הדמיה תלת מימדית של סיבי קולגן PDL במהלך תנועת שן אורתודונטית במודל מורין מנדיבולרי
Summary
אנו מציגים פרוטוקול ליצירת תנועת שן אורתודונטית בעכברים ושיטות להדמיה תלת מימדית של סיבי הקולגן וכלי הדם של רצועה חניכיים ללא חתך.
Abstract
תנועת שן אורתודונטית היא תהליך ביולוגי מורכב של שינוי שיפוץ רקמות רכות וקשות כתוצאה מכוחות חיצוניים. על מנת להבין את תהליכי השיפוץ המורכבים הללו, חיוני לחקור את רקמות השן והתקופה בהקשר התלת מימדי שלהם ולכן למזער כל ניתוק וחפצי רקמות. מודלים של עכברים מנוצלים לעתים קרובות בביולוגיה התפתחותית ומבנית, כמו גם בביומכניקה בשל גודלם הקטן, קצב חילוף החומרים הגבוה, גנטיקה וקלות הטיפול. בעיקרון זה גם עושה אותם מודלים מצוינים עבור מחקרים הקשורים לרפואת שיניים. עם זאת, מכשול גדול הוא גודל השן הקטן שלהם, הטוחנות בפרט. נייר זה נועד לספק פרוטוקול צעד אחר צעד ליצירת תנועת שן אורתודונטית ושתי שיטות להדמיה תלת-ממדית של הרכיב הסיבי של רצועה חניכיים של טוחנת גברים של עכבר. השיטה הראשונה שהוצגה מבוססת על מערך מיקרו-CT המאפשר הדמיה של שיפור פאזה של רקמות קולגן טריות. השיטה השנייה היא שיטת ניקוי עצמות המשתמשת באתיל קינמט המאפשרת הדמיה דרך העצם ללא חתך ושומרת על פלואורסצנטיות אנדוגנית. שילוב שיטת סליקה זו עם עכברי כתב כמו Flk1–Cre; TdTomato סיפק הזדמנות ראשונה מסוגה לדמיין את כלי הדם 3D ב PDL ועצם מכתשית.
Introduction
התהליך הביולוגי הבסיסי בתנועת השן האורתודונטית (OTM) הוא שיפוץ עצם. הטריגר לתהליך שיפוץ זה מיוחס לשינויים במבנה הרצועה התקופתית (PDL) כגון מטריצה חוץ-תאית (ECM), נמק, כמו גם הרס כלידםוהיווצרות 1,2,3. גורמים אפשריים אחרים לשיפוץ עצם מכתוש קשורים לחישת כוח על ידי אוסטאוציטים בעצם, כמו גם עיוות מכני של עצם מכתוש עצמו; עם זאת תפקידם ב- OTM עדיין אינו ברור לחלוטין4,5.
למרות מחקרים רבים שמטרתם לחשוף יחסי מבנה-פונקציה של PDL במהלך OTM, מנגנון תפקודי ברור עדיין לא הוגדר6,7. הסיבה העיקרית לכך היא האתגר באחזור נתונים של רקמה רכה (PDL) הממוקמת בין שתי רקמות קשות (מלט ועצם מכתשית). השיטות המקובלות לאיסוף מידע מבני מחייבות בדרך כלל קיבעון ומקטעים המשבשים ומשנים את מבנה ה- PDL. יתר על כן, רוב השיטות הללו מניבות נתונים דו-מימדיים שגם אם אינם מעוותים, נותנים מידע חלקי ומקומי בלבד. מכיוון שה- PDL אינו אחיד במבנה ובתפקודו, יש צורך בגישה המטפלת במבנה תלת-ממדי שלם של כל קומפלקס עצם השיניים-PDL.
מאמר זה יתאר שיטה ליצירת OTM בעכברים ושתי שיטות המאפשרות הדמיה תלת-ממדית של סיבי הקולגן ב- PDL ללא כל מקטע של המדגם.
