Summary

3D-avbildning av PDL kollagenfibre under kjeveortopedisk tannbevegelse i mandibulær murinemodell

Published: April 15, 2021
doi:

Summary

Vi presenterer en protokoll for å generere kjeveortopedisk tannbevegelse hos mus og metoder for 3D-visualisering av kollagenfibrene og blodkarene i periodontal ligament uten seksjonering.

Abstract

Kjeveortopedisk tannbevegelse er en kompleks biologisk prosess med endret myk og hard vevsoppussing som følge av ytre krefter. For å forstå disse komplekse ombyggingsprosessene er det viktig å studere tann- og periodontalvevet i 3D-konteksten og derfor minimere eventuelle seksjonerings- og vevsgjenstander. Musemodeller brukes ofte i utviklings- og strukturbiologi, så vel som i biomekanikk på grunn av deres lille størrelse, høye metabolske rate, genetikk og enkel håndtering. I prinsippet gjør dette dem også gode modeller for tannrelaterte studier. Imidlertid er en stor hindring deres lille tannstørrelse, spesielt molarene. Dette papiret er rettet mot å gi en trinnvis protokoll for å generere kjeveortopedisk tannbevegelse og to metoder for 3D-avbildning av den periodontale ligamentfibrøse komponenten av en mus mandibulær molar. Den første metoden som presenteres er basert på et mikro-CT-oppsett som muliggjør faseforbedringsavbildning av fersk kollagenvev. Den andre metoden er en beinryddingsmetode ved hjelp av etylcinnamat som gjør det mulig å avbildning gjennom beinet uten seksjonering og bevarer endogen fluorescens. Kombinerer denne clearingmetoden med reportermus som Flk1Cre; TdTomato ga en første av sitt slag mulighet til å avbilde 3D-vaskulaturen i PDL- og alveolarbenet.

Introduction

Den grunnleggende underliggende biologiske prosessen i kjeveortopedisk tannbevegelse (OTM) er beinoppussing. Utløseren for denne ombyggingsprosessen tilskrives endringer i strukturen av periodontal ligament (PDL) som ekstracellulær matrise (ECM) stress, nekrose samt blodkar ødeleggelse ogformasjon 1,2,3. Andre mulige utløsere for alveolar bein ombygging er relatert til kraft sensing av osteocytter i beinet, samt mekanisk deformasjon av alveolarbenet selv; men deres rolle i OTM er fortsatt ikke fullt belyst4,5.

Til tross for mange studier som tar sikte på å avsløre strukturfunksjonsrelasjoner av PDL under OTM, er en klar funksjonell mekanisme ennå ikke definert6,7. Hovedårsaken til dette er utfordringen med å hente data om et bløtvev (PDL) som ligger mellom to harde vev (sementum og alveolarben). De aksepterte metodene for å samle inn strukturell informasjon krever vanligvis fiksering og seksjonering som forstyrrer og endrer PDL-strukturen. Videre gir de fleste av disse metodene 2D-data som selv om de ikke er forvrengt, bare gir delvis og lokalisert informasjon. Siden PDL ikke er ensartet i sin struktur og funksjon, er en tilnærming som adresserer den intakte 3D-strukturen til hele tann-PDL-beinkomplekset berettiget.

Dette dokumentet vil beskrive en metode for å generere en OTM hos mus og to metoder som muliggjør 3D-visualisering av kollagenfibrene i PDL uten noen seksjonering av prøven.

Murine-modeller er mye brukt til in-vivo-eksperimenter innen medisin, utviklingsbiologi, legemiddellevering og strukturelle studier. De kan genetisk modifiseres for å eliminere eller forbedre spesifikke proteiner og funksjon; de gir rask, repeterbar og forutsigbar utviklingskontroll; de er også enkle å bilde på grunn av sin lille størrelse8. Til tross for deres mange fordeler, brukes musemodeller i tannforskning ikke ofte, spesielt når kliniske manipulasjoner er berettiget, hovedsakelig på grunn av de små tennene. Dyremodeller som rotter9,10,11, hunder12,13, griser14,15,16 og aper17 brukes oftere enn mus. Med den nylige utviklingen av høyoppløselige bildeteknikker er fordelene ved å bruke en musemodell for å dechiffrere de innviklede prosessene i OTM mange. Dette papiret presenterer en metode for å generere en flerårig bevegelse av molartannen i mandibelen med konstante kraftnivåer som utløser beinoppussing. De fleste OTM-forsøkene hos gnagere gjøres i maxilla, siden mobiliteten til mandibelen og tilstedeværelsen av tungen gir et annet kompleksitetsnivå. Mandibelen har imidlertid mange fordeler når 3D strukturell integritet er ønsket. Det kan lett dissekeres som et helt bein; i noen arter kan den deles inn i to hemi-mandibler gjennom den fibrøse symfysen; den er kompakt, flat og inneholder bare tennene uten bihuleplasser. I motsetning er maxilla en del av skallen og nært knyttet til andre organer og strukturer, og dermed er det nødvendig med omfattende seksjonering for å dissekere alveolarbenet med de tilknyttede tennene.

