Vi presenterer en protokoll for å generere kjeveortopedisk tannbevegelse hos mus og metoder for 3D-visualisering av kollagenfibrene og blodkarene i periodontal ligament uten seksjonering.
Kjeveortopedisk tannbevegelse er en kompleks biologisk prosess med endret myk og hard vevsoppussing som følge av ytre krefter. For å forstå disse komplekse ombyggingsprosessene er det viktig å studere tann- og periodontalvevet i 3D-konteksten og derfor minimere eventuelle seksjonerings- og vevsgjenstander. Musemodeller brukes ofte i utviklings- og strukturbiologi, så vel som i biomekanikk på grunn av deres lille størrelse, høye metabolske rate, genetikk og enkel håndtering. I prinsippet gjør dette dem også gode modeller for tannrelaterte studier. Imidlertid er en stor hindring deres lille tannstørrelse, spesielt molarene. Dette papiret er rettet mot å gi en trinnvis protokoll for å generere kjeveortopedisk tannbevegelse og to metoder for 3D-avbildning av den periodontale ligamentfibrøse komponenten av en mus mandibulær molar. Den første metoden som presenteres er basert på et mikro-CT-oppsett som muliggjør faseforbedringsavbildning av fersk kollagenvev. Den andre metoden er en beinryddingsmetode ved hjelp av etylcinnamat som gjør det mulig å avbildning gjennom beinet uten seksjonering og bevarer endogen fluorescens. Kombinerer denne clearingmetoden med reportermus som Flk1–Cre; TdTomato ga en første av sitt slag mulighet til å avbilde 3D-vaskulaturen i PDL- og alveolarbenet.
Den grunnleggende underliggende biologiske prosessen i kjeveortopedisk tannbevegelse (OTM) er beinoppussing. Utløseren for denne ombyggingsprosessen tilskrives endringer i strukturen av periodontal ligament (PDL) som ekstracellulær matrise (ECM) stress, nekrose samt blodkar ødeleggelse ogformasjon 1,2,3. Andre mulige utløsere for alveolar bein ombygging er relatert til kraft sensing av osteocytter i beinet, samt mekanisk deformasjon av alveolarbenet selv; men deres rolle i OTM er fortsatt ikke fullt belyst4,5.
Til tross for mange studier som tar sikte på å avsløre strukturfunksjonsrelasjoner av PDL under OTM, er en klar funksjonell mekanisme ennå ikke definert6,7. Hovedårsaken til dette er utfordringen med å hente data om et bløtvev (PDL) som ligger mellom to harde vev (sementum og alveolarben). De aksepterte metodene for å samle inn strukturell informasjon krever vanligvis fiksering og seksjonering som forstyrrer og endrer PDL-strukturen. Videre gir de fleste av disse metodene 2D-data som selv om de ikke er forvrengt, bare gir delvis og lokalisert informasjon. Siden PDL ikke er ensartet i sin struktur og funksjon, er en tilnærming som adresserer den intakte 3D-strukturen til hele tann-PDL-beinkomplekset berettiget.
Dette dokumentet vil beskrive en metode for å generere en OTM hos mus og to metoder som muliggjør 3D-visualisering av kollagenfibrene i PDL uten noen seksjonering av prøven.
Murine-modeller er mye brukt til in-vivo-eksperimenter innen medisin, utviklingsbiologi, legemiddellevering og strukturelle studier. De kan genetisk modifiseres for å eliminere eller forbedre spesifikke proteiner og funksjon; de gir rask, repeterbar og forutsigbar utviklingskontroll; de er også enkle å bilde på grunn av sin lille størrelse8. Til tross for deres mange fordeler, brukes musemodeller i tannforskning ikke ofte, spesielt når kliniske manipulasjoner er berettiget, hovedsakelig på grunn av de små tennene. Dyremodeller som rotter9,10,11, hunder12,13, griser14,15,16 og aper17 brukes oftere enn mus. Med den nylige utviklingen av høyoppløselige bildeteknikker er fordelene ved å bruke en musemodell for å dechiffrere de innviklede prosessene i OTM mange. Dette papiret presenterer en metode for å generere en flerårig bevegelse av molartannen i mandibelen med konstante kraftnivåer som utløser beinoppussing. De fleste OTM-forsøkene hos gnagere gjøres i maxilla, siden mobiliteten til mandibelen og tilstedeværelsen av tungen gir et annet kompleksitetsnivå. Mandibelen har imidlertid mange fordeler når 3D strukturell integritet er ønsket. Det kan lett dissekeres som et helt bein; i noen arter kan den deles inn i to hemi-mandibler gjennom den fibrøse symfysen; den er kompakt, flat og inneholder bare tennene uten bihuleplasser. I motsetning er maxilla en del av skallen og nært knyttet til andre organer og strukturer, og dermed er det nødvendig med omfattende seksjonering for å dissekere alveolarbenet med de tilknyttede tennene.
