Una nueva plataforma estática se utiliza para caracterizar la estructura proteica y los sitios de interacción en el entorno celular nativo utilizando una técnica de huella proteica llamada oxidación fotoquímica rápida en células de proteínas (IC-FPOP).
La oxidación fotoquímica rápida de proteínas (FPOP) junto con la espectrometría de masas (EM) se ha convertido en una herramienta invaluable en la proteómica estructural para interrogar interacciones proteicas, estructura y dinámicas de conformación de proteínas en función de la accesibilidad a los disolventes. En los últimos años, el alcance de FPOP, una técnica de impresión de pies de proteína de radical hidroxilo (HRPF), se ha ampliado al etiquetado de proteínas en cultivos celulares vivos, proporcionando los medios para estudiar las interacciones proteicas en el entorno celular enrevesado. Las modificaciones de proteínas en las células pueden proporcionar información sobre los cambios estructurales inducidos por ligando o los cambios de conformación que acompañan la formación compleja de proteínas, todo dentro del contexto celular. Se ha logrado la huella proteica empleando un sistema basado en flujo habitual y un láser de excitador KrF de 248 nm para producir radicales hidroxilos mediante fotolisis de peróxido de hidrógeno, requiriendo 20 minutos de análisis para una muestra celular. Para facilitar experimentos FPOP resueltos en el tiempo, se fue pionero en el uso de una nueva plataforma IC-FPOP basada en placas de 6 pozos. En el sistema actual, un solo pulso láser irradia un pozo entero, lo que trunca el marco de tiempo experimental FPOP, lo que resulta en 20 segundos de tiempo de análisis, una disminución de 60 veces. Este tiempo de análisis muy reducido permite investigar mecanismos celulares como cascadas de señalización bioquímica, plegado de proteínas y experimentos diferenciales (es decir, libres de drogas frente a fármacos) de una manera dependiente del tiempo. Esta nueva instrumentación, titulada Incubadora de plataforma con etapa XY móvil (PIXY), permite al usuario realizar cultivo celular e IC-FPOP directamente en el banco óptico utilizando una incubadora de plataforma con temperatura, CO2 y control de humedad. La plataforma también incluye una etapa de posicionamiento, bombas peristálticas y óptica de espejo para la orientación del rayo láser. Las condiciones IC-FPOP tales como la configuración óptica, los caudales, las transcciones transitorias, y la concentración H2O2 en PIXY se han optimizado y revisado por pares. La automatización de todos los componentes del sistema reducirá la manipulación humana y aumentará el rendimiento.
Las técnicas de huella proteica pueden revelar información profunda sobre la organización de proteínas. Estas técnicas esenciales basadas en EM de biología estructural son un componente de la caja de herramientas de espectrometría de masas. Estos métodos sondean la estructura de orden superior de proteínas (HOS) y la sinergia a través del etiquetado covalente1,2,3,4. La oxidación fotoquímica rápida de las proteínas (FPOP) emplea radicales hidroxilos para modificar oxidativamente las cadenas laterales accesibles al disolvente de los aminoácidos5,6 (Tabla 1). El método utiliza un láser de excitación a 248 nm para la fotolisis de peróxido de hidrógeno (H2O2)para generar radicales hidroxilos. Teóricamente, 19 de los 20 aminoácidos pueden ser modificados oxidativamente con Gly siendo la única excepción. Sin embargo, debido a las diferentes tasas de reactividad de los aminoácidos con radicales hidroxilos, modificación de sólo un subconjunto de estos se ha observado experimentalmente. Aún así, el método tiene el potencial de análisis a lo largo de la longitud de una secuencia deproteínas 5. FPOP modifica las proteínas en la escala de tiempo del microsegundo, por lo que es útil para estudiar interacciones débiles con velocidades de apagado rápido. La accesibilidad al disolvente cambia en la unión de ligando o un cambio en la conformación de proteínas, por lo tanto, el poder del método radica en la comparación del patrón de etiquetado de una proteína en múltiples estados (es decir, libre de ligando en comparación con el ligando). Como resultado, FPOP ha tenido éxito en la identificación de sitios de interacción proteína-proteína y ligando proteínas y regiones de cambio conformacional7,8,9,10. El método FPOP se ha extendido desde el estudio de sistemas de proteínas purificadas hasta el análisis en células. FPOP en células (IC-FPOP) puede modificar oxidativamente más de mil proteínas en las células para proporcionar información estructural a través del proteoma11,12. La plataforma IC-FPOP convencional utiliza un sistema de flujo para fluir las celdas un solo archivo más allá del rayo láser. El desarrollo de este sistema permitió que las células individuales tuvieran la misma exposición a la irradiación láser. Esto condujo a un aumento de 13 veces en el número de proteínas etiquetadas oxidativamente12. Sin embargo, una limitación del sistema de flujo es la longitud de un único experimento de muestra que consiste en un intervalo de irradiación de 10 minutos durante el cual se produce una modificación y un ciclo de lavado adicional de 10 minutos. Las limitaciones de tiempo de IC-FPOP hacen que no sea adecuado para estudiar intermedios plegables de proteínas de corta duración o cambios que existen entre las redes de interacción en cascadas de señalización bioquímica. Esta limitación temporal inspiró el diseño de una nueva plataforma IC-FPOP equipada con mayor rendimiento.
