Summary
우리는 마우스에서 치열 교정 치아 운동을 생성하기위한 프로토콜과 교단없이 치주 인대의 콜라겐 섬유및 혈관의 3D 시각화방법을 제시한다.
Abstract
치열 교정 치아 운동은 외부 힘의 결과로 연하고 단단한 조직 리모델링을 변경한 복잡한 생물학적 과정입니다. 이러한 복잡한 리모델링 과정을 이해하기 위해서는 3D 컨텍스트 내에서 치아 및 치주 조직을 연구하여 단면 및 조직 동맥을 최소화하는 것이 중요합니다. 마우스 모델은 종종 개발 및 구조 생물학뿐만 아니라 작은 크기, 높은 신진 대사 속도, 유전학 및 취급의 용이성으로 인해 생체 역학에서 활용됩니다. 원칙적으로 이것은 또한 치과 관련 연구를위한 훌륭한 모델을 만듭니다. 그러나, 주요 장애물은 그들의 작은 치아 크기, 특히 어금니입니다. 이 논문은 마우스 하악 형 어어의 치주인 섬유 구성 요소의 3D 이미징을위한 치열 교정 치아 운동을 생성하기위한 단계 프로토콜및 두 가지 방법을 제공하는 것을 목표로합니다. 제시된 첫번째 방법은 신선한 콜라겐 조직의 위상 향상 화상 진찰을 가능하게 하는 마이크로 CT 설치를 기반으로 합니다. 두 번째 방법은 절개없이 뼈를 통해 이미징을 가능하게하고 내인성 형광을 보존하는 에틸 신나메이트를 사용하는 뼈 청산 방법입니다. Flk1같은 기자 마우스와이 클리어링 방법을 결합 -Cre; TdTomato는 PDL과 폐포 뼈에서 3D 혈관을 이미지화 할 수있는 최초의 기회를 제공했습니다.
Introduction
치열 교정 치아 운동 (OTM)의 기본 기본 생물학적 과정은 뼈 리모델링입니다. 이러한 리모델링 과정의 트리거는 세포외 매트릭스(ECM) 스트레스, 괴사 뿐만 아니라 혈관 파괴 및 형성1,2,3과같은 치주 인대(PDL)의 구조의 변화에 기인한다. 폐포 뼈 리모델링을 위한 다른 가능한 트리거는 골의 골세포에 의한 강제 감지뿐만 아니라 폐포 뼈 자체의 기계적 변형과 관련이 있습니다. 그러나 OTM에서의 역할은 여전히 완전히4,5를해명하지 는 않습니다.
OTM 동안 PDL의 구조 기능 관계를 밝히기 위한 많은 연구에도 불구하고 명확한 기능 적 메커니즘은 아직6,7로정의되지 않았습니다. 이에 대 한 주요 이유는 연조직 (PDL)의 데이터를 검색에 도전 이다 (시멘트와 폐포 뼈). 구조 정보를 수집하는 허용된 메서드는 일반적으로 PDL 구조를 방해하고 수정하는 고정 및 절위를 필요로 합니다. 또한 이러한 메서드의 대부분은 왜곡되지 않더라도 부분 및 지역화된 정보만 제공하는 2D 데이터를 생성합니다. PDL의 구조와 기능이 균일하지 않기 때문에 전체 치아 PDL-뼈 복합체의 그대로 3D 구조를 해결하는 접근 방식이 보증됩니다.
본 백서는 마우스에서 OTM을 생성하는 방법과 시료의 단면 없이 PDL에서 콜라겐 섬유의 3D 시각화를 가능하게 하는 두 가지 방법을 설명한다.
Murine 모델은 의학, 발달 생물학, 약물 전달 및 구조 연구에서 생체 내 실험에 널리 사용됩니다. 그(것)들은 특정 단백질 및 기능을 제거하거나 강화하기 위하여 유전으로 변형될 수 있습니다; 빠르고 반복 가능하며 예측 가능한 개발 제어를 제공합니다. 그들은 또한 때문에 작은 크기8이미지에 쉽게 8. 그들의 많은 장점에도 불구 하 고, 치과 연구에서 마우스 모델은 자주 사용 되지 않습니다., 임상 조작 보증 하는 경우에 특히, 주로 작은 크기의 치아 때문에. 쥐9,10,11,개12개,13개,돼지14개,15,16, 원숭이(17)와 같은 동물모델은 쥐보다 더 자주 사용된다. 최근 고해상도 이미징 기술이 개발되면서 OTM의 복잡한 프로세스를 해독하기 위해 마우스 모델을 활용하는 장점은 매우 많습니다. 이 논문은 뼈 리모델링을 유발하는 일정한 힘 수준으로 하악에서 어금니치아의 매혹적인 움직임을 생성하는 방법을 제시한다. 설치류에 있는 OTM 실험의 대부분은 하악의 이동성및 혀의 존재가 또 다른 복잡성 수준을 추가하기 때문에, 맥심증에서 행해지됩니다. 그러나 하악은 3D 구조적 무결성이 원할 때 많은 장점이 있습니다. 그것은 쉽게 전체 뼈로 해부 될 수있다; 일부 종에서는 섬유성 심기심을 통해 두 개의 헤미 하악으로 분리 될 수 있습니다. 컴팩트하고 평평하며 부비동 공간이 없는 치아만 들어 있습니다. 대조적으로, 맥슬아는 두개골의 일부이며 다른 장기 및 구조와 밀접하게 관련되어 있으므로 폐포 뼈를 관련 치아와 해부하기 위해 광범위한 단면이 필요합니다.
