التصوير ثلاثي الأبعاد لألياف الكولاجين PDL أثناء حركة تقويم الأسنان في نموذج مورين الفك السفلي
Summary
نقدم بروتوكولا لتوليد حركة الأسنان التقويمية في الفئران وطرق التصور ثلاثي الأبعاد لألياف الكولاجين والأوعية الدموية للأربطة اللثة دون تقسيم.
Abstract
حركة الأسنان التقويمية هي عملية بيولوجية معقدة لتغيير الأنسجة الرخوة والثابتة نتيجة للقوى الخارجية. من أجل فهم عمليات إعادة العرض المعقدة هذه ، من المهم دراسة أنسجة الأسنان واللثة ضمن سياقها ثلاثي الأبعاد وبالتالي تقليل أي قطع أثرية من الأقسام والأنسجة. وغالبا ما تستخدم نماذج الماوس في علم الأحياء التنموية والهيكلية، وكذلك في الميكانيكا الحيوية نظرا لصغر حجمها، وارتفاع معدل الأيض، وعلم الوراثة وسهولة التعامل معها. من حيث المبدأ هذا أيضا يجعلها نماذج ممتازة للدراسات المتعلقة بالأسنان. ومع ذلك ، فإن العائق الرئيسي هو صغر حجم الأسنان ، والأضراس على وجه الخصوص. تهدف هذه الورقة إلى توفير بروتوكول خطوة بخطوة لتوليد حركة الأسنان التقويمية وطرقتين للتصوير ثلاثي الأبعاد للمكون الليفي للأربطة اللثة من ضرس الفك السفلي للفأرة. تعتمد الطريقة الأولى المقدمة على إعداد التصوير المقطعي الدقيق الذي يتيح تصوير المرحلة لتعزيز أنسجة الكولاجين الطازجة. الطريقة الثانية هي طريقة تطهير العظام باستخدام إيثيل سينامات التي تمكن التصوير من خلال العظام دون تقسيم ويحافظ على الفلورية الذاتية. الجمع بين هذه الطريقة المقاصة مع الفئران مراسل مثل Flk1–كري; قدمت TdTomato فرصة أولى من نوعها لتصوير الأوعية ثلاثية الأبعاد في PDL وعظم الحويصلات.
Introduction
العملية البيولوجية الأساسية الكامنة في حركة الأسنان التقويمية (OTM) هي إعادة عرض العظام. ويعزى الزناد لعملية إعادة عرض هذه التغييرات في هيكل الرباط اللثة (PDL) مثل الإجهاد خارج الخلية (ECM) ، نخر وكذلك تدمير الأوعية الدموية وتشكيل1،2،3. ترتبط المحفزات المحتملة الأخرى لإعادة عرض العظام الحويصلات الشمسية باستشعار القوة بواسطة الخلايا العظمية في العظام ، وكذلك التشوه الميكانيكي للعظم الحويصلات الدموية نفسه ؛ لكن دورهم في OTM لا يزال غير توضيح كامل4,5.
على الرغم من العديد من الدراسات التي تهدف إلى الكشف عن العلاقات بين هيكل وظيفة من PDL خلال OTM، آلية وظيفية واضحة لم يتم تعريفهابعد 6،7. والسبب الرئيسي لذلك هو التحدي في استرجاع بيانات الأنسجة الرخوة (PDL) الموجودة بين اثنين من الأنسجة الصلبة (الاسمنت والعظام الحويصلات). عادة ما تتطلب الطرق المقبولة لجمع المعلومات الهيكلية التثبيت والقسمة التي تعطل وتعديل بنية PDL. وعلاوة على ذلك، فإن معظم هذه الطرق تسفر عن بيانات 2D التي حتى لو لم تكن مشوهة، تعطي معلومات جزئية ومترجمة فقط. وبما أن PDL ليست موحدة في هيكلها ووظيفتها ، فإن النهج الذي يعالج الهيكل ثلاثي الأبعاد السليم لمجمع الأسنان PDL-bone بأكمله له ما يبرره.
هذه الورقة سوف تصف طريقة لتوليد OTM في الفئران وطريقتين التي تمكن التصور 3D من ألياف الكولاجين في PDL دون أي تقسيم العينة.
