一种新的静态平台用于利用一种称为蛋白质细胞内快速光化学氧化(IC-FPOP)的蛋白质足迹技术,对原生细胞环境中的蛋白质结构和相互作用部位进行特征。
蛋白质的快速光化学氧化(FPOP)与质谱(MS)已成为结构蛋白质组学中一种宝贵的工具,将蛋白质相互作用、结构和蛋白质构象动力学作为溶剂可访问性的函数。近年来,FPOP(一种羟基基蛋白足印(HRPF)技术)的范围已扩大到活细胞培养中的蛋白质标签,为研究复杂细胞环境中的蛋白质相互作用提供了手段。细胞内蛋白质修饰可以深入了解配体诱导的结构变化或伴随蛋白质复合形成的构象变化,所有这些都在细胞环境中。蛋白质足迹利用惯常的基于流量的系统和248纳米KrF除菌激光通过过氧化氢的光解产生羟基基,需要20分钟的分析才能获得一个细胞样本。为了便于进行时间解决的FPOP实验,率先采用了基于6井板的IC-FPOP平台。在目前的系统中,单个激光脉冲照射整个井,从而截断FPOP实验时间框架,导致20秒的分析时间,减少60倍。这大大缩短了分析时间,使得以时间依赖的方式研究细胞机制(如生化信号级联、蛋白质折叠和微分实验(即无药物与药物结合)成为可能。这种名为”可移动XY阶段平台孵化器”(PIXY)的新仪器允许用户使用温度、CO2 和湿度控制的平台孵化器直接在光学台上执行细胞培养和 IC-FPOP。该平台还包括定位阶段、永久泵和用于激光束制导的镜面光学。对 PIXY 中的光学配置、流速、瞬态瞬变和 H2O2 浓度等 IC-FPOP 条件进行了优化和同行评审。系统所有组件的自动化将减少人工操作并增加吞吐量。
蛋白质足迹技术可以揭示蛋白质组织的深刻信息。这些基于MS的基本结构生物学技术是质谱工具箱的组成部分。这些方法通过共价标记1、2、3、4来探测蛋白质的更高阶结构(HOS)和协同作用。蛋白质的快速光化学氧化 (FPOP) 使用羟基基氧化改变氨基酸的溶剂可访问侧链5,6 (表 1)。该方法利用248纳米的兴奋激光对过氧化氢(H 2 O2)进行光解,以产生羟基基。从理论上讲,20种氨基酸中,有19种可以氧化改性,而Gly是唯一的例外。然而,由于氨基酸与羟基基的抗反应率不同,实验中只观察到其中一部分的改性。尽管如此,该方法仍有分析蛋白质序列5的长度的潜力。FPOP 在微秒时间尺度上修改蛋白质,使其有助于研究与快速关闭速率的弱相互作用。溶剂可访问性在配体结合或蛋白质构象变化时发生变化,因此,该方法的威力在于比较多种状态下蛋白质的标签模式(即与配体绑定相比无配体)。因此,FPOP成功地识别了蛋白质-蛋白质和蛋白质-脂的相互作用位点和构象变化7、8、9、10的区域。FPOP方法已从纯化蛋白系统研究扩展到细胞内分析。细胞内FPOP(IC-FPOP)可以氧化地改变细胞中的一千多个蛋白质,从而在蛋白质组11、12之间提供结构信息。传统的IC-FPOP平台利用流系统将单个文件流过激光束。该系统的开发使单个细胞能够平等地暴露在激光照射下。这导致氧化标记的蛋白质数量增加了13倍。但是,流量系统的局限性是单个示例实验的长度,包括 10 分钟的辐照间隔,在此期间进行修改,并增加 10 分钟的洗涤周期。IC-FPOP 的时间限制使得它不适合研究短寿命蛋白质折叠中间体或生化信号级联中交互网络之间存在的变化。这种时间限制启发了配备更高吞吐量的新型 IC-FPOP 平台的设计。
为了准确测量原生细胞环境中的蛋白质高阶结构,新设计允许在激光平台上直接完成细胞培养,使IC-FPOP的吞吐量更高。此设置还允许最大限度地减少对蜂窝环境的扰动,与IC-FPOP相比,使用必须从基板中去除粘附细胞的流量。新平台允许IC-FPOP在无菌孵化系统中使用CO2 和温度控制的阶段顶室进行,同时利用配置的镜面光学进行激光束制导,XY运动的定位系统和用于化学交换的永久泵。进行IC-FPOP的新平台名为”可移动XY阶段平台孵化器”(PIXY)(图1)。在 PIXY 中,IC-FPOP 在平台孵化器室内六井板中生长的人体细胞上进行。对于此配置,激光束使用光束兼容的反射镜向下反射到板上,作为在 XY 平面中保持孵化器移动的定位阶段,因此激光束战略性地对齐,一次只照射一口井。验证研究表明,IC-FPOP在PIXY中的执行速度比在流动系统中快,并导致每蛋白质氨基酸的改性增加。这个新的IC-FPOP平台的开发将阐述从细胞实验13中可以获得的知识。
蛋白质在活细胞中执行大部分工作。鉴于这一重要性,需要详细的数据蛋白质功能和细胞环境中的更高阶结构(HOS),以加深对较大复合体的复杂性和细胞酶反应的理解,而不是纯化系统。为此,采用了一种羟基基蛋白足印(HRFP)方法,名为细胞内快速光化学蛋白质氧化(IC-FPOP)。大多数FPOP研究 都是在 相对纯净的蛋白质系统中进行的体外研究,这与影响结合相互作用和蛋白质构象动力学的拥挤的分子环境形成鲜明对比。因此,体 外 实验18 的发现与在实际细胞环境中获得的发现之间存在鸿沟。为了弥合 体外 FPOP实验理想化条件与细胞复杂性质之间的差距,开发了基于细胞-FPOP的新型自动化六井板平台。这种新型的FPOP技术能够识别和描述这些分子物种,并在健康和疾病状态中追踪它们的动态分子相互作用。此新平台称为具有可移动 XY 阶段 (PIXY) 的平台孵化器。