위상 향상을 가능하게 하는 고해상도 마이크로 CT 내부의 로딩 시스템에 결합된 집 습도 챔버를 사용하여, 앞서 설명한 바와 같이 3D로 신선한 섬유 조직을 시각화하는 방법을 개발하였다9,18,19,20,21,22, 23. 신선한 조직은 동물이 염색이나 고정없이 희생 된 직후 스캔되어 조직 유물과 생체 역학 적 특성의 변경을 줄입니다. 이러한 3D 데이터는 다른 곳에서 설명된 바와 같이 섬유의 분포 및 방향 분석에 활용될 수 있다19.
여기에 제시된 두 번째 3D 전체 조직 이미징 방법은 단면 없이 뼈를 통해 PDL 섬유의 이미징을 가능하게 하는 하악의 광학 클리어링을 기반으로 한다. 흥미롭게도 뼈 자체의 콜라겐 섬유의 시각화를 가능하게하지만, 이것은 여기에서 논의되지 않습니다. 일반적으로 조직 정리를 위한 두 가지 방법이 있습니다. 첫 번째는 간단한 침지, 과수화 또는 하이드로겔 포함을 통해 1.4보다 큰 굴절률을 가진 수성 용액에 샘플을 침지하는 수성 기반 클리어링입니다. 그러나, 이 방법은 조직의 구조적 보존뿐만 아니라 투명성의 수준에서 제한되므로 조직의 고정이 필요하다. 고투명 샘플을 산출하고 고정이 필요하지 않은 두 번째 방법은 용매 기반 클리어링방법(24,25)이다. 우리는 하악 시료에 대한 에틸-3-페닐프로프-2-에노이트(ethyl cinnamate, ECi)를 기반으로 수정된 용매 계 청산 방법을 생성하였다. 이 방법은 비독성 식품 등급 클리어링 에이전트, 최소한의 조직 수축 및 형광 단백질보존을 사용하는 장점이 있습니다.
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Protocol
모든 동물 실험은 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH의 지침과 하버드 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (프로토콜 번호 01840)의 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 치열 교정 치아 운동
- 마우스 침대를 생성하려면 쐐기 모양의 45° 각진 헤드레스트가 있는 플랫 플라스틱 플랫폼을 사용하십시오. 헤드레스트는 플라스틱 상자를 절단하여 생성할 수 있습니다.
- 플랫폼의 헤드 엔드를 상승하여 헤드레스트와 테이블 평면 사이에 약 30° 각도를 생성합니다. 구부러진 두꺼운 종이 클립(직경 0.036")을 머리 쪽 끝에 부착하여 상부 절개를 잡습니다.
- 꼬리 끝에서, 치열 교정 전원 체인을 부착하여 하부 절개를 보유할 수 있는 높은 표면을 생성합니다. 예제 플랫폼의 그림 1을 참조하십시오.
- 10 mg/kg에서 자일라진의 내관 주사와 케타민 100mg/kg을 사용하여 마우스를 마취1 mL 주사기와 27 게이지 바늘.
- 마세테화된 마우스를 맞춤형 플랫폼에 놓고 클립 루프의 상부 절개를 연결하여 위턱을 고정합니다. 아래 절개에 매여 있는 치열 교정 파워 체인으로 마우스 아래턱을 엽니다. 미니 대장균 입 리트랙터로 뺨을 후퇴 유지합니다.
- 5-6배 배율에 도달할 수 있는 수술 현미경 또는 기타 입체 스코프 아래에 플랫폼을 배치합니다.
- 각막 탈수를 방지하기 위해 마우스 눈에 식염수 50 μL (약 1 방울)을 적용합니다. 20분마다 식염수보충.
- 알루미늄 와이어(직경 0.08mm) 길이 1cm를 자른다. 미세 수술 바늘 홀더를 사용하여 제 1 과 제 2 어금니 사이의 접촉 점을 울부 짖는 중형 영역에서 목이 쪽에서 와이어를 슬링으로 밀어. 스프링 엔드에 나사로 연결하기 위해 첫 번째 어어 앞에 2mm 프리 엣지를 둡니다.
- 니켈 티타늄 (NiTi) 코일 조각을 잘라, 길이 약 7 ~ 9 스레드.
참고: 코일의 탄성 특성은 치열 교정 운동에 일정한 힘을 제공합니다. 코일의 총 훈련되지 않은 길이는 절개와 어금니 사이의 간격보다 짧아야 합니다. 치아에 코일을 고정하려면 양쪽 끝에 2 개의 스레드가 추가로 필요합니다. 알루미늄 와이어는 마이크로 CT 스캔 중에 빔 경화와 같은 스캐닝 아티팩트를 줄이기 위해 선택된다. - NiTi 코일 스프링(와이어 직경 0.15mm, 내부 코일 직경 0.9mm; 10g의 힘을 전달함)을 하부 제1 어어와 하부 절개 사이에 삽입합니다. 1.6단계에서 첫 번째 어금니 주위에 삽입된 와이어 합자를 사용하여 코일 스프링의 2실 주위로 와이어를 단단히 비틀어 어금니 측의 코일을 고정시합니다.