وتستخدم نماذج مورين على نطاق واسع للتجارب في الجسم الحي في الطب والبيولوجيا التنموية وتسليم الأدوية والدراسات الهيكلية. ويمكن تعديلها وراثيا للقضاء على أو تعزيز بروتينات محددة وظيفة; أنها توفر سيطرة سريعة وقابلة للتكرار ويمكن التنبؤ بها التنمية; كما أنها سهلة الصورة نظرا لحجمها الصغير8. على الرغم من مزاياها العديدة ، لا تستخدم نماذج الماوس في أبحاث طب الأسنان بشكل متكرر ، خاصة عندما يكون هناك ما يبرر التلاعب السريري ، ويرجع ذلك في الغالب إلى الأسنان الصغيرة الحجم. نماذج حيوانية مثل الفئران9،10،11، ال12،13، الخنازير14،15،16 والقرود17 تستخدم في كثير من الأحيان من الفئران. مع التطور الأخير لتقنيات التصوير عالية الدقة ، فإن مزايا استخدام نموذج الماوس لفك رموز العمليات المعقدة في OTM عديدة. تقدم هذه الورقة طريقة لتوليد حركة ميسالية للسن الضرس في الفك السفلي مع مستويات القوة الثابتة التي تؤدي إلى إعادة عرض العظام. تتم معظم تجارب OTM في القوارض في الفك العلوي ، لأن حركة الفك السفلي ووجود اللسان يضيفان مستوى تعقيد آخر. ومع ذلك ، فإن الفك السفلي له العديد من المزايا عندما يكون المطلوب السلامة الهيكلية ثلاثية الأبعاد. يمكن تشريحه بسهولة كعظم كامل. في بعض الأنواع يمكن فصله إلى اثنين من الفك السفلي هيمي من خلال السمفونية الليفية; وهو مدمج، شقة ويحتوي فقط على الأسنان دون أي مساحات الجيوب الأنفية. في المقابل ، فإن الفك العلوي هو جزء من الجمجمة ويرتبط ارتباطا وثيقا بالأعضاء والهياكل الأخرى ، وبالتالي هناك حاجة إلى تقسيم واسع النطاق من أجل تشريح عظم السنفية مع الأسنان المرتبطة بها.
باستخدام غرفة الرطوبة في المنزل إلى جانب نظام التحميل داخل عالية الدقة الصغرى CT التي تمكن تعزيز المرحلة، وضعنا طريقة لتصور الأنسجة الليفية الطازجة في 3D كما هو موضح سابقا9،18،19،20،21،22،23. يتم مسح الأنسجة الطازجة مباشرة بعد التضحية بالحيوان دون أي تلطيخ أو تثبيت ، مما يقلل من قطع الأنسجة وكذلك تعديلات الخصائص الميكانيكية الحيوية. ويمكن استخدام هذه البيانات 3D للتوزيع وتحليل اتجاه الألياف كما هو موضح في مكان آخر19.
ويستند الثاني 3D طريقة تصوير الأنسجة الكاملة المعروضة هنا على المقاصة البصرية من الفك السفلي الذي يتيح التصوير من ألياف PDL من خلال العظام دون أي تقسيم. ومن المثير للاهتمام أنه يتيح أيضا تصور ألياف الكولاجين من العظام نفسها، ولكن هذا لن يناقش هنا. بشكل عام، هناك طريقتان لإزالة الأنسجة. الأول هو المقاصة المائية حيث يتم غمر العينة في محلول مائي مع مؤشر انكسار أكبر من 1.4 إما من خلال الغمر البسيط أو الإماهة المفرطة أو تضمين الهيدروجيل. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة محدودة في مستوى الشفافية وكذلك الحفاظ الهيكلي على الأنسجة ، وبالتالي تتطلب تثبيت الأنسجة. الطريقة الثانية التي تسفر عن عينات شفافة للغاية ولا تتطلب التثبيت هي طريقة المقاصة القائمة على المذيبات24،25. لقد قمنا بإنشاء طريقة مقاصة معدلة قائمة على المذيبات استنادا إلى الإيثيل-3-فينيلبروب-2-إينوات (إيثيل سينامات، ECi) للعينات الفكية. هذه الطريقة لديها مزايا استخدام غير سامة الغذاء الصف عامل المقاصة، والحد الأدنى من انكماش الأنسجة، والحفاظ على البروتينات الفلورية.
Protocol
Representative Results
Discussion
توليد OTM في الفئران مرغوب فيه للغاية بسبب الحجم وعلم الوراثة ومزايا المناولة. استخدام الفك السفلي يوفر سهولة التعامل مع كل من حيث تشريح الأنسجة وكذلك إعداد العينة والتصوير. هنا قدمنا طريقة لتوليد OTM مع حركة تحويلية من الأسنان داخل العظام في غضون 7 أيام من OTM. باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن ت?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعمت هذه الدراسة من قبل المعاهد القومية للصحة (NIDCR R00- DE025053، PI:Naveh). نود أن نشكر مركز هارفارد للتصوير البيولوجي على البنية التحتية والدعم. يتم إنشاء جميع الأرقام مع biorender.com.