Para medir con precisión la estructura de orden superior de proteínas en el entorno celular nativo, el nuevo diseño permite que el cultivo celular se realice directamente en la plataforma láser, lo que permite que IC-FPOP tenga un alto rendimiento. Esta configuración también permite minimizar las perturbaciones al entorno celular, a diferencia de IC-FPOP utilizando el flujo donde las células adherentes deben ser eliminadas del sustrato. La nueva plataforma permite que IC-FPOP se produzca en un sistema de incubación estéril utilizando una cámara superior de etapa controlada por temperatura y CO2 mientras utiliza óptica de espejo configurada para la guía de haz láser, un sistema de posicionamiento para movimiento XY y bombas peristálticas para intercambio químico. La nueva plataforma para la realización de IC-FPOP se titula Incubadora de Plataformas con Etapa XY Móvil (PIXY) (Figura 1). En PIXY, IC-FPOP se lleva a cabo en células humanas cultivadas en placas de seis pozos dentro de la cámara de incubadora de plataforma. Para esta configuración, el rayo láser se refleja hacia abajo en la placa utilizando espejos compatibles con vigas como una etapa de posicionamiento que sostiene la incubadora se mueve, en el plano XY, por lo que el rayo láser está estratégicamente alineado para irradiar sólo un pozo a la vez. Los estudios de validación demuestran que IC-FPOP se puede realizar más rápido en PIXY que en el sistema de flujo y conduce a mayores modificaciones de aminoácidos por proteína. El desarrollo de esta nueva plataforma IC-FPOP expondrá el conocimiento que se puede obtener de los experimentos celulares13.
Las proteínas realizan gran parte del trabajo en células vivas. Dada esta importancia, se necesitan datos detallados sobre la función proteica y la estructura de orden superior (HOS) en el entorno celular para profundizar la comprensión de los entresijos en complejos más grandes y reacciones enzimáticas en las células en lugar de sistemas purificados. Para ello, se adoptó un método de impresión de pies de proteína de radical hidroxilo (HRFP) titulado Oxidación fotoquímica rápida en células de proteínas (IC-FPOP). La mayoría de los estudios de FPOP se han realizado in vitro en sistemas proteicos relativamente puros, lo que contrasta notablemente con el ambiente molecular lleno de gente que afecta a las interacciones de unión y la dinámica de conformación de proteínas. Como resultado, hay un abismo entre los hallazgos de los experimentos in vitro 18 y los que se obtendrían en un entorno celular real. Para cerrar la brecha entre las condiciones idealizadas de un experimento FPOP in vitro y la naturaleza compleja de la célula, se ha desarrollado una nueva plataforma automatizada de seis pozos basada en placas en células-FPOP. Esta novedosa tecnología FPOP es capaz de identificar y caracterizar estas especies moleculares y rastrear sus interacciones moleculares dinámicas tanto en estados sanos como enfermos. Esta nueva plataforma se llama Incubadora de Plataforma con etapa XY Móvil (PIXY).
FPOP se ha utilizado con éxito para caracterizar la información estructural dentro del proteoma. Sin embargo, cada técnica biológica tiene ciertas limitaciones que requieren una mejora adicional. Se requieren reactivos específicos durante la fotolisis láser y para saciar eficientemente los radicales hidroxilos no reactivos. La separación de péptidos digeridos puede requerir grandes cantidades de tiempo para maximizar la información estructural. Esta gran cantidad de información también puede requerir una cuantificación extensa durante el análisis de datos posteriores a la EM1. La incubadora de plataformas, incluida la maquinaria periférica necesaria para el cultivo celular y IC-FPOP en la plataforma láser, tiene un gran costo que puede no ser factible para algunos laboratorios. A medida que se sigan avanzando, el software robusto y las herramientas de análisis deben seguir avanzando en la técnica; algunos de los cuales se muestran en este estudio. Los estudios actuales en esta incubadora de plataforma se han realizado en células HEK293T y en C. elegans. Se ha demostrado que el método IC-FPOP es compatible con una amplia variedad de líneas celulares, incluyendo ovario de hámster chino (CHO), vero, MCF-7 y células MCF10-A19. Puesto que el método general IC-FPOP es traducible a esta plataforma estática, estas líneas celulares deben ser amenables para el estudio usando PIXY también.