- 균일한 힘 레벨을 보장하려면 첫 번째 어금니와 절개 사이에 정확히 3개의 활성 스레드를 사용합니다. 절개에서 전원 체인을 일시적으로 제거하고 코일을 고정하기 위해 절개 위에 2 ~3개의 비훈련되지 않은 스레드를 반복합니다. 나사수 무료 치지발 여백으로 스레드를 밀어 내다.
- 코일의 절개 테두리에 흐르는 복합 수지층을 놓고 치과 경화 빛으로 치료하십시오. 수지를 경화한 후 전원 체인을 교체합니다.
- 동일한 경화 광을 사용하여 NiTi 코일을 20s에 가열합니다. 이것은 NiTi 코일을 조여줄 것입니다. 완성된 배치는 그림 1C를 표시합니다.
- 콘트라탈측을 그대로 두거나 제1및 제2 어금니 사이에 와이어와 같은 샴을 삽입한다.
- 마취된 마우스를 가열된 빛 아래에 놓고 회복될 때까지 마우스를 따뜻하게 유지합니다.
- 마우스를 개별 케이지에 다시 넣고 매일 모니터링합니다. 치열 교정 운동 중에 는 식단 변경이 필요하지 않습니다.
참고: 한쪽에 있는 OTM 장치는 약간의 불편함을 유발하지만 수유를 손상시키지 않습니다. 그러나, 양쪽에 장치를 삽입하는 것은 불편의 추가 양으로 인해 권장되지 않습니다. 통증의 외부 징후를 보이지 않는 한 진통제는 필요하지 않습니다.
2. 신선한 헤미 하악에 PDL 섬유의 마이크로 CT 스캔
- 헤미 하악을 장착(그림 2)
- 치열 교정 운동의 원하는 기간 후, 자궁 경부 탈구를 통해 마우스를 희생. 하악을 제거하고 헤미 하악으로 분리합니다.
참고: 시료가 고정되지 않으므로 턱의 해부를 가능한 한 빨리 수행하는 것이 중요하며 30 분 이내에 이상적입니다. - 깨끗한 보풀이 없는 닦아 주변의 연조직을 부드럽게 제거합니다.
- 최소 4배 배율의 스테레오 현미경으로 미세 수술 가위와 핀셋을 사용하여 교정 장치를 제거하십시오.
- 1.5mL 부피, 마이크로 원심분리기 튜브에 물으로 촉촉해진 보풀이 없는 닦아냅니다.
- 포장 가능한 치과 복합 수지를 무대의 샘플 슬롯에 넣은 다음 신선한 헤미 하악을 복합재료에 넣습니다. 장착하기 전에 치과 복합체와 접촉하는 뼈 표면이 연조직과 건조하지 않고 제대로 치료되지 않도록 하십시오.
- 첫 번째 어금니가 무대의 중간 홈을 중심으로 될 때까지 헤미 하악의 위치를 조정합니다. 폐색 표면이 수평인지 확인합니다. 포지셔닝에 만족하면 복합체를 치료합니다.
참고: 추가 소량의 치과 복합재는 헤미 하악의 측면에 배치될 수 있으며/또는 시료 안정화를 돕기 위해 절개 전체에 배치할 수 있습니다. - 샘플 스테이지의 습도 풀 내부에 감쇠된 보풀이 없는 물기를 놓습니다. 첫 번째 어금니의 오클루물 표면에 치과 용 복합체를 놓습니다. 챔버를 닫기 전에 시편 수준에서 엑스레이 경로를 차단하지 않도록 하십시오.
- 마이크로 CT에 챔버를 부착합니다. 챔버를 마이크로 CT 샘플 단계로 나사로 나사로 전환하여 이미징 중 의 움직임을 최소화합니다.
- 모루 끝이 복합체로 둘러싸여 있지만 힘이 증가하지 않을 때까지 모루를 수직으로 낮추면서 엑스레이를 켜고 2D 이미지를 가져 가라.
- 모루가 복합체에 내장되면 x선 소스를 닫습니다. 그런 다음 마이크로 CT 챔버를 열고 투명 플렉시 유리 창을 통해 복합체를 치료합니다.
- 치열 교정 운동의 원하는 기간 후, 자궁 경부 탈구를 통해 마우스를 희생. 하악을 제거하고 헤미 하악으로 분리합니다.
- 마이크로 CT 설정
- 소스 전압을 40kV로 설정하고 전류를 200 μA로 설정합니다. 10배율 검출기를 사용하여 뷰 프레임 내에 샘플을 배치합니다. 캡처된 이미지에 대해 2의 비닝을 사용합니다.
참고: PDL은 뼈와 치아보다 밀도가 훨씬 낮기 때문에 PDL을 시각화하려면 더 높은 전력과 노출 시간이 필요합니다. 이 프로토콜은 PDL을 시각화하기 위한 설정을 제공합니다. - 단일 이미지 노출 시간을 25s로 설정합니다. 샘플 스테이지의 회전을 183도 이상의 범위로 설정합니다. 2,500프로젝션에 대한 스캔을 설정합니다. 엑스레이 소스 필터를 사용하지 마십시오, 결과 스캔은 각 측면에 0.76 μm의 복셀 크기를 가지고있다.