Materials
| 1-mL BD Luer-Lok syringe | BD | 309628 | |
| 1X phosphate buffered saline | VWR Life Sciences | 0780-10L | |
| 200 proof ethanol | VWR Life Sciences | V1016 | |
| Aluminum alloy 5019 wire | Sigma-aldrich | GF15828813 | 0.08 mm diameter wire, length 100th, temper hard. Used as wire ligature around molar. |
| Avizo 9.7 | Thermo Fisher Scientific | N/A | Used to analyze microCT scans |
| Castroviejo Micro Needle Holders | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| Clr Plan-Apochromat 20x/1.0,CorrVIS-IR M27 85mm | Zeiss | N/A | Used for second harmonic generation imaging |
| Cone socket handle, single ended, hand-form | G.Hartzell and son | 126-CSH3 | Handle of the inspection mirror |
| EC Plan-Neofluar 5x/0.16 | Zeiss | 440321-9902 | Used for light-sheet imaging |
| Elipar DeepCure-S LED curing light | 3M ESPE | 76985 | |
| Eppendorf safe-lock tubes, 1.5mL | Eppendorf | 22363204 | |
| Ethyl cinnamate, >= 98% | Sigma-aldrich | W243000-1KG-K | |
| Hypodermic Needle, 27G x 1/2'' | BD | 305109 | |
| Ketathesia 100mg/ml | Henry Schein Animal Health | NDC:11695-0702-1 | |
| KIMWIPES delicate task wipers | Kimberly-Clark | 21905-026 (VWR Catalog number) | Purchased from VWR |
| LightSheet Z.1 dual illumination microscope system | Zeiss | LightSheet Z.1/LightSheet 7 | Used for lightsheet imaging |
| LSM 880 NLO multi-photon microscope | Zeiss | LSM 880 NLO | Used for two-photon imaging |
| MEGAmicro, plane, 5mm dia, SS-Thread | Hahnenkratt | 6220 | Front surface inspectrio mirror |
| MicroCT machine, MicroXCT-200 | Xradia | MICRO XCT-200 | |
| Mini-Colibri | Fine Science Tools | 17000-01 | |
| PermaFlo Flowable Composite | Ultradent | 948 | |
| Procedure platform | N/A | N/A | Custom-made from lab materials |
| Routine stereo micscope M80 | Leica Micosystems | M80 | |
| Sentalloy NiTi open coil spring | TOMY Inc. | A 0.15mm diameter closed NiTi coil with an inner coil diameter of 0.9mm delivers a force of 10g. Similar products can be purchased from Dentsply Sirona. | |
| T-304 stainless steel ligature wire, 0.009'' diameter | Orthodontics | SBLW109 | 0.009''(.23mm) diameter, Soft temper |
| X-Ject E (Xylazine) 100mg/ml | Henry Schein Animal Health | NDC:11695-7085-1 | |
| Z100 Restorative, A2 shade | 3M ESPE | 5904A2 |
References
- Li, Y., et al. Orthodontic tooth movement: The biology and clinical implications. The Kaohsiung Journal of Medical Sciences. 34 (4), 207-214 (2018).
- Meikle, M. C. The tissue, cellular, and molecular regulation of orthodontic tooth movement: 100 years after Carl Sandstedt. European Journal of Orthodontics. 28, 221-240 (2006).
- Krishnan, V., Davidovitch, Z., molecular, Cellular, molecular, and tissue-level reactions to orthodontic force. American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 129 (4), 1-32 (2006).
- Shoji-Matsunaga, A., et al. Osteocyte regulation of orthodontic force-mediated tooth movement via RANKL expression. Scientific Reports. 7 (1), 8753 (2017).
- Oppenheim, A. Tissue changes, particularly of the bone, incident to tooth movement. European Journal of Orthodontics. 29, 2-15 (2007).
- Unnam, D., et al. Accelerated Orthodontics-An overview. Journal of Archives of Oral Biologyogy and Craniofacial Research. 3 (1), 4 (2018).
- von Bohl, M., Kuijpers-Jagtman, A. M. Hyalinization during orthodontic tooth movement : a systematic review on tissue reactions. European Journal of Orthodontics. 31 (1), 30-36 (2009).
