Summary
マウスにおける歯の動きを発生させるプロトコルと、歯周靭帯のコラーゲン線維や血管の3D可視化法を、切り離さずに提示する。
Abstract
歯歯の運動は、外部力の結果として変化した軟部および硬い組織の複雑な生物学的プロセスである。これらの複雑なリモデリングプロセスを理解するためには、歯と歯周組織を3Dコンテキスト内で研究し、断面や組織のアーティファクトを最小限に抑えることが重要です。マウスモデルは、小さなサイズ、高い代謝率、遺伝学、取り扱いの容易さから、発生生物学や構造生物学、バイオメカニクスにも利用されることが多い。原則として、歯科関連研究のための優れたモデルにもなります。しかし、大きな障害は、その小さな歯の大きさ、特に臼歯です。本論文は、マウス下顎臼歯の歯周靭帯線維成分の歯周歯周運動を生成するためのステップ・プロトコルと、3Dイメージングのための2つの方法を提供することを目的としている。最初に提示される方法は、新鮮なコラーゲン組織の位相増強イメージングを可能にするマイクロCTセットアップに基づいています。第2の方法は、切片をかけずに骨を通してイメージングを可能にし、内因性蛍光を保存するエチルシンナメートを用いた骨のクリアリング法である。 Flk1-Creのようなレポーターマウスとこのクリアリング方法を組み合わせる 。TdTomatoは、PDLと歯槽骨の3D血管構造を画像化するその種の機会の最初の機会を提供しました。
Introduction
歯歯運動(OTM)の基本的な基礎となる生物学的プロセスは骨のリモデリングである。このリモデリングプロセスのトリガは、細胞外マトリックス(ECM)ストレス、壊死、血管破壊および形成1、2、3などの歯周靭帯(PDL)の構造の変化に起因する。歯槽骨リモデリングの他の可能なトリガーは、骨の骨細胞による力の感知に関連しています, だけでなく、歯槽骨自体の機械的変形;しかし、OTMにおける彼らの役割はまだ完全に解明されていません4,5.
OTM中のPDLの構造機能関係を明らかにすることを目的とした多くの研究にもかかわらず、明確な機能機構はまだ6,7に定義されていない。この主な理由は、2つの硬い組織(セメントと歯槽骨)の間にある軟部組織(PDL)のデータを取得する際の課題です。通常、構造情報を収集するメソッドは、PDL 構造を中断および変更する固定と断面化を必要とします。さらに、これらのメソッドのほとんどは、歪んでいなくても部分的な情報とローカライズされた情報のみを提供する2Dデータを生成します。PDLは構造と機能において均一ではないため、歯-PDL-骨複合体全体の無傷の3D構造に対処するアプローチが保証されています。
本論文では、マウスでOTMを生成する方法と、サンプルを切り離さずにPDL内のコラーゲン線維を3D可視化する2つの方法について説明する。
マウスモデルは、医学、発生生物学、薬物送達および構造研究におけるインビボ実験に広く使用されています。彼らは、特定のタンパク質と機能を排除または強化するために遺伝子組み換えすることができます。高速で再現可能で予測可能な開発制御を提供します。彼らはまた、その小さなサイズ8に画像を容易に.多くの利点にもかかわらず、歯科研究におけるマウスモデルは、特に臨床操作が保証されている場合、主に小さな歯のために頻繁に使用されません。ラット9、10、11、イヌ12、13、豚14、15、16およびサル17などの動物モデルは、マウスよりも頻繁に使用される。近年の高解像度イメージング技術の開発により、マウスモデルを利用してOTMの複雑なプロセスを解読する利点は数多くあります。本論文では、骨のリモデリングを引き起こす一定の力レベルを有する下顎骨の臼歯のメシャル運動を生成する方法を提示する。げっ歯類のOTM実験のほとんどは、下顎骨の移動性と舌の存在が別の複雑性レベルを追加するので、上顎で行われます。しかし、3D構造の完全性が望まれる場合には、下顎が多くの利点を有する。骨全体として簡単に解剖することができます。いくつかの種では、線維性の交付を介して2つの半下顎骨に分離することができます。それは密集し、平らであり、すべての内大なスペースのない歯だけを含んでいる。対照的に、上顎は頭蓋骨の一部であり、他の器官および構造と密接に関連しており、したがって、関連する歯茎骨を関連する歯槽骨を解剖するために広範な断面化が必要である。
位相増強を可能にする高分解能マイクロCT内のローディングシステムに結合した室内湿度室を用いて、先に述べたとおりに新鮮な繊維組織を3Dで可視化する方法を開発しました。新鮮な組織は、動物が染色や固定なしで犠牲にされた直後にスキャンされ、組織のアーティファクトや生体機械特性の変化を減らします。これらの3Dデータは、他の場所で説明されているように繊維の分布と方向分析に利用することができる。