- 마이크로 CT 지침에 따라 적절한 재건을 위한 참조 스캔을 수집합니다. 총 투영으로 참조 이미지 의 1/3 수를 사용합니다. 백 프로젝션 필터링 알고리즘을 사용하여 추가 비닝 없이 볼륨을 재구성합니다.
- 소스 전압을 40kV로 설정하고 전류를 200 μA로 설정합니다. 10배율 검출기를 사용하여 뷰 프레임 내에 샘플을 배치합니다. 캡처된 이미지에 대해 2의 비닝을 사용합니다.
3. 클리어링 방법(그림 3)
- 5 개의 1.5 mL 마이크로 원심 분리튜브를 준비하십시오.
- 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브에서 다음 솔루션 1.4mL을 준비: 인산염 완충식식염수(PBS)의 파라포름데히드(PFA) 4%, 디온화(DI) 물 50% 에탄올(EtOH), DI 수의 70% EtOH, 100% EtOH 2튜브를 준비한다.
참고: PFA는 샘플 고정에 사용됩니다. ECi 클리어링은 고정되지 않은 샘플에서도 작동합니다. 고정되지 않은 샘플을 지우려면 PFA 단계를 건너뜁니다. - 해부 된 헤미 하악을 4 % PFA에 놓습니다. 알루미늄 호일로 덮고 6 시간 동안 실온에서 부드러운 설정에 로커에 배치합니다.
- 헤미 하악을 50 % EtOH로 이동합니다. 16 시간 동안 빛에서 덮여 로커에 배치합니다.
- 헤미 하악을 70 % EtOH로 이동합니다. 16 시간 동안 빛에서 덮여 로커에 배치합니다.
- 헤미 하악을 100 % EtOH로 이동합니다. 16 시간 동안 빛에서 덮여 로커에 배치합니다.
- 3.6을 반복합니다. 두 번째 100 % EtOH 튜브에서.
- 유리 또는 폴리 프로필렌 튜브에 ECi의 5 mL을 준비합니다.
참고: ECi는 폴리스티렌을 녹여주지만 폴리프로필렌은 녹지 않습니다. 또한, 형광 단백질을 가진 조직을 사용하지 않을 경우 시료는 청산 절차 중에 빛에 노출될 수 있다. - 헤미 하악을 ECi 튜브로 이동합니다. 알루미늄 호일로 튜브를 덮고 최소 12시간 동안 부드러운 설정으로 로커에 놓습니다.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 탈수된 시료는 실온에서 ECi에 보관할 수 있습니다. ECi의 동결 또는 융점은 6.5 ~ 8.0 °C이다. 4 °C에 보관하지 마십시오. - 헤미 하악은 형광 현미경으로 이미징할 준비가 되어 있습니다.
참고: 이미징 중에 광학적으로 투명하게 유지하려면 샘플을 ECi에 침지해야 합니다.
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Representative Results
이 논문은 어떤 단면없이 PDL 내부의 콜라겐 섬유의 3D 이미징을위한 두 가지 방법뿐만 아니라 OTM을 생산하는 방법을 제시한다. 동물 연구 목적으로 치아의 정렬이 필요하지 않을 때, 모든 루트 수준에서 폐포 뼈의 리모델링을 생성하는 경우 치아 운동은 치열 교정으로 간주됩니다. 신뢰할 수 있는 OTM을 생성하기 위해서는 치아에 적용된 일정한 힘 레벨이 필요합니다. 여기서, 활성화된 형상 기억 NiTi 코일은 7일 이상의 실험 시간 동안 10g의 일관된 힘을 생성하는 데 사용됩니다. 여기에 설명된 코일활성화(도 1)는마르텐시트 상 내의 NiTi 코일에 균주를 생성하고 코일을 히스테리시스 상태로 가져와 치아에 일정한 응력을 전달한다. 코일 삽입 후 경화광으로 코일을 따뜻하게 하면 합금이 오스테니티 형태로 이동하고 모양 메모리 효과가 수행되도록 합니다.
여기에서 우리는 9 주 된, 남성 마우스에서 대표 적인 결과 보여줍니다. OTM7일 후 제1 및 제2 어금니의 크라운 사이의 평균 메시오디탈 공간은 마이크로 CT내 어금니 표면 간에 측정된 40 μm이며, 1X 배율(n=12, st.dev. = 15 μm)(그림 1E). 메시오디스탈 방향에서 PDL의 평균 공간은 OTM(도4B)의7일 전후80μm이다. 이는 첫 번째 어어가 매터리 로 번역되고 7일 간 마우스 모델에서 OTM을 생성하는 데 적절한 시간임을 확인하며, 자연에서 뼈 흡수 및 apposition의 공정을 생성하는과정(도 4). 마우스는 표준 하드 팔레트 다이어트를 공급했다. 포스트 디바이스 삽입은 다이어트 변경이 이루어지지 않았습니다.
