Summary
Presentiamo un protocollo per generare movimento ortodontico dei denti nei topi e metodi per la visualizzazione 3D delle fibre di collagene e dei vasi sanguigni del legamento parodontale senza sezioni.
Abstract
Il movimento ortodontico dei denti è un complesso processo biologico di rimodellamento alterato dei tessuti molli e duri come risultato di forze esterne. Per comprendere questi complessi processi di rimodellamento, è fondamentale studiare i tessuti dentali e parodontali all'interno del loro contesto 3D e quindi ridurre al minimo qualsiasi sezionamento e artefatti tissutali. I modelli di topo sono spesso utilizzati nella biologia dello sviluppo e strutturale, così come nella biomeccanica a causa delle loro piccole dimensioni, alto tasso metabolico, genetica e facilità di manipolazione. In linea di principio questo li rende anche modelli eccellenti per studi relativi all'odontoiatria. Tuttavia, un grosso impedimento è la loro piccola dimensione del dente, i molari in particolare. Questo documento ha lo scopo di fornire un protocollo passo dopo passo per generare il movimento ortodontico dei denti e due metodi per l'imaging 3D del componente fibroso legamento parodontale di un molare mandibolare del topo. Il primo metodo presentato si basa su una configurazione micro-CT che consente l'imaging di miglioramento della fase dei tessuti di collagene fresco. Il secondo metodo è un metodo di compensazione ossea che utilizza cinnamato etilico che consente l'imaging attraverso l'osso senza sessare e preserva la fluorescenza endogena. Combinando questo metodo di compensazione con topi reporter come Flk1-Cre; TdTomato ha fornito una prima opportunità nel suo genere di immagine della vascuola 3D nel PDL e nell'osso alveolare.
Introduction
Il processo biologico di base nel movimento ortodontico dei denti (OTM) è il rimodellamento osseo. Il trigger per questo processo di rimodellamento è attribuito a cambiamenti nella struttura del legamento parodontale (PDL) come lo stress della matrice extracellulare (ECM), la necrosi, la distruzione e la formazione dei vasisanguigni 1,2,3. Altri possibili fattori scatenanti per il rimodellamento osseo alveolare sono correlati al rilevamento della forza da parte degli osteociti nell'osso, così come alla deformazione meccanica dell'osso alveolare stesso; tuttavia il loro ruolo in OTM non è ancora del tutto chiarito4,5.
Nonostante molti studi volti a rivelare le relazioni struttura-funzione del PDL durante l'OTM, un chiaro meccanismo funzionale deve ancora esseredefinito 6,7. La ragione principale di ciò è la sfida nel recupero dei dati di un tessuto molle (PDL) situato tra due tessuti duri (cemento e osso alveolare). I metodi accettati per raccogliere informazioni strutturali di solito richiedono fissazione e sezionamento che interrompono e modificano la struttura PDL. Inoltre, la maggior parte di questi metodi fornisce dati 2D che, anche se non distorti, forniscono solo informazioni parziali e localizzate. Poiché il PDL non è uniforme nella sua struttura e funzione, è giustificato un approccio che affronta la struttura 3D intatta dell'intero complesso dentale-PDL-osso.
Questo documento descriverà un metodo per generare un OTM nei topi e due metodi che consentono la visualizzazione 3D delle fibre di collagene nel PDL senza alcuna sezione del campione.
I modelli murini sono ampiamente utilizzati per esperimenti in vivo in medicina, biologia dello sviluppo, somministrazione di farmaci e studi strutturali. Possono essere geneticamente modificati per eliminare o migliorare proteine e funzioni specifiche; forniscono un controllo dello sviluppo rapido, ripetibile e prevedibile; sono anche facili da immaginare grazie alle loro piccole dimensioni8. Nonostante i loro numerosi vantaggi, i modelli di topo nella ricerca dentale non vengono utilizzati frequentemente, specialmente quando le manipolazioni cliniche sono giustificate, principalmente a causa dei denti di piccole dimensioni. Modelli animali come ratti9,10,11,cani12,13,maiali14,15,16 e scimmie 17 sono usati più spesso dei topi. Con il recente sviluppo di tecniche di imaging ad alta risoluzione, i vantaggi dell'utilizzo di un modello di mouse per decifrare i processi contorti in OTM sono numerosi. Questo articolo presenta un metodo per generare un movimento mesiale del dente molare nella madibola con livelli di forza costanti che innescano il rimodellamento osseo. La maggior parte degli esperimenti OTM sui roditori sono fatti nella mascella, poiché la mobilità della mattiglia e la presenza della lingua aggiungono un altro livello di complessità. Tuttavia, la madibola ha molti vantaggi quando si desidera l'integrità strutturale 3D. Può essere facilmente sezionato come un osso intero; in alcune specie può essere separato in due emi-madibole attraverso la sifisi fibrosa; è compatto, piatto e contiene solo i denti senza spazi seno. Al contrario, la mascella è una parte del cranio e strettamente correlata ad altri organi e strutture, quindi è necessaria una sezione estesa per sezionare l'osso alveolare con i denti associati.
Utilizzando una camera di umidità interna accoppiata a un sistema di carico all'interno di una micro-TAC ad alta risoluzione che consente il miglioramento della fase, abbiamo sviluppato un metodo per visualizzare tessuti fibrosi freschi in 3D comeprecedentemente descritto 9,18,19,20,21,22,23. I tessuti freschi vengono scansionati immediatamente dopo che l'animale è stato sacrificato senza alcuna colorazione o fissazione, il che riduce i manufatti tissutali e le alterazioni delle proprietà biomeccaniche. Questi dati 3D possono essere utilizzati per analisi di distribuzione e direzione delle fibre come descritto altrove19.