ここで紹介する第2の3D組織全体のイメージング方法は、切断することなく骨を通してPDL繊維のイメージングを可能にする下顎骨の光学的なクリアリングに基づいています。興味深いことに、骨自体のコラーゲン線維の視覚化も可能にしますが、ここでは議論されません。一般に、組織をクリアする方法は2つあります。1つ目は、単純な浸漬、過水性またはヒドロゲル埋め込みのいずれかを介して、1.4を超える屈折率を有する水溶液にサンプルが浸漬される水性の洗浄である水性ベースのクリアリングです。しかし、この方法は、組織の構造保存と同様に透明性のレベルに制限され、したがって、組織の固定を必要とします。高透明サンプルを生成し、固定を必要としない第2の方法は、溶媒ベースの清算方法24,25である。下顎試料に対するエチル-3フェニルプロップ-2-エノエート(エチルシンナメート、ECi)に基づく修飾溶媒ベースのクリアリング法を生成した。この方法は、非毒性食品グレードのクリアリング剤、最小限の組織収縮、および蛍光タンパク質の保存を使用する利点を有する。
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Protocol
すべての動物実験は、NIHの実験動物のケアと使用に関するガイドラインとハーバード大学の施設動物のケアと使用委員会(議定書no.01840)のガイドラインに従って行われました。
1. 歯列歯運動
- マウスベッドを生成するには、くさび状の45°斜めヘッドレストを備えた平らなプラスチックプラットフォームを使用してください。ヘッドレストはプラスチック製の箱を切断することによって生成することができる。
- ヘッドレストとテーブル平面の間に約 30° の角度を生成するには、プラットフォームのヘッドエンドを高くします。曲がった厚いペーパークリップ(直径0.036インチ)をヘッド側端に取り付け、上部の切り傷を保持します。
- 尾端に、下部切歯を保持するために矯正パワーチェーンを取り付けることができる高い表面を生成します。プラットフォームの例については 、図 1 を参照してください。
- 1mLシリンジと27ゲージ針を用いて、キシラジンを10mg/kgで腹腔内注射し、ケタミン100mg/kgでマウスを麻酔します。
- カスタムメイドのプラットフォーム上に麻酔マウスを配置し、クリップループ上の上部切歯部をフックして上顎を固定します。下側切歯に矯正力チェーンを掛けてマウス下顎を開きます。ミニコリブリの口のレトラクターで頬を引っ込まておいてください。
- 5-6倍の倍率に達することができる外科顕微鏡または他の任意のステレオスコープの下にプラットホームを置く。
- 角膜脱水を防ぐために、マウスの目に50μLの生理焼け(約1滴)を塗布します。生理液を20分ごとに補充する。
- アルミ線(直径0.08mm)の長さ1cmを切ります。近位領域の頬側から、マイクロ外科用針ホルダーを使用して、第1モルと第2モル間の接触点をベローズにスライドさせます。スプリングエンドに通すために、最初の大臼歯の前に2mmの自由なエッジを残します。
- ニッケルチタン(NiTi)コイルを7~9個の糸で切ります。
注: コイルの弾性特性は、矯正運動に一定の力を与えます。コイルの訓練されていない全長は、切歯と大臼歯の間のギャップよりも短くする必要があります。歯にコイルを固定するために、両端に余分な2つの糸が必要であることを覚えておいてください。マイクロCTスキャン中にビーム硬化などのスキャンアーティファクトを低減するために、アルミニウム線が選択されます。 - NiTiコイルスプリング(0.15mm線径、0.9mm内コイル径、10gの力)を下の第1モルと下切歯の間に挿入します。ステップ1.6の最初の大臼歯の周りに挿入されたワイヤ合字を使用して、コイルスプリングの2つのスレッドの周りにワイヤーをしっかりとねじって、大臼歯側にコイルを固定します。
- 均一な力レベルを確保するために、最初の大臼歯と切歯の間に3つのアクティブな糸を正確に使用します。切り傷から電源チェーンを一時的に取り外し、切り傷部の上に2~3個の緊張していない糸をループしてコイルを固定します。スレッドを切歯のない歯肉マージンまでスライドさせます。
- 流動性複合樹脂の層をコイルの切口境界に置き、歯科硬化光で硬化させます。樹脂を硬化した後、電源チェーンを交換してください。
- 同じ硬化光を使用して、NiTiコイルを20sで加熱します。これにより、NiTiコイルが引き締まる。完成した配置は 図1Cを示しています。
- 反対側をそのままにするか、1番目と2番目の大臼歯の間にワイヤーなどのシャムを挿入します。
- 麻酔したマウスを加熱した光の下に置き、回復するまでマウスを暖かく保ちます。
- マウスを個々のケージに戻し、毎日監視します。歯列矯正運動では食事の変化は必要ありません。