Ved hjelp av et i huset fuktighetskammer koblet til et lastesystem inne i en høyoppløselig mikro-CT som muliggjør faseforbedring, utviklet vi en metode for å visualisere friske fibrøse vev i 3D som tidligere beskrevet9,18,19,20,21,22,23. Friskt vev skannes umiddelbart etter at dyret er ofret uten farging eller fiksering, noe som reduserer vevsgjenstander samt endringer av biomekaniske egenskaper. Disse 3D-dataene kan brukes til distribusjon og retningsanalyser av fibrene som beskrevet andre steder19.
Den andre 3D-metoden for avbildning av hele vevet som presenteres her, er basert på optisk rydding av mandibelen som muliggjør avbildning av PDL-fibrene gjennom beinet uten seksjonering. Interessant er det også mulig å visualisere kollagenfibrene i selve beinet, men dette vil ikke bli diskutert her. Generelt er det to metoder for vevsrydding. Den første er vandig basert rydding der prøven er nedsenket i en vandig løsning med en brytningsindeks større enn 1,4 enten gjennom en enkel nedsenking, hyperhydrering eller hydrogelinnstøtning. Denne metoden er imidlertid begrenset i nivået av gjennomsiktighet samt strukturell bevaring av vevet og krever derfor fiksering av vevet. Den andre metoden som gir svært gjennomsiktige prøver og ikke krever fiksering, er den løsningsmiddelbaserte avregningsmetoden24,25. Vi genererte en modifisert løsningsmiddelbasert clearingmetode basert på etyl-3-fenylprop-2-enoate (etylcinnamat, ECi) for mandibulære prøver. Denne metoden har fordelene ved å bruke ikke-giftig mat-grade clearing agent, minimal vev krymping, og bevaring av fluorescerende proteiner.
Generering av OTM hos mus er svært ønsket på grunn av størrelse, genetikk og håndteringsfordeler. Bruk av mandibelen gir en enkel håndtering både når det gjelder vevs disseksjon samt prøvepreparering og avbildning. Her presenterte vi en metode for å generere OTM med translasjonell bevegelse av tannen inne i beinet innen 7 dager etter OTM. Ved hjelp av denne protokollen kan den totale varigheten av tannbevegelsen forlenges, siden den aktiverte spolen gir et konstant kraftnivå for bevegelse på opptil ca. 1 mm. …
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble støttet av NIH (NIDCR R00- DE025053, PI:Naveh). Vi vil takke Harvard Center for Biological Imaging for infrastruktur og støtte. Alle tall genereres med biorender.com.
1-mL BD Luer-Lok syringe | BD | 309628 | |
1X phosphate buffered saline | VWR Life Sciences | 0780-10L | |
200 proof ethanol | VWR Life Sciences | V1016 | |
Aluminum alloy 5019 wire | Sigma-aldrich | GF15828813 | 0.08 mm diameter wire, length 100th, temper hard. Used as wire ligature around molar. |
Avizo 9.7 | Thermo Fisher Scientific | N/A | Used to analyze microCT scans |
Castroviejo Micro Needle Holders | Fine Science Tools | 12060-01 | |
Clr Plan-Apochromat 20x/1.0,CorrVIS-IR M27 85mm | Zeiss | N/A | Used for second harmonic generation imaging |
Cone socket handle, single ended, hand-form | G.Hartzell and son | 126-CSH3 | Handle of the inspection mirror |
EC Plan-Neofluar 5x/0.16 | Zeiss | 440321-9902 | Used for light-sheet imaging |
Elipar DeepCure-S LED curing light | 3M ESPE | 76985 | |
Eppendorf safe-lock tubes, 1.5mL | Eppendorf | 22363204 | |
Ethyl cinnamate, >= 98% | Sigma-aldrich | W243000-1KG-K | |
Hypodermic Needle, 27G x 1/2'' | BD | 305109 | |
Ketathesia 100mg/ml | Henry Schein Animal Health | NDC:11695-0702-1 | |
KIMWIPES delicate task wipers | Kimberly-Clark | 21905-026 (VWR Catalog number) | Purchased from VWR |
LightSheet Z.1 dual illumination microscope system | Zeiss | LightSheet Z.1/LightSheet 7 | Used for lightsheet imaging |
LSM 880 NLO multi-photon microscope | Zeiss | LSM 880 NLO | Used for two-photon imaging |
MEGAmicro, plane, 5mm dia, SS-Thread | Hahnenkratt | 6220 | Front surface inspectrio mirror |
MicroCT machine, MicroXCT-200 | Xradia | MICRO XCT-200 | |
Mini-Colibri | Fine Science Tools | 17000-01 | |
PermaFlo Flowable Composite | Ultradent | 948 | |
Procedure platform | N/A | N/A | Custom-made from lab materials |
Routine stereo micscope M80 | Leica Micosystems | M80 | |
Sentalloy NiTi open coil spring | TOMY Inc. | A 0.15mm diameter closed NiTi coil with an inner coil diameter of 0.9mm delivers a force of 10g. Similar products can be purchased from Dentsply Sirona. | |
T-304 stainless steel ligature wire, 0.009'' diameter | Orthodontics | SBLW109 | 0.009''(.23mm) diameter, Soft temper |
X-Ject E (Xylazine) 100mg/ml | Henry Schein Animal Health | NDC:11695-7085-1 | |
Z100 Restorative, A2 shade | 3M ESPE | 5904A2 |