OTM 동안 치아-PDL-bone 복합체의 변화를 시각화하기 위해 제시된 첫 번째 방법은 이전에9,18,19,20,22,23에상세히 설명된 신선한 조직의 위상 강화 된 마이크로 CT 이미징(도 4)을기반으로합니다. 요컨대, 마이크로 CT 또는 싱크로트론의 위상 향상 기능을 제공, 섬유 조직 및 가습 환경의 기계적 안정화, 신선한 콜라주 섬유는 고정 또는 대조제없이 시각화 될 수있다. PDL에서 보이는 섬유는 치아와 뼈 모두에 연결되는 섬유이며, 주로 I 형 I 콜라겐19. 3D에서 그대로 PDL을 시각화할 수 있는 이 독특한 기회는 이전에 설명된바와같이 3D 섬유 밀도, 섬유 방향 및 치아의 3D 움직임을 분석할 수 있게한다. 구체적으로, 여기서 우리는 PDL에서 섬유성 네트워크의 시각화를 제시한다. 0시에, 뼈와 PDL 모두에서 생리적 리모델링을 관찰할 수 있다. 리모델링은 또한 세포 시멘트에서 발생; 그러나 이는 제시된 방법과 직접적인 관련이 없으므로 정교하지 않습니다. 뼈-PDL 인터페이스는 임의의 힘 적용 전에 횡방향(도4A)및 처탈(도4B)평면 모두에서 대부분 매끄럽다. 관상 평면(도4C)에서뼈-PDL 인터페이스는 특히 재모델링 균형을 나타낼 수 있는 정맥 영역쪽으로 거칠어지게 되는 경향이 있다. 첫 번째 어금니가 매혈적으로 이동하는 OTM(도4D-F)의3일에서 PDL의 섬유 밀도가 감소(흰색 화살표 헤드). 뼈-PDL 인터페이스는 PDL26에서주로 압축력과 관련된 골성형 활성 및 뼈 흡수 공정을 나타내는 뼈 표면의 분화구 의 발달로 인해 0일보다 거칠다. PDL 내의 장력 영역에서의 조직 파괴는27,28을 제안하였으며 이 방법을 사용하여 명확하게 볼 수 있다. 거친 테두리는 뿌리 (흰색 화살표)의 다른 수준에서 볼 수 있으므로 치아 운동이 크라운의 팁뿐만 아니라 자연에서 번역된다는 것을 시사합니다. 7일 OTM(도4G-I)에서뼈 내의 분화구, 거친 테두리 및 PDL 공간의 팽창과 같은 뼈 흡수 징후는 모든 평면에서 볼 수 있지만 평균 PDL 공간은 OTM(도4D-F)보다3일 보다 좁습니다. 그러나 일부 지역에서는 OTM이 7일 간 이 지역이 뿌리의 단산 표면에 위치한 후 뼈-PDL 테두리가 부드러워졌으며, 이는 OTM에서 예상되는 바와 같이 뼈 정점에 대한 표시일 가능성이 높습니다.
긴 마이크로 CT 이미징 시간(~19h)과 스테이지회전으로 인해 시료를 계속 유지하는 것이 필수적입니다. 불안정한 샘플은 흐릿한 스캔을 초래합니다. 그림 5에서는 스캔 중에 샘플이 이동했을 때 마이크로 CT 스캔이 어떻게 보이는지 설명합니다. 치아와 뼈가 흐릿합니다. PDL 섬유나 골세포는 관찰되지 않습니다. 이러한 사건에서는 물체의 여백 주위에 실루엣이 존재합니다. 도 5에서,치아 크라운의 여러 윤곽선을 관찰할 수 있다(화살표).
연구 목표에 따라, PDL 섬유의 해상도 와 시각화는 하드 조직에 대한 정보만 원하는 경우 짧은 스캔 시간을 위해 거래에서 희생될 수 있다.
단면없이 PDL 섬유의 3D 시각화를 위한 보완적인 방법은 ECi(도3)를사용하여 광학적으로 지워진 시료에 대한 광학 현미경 검사를 통해이다. 이 방법은 고정없이 시편에 사용할 수 있으며 청산 하기 전에 조직에 존재하는 형광 신호를 보존합니다. ECi 클리어링 전후의 헤미 하악은 도 3B 및 3C에표시됩니다. 그리드 용지가 하악의 라무스를 통해 볼 수 있을 때 PDL의 적절한 샘플 클리어링은 확인할 수 있다. 클리어링의 양은 탈수 과정의 연장에 의해 조절될 수 있습니다. 도 6은 폐포 뼈와 PDL 모두에서 콜라겐 섬유로부터의 제2 고조파 생성(SHG) 신호를 클리어된 하악골에서 나타낸다. 3D에서 뼈의 콜라겐 섬유를 이미징하는 것은 복잡한 과정으로, 종종 FIB/SEM과 같은 전자 현미경 검사법을 활용합니다. 그러나, ECi 기반 의 클리어링 방법 및 SHG를 활용하여, 폐포 뼈 섬유는 특히 수평 방향에서 명확하게 보입니다. 뼈 표면에서 PDL 깊숙이 샘플을 통해 변환할 때 섬유가 갑자기 방향을 수직으로 변경함에 따라 PDL 섬유 수준으로의 전환이 매우 명확합니다.
광시트 현미경 검사는 또한 뼈를 통해 형광성 단백질을 화상 진찰하기 위해 이용될 수 있습니다. 이 경우 형질전환 Flk1-cre로부터의 샘플을 지워; Tdtomato마우스(19,29,30)혈관을 안감하는 형광 내피 세포가 명확하게 관찰된다(도7A,B, C, E). 적절한 클리어링은 라이트시트 현미경으로 이해할 수 있는 이미지를 생성하는 데 핵심적인 역할을 합니다. 뼈가 완전히 지워지지 않았을 때 PDL 내의 혈관은 관찰되지않았다(도 7D,F).