注:一方の側のOTMデバイスは、いくつかの不快感を引き起こすが、供給を損なわない。ただし、両面にデバイスを挿入することは、不快感の追加量のためにお勧めしません。痛みの外向きの兆候が見られない限り、鎮痛薬は必要ありません。
2. 新鮮なヘミ下顎下のPDL繊維のマイクロCTスキャン
- 半額下顎下を取り付ける (図 2)
- 矯正運動の所望の持続時間の後、頸部脱臼を介してマウスを犠牲にする。下顎を取り除き、半顎に分離します。
注:サンプルは固定されないので、顎の解剖と取り付けをできるだけ早く行うことが重要です(理想的には30分以内)。 - 清潔な糸くずのない拭き取りで、周囲の軟部組織を優しく取り除きます。
- 少なくとも4倍の倍率で、マイクロサージカルハサミとピンセットを使用して矯正装置を立体顕微鏡で取り外します。
- 1.5 mLの体積、マイクロ遠心分離チューブに、水で湿らせた糸くずのないワイプの一部にサンプル湿潤を保ちます。
- パック可能な歯科用複合樹脂をステージ上のサンプルスロットに入れ、フレッシュなヘミ下顎を複合材料に入れます。取り付ける前に、歯科用複合材料と接触する骨表面が軟組織から解放され、乾燥していることを確認してください。
- 最初の大臼歯がステージの正中溝に中央に配置されるまで、半顎の位置を調整します。咬合面が水平であることを確認します。位置決めに満足したら、複合材料を硬化させます。
注:少量の歯科複合材料を、試料の安定化に役立てるには、半口下顎の側面や切り傷を横切って置くことができます。 - 湿らせた糸くずのないワイプをサンプルステージの湿度プール内に入れてください。歯科用複合材料を第1大臼歯の咬合面に置く。チャンバーを閉じる前に、標本レベルでX線経路を妨げないようにしてください。
- マイクロCTにチャンバーを貼り付ける。イメージング中の動きを最小限に抑えるように、チャンバーをマイクロCTサンプルステージにねじ込みます。
- X線をオンにし、アンビルの先端が複合材料で囲まれるが、力の増加が検出されないまで、アンビルを垂直に下げながら2D画像を撮影します。
- 複合材料にアンビルが埋め込まれたら、X線源を閉じます。次に、マイクロCTチャンバーを開き、透明なプレキシガラス窓から複合体を硬化させます。
- 矯正運動の所望の持続時間の後、頸部脱臼を介してマウスを犠牲にする。下顎を取り除き、半顎に分離します。
- マイクロCT設定
- ソース電圧を40kVに、電流を200μAに設定し、10倍の倍率検出器を使用して、サンプルを視野の枠内に配置します。キャプチャした画像には 2 のビン分割を使用します。
注: PDL は骨や歯に比べて密度が著しく低いため、PDL の視覚化には電力と露出時間が長く必要です。このプロトコルは、PDL を視覚化するための設定を提供します。 - 単一画像の露出時間を 25 s に設定します。サンプルステージの回転角度を183度以上に設定します。2500 の投影のスキャンを設定します。X線源フィルターを使用しない場合、結果として得られるスキャンの両側に0.76 μmのボクセルサイズがあります。
- マイクロCTガイドラインに従って、適切な再構築のための参照スキャンを収集します。総投影として参照画像の 1/3 数を使用します。バックプロジェクションフィルターアルゴリズムを使用して、追加のビニングなしでボリュームを再構築します。
- ソース電圧を40kVに、電流を200μAに設定し、10倍の倍率検出器を使用して、サンプルを視野の枠内に配置します。キャプチャした画像には 2 のビン分割を使用します。
3. 消し方 (図 3)
- 5つの1.5 mLマイクロ遠心分離管を準備します。
- 1.5 mLマイクロ遠心分離管で、1.4 mLの溶液を調製します:4%パラホルムアルデヒド(PFA)をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に、50%エタノール(EtOH)を脱イオン(DI)水に、DI水中で70%EtOH、および2つのチューブ100%EtOHで調製します。
注: PFA はサンプルの固定に使用されます。ECi クリアリングは、固定されていないサンプルでも機能します。固定されていないサンプルをクリアするには、PFA ステップをスキップします。 - 4%PFAに解剖されたヘミ下顎を置く。アルミホイルで覆い、6時間室温で穏やかな設定でロッカーの上に置きます。
- 半減虫を50%EtOHに移動します。光から覆われたロッカーの上に16時間置きます。
- 半減虫を70%EtOHに移動します。光から覆われたロッカーの上に16時間置きます。
- 半減虫を100%EtOHに移動します。光から覆われたロッカーの上に16時間置きます。
- 3.6 を繰り返します。第2の100%EtOHの管で。