Il secondo metodo di imaging 3D di tessuti interi qui presentato si basa sulla pulizia ottica della madibola che consente l'imaging delle fibre PDL attraverso l'osso senza alcuna sezione. È interessante notare che consente anche la visualizzazione delle fibre di collagene dell'osso stesso, tuttavia questo non sarà discusso qui. In generale, ci sono due metodi per la pulizia dei tessuti. Il primo è la radura a base acquosa in cui il campione è immerso in una soluzione acquosa con un indice di rifrazione maggiore di 1,4 attraverso una semplice immersione, iperidratazione o immersione di idrogel. Tuttavia, questo metodo è limitato nel livello di trasparenza e nella conservazione strutturale del tessuto e quindi richiede la fissazione del tessuto. Il secondo metodo che produce campioni altamente trasparenti e non richiede fissazione è il metodo di compensazione a base disolventi 24,25. Abbiamo generato un metodo di compensazione modificato a base di solventi basato sull'etil-3-fenilprop-2-enoato (etil cinnamato, ECi) per i campioni mandibolari. Questo metodo ha i vantaggi di utilizzare agenti di compensazione non tossici per uso alimentare, restringimento minimo dei tessuti e conservazione delle proteine fluorescenti.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le Linee guida del NIH per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e le linee guida del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Harvard (protocollo n. 01840).
1. Movimento ortodontico dei denti
- Per generare un letto per topi, utilizzare una piattaforma di plastica piatta con un poggiacapo angolato a forma di cuneo a 45°. Il poggiacapo può essere generato tagliando una scatola di plastica.
- Elevare l'estremità della testa della piattaforma per generare un angolo di circa 30° tra il poggiacapo e il piano del tavolo. Attaccare una graffetta spessa piegata (0,036" di diametro) all'estremità laterale della testa per tenere gli incisivi superiori.
- All'estremità della coda, generare una superficie elevata a cui è possibile attaccata una catena di potenza ortodontica per contenere gli incisivi inferiori. Vedere la figura 1 per una piattaforma di esempio.
- Anestetizzare il topo mediante iniezione intraperitoneale di xiazina a 10 mg/kg e chetamina 100 mg/kg utilizzando una siringa da 1 ml e un ago calibro 27.
- Posizionare il mouse anestetizzato sulla piattaforma su misura e immobilizzare la mascella superiore agganciando gli incisivi superiori sul loop della graffetta. Aprire la mascella inferiore del mouse con la catena di potenza ortodontica agganciata agli incisivi inferiori. Tenere le guance retrattili con il retrattile per bocca mini-colibri.
- Posizionare la piattaforma al microscopio chirurgico o a qualsiasi altro stereoscopio che possa raggiungere un ingrandimento di 5-6x.
- Applicare 50 μL di soluzione salina (circa 1 goccia) sugli occhi del topo per evitare la disidratazione corneale. Reintegrare la soluzione salina ogni 20 minuti.
- Tagliare un pezzo di un filo di alluminio (0,08 mm di diametro) di 1 cm di lunghezza. Far scorrere il filo dal lato buccale lingualmente nell'area interprossimale soffiare il punto di contatto tra il primo e il secondo molare utilizzando un portaaghi microchirurgici. Lasciare il bordo libero di 2 mm davanti al primo molare per essere infilato nell'estremità della molla.
- Tagliare un pezzo di bobina di nichel titanio (NiTi), di circa 7-9 fili di lunghezza.
NOTA: Le proprietà elastiche della bobina forniranno forza costante per il movimento ortodontico. La lunghezza totale non tesa della bobina deve essere più corta dello spazio tra l'incisivo e il molare. Tieni presente che sono necessari altri 2 fili su ogni estremità per ancorare la bobina al dente. Il filo di alluminio viene selezionato al fine di ridurre i manufatti di scansione come l'indurimento del fascio durante la scansione micro-CT. - Inserire la molla della bobina NiTi (diametro del filo di 0,15 mm, diametro della bobina interna di 0,9 mm; eroga una forza di 10 g) tra il primo molare inferiore e l'incisivo inferiore. Utilizzare la legatura del filo inserita attorno al primo molare nel passaggio 1.6, ruotare saldamente il filo intorno a 2 fili della molla della bobina per fissare la bobina sul lato molare.
- Per garantire un livello di forza uniforme, utilizzare esattamente 3 fili attivi tra il primo molare e l'incisivo. Rimuovere temporaneamente la catena di alimentazione dall'incisivo e avvolgere da 2 a 3 fili non tesi sull'incisivo per ancorare la bobina. Far scorrere i fili verso il basso fino al margine gengivale libero incisore.
- Posizionare uno strato di resina composita scorrevole sul bordo incisale della bobina e curarlo con luce di polimerizzazione dentale. Sostituire la catena di alimentazione dopo aver polimerizzato la resina.
- Utilizzando la stessa luce di polimerizzazione, riscaldare la bobina NiTi per 20 s. Questo stringerà la bobina NiTi. Il posizionamento finito viene mostrato figura 1C.
- Lasciare intatto il lato contralaterale o inserire una farsa come il filo tra il primo e il secondo molare.
- Posizionare il mouse anestetizzato sotto una luce riscaldata per mantenere il mouse caldo fino al recupero.
- Riposizionare il mouse in una gabbia individuale e monitorare quotidianamente. Non è necessario alcun cambiamento dietetico durante il movimento ortodontico.
NOTA: Il dispositivo OTM da un lato causa qualche disagio ma non compromette l'alimentazione. Tuttavia, i dispositivi di inserimento su entrambi i lati non sono consigliati a causa della quantità aggiunta di disagio. I farmaci antidolorifici non sono necessari a meno che non si vedono segni esteriori di dolore.