Ved hjelp av et i huset fuktighetskammer koblet til et lastesystem inne i en høyoppløselig mikro-CT som muliggjør faseforbedring, utviklet vi en metode for å visualisere friske fibrøse vev i 3D som tidligere beskrevet9,18,19,20,21,22,23. Friskt vev skannes umiddelbart etter at dyret er ofret uten farging eller fiksering, noe som reduserer vevsgjenstander samt endringer av biomekaniske egenskaper. Disse 3D-dataene kan brukes til distribusjon og retningsanalyser av fibrene som beskrevet andre steder19.

Den andre 3D-metoden for avbildning av hele vevet som presenteres her, er basert på optisk rydding av mandibelen som muliggjør avbildning av PDL-fibrene gjennom beinet uten seksjonering. Interessant er det også mulig å visualisere kollagenfibrene i selve beinet, men dette vil ikke bli diskutert her. Generelt er det to metoder for vevsrydding. Den første er vandig basert rydding der prøven er nedsenket i en vandig løsning med en brytningsindeks større enn 1,4 enten gjennom en enkel nedsenking, hyperhydrering eller hydrogelinnstøtning. Denne metoden er imidlertid begrenset i nivået av gjennomsiktighet samt strukturell bevaring av vevet og krever derfor fiksering av vevet. Den andre metoden som gir svært gjennomsiktige prøver og ikke krever fiksering, er den løsningsmiddelbaserte avregningsmetoden24,25. Vi genererte en modifisert løsningsmiddelbasert clearingmetode basert på etyl-3-fenylprop-2-enoate (etylcinnamat, ECi) for mandibulære prøver. Denne metoden har fordelene ved å bruke ikke-giftig mat-grade clearing agent, minimal vev krymping, og bevaring av fluorescerende proteiner.

Protocol

Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med NIHs retningslinjer for pleie og bruk av forsøksdyr og retningslinjer fra Harvard University Institutional Animal Care and Use Committee (protokoll nr. 01840). 1. Kjeveortopedisk tannbevegelse For å generere en museseng, bruk en flat plastplattform med en kileformet, 45 ° vinklet nakkestøtte. Nakkestøtten kan genereres ved å kutte en plastboks. Løft hodeenden av plattformen for å generere en omtrent 30° vinkel mellom hodest?…

Representative Results

Dette papiret presenterer en metode for å produsere OTM samt to metoder for 3D-avbildning av kollagenfibre inne i PDL uten seksjonering. For dyreforskningsformål, når justering av tennene ikke er nødvendig, anses en tannbevegelse som kjeveortopedisk hvis det genererer ombygging av alveolarbenet på alle rotnivåer. Konstant kraftnivå påført på tennene er nødvendig for å generere en pålitelig OTM. Her brukes en aktivert formminne NiTi-spole til å generere en konsistent kraft på 10 g gjennom eksperimentell tid…

Discussion

Generering av OTM hos mus er svært ønsket på grunn av størrelse, genetikk og håndteringsfordeler. Bruk av mandibelen gir en enkel håndtering både når det gjelder vevs disseksjon samt prøvepreparering og avbildning. Her presenterte vi en metode for å generere OTM med translasjonell bevegelse av tannen inne i beinet innen 7 dager etter OTM. Ved hjelp av denne protokollen kan den totale varigheten av tannbevegelsen forlenges, siden den aktiverte spolen gir et konstant kraftnivå for bevegelse på opptil ca. 1 mm. …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denne studien ble støttet av NIH (NIDCR R00- DE025053, PI:Naveh). Vi vil takke Harvard Center for Biological Imaging for infrastruktur og støtte. Alle tall genereres med biorender.com.