- ガラスまたはポリプロピレンチューブに5 mLのECiを用意します。
注:ECiはポリスチレンを溶解しますが、ポリプロピレンは溶解しません。また、蛍光タンパク質を有する組織を用いなければ、試料は、クリア処理時に光にさらされ得る。 - 半位取り可能なチューブをECiチューブに移動します。チューブをアルミホイルで覆い、ロッカーの上に12時間以上穏やかな設定で置きます。
注: プロトコルはここで一時停止することができます。脱水サンプルは、室温でECiに保存することができます。ECiの凍結または融点は6.5〜8.0°Cである。 4°Cで保管しないでください。 - 半顎下は蛍光顕微鏡での画像作成の準備ができている。
注: イメージング中は、光学的に透明な状態を保つために、サンプルを ECi に浸す必要があります。
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Representative Results
本論文では、OTMを作製する方法と、断面を全くつけずにPDL内部のコラーゲン繊維を3Dイメージングする方法を2つ紹介する。動物研究のために、歯の整列が必要でない場合、歯の動きは、すべての根のレベルで歯槽骨の改造を生成する場合、矯正と見なされます。信頼性の高いOTMを生成するためには、歯に適用される一定の力レベルが必要です。ここで、活性化された形状記憶NiTiコイルは、7日間および7日を超える実験時間を通して10gの一貫した力を生成するために使用される。ここで説明するコイルの活性化(図1)は、マルテンシティック相内でNiTiコイルにひずみを発生させ、ヒステリシス状態にコイルを引き起こし、歯に一定の応力を与えます。コイル挿入後に硬化光でコイルを温める場合、合金がオーステニアスの形に移行し、形状メモリ効果が発生することも確認します。
ここでは、9週齢の雄マウスの代表的な結果を示します。OTMの7日後の第1および第2の大臼歯のクラウン間の平均分裂性空間は、1X倍率(n=12、st.dev を有するマイクロCT中のモルの近位表面間で測定された40μm である。= 15 μm) (図 1E)。MDLの平均空間は、OTMの7日前と後の80μmです(図4B)。これは、最初のモルがメシリーに翻訳され、7日間が自然の中で骨吸収とアポレーションのプロセスを生成しながら、マウスモデルでOTMを生成するための十分な時間であることを確認します(図4)。マウスは標準的なハードパレット食を与えた。ダイエットの変更は、デバイス挿入後に行われました。
OTM中の歯-PDL骨複合体の変化を可視化する最初の方法は、先に9、18、19、20、22、23を詳細に説明した新鮮な組織の位相増強マイクロCTイメージング(図4)に基づいています。要するに、マイクロCTまたはシンクロトロンのいずれかの位相増強能力を備え、繊維組織の機械的安定化および加湿環境、新鮮なコラーゲン繊維は、いかなる固定または造影剤を使用せずに可視化することができる。PDLでは見られる繊維は、歯と骨の両方に接続されているものであり、主にI型コラーゲン19である。このユニークな機会を3Dで可視化するこのユニークな機会を無傷のPDLで、3D繊維密度、繊維配向、および先に説明した9、19のような歯の3D運動の分析を可能にする。具体的には、ここでは、PDLにおける繊維ネットワークの可視化を提示する。時間0では、骨とPDLの両方で生理学的なリモデリングが観察され得る。リモデリングは、セルラーセメントで発生します。ただし、これは提示された方法に直接関係していないため、詳しく説明しません。bone-PDL インターフェイスは、任意の力の適用の前に横 (図 4A) と矢状 (図 4B)の両方の平面でほとんど滑らかです。コロナ平面(図4C)では、骨-PDLインターフェースは、特にリモデリングバランスを示す可能性のある有端領域に向かって荒く、再吸収に向かう傾向があります。OTM(図4D-F)の3日間で、最初のモルが間に合って移動する(方向は破線の矢印で表される)、PDLの繊維密度が低下する(白矢印ヘッド)。骨-PDL界面は、PDL26の主に圧縮力に関連する破骨形成活性および骨吸収プロセスを示す骨表面のクレーターの発達により、0日よりも粗いが、ここでは3日の張力領域で見られる。PDL内の張力領域における組織破壊は27,28を示唆しており、この方法を用いて明らかに見ることができる。荒い境界線は根の異なるレベル(白い矢印)で見られるので、歯の動きは王冠の転倒だけでなく、本質的に翻訳的であることを示唆しています。OTMの7日間(図4G-I)では、骨内のクレーター、粗い境界、PDL空間の膨張などの骨吸収徴候が全ての平面に見られますが、平均PDL空間はOTMの3日よりも狭いです(図4D-F)。しかし、一部の地域では、OTMの7日後に骨とPDLの境界が滑らかになり、これらの領域は根の遠位面に位置し、これはOTMでのメシアル方向への期待通り、骨のアポジショの徴候である可能性が最も高い。