그림 1: 치열 교정기기 삽입 설정. A. 동물을 지원하고 입을 열어 유지하기 위해 실험실 공급으로 만든 마우스 침대. 바디를 위한 플라스틱 플랫폼(PP)은 30° 경사에 있고 헤드레스트(HR)는 PP 표면으로부터 45° 각도에 있습니다. 2계층 튜브 스탠드(TS)는 PP의 최종 헤드를 높이는 데 사용됩니다. 용지 클립 루프(검정 화살표)는 상단 절개, 아래 쪽 치열 교정 전원 체인(흰색 화살표) 후크를 아래 절개부에 고정합니다. 직경 5mm 검사 거울은 어금니의 육안으로 사용되었습니다. B. 마우스 침대의 측면 보기. 서피스 사이의 각도가 표시됩니다(녹색 및 마젠타). C. 제대로 배치 된 장치의 대표 이미지. D. 장치 이식 전에 검사 거울을 통해 본 어금니. E. 치열 교정 운동 후 어금니의 대표적인 이미지. 대시 선은 첫 번째 및 두 번째 어금니의 윤곽을 추적합니다. F. 장치 및 해당 배치의 다이어그램입니다. 빨간색 선은 첫 번째 어금니 주위의 와이어 합자를 나타냅니다. 주황색 선은 코일을 고정하는 데 사용되는 흐르는 복합 수지를 나타냅니다. NiTi 코일은 파란색으로 표시되고 레이블이 지정됩니다. G. 7 일 치열 교정 운동 후 부착 된 장치로 헤미 하악을 해부. 3 코일 스레드가 여전히 열려 있는 방법을 참고하여 7일 후에도 코일이 계속 활성화되어 있음을 나타냅니다. 크기 막대 = E 및 G에서 1mm를 클릭하십시오.
도 2: 마이크로 CT 이미징을 위한 맞춤형 챔버에 장착된 헤미 하악. 엑스레이 소스는 왼쪽과 오른쪽에 있는 검출기를 볼 수 있습니다. 빨간색 사각형은 샘플 스테이지(SS)의 챔버에 장착된 헤미 하악을 간략하게 설명합니다. 여기에 표시된 예제 챔버는 챔버 꼭대기에 모터(M), 모루(A, 흰색 파선으로 윤곽) 및 모루 샤프트(AS)를 포함한 기계적 테스트 설정의 일부입니다. 전체 설정이 CT 단계에 나사로 놓입니다. 인셋 이미지는 내부 샘플이 있는 습도 챔버를 포함하는 빨간색 윤곽 영역의 클로즈업을 보여줍니다. B. 샘플 스테이지에 장착된 샘플의 상단 보기입니다. 습도 풀(회색 화살표)은 이미징 중에 습도를 유지하기 위해 둘레에 내장되어 있습니다. 중간의 원형 스테이지에서 헤미 하악을 경사 깊은 홈(검정 화살표)에 장착할 수 있습니다. 얇은 홈(흰색 화살표)은 시료의 방향을 지정하는 데 도움이 되는 스테이지의 중간선을 표시합니다. C. 샘플 홈과 원형 단계의 다이어그램. 홈의 경사는 하악을 지원하고 어금니가 뿌리의 수직 축을 따라 장착 할 수 있습니다. D. 대표적인 마이크로 CT 2D 슬라이스와 헤미 하악시 3D 볼륨 이미지결합. 여기서 상호 격차는 52 μm입니다. 샘플은 아래 샘플 단계에 장착 (도시되지 않음) 및 치과 복합 (DC)에 의해 상단에 모루 (A). 스케일 바 = 500 μm. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.
그림 3. 해부 된 마우스 헤미 하악을위한 ECi 기반 클리어링 방법. A. 해부 된 헤미 하악은 PFA 4 %, EtOH 50 %, 70 % EtOH 및 100 % EtOH에 연속적으로 몰입됩니다. 탈수 후, 헤미 하악은 이미징까지 최소 12 시간 동안 ECi에 저장됩니다. B. 해부 직후 헤미 하악. C. 헤미 하악클리어 완료 후. 스케일 바 = 5mm이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 치열 교정운동의 다른 단계에서 신선한 샘플의 PDL의 대표 현미경 CT 스캔. A-C, 치열 교정 운동 없음. A. 폐포 뼈, B-Buccal, L-Lingual 측면 내의 메약(M) 및 탈구(D) 뿌리를 보여주는 헤미 하악의 횡측 평면내마이크로CT 2D 이미지. 치아 뿌리와 폐포 뼈 사이에 PDL 공간과 그 안에 있는 섬유가 명확하게 관찰됩니다. B. 적중 평면에서 2D 이미지. 관상 평면의 C. 2D 이미지. D-E, 2D 이미지 OTM 3 일 후, 화살 헤드는 콜라겐 섬유 밀도의 감소와 PDL의 영역에서 점, 뼈 흡수 영역에서 흰색 화살표 포인트. G-I, OTM 7일 후 2D 이미지, 검은 화살은 뼈 정점 의 영역에서 가리킵니다. 스케일 바 = 150 μm. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.