Materials

1-mL BD Luer-Lok syringe BD 309628
1X phosphate buffered saline VWR Life Sciences 0780-10L
200 proof ethanol VWR Life Sciences V1016
Aluminum alloy 5019 wire Sigma-aldrich GF15828813 0.08 mm diameter wire, length 100th, temper hard. Used as wire ligature around molar.
Avizo 9.7 Thermo Fisher Scientific N/A Used to analyze microCT scans
Castroviejo Micro Needle Holders Fine Science Tools 12060-01
Clr Plan-Apochromat 20x/1.0,CorrVIS-IR M27 85mm Zeiss N/A Used for second harmonic generation imaging
Cone socket handle, single ended, hand-form G.Hartzell and son 126-CSH3 Handle of the inspection mirror
EC Plan-Neofluar 5x/0.16 Zeiss 440321-9902 Used for light-sheet imaging
Elipar DeepCure-S LED curing light 3M ESPE 76985
Eppendorf safe-lock tubes, 1.5mL Eppendorf 22363204
Ethyl cinnamate, >= 98% Sigma-aldrich W243000-1KG-K
Hypodermic Needle, 27G x 1/2'' BD 305109
Ketathesia 100mg/ml Henry Schein Animal Health NDC:11695-0702-1
KIMWIPES delicate task wipers Kimberly-Clark 21905-026 (VWR Catalog number) Purchased from VWR
LightSheet Z.1 dual illumination microscope system Zeiss LightSheet Z.1/LightSheet 7 Used for lightsheet imaging
LSM 880 NLO multi-photon microscope Zeiss LSM 880 NLO Used for two-photon imaging
MEGAmicro, plane, 5mm dia, SS-Thread Hahnenkratt 6220 Front surface inspectrio mirror
MicroCT machine, MicroXCT-200 Xradia MICRO XCT-200
Mini-Colibri Fine Science Tools 17000-01
PermaFlo Flowable Composite Ultradent 948
Procedure platform N/A N/A Custom-made from lab materials
Routine stereo micscope M80 Leica Micosystems M80
Sentalloy NiTi open coil spring TOMY Inc. A 0.15mm diameter closed NiTi coil with an inner coil diameter of 0.9mm delivers a force of 10g. Similar products can be purchased from Dentsply Sirona. 
T-304 stainless steel ligature wire, 0.009'' diameter Orthodontics SBLW109 0.009''(.23mm) diameter, Soft temper
X-Ject E (Xylazine) 100mg/ml Henry Schein Animal Health NDC:11695-7085-1
Z100 Restorative, A2 shade 3M ESPE 5904A2