2. Micro-TAC di fibre PDL in emi-madibole fresche
- Montaggio dell'emi-madibola(Figura 2)
- Dopo la durata desiderata del movimento ortodontico, sacrificare il topo tramite lussazione cervicale. Rimuovere la mattiere e separarsi in emi-madibole.
NOTA: Poiché il campione non verrà fissato, è fondamentale eseguire la dissezione della mascella e il montaggio il prima possibile, idealmente entro 30 minuti. - Rimuovere delicatamente il tessuto molle circostante con una salvietta pulita senza pelucchi.
- Rimuovere il dispositivo ortodontico utilizzando forbici e pinzette microchirurgiche al microscopio stereo con almeno 4 volte l'ingrandimento.
- Mantenere il campione umido in un volume di 1,5 ml, tubo di micro-centrifuga insieme a un pezzo di salvietta priva di pelucchi inumidita con acqua.
- Posizionare la resina composita dentale impacchettabile nello slot del campione sul palco, quindi posizionare l'emi-mandibola fresca nel composito. Prima del montaggio assicurarsi che la superficie ossea a contatto con il composito dentale sia priva di tessuti molli e asciutta, altrimenti il composito dentale non si polimerizza correttamente.
- Regolare la posizione dell'emi-madibola fino a quando il primo molare non è centrato sulla scanalatura della linea mediana dello stadio. Assicurarsi che la superficie occlusione sia orizzontale. Curare il composito se soddisfatto del posizionamento.
NOTA: Ulteriori piccole quantità di compositi dentali possono essere posizionate sui lati dell'emi-madibola e/o attraverso l'incisivo per aiutare a stabilizzare il campione. - Posizionare la salvietta inumidita senza pelucchi all'interno delle piscine di umidità nella fase del campione. Posizionare il composito dentale sulla superficie occlusale del primo molare. Prima di chiudere la camera, assicurarsi che nulla blocchi il percorso dei raggi X a livello del campione.
- Apporre la camera nella micro-TAC. Avvitare la camera nello stadio del campione micro-CT in modo da ridurre al minimo il movimento durante l'imaging.
- Accendi i raggi X e scatta immagini 2D abbassando verticalmente l'incudine, fino a quando la punta dell'incudine non è circondata dal composito ma non viene rilevato alcun aumento della forza.
- Una volta che l'incudine è incorporata nel composito, chiudere la sorgente di raggi X. Quindi, aprire la camera micro-CT e polimeri il composito attraverso la finestra in plexiglass trasparente.
- Dopo la durata desiderata del movimento ortodontico, sacrificare il topo tramite lussazione cervicale. Rimuovere la mattiere e separarsi in emi-madibole.
- Impostazioni micro-CT
- Impostare la tensione di sorgente su 40 kV e la corrente su 200 μA. Utilizzando un rilevatore di ingrandimento 10x, posizionare il campione all'interno del frame di visualizzazione. Usa l'binning di 2 per le immagini acquisite.
NOTA: Poiché il PDL è significativamente meno denso dell'osso e del dente, la visualizzazione del PDL richiede una maggiore potenza e tempo di esposizione. Questo protocollo fornirà le impostazioni per la visualizzazione del PDL. - Impostare il tempo di esposizione di una singola immagine su 25 s. Impostare la rotazione dello stadio campione su un intervallo di 183 gradi o più. Impostare la scansione per 2500 proiezioni. Non utilizzare alcun filtro sorgente a raggi X, le scansioni risultanti hanno una dimensione voxel di 0,76 μm su ciascun lato.
- Raccogliere una scansione di riferimento per una corretta ricostruzione secondo le linee guida micro-CT. Utilizzare 1/3 di numero di immagini di riferimento come proiezioni totali. Ricostruire il volume senza un binning aggiuntivo, utilizzando un algoritmo filtrato di proiezione posteriore.
- Impostare la tensione di sorgente su 40 kV e la corrente su 200 μA. Utilizzando un rilevatore di ingrandimento 10x, posizionare il campione all'interno del frame di visualizzazione. Usa l'binning di 2 per le immagini acquisite.
3. Metodo di compensazione (figura 3)
- Preparare cinque tubi di microcentrofuga da 1,5 ml.
- Preparare 1,4 ml delle seguenti soluzioni in tubi di micro-centrifuga da 1,5 ml: 4% di paraformaldeide (PFA) in salina tamponata fosfato (PBS), 50% di etanolo (EtOH) in acqua deionizzata (DI), 70% EtOH in acqua DI e due tubi del 100% EtOH.
NOTA: pfa viene utilizzato per la fissazione del campione. La compensazione ECi funzionerà anche su campioni non con prefisso. Per cancellare i campioni non con prefisso, è sufficiente saltare il passaggio PFA. - Posizionare l'emi-madibola sezionata nel 4% di PFA. Coprire con un foglio di alluminio e posizionare sul rocker su un'impostazione delicata a temperatura ambiente per 6 ore.
- Spostare l'emi-madibola al 50% di EtOH. Posizionarlo sul rocker coperto di luce per 16 ore.
- Spostare l'emi-madibola al 70% etoh. Posizionarlo sul rocker coperto di luce per 16 ore.
- Spostare l'emi-madibola al 100% EtOH. Posizionarlo sul rocker coperto di luce per 16 ore.
- Ripetere 3.6. nel secondo tubo EtOH al 100%.
- Preparare 5 ml di ECi in un tubo di vetro o polipropilene.
NOTA: ECi scioglie il polistirolo, ma non il polipropilene. Inoltre, se non si utilizza un tessuto con proteine fluorescenti, il campione può essere esposto alla luce durante la procedura di compensazione. - Spostare l'emi-madibola nel tubo ECi. Coprire il tubo con un foglio di alluminio e posizionarlo sul rocker su un ambiente delicato per un minimo di 12 ore.
NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui. Il campione disidratato può essere conservato in ECi a temperatura ambiente. Il punto di congelamento o fusione di ECi è da 6,5 a 8,0 °C. Non conservare a 4 °C. - L'emi-madibola è pronta per l'imaging con microscopio a fluorescenza.
NOTA: Durante l'imaging, il campione deve essere immerso nell'ICE per rimanere otticamente trasparente.
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Representative Results
Questo articolo presenta un metodo per produrre OTM e due metodi per l'imaging 3D di fibre di collagene all'interno del PDL senza alcuna sezione. Ai fini della ricerca animale, quando l'allineamento dei denti non è necessario, un movimento del dente è considerato ortodontico se genera rimodellamento dell'osso alveolare a tutti i livelli delle radici. È necessario un livello di forza costante applicato sui denti per generare un OTM affidabile. Qui, una bobina NiTi a memoria di forma attivata viene utilizzata per generare una forza costante di 10 g per tutto il tempo sperimentale di 7 giorni e oltre se giustificata. L'attivazione della bobina qui descritta(Figura 1)genera tensione nella bobina NiTi all'interno della fase martensitica e porta la bobina allo stato di isteresi, che fornisce una sollecitazione costante sul dente. Riscaldare la bobina con la luce di polimerizzazione dopo l'inserimento della bobina farà anche in modo che la lega si sposti nella sua forma austenitica e che l'effetto memoria della forma avrà luogo.
Qui mostriamo i risultati rappresentativi dei topi maschi di 9 settimane. Lo spazio mesiodistale medio tra le corone del primo e del secondo molare dopo 7 giorni di OTM è di 40 μm misurato tra le superfici interprossimali dei molari nella micro-TC con ingrandimento 1X (n=12, st.dev. = 15 μm)(Figura 1E). Lo spazio medio del PDL nella direzione mesiodistale è di 80 μm prima e dopo 7 giorni di OTM (Figura 4B). Ciò conferma che il primo molare tradotto mesialmente e 7 giorni è un tempo adeguato per generare OTM in un modello di topo generando al contempo processi di riassorbimento osseo e apposizione in natura (Figura 4). I topi venivano nutriti con una dieta standard a pallet duri. Non è stato apportato alcun cambiamento dietetico all'inserimento post-dispositivo.
Il primo metodo presentato per visualizzare i cambiamenti nel complesso dentale-PDL-osso durante l'OTM si basa sull'imaging micro-CT potenziato in fase di tessuti freschi (Figura 4) che è stato descritto in dettaglio inprecedenza 9,18,19,20,22,23. In breve, fornito una capacità di miglioramento di fase di una micro-TAC o di un sincrotrone, stabilizzazione meccanica del tessuto fibroso e ambiente umidificato, le fibre collagene fresche possono essere visualizzate senza alcun agente fissazione o contrastante. Nel PDL le fibre che si vedono sono quelle che sono collegate sia al dente che all'osso, principalmente collagene di tipo I19. Questa opportunità unica di visualizzare in 3D un PDL intatto consente l'analisi della densità della fibra 3D, dell'orientamento delle fibre e del movimento 3D del dente come descritto inprecedenza 9,19. Nello specifico, qui presentiamo la visualizzazione della rete fibrosa nel PDL. Al tempo 0, si può osservare un rimodellamento fisiologico sia nell'osso che nel PDL. Il rimodellamento avviene anche nel cementum cellulare; tuttavia, questo non è direttamente correlato al metodo presentato e quindi non verrà elaborato. L'interfaccia osso-PDL è per lo più liscia sia nei piani trasversale (Figura 4A) che sagittale (Figura 4B) prima di qualsiasi applicazione di forza. Nel piano coronale (Figura 4C), l'interfaccia osso-PDL è più ruvida soprattutto verso la regione apicale che potrebbe essere indicativa del fatto che l'equilibrio di rimodellamento tende al riassorbimento. A 3 giorni di OTM (Figura 4D-F), su cui il primo molare viene spostato mesialmente (la direzione è rappresentata dalla freccia tratteggiata), la densità delle fibre nel PDL è ridotta (punte di freccia bianche). L'interfaccia osso-PDL è più ruvida rispetto a 0 giorni a causa dello sviluppo di crateri nella superficie ossea che sono indicativi dell'attività osteoclastica e dei processi di riassorbimento osseo associati principalmente alle forze di compressione nel PDL26, tuttavia qui visto nelle aree di tensione a 3 giorni. La distruzione dei tessuti nelle aree di tensione all'interno del PDLè stata suggerita 27,28 e può essere chiaramente vista usando questo metodo. Il bordo ruvido è visto a diversi livelli delle radici (frecce bianche) e quindi suggerisce che il movimento del dente è di natura traslazionale e non solo ribaltamento della corona. A 7 giorni di OTM (Figura 4G-I), i segni di riassorbimento osseo, come i crateri all'interno dell'osso, i bordi ruvidi e l'espansione dello spazio PDL, sono visti su tutti i piani, ma lo spazio PDL medio è più stretto rispetto a 3 giorni di OTM (Figura 4D-F). In alcune aree, tuttavia, il bordo osso-PDL è diventato più liscio dopo 7 giorni di OTM queste aree si trovano sulle superfici distali delle radici, il che è molto probabilmente un'indicazione per l'apposizione ossea, come previsto in OTM alla direzione mesiale.
A causa del lungo tempo di imaging micro-CT (~ 19 h) e della rotazione dello stadio, il montaggio del campione è essenziale per mantenere fermo il campione. Il campione instabile comporterà scansioni sfocate. La figura 5 presenta l'aspetto della micro-TAC quando il campione si è spostato durante la scansione. Il dente e l'osso sono sfocati. Né le fibre PDL né gli osteociti sono osservati. In tali incidenti c'è una sagoma presente intorno al margine di un oggetto. Nella figura 5è possibile osservare più contorni della corona dentale (frecce).