도 5: 검사 중 치아의 움직임으로 인한 치아와 뼈의 흐릿한 구조를 보여주는 적기 평면에서 2D 마이크로 CT 이미지. 화살표는 치아의 여러 보드 라인을 가리키며 움직임을 나타냅니다. 배율 막대 150 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: ECi는 제2 고조파 생성 (SHG)으로 이미지 된 첫 번째 어어를 보여주는 하악을 지웠다. PDL의 콜라겐 섬유가 보이는 지역의 흰색 화살표 점은 PDL의 수직 섬유뿐만 아니라 폐포 뼈의 수평 섬유가 모두 보이는 영역에서 수직 방향, 검은 화살 점을 주목한다. T-치아, F-furcation, AB-폐포 뼈, MR-메소알 루트, DR-Distal 뿌리, 스케일 바 150 μm. 이미지는 1.33-1.56의 RI를 가진 용액을 위해 20X 다중 침지 렌즈를 사용하여 얻어졌습니다. 흥분 레이저는 10 %의 전력으로 860nm에서 설정되었습니다. 픽셀 거주 시간: 0.51μs; 스캔 모드: 프레임; 평균: 16; 검출기 유형 : 비descanned 광증 튜브 검출기; 검출기 게인 800V. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7. ECi 클리어 Flk1-Cre;tdTomato 마우스의 라이트시트 현미경 이미지. A. 최적으로 클리어된 제어 헤미 하악. 뼈 내혈관(화살표 헤드) 및 PDL 공간(화살표)이 보입니다. B. 첫 번째 어금니 (A에 설명 된 빨간색)의 메시오 링구아 영역의 발병은 혈관을 보여줍니다. C. 7일 OTM 헤미하악과 D. 아수 최적으로 지워진 헤미 하악. E. 적중 평면에서 패널 C의 2D 이미지, 이미지는 뼈 (회색 화살표) 및 PDL 공간 (흰색 화살표)에서 잘 정의 된 혈관을 보여줍니다. F. 패널 D의 2차원 슬라이스 이미지, E의 이미지와 동일한 영역, 흐릿한 이미지의 결과. 스케일 바 A, C, D = 500 μm, B, E, F = 100 μm 이미지는 카메라를 검출기로 사용하여 5X 계획 목표로 촬영했습니다. 흥분 레이저는 4 %의 전력에서 561 nm이었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
마우스에서 OTM을 생성하는 것은 크기, 유전학 및 취급 이점으로 인해 매우 원합니다. 하악을 사용하면 조직 해부와 샘플 준비 및 이미징 측면에서 쉽게 취급할 수 있습니다. 여기서 우리는 OTM의 7 일 이내에 뼈 내부의 치아의 번역 운동으로 OTM을 생성하는 방법을 제시했습니다. 이 프로토콜을 사용하여, 활성화 된 코일은 약 1mm의 움직임에 대한 일정한 힘 수준을 제공하기 때문에, 치아 운동의 전체 기간을 확장 할 수 있습니다. 그러나 코일의 매혹적인 면은 끊임없이 분출되는 절개에 고정됩니다. 결과적으로 힘 벡터는 점차 적으로 변경되어 압출 력을 생성하기 시작합니다. 이는 매 7일마다 매번 메스멘타말의 부착 수준을 조정하는 경우 피할 수 있다.
PDL은 OTM의 초기화기이므로 OTM의 다양한 단계에서 구조와 기능을 이해하는 것이 매우 중요합니다. 그러나 PDL은 구조와기능(19,22,31,32)에서모두 균일하지 않다. 그 결과, 의미 있는 데이터를 검색하기 위해서는 PDL을 3D로 연구해야 하며 조직 단면과 조작은 가능한 한 많이 피해야 합니다. 그러나, 두 개의 단단한 조직 사이 있는 연조직을 조사하는 것은 그 같은 요구 사항을 이행하기 어렵게 만듭니다. PDL을 연구하는 전통적인 방법은 종종 3D 구조를 손상시키고 결과적으로 PDL 구조 및 생체 역학적 특성을 변경하는 생리 적 환경에서 조직을 제거하는 것을 포함합니다. 구조 및 생체 역학 적 특성 모두 조직 3D 컨텍스트를 더욱 보존하는 것을 정당화하는 OTM 동안 동적 변화를 겪습니다. 이렇게 하기 위하여우리는 또한 형광 신호, 형태학 및 광물화 데이터를 공동 국소화하는 동일 견본에 사용될 수 있는 단면 없이 전체 조직 화상 진찰을 가능하게 하는 2개의 방법을 기술했습니다.
제공된 방법론적 설명은 독자가 자신의 연구 분야에 메서드를 적용하도록 지시합니다. 마이크로 CT 이미징은 PDL 섬유 네트워크의 3D 시각화를 허용합니다. 이미지를 분석하여 방향성 및 밀도 분석을 생성하고 OTM 동안 PDL의 변화를 정량적으로 조사할 수 있습니다. 또한 광시트 현미경 검사및 공초점 이미징과 같은 쉽게 사용할 수 있는 광학 현미경 방법으로 시각화를 가능하게 하는 클리어링 방법을 설명했습니다. Lightsheet 현미경 검사는 상대적으로 빠른 이미징 속도를 가진 대형 표본의 3D 이미지를 생성하는 장점이 있습니다. 공초점 현미경 검사는 콜라겐 섬유 이미징 및 형광 태그에 대한 SHG 신호를 활용하여 고해상도 3D 시각화를 가능하게합니다. 이러한 방법은 독립적으로 또는 결합최소한의 조직 준비와 3D 구조 연구에 많은 가능성을 엽니 다.