マイクロCTイメージング時間が長く(〜19時間)、ステージの回転が原因で、サンプルの取り付けはサンプルを静止させるために不可欠です。サンプルが不安定な場合、スキャンがぼやけます。 図 5 は、スキャン中にサンプルが移動したときのマイクロ CT スキャンの外観を示しています。歯と骨がぼやけています。PDL繊維も骨細胞も観察されない。このような事件では、オブジェクトの余白の周りに存在するシルエットがあります。 図5では、歯冠の複数の輪郭が観察され得る(矢印)。
研究目標に応じて、硬い組織に関する情報のみが必要な場合、PDL繊維の分解能と可視化は、より短いスキャン時間のために貿易で犠牲になる可能性があります。
断面化を行わないPDL繊維の3D可視化の相補的な方法は、ECiを用いた光学的にクリアされたサンプルの光学顕微鏡検査によるものである(図3)。この方法は、固定化せずに標本に使用することができ、クリアする前に組織に存在する蛍光シグナルを保存します。ECiクリアリング前後の半下顎下が 図3B および 3Cに示されています。PDLの十分なサンプルの除去は、下顎の突出を通してグリッドペーパーが見えるときに確認することができる。除きの量は脱水プロセスの延長によって調節することができる。 図6 は、歯槽骨およびPDLの両方のコラーゲン線維からの第2ハーモニック生成(SHG)シグナルをクリアされた下顎骨に示す。骨のコラーゲン線維を3Dでイメージングすることは複雑なプロセスであり、FIB/SEMなどの電子顕微鏡法を利用することが多い。しかし、ECi系クリアリング法及びSHGを利用して、歯槽骨繊維は、特に水平方向にはっきりと見られる。骨表面からPDLの奥深くにサンプルを通して変換する場合、繊維が突然その向きを垂直に変えるため、PDLファイバレベルへの移行は非常に明確です。
光シート顕微鏡は、骨を通して蛍光タンパク質をイメージングするためにも利用することができる。この場合、トランスジェニックFlk1-creからクリアされたサンプルTdtomatoマウス19、29、30、血管を裏打ちする蛍光内皮細胞が明らかに観察される(図7A、B、C、E)。適切なクリアは、ライトシート顕微鏡で分かりやすい画像を生成するための鍵です。骨が完全にクリアされていないと、PDL内の血管は観察されなかった(図7D、F)。
図1:矯正用器具挿入装置の設置A. マウスのベッドは、動物をサポートし、口を開いたままにするために、実験室の供給から作られました。本体用のプラスチックプラットフォーム(PP)は30°傾斜上にあり、ヘッドレスト(HR)はPPの表面から45°の角度にあります。PPの末端ヘッドを上昇させるために2層の管の立場(TS)は使用される。クリップループ(黒矢印)は上部の切歯を固定し、下部の歯列のパワーチェーン(白い矢印)を下側切歯に引っ掛けます。直径5mmの検査ミラーを臼歯の目視検査に使用した。 B. マウスベッドの側面図。サーフェス間の角度は(緑とマゼンタ)マークされます。 C. 適切に配置されたデバイスの代表的な画像。 D. デバイスの注入前に検査ミラーを通して見られる臼歯。 E. 矯正運動後の大臼歯の代表的な画像。破線は、第1モルと第2の大臼歯の輪郭をトレースします。 F. デバイスとその配置の図。赤い線は、最初の大臼歯の周りのワイヤ合字を表します。オレンジ色の線は、コイルを固定するために使用される可動性複合樹脂を表します。NiTiコイルは青色で表示され、ラベルが付いています。 G. 7日間の矯正運動後に取り付けられた装置で半形下顎骨を解剖した。3つのコイルスレッドがまだ開いている様子に注意して、7日後もコイルがアクティブであることを示します。スケールバー= EとGで1 mm この 図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:マイクロCTイメージング用のカスタムメイドのチャンバーに取り付けられたヘミ下顎分A.マイクロCTマシン内のサンプルチャンバーの完全なセットアップ。X線源は左側に、検出器は右に見られます。赤い長方形は、サンプルステージ(SS)のチャンバーに取り付けられた半下顎の輪郭を描いています。ここに示すサンプルチャンバは、モーター(M)、アンビル(A、白い破線で囲まれている)、チャンバーの上にあるアンビルシャフト(AS)を含む機械的な試験セットアップの一部です。完全なセットアップはCT段階にねじ込まれる。インセット画像は、内部のサンプルと湿度チャンバーを含む赤い輪郭領域のクローズアップを示しています。B.サンプルステージに取り付けられたサンプルのトップビュー。