celler, der transplanteres som celleophæng, potentiel celledød under fødslen, manglende vedhæftning og varians i cellefordeling; men disse ulemper kunne overvindes ved vævsteknik tilgange42; derudover kan celleoverlevelsen forbedres ved hjælp af pro-overlevelsesmidler44,45,46,47. Vi mener, at transplantation af primære PE-celler, der overekspresserer neuroprotektive faktorer som PEDF og GM-CSF som celleophængning, er en lovende tilgang til behandling af AMD, og for at udvikle denne terapi er de protokoller, der præsenteres her, afgørende, da de tillader standardisering af isolation, kultur og analyse af de primære PE-celler.
Sammenfattende leverer protokollen et avanceret modelsystem til udvikling og præklinisk in vitro- og in vivo-test af avancerede okulære medicinske behandlinger i fem forskellige arter, robust nok til at kompensere for individuelle afvigelser i cellekvaliteten fra de forskellige kilder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
En tak fortjener gregg Sealy og Alain Conti for deres fremragende tekniske bistand. Dette arbejde blev støttet af Europa-Kommissionen inden for rammerne af det syvende rammeprogram, Swiss National Sciences Foundation og Schmieder-Bohrisch Foundation. Z.I. modtog støtte fra Det Europæiske Forskningsråd, ERC Advanced [ERC-2011-ADG 294742] og B.M.W. fra et Fulbright Research Grant og Swiss Government Excellence Scholarship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plates | Corning | 353043 | |
| 24-well plates | Corning | 353047 | |
| 48-well plates | ThermoFisher Scientific | 150687 | |
| 6-well plate | Greiner | 7657160 | |
| Betadine | Mundipharma | ||
| Bonn micro forceps flat | |||
| Colibri forceps (sterile) | |||
| CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay | Promega | G9291 | |
| DMEM/Ham`s F12 | Sigma-Aldrich | D8062 | |
| Drape (sterile) | Mölnlycke Health Care | 800530 | |
| Electroporation buffer 3P.14 | 3P Pharmaceutical | ||
| FBS | Brunschwig | P40-37500 | |
| Forceps (different size) (sterile) | |||
| Gauze compress | PROMEDICAL AG | 25403 | |
| NaCl (0.9%) | Laboratorium Dr. Bichsel AG | 1000090 | |
| Needle (18G) | Terumo | TER-NN1838R | |
| Neon Transfection kit 10 µL | ThermoFisher Scientific | MPK1096 | |
| Neon Transfection System | ThermoFisher Scientific | MPK5000S | |
| Neubauer chamber | Marienfeld-superior | 640010 | |
| Pasteur pipette (fire-polish) | Witeg | 4100150 | |
| PBS 1X | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781-100 | |
| Pentobarbital (Thiopental Inresa) | Ospedalia AG | 31408025 | |
| Petri dish | ThermoFisher Scientific | 150288 | |
| pFAR4-PEDF | |||
| pFAR4-SB100X | |||
| pFAR4-Venus | Pastor et al., 2018. Kindly provided by Prof. Scherman and Prof. Marie | ||
| pSB100X (250 ng/µL) | Mátés et al., 2009. Provide by Prof. Izsvak | ||
| pT2-CAGGS-Venus | Johnen et al., 2012 | ||
| pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/µL) | Cloned in our lab | ||
| pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/µL) | Pastor et al., 2018 | ||
| scarpel no. 10 | Swann-Morton | 501 | |
| scarpel no. 11 | Swann-Morton | 503 | |
| Sharp-sharp tip curved Extra Fine Bonn Scissors (sterile) | |||
| Sharp-sharp tip straight Extra Fine Bonn Scissors (sterile) | |||
| Tali Image-Based Cytometer | ThermoFisher Scientific | T10796 | |
| Trypsin 0.25% | ThermoFisher Scientific | 25050014 | |
| Trypsin 5%/EDTA 2% | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| Vannas spring scissors curved (sterile) |
References
- Johnen, S., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (8), 4787-4796 (2012).
- Prado, D. A., Acosta-Acero, M., Maldonado, R. S. Gene therapy beyond luxturna: A new horizon of the treatment for inherited retinal disease. Current Opinion in Ophthalmology. 31 (3), 147-154 (2020).
- Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. The Lancet. 390, 849-860 (2017).
- Age Related Macular Degeneration and Data and Statistics. NIH. , Available from: https://nei.nih.gov/learn-about-eye-health/resources-for-health-educators/eye-health-data-and-statistics/age-related-macular-degeneration-amd-data-and-statistics (2020).
- Al-Zamil, W. M., Yassin, S. A. Recent developments in age-related macular degeneration: A review. Clinical Interventions in Aging. 12, 1313-1330 (2017).
- Stahl, A. The diagnosis and treatment of age-related macular degeneration. Deutsches Arzteblatt International. 117, 513-520 (2020).
- Mitchell, P., Liew, G., Gopinath, B., Wong, T. Y.
- Binder, S., et al. Transplantation of autologous retinal pigment epithelium in eyes with foveal neovascularization resulting from age-related macular degeneration: a pilot study. American Journal of Ophthalmology. 133 (2), 215-225 (2002).
- Binder, S., et al. Outcome of transplantation of autologous retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: a prospective trial. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 45 (11), 4151-4160 (2004).
- Binder, S. The Macula. Diagnosis, treatment and future trends. , Springer-VerlaglWien. New York. 7985-7987 (2004).
- da Cruz, L., et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nature Biotechnology. 36 (4), 1-10 (2018).
- Stanga, P. E., et al. Retinal pigment epithelium translocation after choroidal neovascular membrane removal in age-related macular degeneration. Ophthalmology. 109 (8), 1492-1498 (2002).
- Van Zeeburg, E. J. T., Maaijwee, K. J. M., Missotten, T. O. A. R., Heimann, H., Van Meurs, J. C. A free retinal pigment epitheliumchoroid graft in patients with exudative age-related macular degeneration: Results up to 7 years. American Journal of Ophthalmology. 153 (1), 120-127 (2012).
- Chen, F. K., et al. Long-term visual and microperimetry outcomes following autologous retinal pigment epithelium choroid graft for neovascular age-related macular degeneration. Clinical and Experimental Ophthalmology. 37 (3), 275-285 (2009).
- Mandai, M., et al. Autologous induced stem-cell-derived retinal cells for macular degeneration. New England Journal of Medicine. 376 (11), 1038-1046 (2017).
- Akyol, E., Lotery, A. Gene, cell and antibody-based therapies for the treatment of age-related macular degeneration. Biologics: Targets and Therapy. 14, 83-94 (2020).
- Hemera Biosciences. Treatment of advanced dry age related macular degeneration with AAVCAGsCD59. ClinicalTrialsgov. , NCT03144999 (2019).
- , Hemera Biosciences. Intravitreal AAVCAGsCD59 for advanced dry age-related macular degeneration (AMD) with geographic atrophy (GA). ClinicalTrialsgov. , NCT04358471 (2020).
- Gyroscope Therapeutics. First in human study to evaluate the safety and efficacy of GT005 administered in subjects with dry AMD. ClinicalTrialsgov. , NCT03846193 (2019).
- Thumann, G., et al. Transplantation of autologous iris pigment epithelium after removal of choroidal neovascular membranes. Archives of Ophthalmology. 118 (10), 1350-1355 (2000).
- Thumann, G., Salz, A. K., Walter, P., Johnen, S. Preservation of photoreceptors in dystrophic RCS rats following allo- and xenotransplantation of IPE cells. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 247 (3), 363-369 (2009).
- Crafoord, S., Geng, L., Seregard, S., Algvere, P. V. Photoreceptor survival in transplantation of autologous iris pigment epithelial cells to the subretinal space. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 80 (4), 387-394 (2002).
- Aisenbrey, S., et al. Iris pigment epithelial translocation in the treatment of exudative macular degeneration: A 3-year follow-up. Archives of Ophthalmology. 124 (2), 183-188 (2006).
- Garcia-Garcia, L., et al. Long-term PEDF release in rat iris and retinal epithelial cells after sleeping beauty transposon-mediated gene delivery. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 9, 1-11 (2017).
- Kropp, M., et al. Results of a biodistribution study of Venus transfected pigment epithelial cells transplanted subretinally in rabbits. Association for Research in Vision and Ophthalmology. , (2016).