FPOP 已成功用于描述蛋白组内的结构信息。然而,每种生物技术都有一定的局限性,需要进一步改进。在激光光解过程中需要特定的试剂,并有效淬灭未经反应的水解基。消化肽的分离可能需要大量的时间才能最大限度地利用结构信息。在MS后数据分析1中,这些丰富的信息也可能需要广泛的量化。平台孵化器,包括激光平台细胞培养和IC-FPOP所需的外围机械,成本高,对于一些实验室来说可能不可行。随着进展的继续,强大的软件和分析工具应进一步推进技术:其中一些在这项研究中进行了展示。目前在这个平台孵化器的研究已经在HK293T细胞和 C.电子根进行。IC-FPOP方法已被证明与各种细胞系兼容,包括中国仓鼠卵巢(CHO)、维罗、MCF-7和MCF10-A细胞19。由于一般IC-FPOP方法可翻译为此静态平台,因此这些细胞系也应适合使用PIXY进行研究。
IC-FPOP 利用 H2O2氧化性地修改溶剂中容易获得的氨基酸侧链,然后进一步辨别可行细胞内的蛋白质相互作用、结构和代谢效应,这对提供生物环境具有重要意义。在IC-FPOP实验之前,必须确认H 2O 2添加后的细胞是可行的。细胞生存能力研究表明,在H2O2浓度高达200mM13的情况下,这些细胞是可行的。此外,在去除介质后,确保 H2O2在最终浓度为 200 mM 时直接注入细胞也很重要。如果不能完全去除细胞培养介质,会导致H2O2浓度的不同。与标准条件相比,将孵化时间增加到 10 秒,同时增加 H2O2浓度,导致 IC-FPOP 在平台孵化器中修改的蛋白质数量增加。在使用前必须使用主要的围网泵,以确保泵正常工作,液体被分散。否则可能导致管内气泡、H2O2的体积不足和/或淬当溶液体积不足。
可能出现的另一个问题是系统中不必要的延迟。这方面的一个例子是验证泵系统接收的命令的过程,这增加了使用集成软件的 1000 毫秒或更多毫秒顺序的重大延迟。这个问题可以通过在实验期间尽量减少与泵的通信和尽可能提前使用预设命令来解决。
今后,PIXY 的目标是生产一个全自动和集成的系统。除了围流泵外,激光脉冲的触发也将实现自动化。还将利用新的定位系统快速移动平台孵化器,以提高速度和准确性。系统的所有组件将继续使用集成软件进行编程,以进一步提高吞吐量。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了NIH R01 GM128983-01的资助。
Ismatec Reglo ICC Peristaltic Pumps | Cole-Palmer | 122270050 | |
Kinematic Mirror Mount for Ø2" Optics | Thor Labs | ||
10X trypsin−EDTA | Corning | AB00490-00005 | |
50.0mm 248nm 45°, Excimer Laser Line Mirror | Edmond Optics | ||
Acetone, HPLC Grade | Fisher Scientific | ||
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | ||
ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100Å, 5 µm, 180 µm x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg | Waters | 23275 | other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used |
ACQUITY UPLC M-Class System | Waters | A53225 | |
Afinia H480 3D Printer | (Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library) | ||
air pump | OKOlabs | D12345 | |
Aluminum Foil | Fisher Scientific | Stock #63-120 | |
Aqua 5 µm C18 125 Å packing material | Phenomenex | ||
carbon dioxide unit | OKOlabs | MadMotor®-UHV | |
Centrifuge | Eppendorf | ||
connectors (Y PP 1/16” and 1/16×1/8”) | Cole-Palmer | 116891000 | |
Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 022625501 | |
Dithiothreiotol (DTT) | AmericanBio | ||
DMSO, Anhydrous | Invitrogen | LS118-500 | |
Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Corning | SK-78001-82 | |