IC-FPOP utiliza H2O2 para modificar oxidativamente cadenas laterales accesibles de disolvente de aminoácidos, para luego discernir aún más las interacciones proteicas, estructura, y efectos metabólicos dentro de las células viables que es significativo en proporcionar contexto biológico. Es esencial antes de un experimento IC-FPOP para confirmar que las células son viables después de la adición H2O2. Los estudios de viabilidad celular demostraron que las células eran viables en presencia de concentraciones H2O2 de hasta 200 mM 13. También es importante asegurarse de que H2O2 está infundido a una concentración final de 200 mM directamente en las células después de que se elimina el medio. Si no se eliminan completamente los medios de cultivo celular, se realizarán concentraciones variables de H2O2. En comparación con las condiciones estándar, aumentar el tiempo de incubación a 10 segundos junto con el aumento de la concentración H2O2 condujo a un mayor número de proteínas modificadas por IC-FPOP en la incubadora de plataformas. Es imperativo preparar bombas peristálticas antes de su uso para garantizar que las bombas funcionen correctamente y que el líquido se disperse. Si no lo hace, puede provocar burbujas de aire en el tubo, un volumen insuficiente de H2O2 para sumergir las células y/o un volumen insuficiente de solución de enfriamiento.
Otro problema que puede surgir son los retrasos no deseados en el sistema. Un ejemplo de esto es el proceso de verificar los comandos recibidos para los sistemas de bomba que agrega retrasos significativos en el orden de 1000 o más milisegundos utilizando el software de integración. Este problema se puede solucionar minimizando la comunicación con las bombas durante el experimento y utilizando comandos preestables con anticipación tanto como sea posible.
En el futuro, el objetivo de PIXY es producir un sistema totalmente automatizado e integrado. Además de las bombas peristálticas, se automatizará la activación del pulso láser. También se utilizará un nuevo sistema de posicionamiento para el rápido movimiento de la incubadora de plataformas para mejorar la velocidad y la precisión. Todos los componentes del sistema seguirán estadándose utilizando el software de integración para aumentar aún más el rendimiento.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por una subvención del NIH R01 GM128983-01.
Ismatec Reglo ICC Peristaltic Pumps | Cole-Palmer | 122270050 | |
Kinematic Mirror Mount for Ø2" Optics | Thor Labs | ||
10X trypsin−EDTA | Corning | AB00490-00005 | |
50.0mm 248nm 45°, Excimer Laser Line Mirror | Edmond Optics | ||
Acetone, HPLC Grade | Fisher Scientific | ||
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | ||
ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100Å, 5 µm, 180 µm x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg | Waters | 23275 | other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used |
ACQUITY UPLC M-Class System | Waters | A53225 | |
Afinia H480 3D Printer | (Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library) | ||
air pump | OKOlabs | D12345 | |
Aluminum Foil | Fisher Scientific | Stock #63-120 | |
Aqua 5 µm C18 125 Å packing material | Phenomenex | ||
carbon dioxide unit | OKOlabs | MadMotor®-UHV | |
Centrifuge | Eppendorf | ||
connectors (Y PP 1/16” and 1/16×1/8”) | Cole-Palmer | 116891000 | |
Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 022625501 | |
Dithiothreiotol (DTT) | AmericanBio | ||
DMSO, Anhydrous | Invitrogen | LS118-500 | |
Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Corning | SK-78001-82 | |
EX350 excimer laser | GAM Laser | PI89900 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Corning | SK-12023-78 | |
Formic Acid, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A929-4 | 4 L quantity is not necessary |
HEK293T cells | Paul Shapiro Lab (University of Maryland Baltimore) | ||
humidifier | OKOlabs | Nano-LPMW stage | |
HV3-2 VALVE | Hamilton | BP152-500 | |
Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | LS120-500 | |
Iodoacetamide (IAA) | ACROS Organics | ||
LABVIEW Professional 2018 | National Instruments | 86728 | |
MadMotor Positioning system and controllers | Mad City Labs | W6-4 | |
Methanol, LC/MS Grade | Fisher Scientific | 01-213-100 | any brand is sufficient |
Microcentrifuge | Thermo Scientific | H301-T Unit-BL-PLUS | |
N,N′-Dimethylthiourea (DMTU) | ACROS Organics | ||
Nanopositioinging stage | Mad City Labs | ||
N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN) | ACROS Organics | ||
OKO Touch Monitoring System | OKOlabs | ||
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | 7Z02936 | |
PE50-C pyroelectric energy meter | Ophir Optronics | ||
Penicillin-streptomycin | Corning | ||
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | ||
Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | ||
Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Scientific | 75002436 | |
Pierce Universal Nuclease for Cell Lysis | Fisher Scientific | 06-666A | |
pressure gauge | OKOlabs | OKO-AIR-PUMP-BL | |
PTFE filter | OKOlabs | CO2-UNIT-BL | |
Six 33 mm PLA filament rings | (Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library) | ||
sterile incubator | OKOlabs | ||
temperature unit | OKOlabs | OKO-TOUCH | |
Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer | Fisher Scientific | A117-50 | |
TiNKERcad | (Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library) | ||
Tris Base | Fisher Scientific | H325-100 | any 30% hydrogen peroxide is sufficient |
tubing (Tygon 3.18 and 1.59 ID) | Cole-Palmer | 177350250 | |
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | A454SK-4 | 4 L quantity is not necessary |
Water, LC/MS Grade | Fisher Scientific | 88702 | |
90058 | |||
KM200 | |||
186007496 |