- Kropp, M., et al. Improved transferability of a disease model for avascular age-related macular degeneration (AMD) to evaluate cell-based gene therapies using aged mice. ISSCR Annual Meeting. , Boston, USA. Meeting Abstract: MDD228. Poster (2020).
- Uebersax, E. D., Grindstaff, R. D., Defoe, D. M. Survival of the retinal pigment epithelium in vitro: Comparison of freshly isolated and subcultured cells. Experimental Eye Research. 70 (3), 381-390 (2000).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
- Thumann, G., et al. Engineering of PEDF-expressing primary pigment epithelial cells by the sb transposon system delivered by pFAR4 plasmids. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 6, 302-314 (2017).
- Pastor, M., et al. The antibiotic-free pFAR4 vector paired with the sleeping beauty transposon system mediates efficient transgene delivery in human cells. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 11, 57-67 (2018).
- Hernández-Pinto, A., et al. PEDF peptides promote photoreceptor survival in rd10 retina models. Experimental Eye Research. 184, 24-29 (2019).
- Bascuas, T., et al. Non-virally transfected primary human pigment epithelium cells overexpressing the oxidative stress reduction factors PEDF and GM-CSF to treat retinal neurodegeneration neurodegenerationl. Human Gene Therapy. 30 (11), (2019).
- Kropp, M., et al. Development of GMP-compliant production of freshly isolated and transfected iris pigment epithelial (IPE) cells to treat age-related macular degeneration (AMD). Human Gene Therapy. Meeting abstract: P371 Poster. , (2017).
- Marienfeld. Marienfeld Technical information Neubauer-improved. , Available from: https://www.marienfeld-superior.com/information-about-our-counting-chambers.html (2020).
- Electron Microscopy Sciences. Neubauer Haemocytometry. , Available from: https://www.emsdiasum.com/microscopy/technical/datasheet/68052-14.aspx (2020).
- Johnen, S., Wickert, L., Meier, M., Salz, A. K., Walter, P., Thumann, G. Presence of xenogenic mouse RNA in RPE and IPE cells cultured on mitotically inhibited 3T3 fibroblasts. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (5), 2817-2824 (2011).
- Bascuas, T., et al. Induction and analysis of oxidative stress in sleeping beauty transposon-transfected human retinal pigment epithelial cells. Journal of Visualized Experiments. , e61957 (2020).
- Thumann, G., et al. High efficiency non-viral transfection of retinal and iris pigment epithelial cells with pigment epithelium-derived factor. Gene Therapy. 17, 181-189 (2010).
- Thumann, G., et al. Transplantation of autologous iris pigment epithelium to the subretinal space in rabbits. Transplantation. 68, 195-201 (1999).
- Bilak, M. M., et al. Pigment epithelium-derived factor (PEDF) protects motor neurons from chronic glutamate-mediated neurodegeneration. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 58, 719-728 (1999).
- Duh, E. J., et al. Pigment epithelium-derived factor suppresses ischemia-induced retinal neovascularization and VEGF-induced migration and growth. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 43, 821-829 (2002).
- Chichagova, V., et al. Cellular regeneration strategies for macular degeneration: Past, present and future. Eye. 32 (5), 946-971 (2018).
- Veckeneer, M., et al. angiography documented reperfusion of translocated autologous full thickness RPE-choroid graft for complicated neovascular age-related macular degeneration. Eye. 31, 1274-1283 (2017).
- Afshari, F. T., et al. Integrin activation or alpha9 expression allows retinal pigmented epithelial cell adhesion on Bruch's membrane in wet age-related macular degeneration. Brain. 133, 448-464 (2010).
- Tezel, T. H., Kaplan, H. J., Del Priore, L. V. Fate of human retinal pigment epithelial cells seeded onto layers of human Bruch's membrane. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 40 (2), 467-476 (1999).
- Tezel, T. H., Del Priore, L. V., Kaplan, H. J. Reengineering of aged Bruch's membrane to enhance retinal pigment epithelium repopulation. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 45 (9), 3337-3348 (2004).
- Tezel, T. H., Del Priore, L. V. Repopulation of different layers of host human Bruch's membrane by retinal pigment epithelial cell grafts. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 40 (3), 767-774 (1999).