湿度プール(灰色の矢印)は、イメージング中に湿度を維持するために、周囲に組み込まれています。●真ん中の円形ステージでは、傾斜深溝(黒矢印)にヘミ下顎を取り付けることができます。細い溝(白い矢印)は、サンプルの向きを助けるためにステージの正中線をマークします。C.サンプル溝を有する円形ステージの図。溝の傾斜は下顎を支え、大臼歯が根の縦軸に沿って取付けられることを可能にする。D.代表的なマイクロCT 2Dスライスと、半減量サンプルの3Dボリューム画像を組み合わせたものです。ここでの近位間ギャップは52μmです。サンプルは、下のサンプルステージ(図示せず)に取り付けられ、アンビル(A)は歯科コンポジット(DC)によって上に取り付けられます。スケールバー= 500 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.マウスの半下顎の解剖のためのECiベースのクリアリング方法。A. 解剖されたヘミ下顎は4%PFA、50%EtOH、70%EtOHおよび100%EtOH連続して浸漬される。脱水後、ヘミ下顎はイメージングまで最低12時間ECiに保存される。 B. 解剖直後の半減食。 C. クリアリング完了後の半下顎。スケールバー= 5 mm この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:歯列運動の異なる段階での新鮮なサンプルのPDLの代表的な in-situ マイクロCTスキャン。A-C、 歯列矯正運動なし。 A. 歯槽骨の中のメス(M)および遠位(D)根を示す半下顎骨の横面におけるマイクロCT2D画像、B-バッカル、肺胞骨のL-リンガル側。歯根と歯槽骨の間には、PDL空間とその中の繊維がはっきりと観察される。 B. 矢状平面の2D画像。 コロ ナ平面内のC.2D画像。 D-E、OTM の3日後の2D画像は、矢印ヘッドは、コラーゲン繊維密度の低下とPDL内の領域を指し、白い矢印は骨吸収の領域を指す。 G-I、OTM の7日後の2D画像は、黒い矢印が骨のアポジスの領域を指す。スケールバー= 150 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:矢状面における2DマイクロCT画像は、スキャン中の歯の動きによる歯と骨の両方のぼやけた構造を示す。 矢印は、歯の複数のボードラインを指し、その動きを示します。スケールバー 150 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:第2高調波発生(SHG)で第1の臼歯画像を示すECiクリアされた下顎がクリアされた。 PDLのコラーゲン線維が見られる領域に白矢印点が見られ、垂直方向に注意し、黒矢印はPDLの垂直繊維と歯槽骨の水平繊維の両方が見られる領域を指す。T歯、Fファーケーション、AB-歯槽骨、MR-mesial根、DR-遠位根、スケールバー150μm。画像は、1.33-1.56のRIを有する溶液用の20Xマルチ浸漬レンズを使用して得られた。励起レーザーは10%の電力で860nmに設定した。ピクセル住居時間:0.51μs;スキャンモード:フレーム;平均: 16;検出器タイプ:非スキャンフォトマルチプライヤ管検出器。検出器ゲイン800V. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 7.ECiクリア Flk1-Cre;tdTomato マウスのライトシート顕微鏡画像。A. 最適にクリアされた制御の半管の半管。骨(矢印頭)とPDL空間(矢印)内の血管のネットワークが見える。 B. 第1大臼歯のメシオリンガル領域の差し込み(Aで輪郭が描かれた赤色)は血管を示す。 C. 7日間のOTM半減食とDを最適にクリア した。 最適にクリアされたヘミ下顎。 E. 矢状面におけるパネルCの2D画像は、骨(灰色の矢印)およびPDL空間(白矢印)における血管を明確に定義した画像である。 F. パネルDの二次元スライス画像は、E内の画像と同じ領域で、ぼやけた画像を生じる。スケールバーA、C、D=500μm、B、E、F=100μm画像は、カメラを検出器として使用して、5X計画目的で撮影しました。励起レーザーは4%の電力で561nmであった。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
マウスでOTMを生成することは、サイズ、遺伝学および取り扱いの利点のために非常に望ましい。下顎薬を使用すると、組織解剖の点で簡単に処理できるだけでなく、サンプル調製物およびイメージングを提供します。ここでは、OTMの7日以内に骨の中の歯の移動運動を伴うOTMを生成する方法を提示した。このプロトコルを使用すると、活性化コイルが約1mmまでの動きのための一定の力レベルを提供するので、歯の動きの全体的な持続時間を延長することができます。しかし、コイルのメシアル側は切歯に固定され、常に噴出している。その結果、力ベクトルが徐々に変化し、押し出し力の生成が開始されます。これは、7日ごとに、メシアルエンドの添付レベルの調整を行う場合に回避できます。