A seconda dell'obiettivo di ricerca, la risoluzione e la visualizzazione delle fibre PDL possono essere sacrificate nel commercio per tempi di scansione più brevi quando si desidera solo informazioni sui tessuti duri.
Un metodo complementare per la visualizzazione 3D delle fibre PDL senza alcun sezionamento è tramite microscopia ottica su campioni otticamente cancellati utilizzando ECi (Figura 3). Questo metodo può essere utilizzato su un campione senza fissazione e preserva i segnali fluorescenti che esistono nel tessuto prima della compensazione. Le emi-madibole prima e dopo la compensazione ECi sono mostrate nelle figure 3B e 3C. Un'adeguata pulizia del campione del PDL può essere confermata quando una carta griglia può essere vista attraverso il ramus della mavibile. La quantità di compensazione può essere regolata allungando il processo di disidratazione. La figura 6 mostra il segnale di seconda generazione armonica (SHG) proveniente dalle fibre di collagene sia nell'osso alveolare che nel PDL in una mattiera cancellata. L'imaging delle fibre di collagene dell'osso in 3D è un processo complicato, che spesso utilizza metodi di microscopia elettronica come FIB / SEM. Tuttavia, utilizzando il metodo di compensazione basato su ECi e SHG, le fibre ossee alveolari sono chiaramente viste, specialmente nella direzione orizzontale. Quando si traduce attraverso il campione in profondità nel PDL dalla superficie ossea, la transizione al livello della fibra PDL è molto chiara poiché le fibre cambiano improvvisamente il loro orientamento in uno verticale.
La microscopia a fogli leggeri può anche essere utilizzata per l'imaging di proteine fluorescenti attraverso l'osso. In questo caso di campione sdoganato da un Flk1-cre transgenico; Il topo tdtomato19,29,30, le cellule endoteliali fluorescenti che rivestono i vasi sanguigni sono chiaramente osservate(figura 7A,B, C, E). La corretta cancellazione è la chiave per generare immagini intelligibili con microscopia a fogli luce. Quando l'osso non è completamente sdoganato, i vasi sanguigni all'interno del PDL non sono statiosservati (figura 7D, F).
Figura 1: Inserimento ortodontico dell'apparecchio. A. La commissione per l'a Letto per topi realizzato in laboratorio per sostenere l'animale e tenere la bocca aperta. La piattaforma in plastica (PP) per il corpo è inclinata di 30° e il poggiacapo (HR) è su un angolo di 45 ° dalla superficie di PP. Un supporto per tubi a 2 livelli (TS) viene utilizzato per elevare la testa finale del PP. Il loop di graffetta (freccia nera) ancora gli incisivi superiori e la catena di potenza ortodontica inferiore (freccia bianca) si aggancia agli incisivi inferiori. Lo specchio di ispezione di 5 mm di diametro è stato utilizzato per l'ispezione visiva dei molari. B. La commissione per l' Vista laterale del letto del mouse. Gli angoli tra le superfici sono contrassegnati (verde e magenta). C. La commissione per l' Immagine rappresentativa del dispositivo posizionato correttamente. D. La commissione per l' Molari visti attraverso lo specchio di ispezione prima dell'impianto del dispositivo. E. La commissione per l' Immagine rappresentativa dei molari dopo il movimento ortodontico. Le linee tratteggiate tracciano il contorno del primo e del secondo molare. F. Diagramma del dispositivo e del suo posizionamento. La linea rossa rappresenta la legatura del filo attorno al primo molare. La linea arancione rappresenta la resina composita scorrevole utilizzata per ancorare la bobina. La bobina NiTi è mostrata in blu ed etichettata. G. La commissione per l' Emi-madibola sezionata con il dispositivo collegato dopo il movimento ortodontico di 7 giorni. Si noti come i 3 filetti di bobina sono ancora aperti, indicando che la bobina è ancora attiva dopo 7 giorni. Barra di scala = 1 mm in Mi e G. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Emi-madibola montata in una camera su misura per l'imaging micro-TC. A. Set-up completo della camera campione all'interno della macchina micro-CT. La sorgente di raggi X è vista a sinistra e il rivelatore a destra. Il rettangolo rosso delinea l'emi-madibola montata nella camera sullo stadio del campione (SS). La camera di esempio qui mostrata fa parte di un set-up di prova meccanico, tra cui motore (M), incudine (A, delineata da linee tratteggiate bianche) e albero dell'incudine (AS) in cima alla camera. L'intero set up viene avvitato sul palco CT. L'immagine interna mostra il primo primo della regione rossa delineata, contenente la camera di umidità con campione all'interno. B. La commissione per l' Vista dall'alto del campione montato sullo stadio di campionamento. Le piscine di umidità (freccia grigia) sono integrate sul perimetro per mantenere l'umidità durante l'imaging. Sul palco circolare al centro, l'emi-madibola può essere montata nella scanalatura profonda inclinata (freccia nera). Una scanalatura sottile (freccia bianca) segna la linea mediana dello stadio per aiutare ad orientare il campione. C. La commissione per l' Diagramma dello stadio circolare con la scanalatura del campione. L'inclinazione della scanalatura sostiene la mattiere e consente di montare i molari lungo l'asse verticale delle radici. D. La commissione per l' Fetta 2D micro-CT rappresentativa combinata con un'immagine del volume 3D del campione emi-madibile. Il divario interprossimale qui è di 52 μm. Il campione è montato sullo stadio del campione sottostante (non mostrato) e l'incudine (A) in cima dal composito dentale (DC). Barra di scala = 500 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Metodo di compensazione basato su ECi per le emi-madibole del mouse sezionate. A. La