이 프로토콜의 몇 가지 까다로운 단계는 다음과 같은 추가주의가 필요합니다.
첫째, 코일 배치 중에 합자 와이어를 첫 번째와 두 번째 어금니 사이에 단단히 배치해야 합니다. 이 과정은 마우스 치아의 작은 치수로 인해 도전적입니다. 배치를 안내하기 위해 벤치탑 스테레오현미경을 사용하는 것이 좋습니다. 그러나 절차 중에 작은 움직임은 마우스를 이동하고 관심 영역이 시야에서 벗어나게 할 수 있습니다. 대안으로, 우리는 더 동적으로 영역을 볼 수 있도록, 연산자에 착용 할 수있는 4-5 배 확대 형편형 loupes를 사용하는 것이 좋습니다.
둘째, 클리어링 결과는 탈수 과정에 의존한다. 샘플이 원하는 투명도 수준에 도달하지 않은 경우, 우리의 제안은 탈수 시간을 증가시키는 것입니다. 보다 구체적으로, 100% EtOH에서 더 긴 침수 시간이 최종 제품의 투명성을 향상시키는 것으로 나타났습니다. 그러나, 탈수의 증가 수준이 극적으로 형광 수준24,25를감소시킬 수 있다는 점에 유의해야 한다. 제시된 ECi 기반 방법은2주 이상 형광 신호를 24주이상 보존하는 것으로 나타났다.
이 프로토콜의 측면은 여러 가지 다른 목적을 연구하도록 수정할 수 있습니다. 마이크로 CT 내부에 설계된 챔버는 로드 셀 및 모터와 결합되어 헤미 하악 샘플에서 장력 /압축 테스트를 수행 할 수있는 능력을 가지고 있습니다. 마이크로 CT의 시각화와 결합하여 이 설정은 다양한 기계적하중(21)을가진 PDL 내 의 변화를 보여줄 수 있다. 설명된 클리어링 방법은 또한 다양한 이미징 양식의 흥미로운 조합을 위한 기회를 제공하는 고정되지 않은 견본에 구현될 수 있었습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 NIH (NIDCR R00-DE025053, PI:Naveh)에 의해 지원되었다. 하버드 센터의 인프라 와 지원에 감사드립니다. 모든 수치는 biorender.com 함께 생성됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-mL BD Luer-Lok syringe | BD | 309628 | |
| 1X phosphate buffered saline | VWR Life Sciences | 0780-10L | |
| 200 proof ethanol | VWR Life Sciences | V1016 | |
| Aluminum alloy 5019 wire | Sigma-aldrich | GF15828813 | 0.08 mm diameter wire, length 100th, temper hard. Used as wire ligature around molar. |
| Avizo 9.7 | Thermo Fisher Scientific | N/A | Used to analyze microCT scans |
| Castroviejo Micro Needle Holders | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| Clr Plan-Apochromat 20x/1.0,CorrVIS-IR M27 85mm | Zeiss | N/A | Used for second harmonic generation imaging |
| Cone socket handle, single ended, hand-form | G.Hartzell and son | 126-CSH3 | Handle of the inspection mirror |
| EC Plan-Neofluar 5x/0.16 | Zeiss | 440321-9902 | Used for light-sheet imaging |
| Elipar DeepCure-S LED curing light | 3M ESPE | 76985 | |
| Eppendorf safe-lock tubes, 1.5mL | Eppendorf | 22363204 | |
| Ethyl cinnamate, >= 98% | Sigma-aldrich | W243000-1KG-K | |
| Hypodermic Needle, 27G x 1/2'' | BD | 305109 | |
| Ketathesia 100mg/ml | Henry Schein Animal Health | NDC:11695-0702-1 | |
| KIMWIPES delicate task wipers | Kimberly-Clark | 21905-026 (VWR Catalog number) | Purchased from VWR |
| LightSheet Z.1 dual illumination microscope system | Zeiss | LightSheet Z.1/LightSheet 7 | Used for lightsheet imaging |
| LSM 880 NLO multi-photon microscope | Zeiss | LSM 880 NLO | Used for two-photon imaging |
| MEGAmicro, plane, 5mm dia, SS-Thread | Hahnenkratt | 6220 | Front surface inspectrio mirror |
| MicroCT machine, MicroXCT-200 | Xradia | MICRO XCT-200 | |
| Mini-Colibri | Fine Science Tools | 17000-01 | |
| PermaFlo Flowable Composite | Ultradent | 948 | |
| Procedure platform | N/A | N/A | Custom-made from lab materials |
| Routine stereo micscope M80 | Leica Micosystems | M80 | |
| Sentalloy NiTi open coil spring | TOMY Inc. | A 0.15mm diameter closed NiTi coil with an inner coil diameter of 0.9mm delivers a force of 10g. Similar products can be purchased from Dentsply Sirona. | |
| T-304 stainless steel ligature wire, 0.009'' diameter | Orthodontics | SBLW109 | 0.009''(.23mm) diameter, Soft temper |
| X-Ject E (Xylazine) 100mg/ml | Henry Schein Animal Health | NDC:11695-7085-1 | |
| Z100 Restorative, A2 shade | 3M ESPE | 5904A2 |
References
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