PDLはOTMのイニシエータであるため、OTMのさまざまな段階での構造と機能を理解することは非常に重要です。しかし、PDLは、その構造と機能19、22、31、32の両方で均一ではありません。その結果、意味のあるデータを取得するためには、PDLを3Dで研究する必要があり、組織の切り離しや操作は可能な限り避けるべきです。しかし、2つの硬い組織の間に位置する軟部組織を調査することは、そのような要件を満たすことが困難になります。PDLを研究する従来の方法では、多くの場合、3D構造を損ない、その生理的環境から組織を取り除き、その結果、PDLの構造および生体力学的特性を変化させる。構造学的特性と生体機械特性の両方がOTM中に動的変化を起こし、組織3Dコンテキストをさらに維持することを正当化します。そのために、断面化せずに組織全体のイメージングを可能にする2つの方法を説明し、同じサンプルで蛍光シグナル、形態および鉱物化データを同時に局化して使用することもできます。
提供された方法論的記述は、読者に学習分野での方法を適用するよう指示します。マイクロCTのイメージ投射はPDL繊維の網の3D視覚化を可能にする。画像を解析して、方向解析や密度解析を行い、OTM中のPDLの変化を定量的に調査することができます。また、ライトシート顕微鏡や共焦点イメージングなど、容易に入手可能な光学顕微鏡法で可視化できるクリアリング方法についても説明した。ライトシート顕微鏡は、比較的高速なイメージング速度で大きな標本の3D画像を生成する利点があります。共焦点顕微鏡は、コラーゲン繊維イメージングおよび蛍光タグ用のSHG信号を利用した高解像度3D可視化を可能にします。これらの方法は、独立してまたは組み合わせることで、最小限の組織製剤で3D構造研究に多くの可能性を開きます。
このプロトコルのいくつかの困難なステップは、特別な注意が必要です。
まず、コイルの配置中に、合字ワイヤは第1モルと第2のモルの間にしっかりと配置されなければならない。このプロセスは、マウスの歯の小さな寸法のために挑戦的です。配置を導くためにベンチトップの実体顕微鏡を使用することを推奨します。ただし、手順中に小さな動きをすると、マウスが動き、関心のある領域が視野の外に出る可能性があります。代わりに、オペレータに装着できる4〜5倍の拡大ループを使用することをお勧めします。
第二に、クリアリング結果は脱水プロセスに依存する。サンプルが目的の透明度レベルに達していない場合、我々の提案は、脱水時間を増加させることです。より具体的には、100%のEtOHにおけるより長い浸漬時間が最終製品の透明性を向上させることが示されている。しかし、脱水のレベルの上昇は、蛍光レベル24,25を劇的に低下させることができることに留意すべきである。提示されたECiベースの方法は、2週間24を超える蛍光シグナルを保存することが示された。
このプロトコルの側面は、他の目的の多くを研究するために変更することができます。マイクロCTの内部で設計された部屋は負荷電池およびモーターと結合され、半減湿サンプルの張力/圧縮テストを行う機能がある。マイクロCTの可視化と組み合わせることで、このセットアップは、様々な機械的負荷21を有するPDL in-in ininsの変化を示すことができる。説明されたクリアリング方法は、固定されていないサンプルにも実装することができ、様々なイメージングモダリティの興味深い組み合わせの機会を提供します。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、NIH(NIDCR R00- DE025053、PI:Naveh)によってサポートされました。ハーバード大学生物イメージングセンターのインフラとサポートに感謝します。すべての数値は biorender.com で生成されます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-mL BD Luer-Lok syringe | BD | 309628 | |
| 1X phosphate buffered saline | VWR Life Sciences | 0780-10L | |
| 200 proof ethanol | VWR Life Sciences | V1016 | |
| Aluminum alloy 5019 wire | Sigma-aldrich | GF15828813 | 0.08 mm diameter wire, length 100th, temper hard. Used as wire ligature around molar. |