commissione per l'a L'emi-madibola sezionata è immersa nel 4% di PFA, 50% EtOH, 70% EtOH e 100% EtOH consecutivamente. Dopo la disidratazione, l'emi-madibola viene conservata in ECi per un minimo di 12 ore fino all'imaging. B. La commissione per l' Emi-madibola subito dopo la dissezione. C. La commissione per l' Emi-madibola dopo il completamento della compensazione. Barre di scala = 5 mm Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Scansioni rappresentative in situ micro-CT del PDL di un campione fresco nelle diverse fasi del movimento ortodontico. A-C, nessun movimento ortodontico. A. La commissione per l'a Immagine 2D micro-CT nel piano trasversale dell'emi-madibola che mostra le radici mesiali (M) e distali (D) all'interno dell'osso alveolare, B-Buccal, L-Lingual lati dell'osso alveolare. Tra le radici dei denti e l'osso alveolare, lo spazio PDL e le fibre al suo interno sono chiaramente osservati. Immagine B. 2D nel piano sagittale. Immagine C. 2D nel piano coronale. D-E, immagini 2D dopo 3 giorni di OTM, le punte delle frecce puntano verso le aree del PDL con riduzione della densità delle fibre di collagene, le frecce bianche puntano verso aree di riassorbimento osseo. G-I, immagini 2D dopo 7 giorni di OTM, le frecce nere puntano verso le regioni di apposizione ossea. Barre di scala = 150 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Immagine micro-CT 2D nel piano sagittale, che mostra strutture sfocate sia del dente che dell'osso a causa del movimento del dente durante la scansione. Le frecce puntano su più linee della tavola del dente, indicandone il movimento. Barra di scala 150 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Madibola cancellata ECi che mostra il primo molare immaginato con seconda generazione armonica (SHG). La freccia bianca punta in una regione in cui si vedono fibre di collagene del PDL, si noti l'orientamento verticale, le frecce nere puntano in una regione in cui sono viste sia fibre verticali del PDL che fibre orizzontali dell'osso alveolare. Dente T, F-furcation, osso ab-alveolare, radice MR-mesiale, radice DR-Distal, barra di scala 150 μm. Le immagini sono state ottenute utilizzando un obiettivo multi-immersione 20X per soluzioni con RI di 1.33-1.56. Il laser di eccitazione è stato impostato a 860nm con una potenza del 10%. Tempo di abitazione dei pixel: 0,51μs; Modalità di scansione: fotogramma; Media: 16; Tipo di rivelatore: rilevatore di tubi fotomoltiplicatore non scansionato; Detector Gain 800V. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7. Immagini al microscopio lightsheet del mouse Flk1-Cre;tdTomato cancellato da ECi. A. La commissione per l'a Emi-madibola di controllo cancellata in modo ottimale. La rete di vasi sanguigni all'interno dell'osso (testa di freccia) e dello spazio PDL (freccia) è visibile. B. La commissione per l' l'interno della regione mesiolinguale del primo molare (rosso delineato in A) mostra i vasi sanguigni. C. emi-madibola OTM a 7 giorni e D. non ottimale cancellato emi-madibola. E. La commissione per l' Immagine 2D del pannello C nel piano sagittale, l'immagine mostra vasi sanguigni ben definiti in osso (freccia grigia) e spazio PDL (frecce bianche). F. Immagine a sezione bidimensionale del pannello D, stessa regione delle immagini in E, con conseguente sfocatura dell'immagine. Barre di scala A, C, D = 500 μm, B, E, F = 100 μm Le immagini sono state scattate con un obiettivo di piano 5X, usando la fotocamera come rilevatore. Il laser ad eccitazione era di 561 nm con una potenza del 4%. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La generazione di OTM nei topi è altamente desiderata a causa delle dimensioni, della genetica e dei vantaggi di gestione. L'uso della mattiere fornisce una facile manipolazione sia in termini di dissezione tissutale che di preparazione e imaging del campione. Qui abbiamo presentato un metodo per generare OTM con movimento trascizionale del dente all'interno dell'osso entro 7 giorni da OTM. Utilizzando questo protocollo, la durata complessiva del movimento del dente può essere estesa, poiché la bobina attivata fornisce un livello di forza costante per il movimento fino a circa 1 mm. Tuttavia, il lato mesiale della bobina è fissato all'incisivo, che erutta costantemente. Di conseguenza, i vettori di forza si altereranno gradualmente e inizieranno a generare forze di estrusione. Questo può essere evitato se la regolazione del livello di attacco sull'estremità mesiale viene eseguita ogni 7 giorni.
Il PDL è l'iniziatore di OTM, quindi comprenderne la struttura e la funzione durante le diverse fasi dell'OTM è di grande importanza. Tuttavia, il PDL non è uniforme sia nella struttura che nella funzione19,22,31,32. Di conseguenza, al fine di recuperare dati significativi, il PDL deve essere studiato in 3D e qualsiasi sessatura e manipolazione dei tessuti dovrebbe essere evitata il più possibile. Tuttavia, indagare su un tessuto molle situato tra due tessuti duri rende tali requisiti difficili da soddisfare. I metodi tradizionali di studio del PDL spesso implicano compromettere la struttura 3D e rimuovere il tessuto dal suo ambiente fisiologico, che di conseguenza altera le proprietà strutturali e biomeccaniche del PDL. Sia le proprietà strutturali che biomeccaniche subiscono cambiamenti dinamici durante l'OTM che giustificano la conservazione del contesto 3D tissutale ancora di più. A tal fine abbiamo descritto due metodi che consentono l'imaging di tessuti interi senza sezionamento, che possono essere utilizzati anche sullo stesso campione co-localizzando i segnali fluorescenti, i dati morfologici e di mineralizzazione.