מודלים מורין נמצאים בשימוש נרחב עבור ניסויים in-vivo ברפואה, ביולוגיה התפתחותית, אספקת תרופות ומחקרים מבניים. הם יכולים להיות מהונדסים גנטית כדי לחסל או לשפר חלבונים ספציפיים ותפקוד; הם מספקים שליטה התפתחותית מהירה, חוזרת וצפויה; הם גם קלים לדימוי בגלל גודלם הקטן8. למרות היתרונות הרבים שלהם, מודלים עכבר במחקר שיניים אינם משמשים לעתים קרובות, במיוחד כאשר מניפולציות קליניות מוצדקות, בעיקר בשל השיניים בגודל קטן. דגמים של בעליחייםכגון חולדות 9,10,11, כלבים12,13, חזירים14,15,16 וקופים17 משמשים לעתים קרובות יותר מאשר עכברים. עם ההתפתחות האחרונה של טכניקות הדמיה ברזולוציה גבוהה, היתרונות של ניצול מודל העכבר כדי לפענח את התהליכים מפותלים OTM הם רבים. נייר זה מציג שיטה ליצירת תנועה mesial של השן הטוחנת בלסת התחתונה עם רמות כוח קבועות המפעילות שיפוץ העצם. רוב הניסויים OTM מכרסמים נעשים maxilla, שכן הניידות של הלסת התחתונה ואת נוכחות הלשון להוסיף רמת מורכבות נוספת. עם זאת, הלסת התחתונה יש יתרונות רבים כאשר שלמות מבנית 3D רצוי. זה יכול להיות מנותח בקלות כמו עצם שלמה; במינים מסוימים ניתן להפריד אותו לשני חמי-לסתות דרך סימפיזיס סיבי; הוא קומפקטי, שטוח ומכיל רק את השיניים ללא כל חללי סינוס. לעומת זאת, המקסילה היא חלק מהגולגולת וקשורה קשר הדוק לאיברים ומבנים אחרים, ולכן יש צורך בניתוח נרחב על מנת לנתח את עצם מכתוש עם השיניים הקשורות.
באמצעות תא לחות בבית יחד עם מערכת טעינה בתוך מיקרו CT ברזולוציה גבוהה המאפשרת שיפור פאזה, פיתחנו שיטה לדמיין רקמות סיביות טריות בתלת מימד כפי שתואר קודם לכן9,18,19,20,21,22,23. רקמות טריות נסרקות מיד לאחר ההקרבה של החיה ללא כל כתמים או קיבעון, אשר מפחית חפצי רקמות, כמו גם שינויים של תכונות ביומכניות. נתונים תלת מימדיים אלה יכולים להיות מנוצלים לניתוחי הפצה וכיוון של הסיבים כמתואר במקומות אחרים19.
שיטת הדמיית הרקמה השלישית כולה השנייה המוצגת כאן מבוססת על ניקוי אופטי של הלסת התחתונה המאפשר הדמיה של סיבי ה- PDL דרך העצם ללא כל חתך. מעניין שזה גם מאפשר הדמיה של סיבי הקולגן של העצם עצמה, אולם זה לא יידונו כאן. באופן כללי, ישנן שתי שיטות לניקוי רקמות. הראשון הוא סליקה מימית שבו המדגם הוא שקוע בתמיסה מימית עם אינדקס שבירה גדול מ 1.4 או באמצעות טבילה פשוטה, hyperhydration או הטמעת הידרוג’ל. עם זאת, שיטה זו מוגבלת ברמת השקיפות, כמו גם בשימור המבני של הרקמה ולכן מחייבת קיבעון של הרקמה. השיטה השנייה אשר מניב דגימות שקופות מאוד ואינו דורש קיבעון היא שיטת סליקה מבוססת ממס24,25. יצרנו שיטת סליקה מבוססת ממס שונה המבוססת על אתיל-3-פנילפרופ-2-אנואט (אתיל קינמאט, ECi) עבור דגימות הלסת התחתונה. לשיטה זו יש את היתרונות של שימוש בחומר ניקוי ברמה של מזון לא רעיל, הצטמקות רקמות מינימלית ושימור חלבונים פלואורסצנטיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
יצירת OTM בעכברים רצויה מאוד בשל הגודל, הגנטיקה ויתרונות הטיפול. השימוש בלסת התחתונה מספק טיפול קל הן מבחינת ניתוח רקמות והן מבחינת הכנה והדמיה לדוגמה. כאן הצגנו שיטה ליצירת OTM עם תנועה תרגום של השן בתוך העצם בתוך 7 ימים של OTM. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן להאריך את משך הזמן הכולל של תנועת השן, שכן…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי NIH (NIDCR R00- DE025053, PI:Naveh). ברצוננו להודות למרכז הרווארד להדמיה ביולוגית על תשתיות ותמיכה. כל הדמויות נוצרות עם biorender.com.