References

  1. Li, Y., et al. Orthodontic tooth movement: The biology and clinical implications. The Kaohsiung Journal of Medical Sciences. 34 (4), 207-214 (2018).
  2. Meikle, M. C. The tissue, cellular, and molecular regulation of orthodontic tooth movement: 100 years after Carl Sandstedt. European Journal of Orthodontics. 28, 221-240 (2006).
  3. Krishnan, V., Davidovitch, Z., molecular, Cellular, molecular, and tissue-level reactions to orthodontic force. American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 129 (4), 1-32 (2006).
  4. Shoji-Matsunaga, A., et al. Osteocyte regulation of orthodontic force-mediated tooth movement via RANKL expression. Scientific Reports. 7 (1), 8753 (2017).
  5. Oppenheim, A. Tissue changes, particularly of the bone, incident to tooth movement. European Journal of Orthodontics. 29, 2-15 (2007).
  6. Unnam, D., et al. Accelerated Orthodontics-An overview. Journal of Archives of Oral Biologyogy and Craniofacial Research. 3 (1), 4 (2018).
  7. von Bohl, M., Kuijpers-Jagtman, A. M. Hyalinization during orthodontic tooth movement : a systematic review on tissue reactions. European Journal of Orthodontics. 31 (1), 30-36 (2009).
  8. Kirschneck, C., et al. Comparative assessment of mouse models for experimental orthodontic tooth movement. Scientific Reports. 10 (1), 1-12 (2020).
  9. Naveh, G. R. S., Weiner, S. Initial orthodontic tooth movement of a multirooted tooth: a 3D study of a rat molar. Orthodontics & Craniofacial Research. 18 (3), 134-142 (2015).
  10. Nakamura, Y., et al. Time-lapse observation of rat periodontal ligament during function and tooth movement, using microcomputed tomography. European Journal of Orthodontics. 30 (3), 320-326 (2008).
  11. Kawarizadeh, A., Bourauel, C., Jager, A. Experimental and numerical determination of initial tooth mobility and material properties of the periodontal ligament in rat molar specimens. European Journal of Orthodontics. 25 (6), 569-578 (2003).
  12. Jónsdóttir, S. H., Giesen, E. B. W., Maltha, J. C. Biomechanical behavior of the periodontal ligament of the beagle dog during the first 5 hours of orthodontic force application. European Journal of Orthodontics. 28, 547 (2006).
  13. Lindhe, J., et al. Experimental breakdown of peri-implant and periodontal tissues. A study in the beagle dog. Clinical Oral Implants Research. 3 (1), 9-16 (1992).
  14. Salamati, A., et al. Functional tooth mobility in young pigs. Journal of Biomechanics. 104, 109716 (2020).
  15. Maria, R., et al. An unusual disordered alveolar bone material in the upper furcation region of minipig mandibles: A 3D hierarchical structural study. Journal of Structural Biology. 206 (1), 128-137 (2019).
  16. Wang, S., et al. The miniature pig: a useful large animal model for dental and orofacial research. Oral Diseases. 10, 1-7 (2007).
  17. Melsen, B. Tissue reaction to orthodontic tooth movement–a new paradigm. European Journal of Orthodontics. 23 (6), 671-681 (2001).
  18. Naveh, G. R. S., et al. Direct MicroCT imaging of non-mineralized connective tissues at high resolution. Connective Tissue Research. 55 (1), 52-60 (2014).
  19. Naveh, G. R. S., et al. Nonuniformity in ligaments is a structural strategy for optimizing functionality. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 9008 (2018).
  20. Naveh, G. R. S., et al. Tooth periodontal ligament: Direct 3D microCT visualization of the collagen network and how the network changes when the tooth is loaded. Journal of Structural Biology. 181 (2), 108-115 (2013).
  21. Naveh, G. R. S., et al. Tooth movements are guided by specific contact areas between the tooth root and the jaw bone : A dynamic 3D microCT study of the rat molar. Journal of Structural Biology. 17 (2), 477-483 (2012).
  22. Naveh, G. R. S., et al. Tooth-PDL-bone complex: Response to compressive loads encountered during mastication -A review. Archives of Oral Biology. 57 (12), 1575-1584 (2012).
  23. Ben-Zvi, Y., et al. Response of the tooth-periodontal ligament-bone complex to load: A microCT study of the minipig molar. Journal of Structural Biology. 205 (2), 155-162 (2019).
  24. Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452 (2017).
  25. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  26. Taddei, S. R. d. A., et al. Experimental model of tooth movement in mice: A standardized protocol for studying bone remodeling under compression and tensile strains. Journal of Biomechanics. 45 (16), 2729-2735 (2012).
  27. Nakamura, K., Sahara, N., Deguchi, T. Temporal changes in the distribution and number of macrophage-lineage cells in the periodontal membrane of the rat molar in response to experimental tooth movement. Archives of Oral Biology. 46 (7), 593-607 (2001).
  28. Rygh, P., et al. Activation of the vascular system: A main mediator of periodontal fiber remodeling in orthodontic tooth movement. American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 89 (6), 453-468 (1986).
  29. Nagao, M., et al. Vascular endothelial growth factor in cartilage development and osteoarthritis. Scientific Reports. 7 (1), 13027 (2017).
  30. Licht, A. H., et al. Endothelium-specific Cre recombinase activity in flk-1-Cre transgenic mice. Developmental Dynamics. 229 (2), 312-318 (2004).
  31. Connizzo, B. K., Naveh, G. R. S. In situ AFM-based nanoscale rheology reveals regional non-uniformity in viscoporoelastic mechanical behavior of the murine periodontal ligament. Journal of Biomechanics. 111, 109996 (2020).
  32. Connizzo, B. K., et al. Nonuniformity in Periodontal Ligament: Mechanics and Matrix Composition. Journal of Dental Research. 2, 179-186 (2020).

Play Video

Cite This Article
Xu, H., Lee, A., Sun, L., Naveh, G. R. S. 3D Imaging of PDL Collagen Fibers during Orthodontic Tooth Movement in Mandibular Murine Model. J. Vis. Exp. (170), e62149, doi:10.3791/62149 (2021).

View Video