- Kirschneck, C., et al. Comparative assessment of mouse models for experimental orthodontic tooth movement. Scientific Reports. 10 (1), 1-12 (2020).
- Naveh, G. R. S., Weiner, S. Initial orthodontic tooth movement of a multirooted tooth: a 3D study of a rat molar. Orthodontics & Craniofacial Research. 18 (3), 134-142 (2015).
- Nakamura, Y., et al. Time-lapse observation of rat periodontal ligament during function and tooth movement, using microcomputed tomography. European Journal of Orthodontics. 30 (3), 320-326 (2008).
- Kawarizadeh, A., Bourauel, C., Jager, A. Experimental and numerical determination of initial tooth mobility and material properties of the periodontal ligament in rat molar specimens. European Journal of Orthodontics. 25 (6), 569-578 (2003).
- Jónsdóttir, S. H., Giesen, E. B. W., Maltha, J. C. Biomechanical behavior of the periodontal ligament of the beagle dog during the first 5 hours of orthodontic force application. European Journal of Orthodontics. 28, 547 (2006).
- Lindhe, J., et al. Experimental breakdown of peri-implant and periodontal tissues. A study in the beagle dog. Clinical Oral Implants Research. 3 (1), 9-16 (1992).
- Salamati, A., et al. Functional tooth mobility in young pigs. Journal of Biomechanics. 104, 109716 (2020).
- Maria, R., et al. An unusual disordered alveolar bone material in the upper furcation region of minipig mandibles: A 3D hierarchical structural study. Journal of Structural Biology. 206 (1), 128-137 (2019).
- Wang, S., et al. The miniature pig: a useful large animal model for dental and orofacial research. Oral Diseases. 10, 1-7 (2007).
- Melsen, B. Tissue reaction to orthodontic tooth movement–a new paradigm. European Journal of Orthodontics. 23 (6), 671-681 (2001).
- Naveh, G. R. S., et al. Direct MicroCT imaging of non-mineralized connective tissues at high resolution. Connective Tissue Research. 55 (1), 52-60 (2014).
- Naveh, G. R. S., et al. Nonuniformity in ligaments is a structural strategy for optimizing functionality. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 9008 (2018).
- Naveh, G. R. S., et al. Tooth periodontal ligament: Direct 3D microCT visualization of the collagen network and how the network changes when the tooth is loaded. Journal of Structural Biology. 181 (2), 108-115 (2013).
- Naveh, G. R. S., et al. Tooth movements are guided by specific contact areas between the tooth root and the jaw bone : A dynamic 3D microCT study of the rat molar. Journal of Structural Biology. 17 (2), 477-483 (2012).
- Naveh, G. R. S., et al. Tooth-PDL-bone complex: Response to compressive loads encountered during mastication -A review. Archives of Oral Biology. 57 (12), 1575-1584 (2012).
- Ben-Zvi, Y., et al. Response of the tooth-periodontal ligament-bone complex to load: A microCT study of the minipig molar. Journal of Structural Biology. 205 (2), 155-162 (2019).
- Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452 (2017).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Taddei, S. R. d. A., et al. Experimental model of tooth movement in mice: A standardized protocol for studying bone remodeling under compression and tensile strains. Journal of Biomechanics. 45 (16), 2729-2735 (2012).
- Nakamura, K., Sahara, N., Deguchi, T. Temporal changes in the distribution and number of macrophage-lineage cells in the periodontal membrane of the rat molar in response to experimental tooth movement. Archives of Oral Biology. 46 (7), 593-607 (2001).
- Rygh, P., et al. Activation of the vascular system: A main mediator of periodontal fiber remodeling in orthodontic tooth movement. American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 89 (6), 453-468 (1986).
- Nagao, M., et al. Vascular endothelial growth factor in cartilage development and osteoarthritis. Scientific Reports. 7 (1), 13027 (2017).
- Licht, A. H., et al. Endothelium-specific Cre recombinase activity in flk-1-Cre transgenic mice. Developmental Dynamics. 229 (2), 312-318 (2004).
- Connizzo, B. K., Naveh, G. R. S. In situ AFM-based nanoscale rheology reveals regional non-uniformity in viscoporoelastic mechanical behavior of the murine periodontal ligament. Journal of Biomechanics. 111, 109996 (2020).
- Connizzo, B. K., et al. Nonuniformity in Periodontal Ligament: Mechanics and Matrix Composition. Journal of Dental Research. 2, 179-186 (2020).