Materials
| 1-mL BD Luer-Lok syringe | BD | 309628 | |
| 1X phosphate buffered saline | VWR Life Sciences | 0780-10L | |
| 200 proof ethanol | VWR Life Sciences | V1016 | |
| Aluminum alloy 5019 wire | Sigma-aldrich | GF15828813 | 0.08 mm diameter wire, length 100th, temper hard. Used as wire ligature around molar. |
| Avizo 9.7 | Thermo Fisher Scientific | N/A | Used to analyze microCT scans |
| Castroviejo Micro Needle Holders | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| Clr Plan-Apochromat 20x/1.0,CorrVIS-IR M27 85mm | Zeiss | N/A | Used for second harmonic generation imaging |
| Cone socket handle, single ended, hand-form | G.Hartzell and son | 126-CSH3 | Handle of the inspection mirror |
| EC Plan-Neofluar 5x/0.16 | Zeiss | 440321-9902 | Used for light-sheet imaging |
| Elipar DeepCure-S LED curing light | 3M ESPE | 76985 | |
| Eppendorf safe-lock tubes, 1.5mL | Eppendorf | 22363204 | |
| Ethyl cinnamate, >= 98% | Sigma-aldrich | W243000-1KG-K | |
| Hypodermic Needle, 27G x 1/2'' | BD | 305109 | |
| Ketathesia 100mg/ml | Henry Schein Animal Health | NDC:11695-0702-1 | |
| KIMWIPES delicate task wipers | Kimberly-Clark | 21905-026 (VWR Catalog number) | Purchased from VWR |
| LightSheet Z.1 dual illumination microscope system | Zeiss | LightSheet Z.1/LightSheet 7 | Used for lightsheet imaging |
| LSM 880 NLO multi-photon microscope | Zeiss | LSM 880 NLO | Used for two-photon imaging |
| MEGAmicro, plane, 5mm dia, SS-Thread | Hahnenkratt | 6220 | Front surface inspectrio mirror |
| MicroCT machine, MicroXCT-200 | Xradia | MICRO XCT-200 | |
| Mini-Colibri | Fine Science Tools | 17000-01 | |
| PermaFlo Flowable Composite | Ultradent | 948 | |
| Procedure platform | N/A | N/A | Custom-made from lab materials |
| Routine stereo micscope M80 | Leica Micosystems | M80 | |
| Sentalloy NiTi open coil spring | TOMY Inc. | A 0.15mm diameter closed NiTi coil with an inner coil diameter of 0.9mm delivers a force of 10g. Similar products can be purchased from Dentsply Sirona. | |
| T-304 stainless steel ligature wire, 0.009'' diameter | Orthodontics | SBLW109 | 0.009''(.23mm) diameter, Soft temper |
| X-Ject E (Xylazine) 100mg/ml | Henry Schein Animal Health | NDC:11695-7085-1 | |
| Z100 Restorative, A2 shade | 3M ESPE | 5904A2 |
References
- Li, Y., et al. Orthodontic tooth movement: The biology and clinical implications. The Kaohsiung Journal of Medical Sciences. 34 (4), 207-214 (2018).
- Meikle, M. C. The tissue, cellular, and molecular regulation of orthodontic tooth movement: 100 years after Carl Sandstedt. European Journal of Orthodontics. 28, 221-240 (2006).
- Krishnan, V., Davidovitch, Z., molecular, Cellular, molecular, and tissue-level reactions to orthodontic force. American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 129 (4), 1-32 (2006).
- Shoji-Matsunaga, A., et al. Osteocyte regulation of orthodontic force-mediated tooth movement via RANKL expression. Scientific Reports. 7 (1), 8753 (2017).
- Oppenheim, A. Tissue changes, particularly of the bone, incident to tooth movement. European Journal of Orthodontics. 29, 2-15 (2007).
- Unnam, D., et al. Accelerated Orthodontics-An overview. Journal of Archives of Oral Biologyogy and Craniofacial Research. 3 (1), 4 (2018).
- von Bohl, M., Kuijpers-Jagtman, A. M. Hyalinization during orthodontic tooth movement : a systematic review on tissue reactions. European Journal of Orthodontics. 31 (1), 30-36 (2009).
- Kirschneck, C., et al. Comparative assessment of mouse models for experimental orthodontic tooth movement. Scientific Reports. 10 (1), 1-12 (2020).
