새로운 정적 플랫폼은 단백질의 세포 내 빠른 광화학 산화(IC-FPOP)라고 불리는 단백질 발자국 기술을 활용하여 네이티브 세포 환경에서 단백질 구조 및 상호 작용 부위를 특성화하는 데 사용됩니다.
질량 분광법(MS)과 결합된 단백질(FPOP)의 빠른 광화학 적 산화는 용매 접근성의 함수로서 단백질 상호 작용, 구조 및 단백질 형성 역학을 심문하는 구조적 프로테오믹스에서 귀중한 도구가 되었습니다. 최근에는 하이드록실 라디칼 단백질 풋 프린팅(HRPF) 기술인 FPOP의 범위가 살아있는 세포 배양에서 단백질 라벨링으로 확장되어 복잡한 세포 환경에서 단백질 상호 작용을 연구할 수 있는 수단을 제공하고 있다. 세포 내 단백질 수정은 세포 내의 모든 단백질 복합 형성을 수반하는 리간드 유도된 구조적 변화 또는 형태 변화에 대한 통찰력을 제공할 수 있다. 단백질 발자국은 관례적인 유량 기반 시스템과 248nm KrF 엑시머 레이저를 사용하여 과산화수소의 광분해를 통해 하이드록실 라디칼을 산출하여 한 세포 샘플에 대해 20분의 분석이 필요합니다. 시간 해결 FPOP 실험을 용이하게 하기 위해 새로운 6웰 플레이트 기반 IC-FPOP 플랫폼의 사용이 개척되었습니다. 현재 시스템에서 단일 레이저 펄스는 FPOP 실험 시간 프레임을 잘 하여 20초의 분석 시간, 60배 감소의 결과로 잘 릿비한 하나의 레이저 펄스를 조사합니다. 이러한 분석 시간이 크게 감소하면 생화학 적 신호 캐스케이드, 단백질 접이식 및 차동 실험 (즉, 약물 이없는 약물 바인딩)과 같은 세포 메커니즘을 시간 의존적 방식으로 연구 할 수 있습니다. 이동식 XY 스테이지(PIXY)가 장착된 플랫폼 인큐베이터라는 제목의 이 새로운 계측기를 통해 사용자는 온도, CO2 및 습도 제어가 가능한 플랫폼 인큐베이터를 사용하여 광학 벤치에서 셀 배양 및 IC-FPOP를 직접 수행할 수 있습니다. 이 플랫폼에는 레이저 빔 가이던스를 위한 포지셔닝 스테이지, 연동 펌프 및 미러 광학도 포함되어 있습니다. 광학 구성, 유량, 일시적인 과도 및 PIXY의 H2 O2농도와 같은 IC-FPOP 조건이 최적화되고 피어 검토를 했습니다. 시스템의 모든 구성 요소를 자동화하면 사람의 조작을 줄이고 처리량을 늘릴 수 있습니다.
단백질 발자국 기술은 단백질의 조직에 대한 심오한 정보를 드러낼 수 있습니다. 이러한 필수 구조 생물학 MS 기반 기술은 질량 분석 도구 상자의 구성 요소입니다. 이들방법은1, 2,3,4를통해 단백질 고차 구조(HOS) 및 시너지 효과를조사한다. 단백질(FPOP)의 빠른 광화학 산화는 하이드록실 라디칼을 사용하여 아미노산5,6(표 1)의용매 접근 측면 사슬을 산화적으로 수정합니다. 이 방법은 과산화수소(H2 O2)의광분해를 위해 248nm에서 엑시머 레이저를 사용하여 하이드록실 라디칼을 생성한다. 이론적으로, 20개의 아미노산 중 19개는 Gly가 외로운 예외인 것으로 산화적으로 변형될 수 있다. 그러나, 하이드록실 라디칼을 가진 아미노산의 다양한 반응성 비율로 인해, 이들의 단지 하위 집합의 변형은 실험적으로 관찰되었습니다. 