| Avizo 9.7 | Thermo Fisher Scientific | N/A | Used to analyze microCT scans |
| Castroviejo Micro Needle Holders | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| Clr Plan-Apochromat 20x/1.0,CorrVIS-IR M27 85mm | Zeiss | N/A | Used for second harmonic generation imaging |
| Cone socket handle, single ended, hand-form | G.Hartzell and son | 126-CSH3 | Handle of the inspection mirror |
| EC Plan-Neofluar 5x/0.16 | Zeiss | 440321-9902 | Used for light-sheet imaging |
| Elipar DeepCure-S LED curing light | 3M ESPE | 76985 | |
| Eppendorf safe-lock tubes, 1.5mL | Eppendorf | 22363204 | |
| Ethyl cinnamate, >= 98% | Sigma-aldrich | W243000-1KG-K | |
| Hypodermic Needle, 27G x 1/2'' | BD | 305109 | |
| Ketathesia 100mg/ml | Henry Schein Animal Health | NDC:11695-0702-1 | |
| KIMWIPES delicate task wipers | Kimberly-Clark | 21905-026 (VWR Catalog number) | Purchased from VWR |
| LightSheet Z.1 dual illumination microscope system | Zeiss | LightSheet Z.1/LightSheet 7 | Used for lightsheet imaging |
| LSM 880 NLO multi-photon microscope | Zeiss | LSM 880 NLO | Used for two-photon imaging |
| MEGAmicro, plane, 5mm dia, SS-Thread | Hahnenkratt | 6220 | Front surface inspectrio mirror |
| MicroCT machine, MicroXCT-200 | Xradia | MICRO XCT-200 | |
| Mini-Colibri | Fine Science Tools | 17000-01 | |
| PermaFlo Flowable Composite | Ultradent | 948 | |
| Procedure platform | N/A | N/A | Custom-made from lab materials |
| Routine stereo micscope M80 | Leica Micosystems | M80 | |
| Sentalloy NiTi open coil spring | TOMY Inc. | A 0.15mm diameter closed NiTi coil with an inner coil diameter of 0.9mm delivers a force of 10g. Similar products can be purchased from Dentsply Sirona. | |
| T-304 stainless steel ligature wire, 0.009'' diameter | Orthodontics | SBLW109 | 0.009''(.23mm) diameter, Soft temper |
| X-Ject E (Xylazine) 100mg/ml | Henry Schein Animal Health | NDC:11695-7085-1 | |
| Z100 Restorative, A2 shade | 3M ESPE | 5904A2 |
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