La descrizione metodologica fornita indirizza i lettori ad applicare i metodi nei loro campi di studio. L'imaging micro-CT consente la visualizzazione 3D della rete fibrosa PDL. Le immagini possono essere analizzate per produrre analisi direzionali e densità e per indagare quantitativamente i cambiamenti nel PDL durante l'OTM. Abbiamo anche descritto un metodo di compensazione che consente la visualizzazione con metodi microscopici ottici prontamente disponibili come la microscopia a fogli luce e l'imaging confocale. La microscopia a fogli leggeri ha il vantaggio di produrre un'immagine 3D di campioni di grandi dimensioni con velocità di imaging relativamente veloce. La microscopia confocale consente una visualizzazione 3D ad alta risoluzione utilizzando il segnale SHG per l'imaging delle fibre di collagene e i tag fluorescenti. Questi metodi indipendentemente o combinati aprono molte possibilità agli studi strutturali 3D con una preparazione minima dei tessuti.
Diversi passaggi impegnativi di questo protocollo richiedono ulteriore attenzione:
In primo luogo, durante il posizionamento della bobina, il filo di legatura deve essere posizionato saldamente tra il primo e il secondo molare. Questo processo è impegnativo a causa delle piccole dimensioni dei denti del mouse. Si consiglia l'uso di stereomicroscopio da banco per guidare il posizionamento. Tuttavia, piccoli movimenti durante la procedura possono spostare il mouse e causare l'uscita della regione di interesse dal campo visivo. In alternativa, suggeriamo di utilizzare loupes ingrandite 4-5x che possono essere indossate sull'operatore, il che potrebbe aiutare a visualizzare l'area in modo più dinamico.
In secondo luogo, i risultati della compensazione dipendono dal processo di disidratazione. Se il campione non ha raggiunto il livello di trasparenza desiderato, il nostro suggerimento è quello di aumentare il tempo di disidratazione. Più specificamente, è stato dimostrato che un tempo di immersione più lungo nel 100% di EtOH migliora la trasparenza del prodotto finale. Tuttavia, va notato che l'aumento del livello di disidratazione può ridurre drasticamente i livelli di fluorescenza24,25. Il metodo presentato basato su ECi ha dimostrato di preservare i segnali fluorescenti per più di 2 settimane24.
Alcuni aspetti di questo protocollo possono essere modificati per studiare una moltitudine di altri scopi. La camera che abbiamo progettato all'interno della micro-TC è accoppiata con una cella di carico e un motore e ha la capacità di eseguire test di tensione / compressione sui campioni emi-madibola. In combinazione con la visualizzazione della micro-TC, questo set up può mostrare cambiamenti nel PDL in situ con carichi meccanici variabili21. Il metodo di compensazione descritto potrebbe anche essere implementato su campioni non con prefisso, il che offre l'opportunità di un'interessante combinazione di varie modalità di imaging.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo studio è stato supportato dal NIH (NIDCR R00- DE025053, PI:Naveh). Vorremmo ringraziare l'Harvard Center for Biological Imaging per le infrastrutture e il supporto. Tutte le cifre sono generate con biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-mL BD Luer-Lok syringe | BD | 309628 | |
| 1X phosphate buffered saline | VWR Life Sciences | 0780-10L | |
| 200 proof ethanol | VWR Life Sciences | V1016 | |
| Aluminum alloy 5019 wire | Sigma-aldrich | GF15828813 | 0.08 mm diameter wire, length 100th, temper hard. Used as wire ligature around molar. |
| Avizo 9.7 | Thermo Fisher Scientific | N/A | Used to analyze microCT scans |
| Castroviejo Micro Needle Holders | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| Clr Plan-Apochromat 20x/1.0,CorrVIS-IR M27 85mm | Zeiss | N/A | Used for second harmonic generation imaging |
| Cone socket handle, single ended, hand-form | G.Hartzell and son | 126-CSH3 | Handle of the inspection mirror |
| EC Plan-Neofluar 5x/0.16 | Zeiss | 440321-9902 | Used for light-sheet imaging |
| Elipar DeepCure-S LED curing light | 3M ESPE | 76985 | |
| Eppendorf safe-lock tubes, 1.5mL | Eppendorf | 22363204 | |
| Ethyl cinnamate, >= 98% | Sigma-aldrich | W243000-1KG-K | |
| Hypodermic Needle, 27G x 1/2'' | BD | 305109 | |
| Ketathesia 100mg/ml | Henry Schein Animal Health | NDC:11695-0702-1 | |
| KIMWIPES delicate task wipers | Kimberly-Clark | 21905-026 (VWR Catalog number) | Purchased from VWR |
| LightSheet Z.1 dual illumination microscope system | Zeiss | LightSheet Z.1/LightSheet 7 | Used for lightsheet imaging |
| LSM 880 NLO multi-photon microscope | Zeiss | LSM 880 NLO | Used for two-photon imaging |
| MEGAmicro, plane, 5mm dia, SS-Thread | Hahnenkratt | 6220 | Front surface inspectrio mirror |
| MicroCT machine, MicroXCT-200 | Xradia | MICRO XCT-200 | |
| Mini-Colibri | Fine Science Tools | 17000-01 | |
| PermaFlo Flowable Composite | Ultradent | 948 | |
| Procedure platform | N/A | N/A | Custom-made from lab materials |
| Routine stereo micscope M80 | Leica Micosystems | M80 | |
| Sentalloy NiTi open coil spring | TOMY Inc. | A 0.15mm diameter closed NiTi coil with an inner coil diameter of 0.9mm delivers a force of 10g. Similar products can be purchased from Dentsply Sirona. | |
| T-304 stainless steel ligature wire, 0.009'' diameter | Orthodontics | SBLW109 | 0.009''(.23mm) diameter, Soft temper |
| X-Ject E (Xylazine) 100mg/ml | Henry Schein Animal Health | NDC:11695-7085-1 | |
| Z100 Restorative, A2 shade | 3M ESPE | 5904A2 |
References
- Li, Y., et al. Orthodontic tooth movement: The biology and clinical implications. The Kaohsiung Journal of Medical Sciences. 34 (4), 207-214 (2018).