그러나, 상기 방법은 단백질 서열5의길이에 걸쳐 분석할 가능성이 있다. FPOP는 마이크로초 타임 스케일에서 단백질을 수정하여 빠른 오프 속도와약한 상호 작용을 연구하는 데 유용합니다. 용매 접근성은 리간드 결합 또는 단백질 형성의 변화에 따라 변화하므로, 방법의 힘은 여러 주에서 단백질의 라벨링 패턴의 비교에 있다(즉, 리간드 바운드에 비해 리간드 프리). 그 결과, FPOP는 단백질-단백질 및 단백질-리간드 상호작용 부위 및 규형 변화7,8,9,10의영역을 식별하는 데 성공했다. FPOP 방법은 정제된 단백질 시스템의 연구에서 세포 내 분석으로 확장되었습니다. 세포 내 FPOP(IC-FPOP)는 세포내 천 단백질 이상을 산화적으로 변형하여 프로테오메11,12에걸쳐 구조적 정보를 제공할 수 있다. 기존의 IC-FPOP 플랫폼은 레이저 빔을 지나 셀 단일 파일을 흐르는 유량 시스템을 활용합니다. 이 시스템의 개발은 개별 세포가 레이저 조사에 동등한 노출을 허용하는 것을 허용했습니다. 이로 인해 산화적으로 표지된단백질(12)의수가 13배 상승했다. 그러나, 유량 시스템의 제한은 10분 조사 간격으로 구성된 단일 샘플 실험의 길이이며, 그 동안 수정이 이루어지고 추가10분 세척 주기가 이루어진다. IC-FPOP의 시간 제약은 생화학 신호 캐스케이드의 상호 작용 네트워크 사이에 존재하는 짧은 수명 단백질 접이식 중간체 또는 변경을 연구하기에 적합하지 않습니다. 이러한 시간적 제한은 더 높은 처리량을 갖춘 새로운 IC-FPOP 플랫폼의 설계에 영감을 주어.
네이티브 셀 환경에서 단백질 고차 구조를 정확하게 측정하기 위해 새로운 설계를 통해 레이저 플랫폼에서 직접 세포 배양을 수행할 수 있으므로 IC-FPOP가 높은 처리량을 가능하게 합니다. 이 설정은 또한 부착 된 세포가 기판에서 제거되어야하는 흐름을 사용하여 IC-FPOP와는 달리 세포 환경에 대한 경구를 최소화 할 수 있습니다. 새로운 플랫폼은 IC-FPOP가 CO2 및 온도 제어 단계 상단 챔버를 사용하여 멸균 인큐베이션 시스템에서 발생하도록 허용하면서 레이저 빔 안내를 위한 구성된 미러 광학, XY 모션을 위한 포지셔닝 시스템 및 화학 물질 교환용 연동 펌프를 활용합니다. IC-FPOP을 수행하기위한 새로운 플랫폼은 이동식 XY 단계 (PIXY)와플랫폼 인큐베이터 (그림 1)입니다. PIXY에서 IC-FPOP는 플랫폼 인큐베이터 챔버 내에서 6웰 플레이트에서 재배된 인간 세포에서 수행됩니다. 이러한 구성을 위해 레이저 빔은 빔 호환 거울을 사용하여 플레이트에 하향 반사되어 인큐베이터를 보유하는 위치 단계로서 XY 평면에서 이동하므로 레이저 빔은 전략적으로 정렬되어 한 번에 하나만 조사하도록 조정됩니다. 유효성 검사 연구에 따르면 IC-FPOP는 유동 시스템보다 PIXY에서 더 빠르게 수행될 수 있으며 단백질당 아미노산 변형이 증가합니다. 이 새로운 IC-FPOP 플랫폼의 개발은 셀룰러실험13에서얻을 수있는 지식을 설명합니다.