EX350 excimer laser | GAM Laser | PI89900 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Corning | SK-12023-78 | |
Formic Acid, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A929-4 | 4 L quantity is not necessary |
HEK293T cells | Paul Shapiro Lab (University of Maryland Baltimore) | ||
humidifier | OKOlabs | Nano-LPMW stage | |
HV3-2 VALVE | Hamilton | BP152-500 | |
Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | LS120-500 | |
Iodoacetamide (IAA) | ACROS Organics | ||
LABVIEW Professional 2018 | National Instruments | 86728 | |
MadMotor Positioning system and controllers | Mad City Labs | W6-4 | |
Methanol, LC/MS Grade | Fisher Scientific | 01-213-100 | any brand is sufficient |
Microcentrifuge | Thermo Scientific | H301-T Unit-BL-PLUS | |
N,N′-Dimethylthiourea (DMTU) | ACROS Organics | ||
Nanopositioinging stage | Mad City Labs | ||
N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN) | ACROS Organics | ||
OKO Touch Monitoring System | OKOlabs | ||
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | 7Z02936 | |
PE50-C pyroelectric energy meter | Ophir Optronics | ||
Penicillin-streptomycin | Corning | ||
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | ||
Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | ||
Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Scientific | 75002436 | |
Pierce Universal Nuclease for Cell Lysis | Fisher Scientific | 06-666A | |
pressure gauge | OKOlabs | OKO-AIR-PUMP-BL | |
PTFE filter | OKOlabs | CO2-UNIT-BL | |
Six 33 mm PLA filament rings | (Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library) | ||
sterile incubator | OKOlabs | ||
temperature unit | OKOlabs | OKO-TOUCH | |
Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer | Fisher Scientific | A117-50 | |
TiNKERcad | (Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library) | ||
Tris Base | Fisher Scientific | H325-100 | any 30% hydrogen peroxide is sufficient |
tubing (Tygon 3.18 and 1.59 ID) | Cole-Palmer | 177350250 | |
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | A454SK-4 | 4 L quantity is not necessary |
Water, LC/MS Grade | Fisher Scientific | 88702 | |
90058 | |||
KM200 | |||
186007496 |