- Naveh, G. R. S., Weiner, S. Initial orthodontic tooth movement of a multirooted tooth: a 3D study of a rat molar. Orthodontics & Craniofacial Research. 18 (3), 134-142 (2015).
- Nakamura, Y., et al. Time-lapse observation of rat periodontal ligament during function and tooth movement, using microcomputed tomography. European Journal of Orthodontics. 30 (3), 320-326 (2008).
- Kawarizadeh, A., Bourauel, C., Jager, A. Experimental and numerical determination of initial tooth mobility and material properties of the periodontal ligament in rat molar specimens. European Journal of Orthodontics. 25 (6), 569-578 (2003).
- Jónsdóttir, S. H., Giesen, E. B. W., Maltha, J. C. Biomechanical behavior of the periodontal ligament of the beagle dog during the first 5 hours of orthodontic force application. European Journal of Orthodontics. 28, 547 (2006).
- Lindhe, J., et al. Experimental breakdown of peri-implant and periodontal tissues. A study in the beagle dog. Clinical Oral Implants Research. 3 (1), 9-16 (1992).
- Salamati, A., et al. Functional tooth mobility in young pigs. Journal of Biomechanics. 104, 109716 (2020).
- Maria, R., et al. An unusual disordered alveolar bone material in the upper furcation region of minipig mandibles: A 3D hierarchical structural study. Journal of Structural Biology. 206 (1), 128-137 (2019).
- Wang, S., et al. The miniature pig: a useful large animal model for dental and orofacial research. Oral Diseases. 10, 1-7 (2007).
- Melsen, B. Tissue reaction to orthodontic tooth movement–a new paradigm. European Journal of Orthodontics. 23 (6), 671-681 (2001).
- Naveh, G. R. S., et al. Direct MicroCT imaging of non-mineralized connective tissues at high resolution. Connective Tissue Research. 55 (1), 52-60 (2014).
- Naveh, G. R. S., et al. Nonuniformity in ligaments is a structural strategy for optimizing functionality. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 9008 (2018).
- Naveh, G. R. S., et al. Tooth periodontal ligament: Direct 3D microCT visualization of the collagen network and how the network changes when the tooth is loaded. Journal of Structural Biology. 181 (2), 108-115 (2013).
- Naveh, G. R. S., et al. Tooth movements are guided by specific contact areas between the tooth root and the jaw bone : A dynamic 3D microCT study of the rat molar. Journal of Structural Biology. 17 (2), 477-483 (2012).
- Naveh, G. R. S., et al. Tooth-PDL-bone complex: Response to compressive loads encountered during mastication -A review. Archives of Oral Biology. 57 (12), 1575-1584 (2012).
- Ben-Zvi, Y., et al. Response of the tooth-periodontal ligament-bone complex to load: A microCT study of the minipig molar. Journal of Structural Biology. 205 (2), 155-162 (2019).
- Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452 (2017).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Taddei, S. R. d. A., et al. Experimental model of tooth movement in mice: A standardized protocol for studying bone remodeling under compression and tensile strains. Journal of Biomechanics. 45 (16), 2729-2735 (2012).
- Nakamura, K., Sahara, N., Deguchi, T. Temporal changes in the distribution and number of macrophage-lineage cells in the periodontal membrane of the rat molar in response to experimental tooth movement. Archives of Oral Biology. 46 (7), 593-607 (2001).
- Rygh, P., et al. Activation of the vascular system: A main mediator of periodontal fiber remodeling in orthodontic tooth movement. American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 89 (6), 453-468 (1986).
- Nagao, M., et al. Vascular endothelial growth factor in cartilage development and osteoarthritis. Scientific Reports. 7 (1), 13027 (2017).
- Licht, A. H., et al. Endothelium-specific Cre recombinase activity in flk-1-Cre transgenic mice. Developmental Dynamics. 229 (2), 312-318 (2004).
- Connizzo, B. K., Naveh, G. R. S. In situ AFM-based nanoscale rheology reveals regional non-uniformity in viscoporoelastic mechanical behavior of the murine periodontal ligament. Journal of Biomechanics. 111, 109996 (2020).
- Connizzo, B. K., et al. Nonuniformity in Periodontal Ligament: Mechanics and Matrix Composition. Journal of Dental Research. 2, 179-186 (2020).