단백질은 살아있는 세포에서 많은 일을 능력을 발휘합니다. 이러한 중요성을 감안할 때, 세포 환경에서 단백질 기능 및 고차 구조(HOS)에 대한 상세한 데이터는 정제 시스템과는 달리 세포의 복잡성과 효소 반응에 대한 이해를 심화하는 데 필요합니다. 이를 위해, 하이드록실 라디칼 단백질 풋 프린팅(HRFP) 방법은 단백질(IC-FPOP)의 세포 내 고속 광화학 산화(IC-FPOP)라는 제목의 방법을 채택하였다. 대부분의 FPOP 연구는 상대적으로 순수한 단백질 시스템에서 시험관내에서 수행되었으며, 이는 결합 상호 작용과 단백질 형성 역학에 영향을 미치는 혼잡한 분자 환경과 현저하게 대조됩니다. 그 결과, 체외 실험(18)과 실제 세포 환경에서 얻을 수 있는 실험 사이의 차이가 있다. 시험관 내 FPOP 실험의 이상화된 조건과 세포의 복잡한 특성 사이의 격차를 해소하기 위해 셀-FPOP 플랫폼에서 새로운 자동화된 6웰 플레이트 기반플레이트 기반이 개발되었습니다. 이 새로운 FPOP 기술은 이러한 분자 종을 식별하고 특성화하고 건강하고 병에 걸린 상태에서 동적 분자 상호 작용을 추적 할 수 있습니다. 이 새로운 플랫폼은 이동식 XY 단계(PIXY)가 있는 플랫폼 인큐베이터라고 합니다.
FPOP는 프로테오메 내의 구조적 정보를 특성화하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 그러나, 모든 생물학적 기술은 추가 개선을 필요로 하는 특정 한계가 있습니다. 레이저 광분해 중에 특정 시약이 필요하며 반응하지 않은 하이드록실 라디칼을 효율적으로 담금질해야 합니다. 소화 된 펩티드의 분리는 구조적 정보를 극대화하기 위해 많은 시간이 필요할 수 있습니다. 이러한 풍부한 정보는 MS 이후 데이터 분석1에서 광범위한 수량을 요구할 수도 있습니다. 레이저 플랫폼에서 세포 배양 및 IC-FPOP에 필요한 주변 기계와 IC-FPOP을 포함한 플랫폼 인큐베이터는 일부 실험실에서 실현 가능하지 않을 수 있는 큰 비용이 함께 제공됩니다. 진전이 계속됨에 따라 강력한 소프트웨어 및 분석 도구는 기술을 더 발전시켜야 합니다. 그 중 일부는 이 연구에서 소개됩니다. 이 플랫폼 인큐베이터의 현재 연구는 HEK293T 세포와 C. elegans에서수행되었습니다. IC-FPOP 방법은 중국 햄스터 난소(CHO), 베로, MCF-7 및 MCF10-A세포(19)를포함한 다양한 세포주와 호환되는 것으로 나타났다. 일반적인 IC-FPOP 방법은 이 정적 플랫폼으로 번역할 수 있기 때문에 이러한 세포주도 PIXY를 사용하여 연구에 적합해야 합니다.
IC-FPOP는 H2O2를 사용하여 아미노산의 용매 접근 가능한 측면 사슬을 산화적으로 수정한 다음 생물학적 맥락을 제공하는 데 중요한 실행 가능한 세포 내에서 단백질 상호 작용, 구조 및 대사 효과를 추가로 분별합니다. IC-FPOP 실험 전에 세포가 H2O2 첨가 후 실행 가능한지 확인하는 것이 필수적입니다. 세포 생존성 연구는 세포가 최대 200mMMM 13까지H2O2 농도의 존재에서 실행 가능하다는 것을 입증하였다. 또한H2O2가 미디어를 제거한 후 세포에 직접 200mMM의 최종 농도로 주입되는지 확인하는 것도 중요합니다. 세포 배양 매체를 완전히 제거하지 못하면 H2O2의농도가 다양하게 발생합니다. 표준 조건에 비해, H 2O2 농도증가와 함께인큐베이션 시간을 10초로 증가시켜 플랫폼 인큐베이터에서 IC-FPOP에 의해 변형된 단백질의 수가 증가하였다. 펌프가 제대로 작동하고 액체가 분산되고 있는지 확인하기 위해 사용하기 전에 정연성 펌프를 프라임하는 것이 필수적입니다. 그렇게 하지 않으면 튜브에 기포가 부족하거나 H2 O2의부피가 부족하여 세포를 침지하거나 담금질 용액의 부피가 부족할 수 있습니다.
발생할 수 있는 또 다른 문제는 시스템에서 원치 않는 지연입니다. 예를 들어 통합 소프트웨어를 사용하여 1000밀리초 이상의 순서에 상당한 지연이 추가되는 펌프 시스템에 대해 수신된 명령을 확인하는 프로세스입니다. 이 문제는 실험 중에 펌프와의 통신을 최소화하고 가능한 한 미리 설정된 명령을 사용하여 해결할 수 있습니다.
