3D-avbildning av PDL kollagenfibre under kjeveortopedisk tannbevegelse i mandibulær murinemodell

Summary

Vi presenterer en protokoll for å generere kjeveortopedisk tannbevegelse hos mus og metoder for 3D-visualisering av kollagenfibrene og blodkarene i periodontal ligament uten seksjonering.

Abstract

Kjeveortopedisk tannbevegelse er en kompleks biologisk prosess med endret myk og hard vevsoppussing som følge av ytre krefter. For å forstå disse komplekse ombyggingsprosessene er det viktig å studere tann- og periodontalvevet i 3D-konteksten og derfor minimere eventuelle seksjonerings- og vevsgjenstander. Musemodeller brukes ofte i utviklings- og strukturbiologi, så vel som i biomekanikk på grunn av deres lille størrelse, høye metabolske rate, genetikk og enkel håndtering. I prinsippet gjør dette dem også gode modeller for tannrelaterte studier. Imidlertid er en stor hindring deres lille tannstørrelse, spesielt molarene. Dette papiret er rettet mot å gi en trinnvis protokoll for å generere kjeveortopedisk tannbevegelse og to metoder for 3D-avbildning av den periodontale ligamentfibrøse komponenten av en mus mandibulær molar. Den første metoden som presenteres er basert på et mikro-CT-oppsett som muliggjør faseforbedringsavbildning av fersk kollagenvev. Den andre metoden er en beinryddingsmetode ved hjelp av etylcinnamat som gjør det mulig å avbildning gjennom beinet uten seksjonering og bevarer endogen fluorescens. Kombinerer denne clearingmetoden med reportermus som Flk1–Cre; TdTomato ga en første av sitt slag mulighet til å avbilde 3D-vaskulaturen i PDL- og alveolarbenet.

Introduction

Den grunnleggende underliggende biologiske prosessen i kjeveortopedisk tannbevegelse (OTM) er beinoppussing. Utløseren for denne ombyggingsprosessen tilskrives endringer i strukturen av periodontal ligament (PDL) som ekstracellulær matrise (ECM) stress, nekrose samt blodkar ødeleggelse og^{formasjon 1,2,3}. Andre mulige utløsere for alveolar bein ombygging er relatert til kraft sensing av osteocytter i beinet, samt mekanisk deformasjon av alveolarbenet selv; men deres rolle i OTM er fortsatt ikke fullt belyst^4,5.

Til tross for mange studier som tar sikte på å avsløre strukturfunksjonsrelasjoner av PDL under OTM, er en klar funksjonell mekanisme ennå ikke definert^6,7. Hovedårsaken til dette er utfordringen med å hente data om et bløtvev (PDL) som ligger mellom to harde vev (sementum og alveolarben). De aksepterte metodene for å samle inn strukturell informasjon krever vanligvis fiksering og seksjonering som forstyrrer og endrer PDL-strukturen. Videre gir de fleste av disse metodene 2D-data som selv om de ikke er forvrengt, bare gir delvis og lokalisert informasjon. Siden PDL ikke er ensartet i sin struktur og funksjon, er en tilnærming som adresserer den intakte 3D-strukturen til hele tann-PDL-beinkomplekset berettiget.

Dette dokumentet vil beskrive en metode for å generere en OTM hos mus og to metoder som muliggjør 3D-visualisering av kollagenfibrene i PDL uten noen seksjonering av prøven.

Murine-modeller er mye brukt til in-vivo-eksperimenter innen medisin, utviklingsbiologi, legemiddellevering og strukturelle studier. De kan genetisk modifiseres for å eliminere eller forbedre spesifikke proteiner og funksjon; de gir rask, repeterbar og forutsigbar utviklingskontroll; de er også enkle å bilde på grunn av sin lille størrelse⁸. Til tross for deres mange fordeler, brukes musemodeller i tannforskning ikke ofte, spesielt når kliniske manipulasjoner er berettiget, hovedsakelig på grunn av de små tennene. Dyremodeller som rotter^9,10,11, hunder^12,13, griser^14,15,16 og aper¹⁷ brukes oftere enn mus. Med den nylige utviklingen av høyoppløselige bildeteknikker er fordelene ved å bruke en musemodell for å dechiffrere de innviklede prosessene i OTM mange. Dette papiret presenterer en metode for å generere en flerårig bevegelse av molartannen i mandibelen med konstante kraftnivåer som utløser beinoppussing. De fleste OTM-forsøkene hos gnagere gjøres i maxilla, siden mobiliteten til mandibelen og tilstedeværelsen av tungen gir et annet kompleksitetsnivå. Mandibelen har imidlertid mange fordeler når 3D strukturell integritet er ønsket. Det kan lett dissekeres som et helt bein; i noen arter kan den deles inn i to hemi-mandibler gjennom den fibrøse symfysen; den er kompakt, flat og inneholder bare tennene uten bihuleplasser. I motsetning er maxilla en del av skallen og nært knyttet til andre organer og strukturer, og dermed er det nødvendig med omfattende seksjonering for å dissekere alveolarbenet med de tilknyttede tennene.

Ved hjelp av et i huset fuktighetskammer koblet til et lastesystem inne i en høyoppløselig mikro-CT som muliggjør faseforbedring, utviklet vi en metode for å visualisere friske fibrøse vev i 3D som tidligere beskrevet^{9,18,19,20,21,22,23}. Friskt vev skannes umiddelbart etter at dyret er ofret uten farging eller fiksering, noe som reduserer vevsgjenstander samt endringer av biomekaniske egenskaper. Disse 3D-dataene kan brukes til distribusjon og retningsanalyser av fibrene som beskrevet andre steder¹⁹.