- Meikle, M. C. The tissue, cellular, and molecular regulation of orthodontic tooth movement: 100 years after Carl Sandstedt. European Journal of Orthodontics. 28, 221-240 (2006).
- Krishnan, V., Davidovitch, Z., molecular, Cellular, molecular, and tissue-level reactions to orthodontic force. American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 129 (4), 1-32 (2006).
- Shoji-Matsunaga, A., et al. Osteocyte regulation of orthodontic force-mediated tooth movement via RANKL expression. Scientific Reports. 7 (1), 8753 (2017).
- Oppenheim, A. Tissue changes, particularly of the bone, incident to tooth movement. European Journal of Orthodontics. 29, suppl 1 2-15 (2007).
- Unnam, D., et al. Accelerated Orthodontics-An overview. Journal of Archives of Oral Biologyogy and Craniofacial Research. 3 (1), 4 (2018).
- von Bohl, M., Kuijpers-Jagtman, A. M. Hyalinization during orthodontic tooth movement : a systematic review on tissue reactions. European Journal of Orthodontics. 31 (1), 30-36 (2009).
- Kirschneck, C., et al. Comparative assessment of mouse models for experimental orthodontic tooth movement. Scientific Reports. 10 (1), 1-12 (2020).
- Naveh, G. R. S., Weiner, S. Initial orthodontic tooth movement of a multirooted tooth: a 3D study of a rat molar. Orthodontics & Craniofacial Research. 18 (3), 134-142 (2015).
- Nakamura, Y., et al. Time-lapse observation of rat periodontal ligament during function and tooth movement, using microcomputed tomography. European Journal of Orthodontics. 30 (3), 320-326 (2008).
- Kawarizadeh, A., Bourauel, C., Jager, A. Experimental and numerical determination of initial tooth mobility and material properties of the periodontal ligament in rat molar specimens. European Journal of Orthodontics. 25 (6), 569-578 (2003).
- Jónsdóttir, S. H., Giesen, E. B. W., Maltha, J. C. Biomechanical behavior of the periodontal ligament of the beagle dog during the first 5 hours of orthodontic force application. European Journal of Orthodontics. 28, 547 (2006).
- Lindhe, J., et al. Experimental breakdown of peri-implant and periodontal tissues. A study in the beagle dog. Clinical Oral Implants Research. 3 (1), 9-16 (1992).
- Salamati, A., et al. Functional tooth mobility in young pigs. Journal of Biomechanics. 104, 109716 (2020).
- Maria, R., et al. An unusual disordered alveolar bone material in the upper furcation region of minipig mandibles: A 3D hierarchical structural study. Journal of Structural Biology. 206 (1), 128-137 (2019).
- Wang, S., et al. The miniature pig: a useful large animal model for dental and orofacial research. Oral Diseases. 10, 1-7 (2007).
- Melsen, B. Tissue reaction to orthodontic tooth movement--a new paradigm. European Journal of Orthodontics. 23 (6), 671-681 (2001).
- Naveh, G. R. S., et al. Direct MicroCT imaging of non-mineralized connective tissues at high resolution. Connective Tissue Research. 55 (1), 52-60 (2014).
- Naveh, G. R. S., et al. Nonuniformity in ligaments is a structural strategy for optimizing functionality. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 9008 (2018).
- Naveh, G. R. S., et al. Tooth periodontal ligament: Direct 3D microCT visualization of the collagen network and how the network changes when the tooth is loaded. Journal of Structural Biology. 181 (2), 108-115 (2013).
- Naveh, G. R. S., et al. Tooth movements are guided by specific contact areas between the tooth root and the jaw bone : A dynamic 3D microCT study of the rat molar. Journal of Structural Biology. 17 (2), 477-483 (2012).
- Naveh, G. R. S., et al. Tooth-PDL-bone complex: Response to compressive loads encountered during mastication -A review. Archives of Oral Biology. 57 (12), 1575-1584 (2012).
- Ben-Zvi, Y., et al. Response of the tooth-periodontal ligament-bone complex to load: A microCT study of the minipig molar. Journal of Structural Biology. 205 (2), 155-162 (2019).
- Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452 (2017).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Taddei, S. R. dA., et al. Experimental model of tooth movement in mice: A standardized protocol for studying bone remodeling under compression and tensile strains. Journal of Biomechanics. 45 (16), 2729-2735 (2012).
- Nakamura, K., Sahara, N., Deguchi, T. Temporal changes in the distribution and number of macrophage-lineage cells in the periodontal membrane of the rat molar in response to experimental tooth movement. Archives of Oral Biology. 46 (7), 593-607 (2001).
- Rygh, P., et al. Activation of the vascular system: A main mediator of periodontal fiber remodeling in orthodontic tooth movement. American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 89 (6), 453-468 (1986).
- Nagao, M., et al. Vascular endothelial growth factor in cartilage development and osteoarthritis. Scientific Reports. 7 (1), 13027 (2017).
- Licht, A. H., et al. Endothelium-specific Cre recombinase activity in flk-1-Cre transgenic mice. Developmental Dynamics. 229 (2), 312-318 (2004).
- Connizzo, B. K., Naveh, G. R. S. In situ AFM-based nanoscale rheology reveals regional non-uniformity in viscoporoelastic mechanical behavior of the murine periodontal ligament. Journal of Biomechanics. 111, 109996 (2020).
- Connizzo, B. K., et al. Nonuniformity in Periodontal Ligament: Mechanics and Matrix Composition. Journal of Dental Research. 2, 179-186 (2020).