앞으로 PIXY의 목표는 완전히 자동화되고 통합된 시스템을 생산하는 것입니다. 연동 펌프 외에도 레이저 펄스의 트리거링이 자동화됩니다. 새로운 포지셔닝 시스템은 속도와 정확성을 향상시키기 위해 플랫폼 인큐베이터의 빠른 움직임에도 활용될 것입니다. 시스템의 모든 구성 요소는 처리량을 더욱 늘리기 위해 통합 소프트웨어를 사용하여 계속 프로그래밍됩니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작업은 NIH R01 GM128983-01의 보조금에 의해 지원되었습니다.
Ismatec Reglo ICC Peristaltic Pumps | Cole-Palmer | 122270050 | |
Kinematic Mirror Mount for Ø2" Optics | Thor Labs | ||
10X trypsin−EDTA | Corning | AB00490-00005 | |
50.0mm 248nm 45°, Excimer Laser Line Mirror | Edmond Optics | ||
Acetone, HPLC Grade | Fisher Scientific | ||
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | ||
ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100Å, 5 µm, 180 µm x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg | Waters | 23275 | other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used |
ACQUITY UPLC M-Class System | Waters | A53225 | |
Afinia H480 3D Printer | (Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library) | ||
air pump | OKOlabs | D12345 | |
Aluminum Foil | Fisher Scientific | Stock #63-120 | |
Aqua 5 µm C18 125 Å packing material | Phenomenex | ||
carbon dioxide unit | OKOlabs | MadMotor®-UHV | |
Centrifuge | Eppendorf | ||
connectors (Y PP 1/16” and 1/16×1/8”) | Cole-Palmer | 116891000 | |
Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 022625501 | |
Dithiothreiotol (DTT) | AmericanBio | ||
DMSO, Anhydrous | Invitrogen | LS118-500 | |
Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Corning | SK-78001-82 | |
EX350 excimer laser | GAM Laser | PI89900 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Corning | SK-12023-78 | |
Formic Acid, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A929-4 | 4 L quantity is not necessary |
HEK293T cells | Paul Shapiro Lab (University of Maryland Baltimore) | ||
humidifier | OKOlabs | Nano-LPMW stage | |
HV3-2 VALVE | Hamilton | BP152-500 | |
Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | LS120-500 | |
Iodoacetamide (IAA) | ACROS Organics | ||
LABVIEW Professional 2018 | National Instruments | 86728 | |
MadMotor Positioning system and controllers | Mad City Labs | W6-4 | |
Methanol, LC/MS Grade | Fisher Scientific | 01-213-100 | any brand is sufficient |
Microcentrifuge | Thermo Scientific | H301-T Unit-BL-PLUS | |
N,N′-Dimethylthiourea (DMTU) | ACROS Organics | ||
Nanopositioinging stage | Mad City Labs | ||
N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN) | ACROS Organics | ||
OKO Touch Monitoring System | OKOlabs | ||
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | 7Z02936 | |
PE50-C pyroelectric energy meter | Ophir Optronics | ||
Penicillin-streptomycin | Corning | ||
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | ||
Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | ||
Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Scientific | 75002436 | |
Pierce Universal Nuclease for Cell Lysis | Fisher Scientific | 06-666A | |
pressure gauge | OKOlabs | OKO-AIR-PUMP-BL | |
PTFE filter | OKOlabs | CO2-UNIT-BL | |
Six 33 mm PLA filament rings | (Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library) | ||
sterile incubator | OKOlabs | ||
temperature unit | OKOlabs | OKO-TOUCH | |
Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer | Fisher Scientific | A117-50 | |
TiNKERcad | (Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library) | ||
Tris Base | Fisher Scientific | H325-100 | any 30% hydrogen peroxide is sufficient |
tubing (Tygon 3.18 and 1.59 ID) | Cole-Palmer | 177350250 | |
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | A454SK-4 | 4 L quantity is not necessary |
Water, LC/MS Grade | Fisher Scientific | 88702 | |
90058 | |||
KM200 | |||
186007496 |