Den andre 3D-metoden for avbildning av hele vevet som presenteres her, er basert på optisk rydding av mandibelen som muliggjør avbildning av PDL-fibrene gjennom beinet uten seksjonering. Interessant er det også mulig å visualisere kollagenfibrene i selve beinet, men dette vil ikke bli diskutert her. Generelt er det to metoder for vevsrydding. Den første er vandig basert rydding der prøven er nedsenket i en vandig løsning med en brytningsindeks større enn 1,4 enten gjennom en enkel nedsenking, hyperhydrering eller hydrogelinnstøtning. Denne metoden er imidlertid begrenset i nivået av gjennomsiktighet samt strukturell bevaring av vevet og krever derfor fiksering av vevet. Den andre metoden som gir svært gjennomsiktige prøver og ikke krever fiksering, er den løsningsmiddelbaserte avregningsmetoden^24,25. Vi genererte en modifisert løsningsmiddelbasert clearingmetode basert på etyl-3-fenylprop-2-enoate (etylcinnamat, ECi) for mandibulære prøver. Denne metoden har fordelene ved å bruke ikke-giftig mat-grade clearing agent, minimal vev krymping, og bevaring av fluorescerende proteiner.

Protocol

Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med NIHs retningslinjer for pleie og bruk av forsøksdyr og retningslinjer fra Harvard University Institutional Animal Care and Use Committee (protokoll nr. 01840). 1. Kjeveortopedisk tannbevegelse For å generere en museseng, bruk en flat plastplattform med en kileformet, 45 ° vinklet nakkestøtte. Nakkestøtten kan genereres ved å kutte en plastboks. Løft hodeenden av plattformen for å generere en omtrent 30° vinkel mellom hodest?…

Representative Results

Dette papiret presenterer en metode for å produsere OTM samt to metoder for 3D-avbildning av kollagenfibre inne i PDL uten seksjonering. For dyreforskningsformål, når justering av tennene ikke er nødvendig, anses en tannbevegelse som kjeveortopedisk hvis det genererer ombygging av alveolarbenet på alle rotnivåer. Konstant kraftnivå påført på tennene er nødvendig for å generere en pålitelig OTM. Her brukes en aktivert formminne NiTi-spole til å generere en konsistent kraft på 10 g gjennom eksperimentell tid…

Discussion

Generering av OTM hos mus er svært ønsket på grunn av størrelse, genetikk og håndteringsfordeler. Bruk av mandibelen gir en enkel håndtering både når det gjelder vevs disseksjon samt prøvepreparering og avbildning. Her presenterte vi en metode for å generere OTM med translasjonell bevegelse av tannen inne i beinet innen 7 dager etter OTM. Ved hjelp av denne protokollen kan den totale varigheten av tannbevegelsen forlenges, siden den aktiverte spolen gir et konstant kraftnivå for bevegelse på opptil ca. 1 mm. …

Materials

1-mL BD Luer-Lok syringe	BD	309628
1X phosphate buffered saline	VWR Life Sciences	0780-10L
200 proof ethanol	VWR Life Sciences	V1016
Aluminum alloy 5019 wire	Sigma-aldrich	GF15828813	0.08 mm diameter wire, length 100th, temper hard. Used as wire ligature around molar.
Avizo 9.7	Thermo Fisher Scientific	N/A	Used to analyze microCT scans
Castroviejo Micro Needle Holders	Fine Science Tools	12060-01
Clr Plan-Apochromat 20x/1.0,CorrVIS-IR M27 85mm	Zeiss	N/A	Used for second harmonic generation imaging
Cone socket handle, single ended, hand-form	G.Hartzell and son	126-CSH3	Handle of the inspection mirror
EC Plan-Neofluar 5x/0.16	Zeiss	440321-9902	Used for light-sheet imaging
Elipar DeepCure-S LED curing light	3M ESPE	76985
Eppendorf safe-lock tubes, 1.5mL	Eppendorf	22363204
Ethyl cinnamate, >= 98%	Sigma-aldrich	W243000-1KG-K
Hypodermic Needle, 27G x 1/2''	BD	305109
Ketathesia 100mg/ml	Henry Schein Animal Health	NDC:11695-0702-1
KIMWIPES delicate task wipers	Kimberly-Clark	21905-026 (VWR Catalog number)	Purchased from VWR
LightSheet Z.1 dual illumination microscope system	Zeiss	LightSheet Z.1/LightSheet 7	Used for lightsheet imaging
LSM 880 NLO multi-photon microscope	Zeiss	LSM 880 NLO	Used for two-photon imaging
MEGAmicro, plane, 5mm dia, SS-Thread	Hahnenkratt	6220	Front surface inspectrio mirror
MicroCT machine, MicroXCT-200	Xradia	MICRO XCT-200
Mini-Colibri	Fine Science Tools	17000-01
PermaFlo Flowable Composite	Ultradent	948
Procedure platform	N/A	N/A	Custom-made from lab materials
Routine stereo micscope M80	Leica Micosystems	M80
Sentalloy NiTi open coil spring	TOMY Inc.		A 0.15mm diameter closed NiTi coil with an inner coil diameter of 0.9mm delivers a force of 10g. Similar products can be purchased from Dentsply Sirona.
T-304 stainless steel ligature wire, 0.009'' diameter	Orthodontics	SBLW109	0.009''(.23mm) diameter, Soft temper
X-Ject E (Xylazine) 100mg/ml	Henry Schein Animal Health	NDC:11695-7085-1
Z100 Restorative, A2 shade	3M ESPE	5904A2