Une nouvelle plate-forme statique est utilisée pour caractériser la structure protéique et les sites d’interaction dans l’environnement cellulaire indigène en utilisant une technique d’empreinte protéique appelée oxydation photochimique rapide des protéines (IC-FPOP).
L’oxydation photochimique rapide des protéines (FPOP) couplée à la spectrométrie de masse (SEP) est devenue un outil précieux dans la protéomique structurale pour interroger les interactions protéiques, la structure et la dynamique conformationnelle des protéines en fonction de l’accessibilité des solvants. Ces dernières années, la portée de FPOP, une technique d’impression de pieds de protéine radicale hydroxyle (HRPF), a été étendue à l’étiquetage des protéines dans les cultures cellulaires vivantes, fournissant les moyens d’étudier les interactions protéiques dans l’environnement cellulaire alambiqué. Les modifications des protéines dans les cellules peuvent donner un aperçu des changements structurels induits par la ligand ou des changements conformationnels accompagnant la formation complexe protéique, le tout dans le contexte cellulaire. L’empreinte protéique a été réalisée à l’aide d’un système coutumier basé sur le débit et d’un laser excimère KrF de 248 nm pour produire des radicaux hydroxyles par photolyse de peroxyde d’hydrogène, nécessitant 20 minutes d’analyse pour un échantillon de cellules. Pour faciliter les expériences FPOP résolues dans le temps, l’utilisation d’une nouvelle plate-forme IC-FPOP à base de plaques à 6 puits a été lancée. Dans le système actuel, une seule impulsion laser irradère un puits entier, ce qui tronque le délai expérimental FPOP, ce qui entraîne 20 secondes de temps d’analyse, soit une diminution de 60 fois. Ce temps d’analyse considérablement réduit permet de rechercher des mécanismes cellulaires tels que des cascades biochimiques de signalisation, le pliage des protéines et des expériences différentielle (c.-à-d. sans drogue par rapport aux médicaments) d’une manière dépendante du temps. Cette nouvelle instrumentation, intitulée Platform Incubator with Movable XY Stage (PIXY), permet à l’utilisateur d’effectuer la culture cellulaire et IC-FPOP directement sur le banc optique à l’aide d’un incubateur de plate-forme avec la température, le CO2 et le contrôle de l’humidité. La plate-forme comprend également une étape de positionnement, des pompes périssaltiques et une optique miroir pour le guidage du faisceau laser. Les conditions IC-FPOP telles que la configuration optique, les débits, les pasfections transitoires et la concentration de H2O2 dans PIXY ont été optimisées et évaluées par les pairs. L’automatisation de tous les composants du système réduira la manipulation humaine et augmentera le débit.
Les techniques d’empreinte protéique peuvent révéler des informations approfondies sur l’organisation des protéines. Ces techniques essentielles de biologie structurale basées sur la SP sont un composant de la boîte à outils de spectrométrie de masse. Ces méthodes sondent la structure des états supérieurs des protéines (HOS) et la synergie par l’étiquetage covalent1,2,3,4. L’oxydation photochimique rapide des protéines (FPOP) emploie des radicaux hydroxyles pour modifier oxydativement les chaînes latérales accessibles aux solvantsd’acides aminés 5,6 (tableau 1). La méthode utilise un laser excimère à 248 nm pour la photolyse du peroxyde d’hydrogène (H2O2) pour produire des radicaux hydroxyles. Théoriquement, 19 des 20 acides aminés peuvent être modifiés oxydativement avec Gly étant la seule exception. Cependant, en raison des taux variables de réactivité des acides aminés avec des radicaux hydroxyles, la modification d’un sous-ensemble seulement de ces derniers a été observée expérimentalement. Pourtant, la méthode a le potentiel d’analyse sur la longueur d’une séquence protéique5. FPOP modifie les protéines sur l’échelle de temps de microseconde, ce qui le rend utile dans l’étude des interactions faibles avec des taux de temps rapides. L’accessibilité des solvants change lors de la liaison ligand ou d’un changement dans la conformation des protéines, de sorte que la puissance de la méthode réside dans la comparaison du modèle d’étiquetage d’une protéine dans plusieurs états (c.-à-ligand-libre par rapport à ligand-bound). En conséquence, FPOP a réussi à identifier les sites d’interaction protéine-protéine et protéine-ligand et les régions de changement conformationnel7,8,9,10. La méthode FPOP a été étendue de l’étude des systèmes protéiques purifiés à l’analyse en cellule. Le FPOP in-cell (IC-FPOP) peut modifier oxydativement plus d’un millier de protéines dans les cellules pour fournir des informations structurelles à travers le protéome11,12. La plate-forme IC-FPOP conventionnelle utilise un système d’écoulement pour faire passer les cellules d’un seul fichier au-delà du faisceau laser. Le développement de ce système a permis aux cellules individuelles d’avoir une exposition égale à l’irradiation laser. Cela a conduit à une augmentation de 13 fois le nombre de protéines oxydativement étiquetées12. Toutefois, une limitation du système d’écoulement est la longueur d’une expérience d’échantillon unique composée d’un intervalle d’irradiation de 10 minutes au cours duquel la modification a lieu et d’un cycle de lavage supplémentaire de 10 minutes. Les contraintes de temps de l’IC-FPOP le rendent impropre à l’étude des intermédiaires de pliage des protéines de courte durée ou des changements qui existent entre les réseaux d’interaction dans les cascades biochimiques de signalisation. Cette limitation temporelle a inspiré la conception d’une nouvelle plate-forme IC-FPOP équipée d’un débit plus élevé.
Pour mesurer avec précision la structure des protéines de plus haut ordre dans l’environnement cellulaire indigène, la nouvelle conception permet d’accomplir la culture cellulaire directement à la plate-forme laser, ce qui permet à IC-FPOP d’être à haut débit. Cette configuration permet également de minimiser les perturbations de l’environnement cellulaire, contrairement à IC-FPOP en utilisant le flux où les cellules adhérentes doivent être retirées du substrat. La nouvelle plate-forme permet à IC-FPOP de se produire dans un système d’incubation stérile à l’aide d’un CO2 et d’une chambre supérieure à scène à température contrôlée tout en utilisant l’optique miroir configurée pour le guidage du faisceau laser, un système de positionnement pour le mouvement XY, et des pompes périssaltiques pour l’échange chimique. La nouvelle plate-forme de conduite d’IC-FPOP s’intitule Platform Incubator with Movable XY Stage (PIXY) (Figure 1). Dans PIXY, IC-FPOP est réalisé sur des cellules humaines cultivées en plaques de six puits dans la chambre d’incubateur de plate-forme. Pour cette configuration, le faisceau laser est réfléchi vers le bas sur la plaque en utilisant des miroirs compatibles faisceau comme une étape de positionnement qui détient l’incubateur est déplacé, dans le plan XY, de sorte que le faisceau laser est stratégiquement aligné pour irradier un seul puits à la fois. Les études de validation montrent que l’IC-FPOP peut être exécuté plus rapidement dans PIXY que dans le système de flux et conduit à des modifications accrues des acides aminés par protéine. Le développement de cette nouvelle plate-forme IC-FPOP exposera les connaissances qui peuvent être acquises à partir d’expériencescellulaires 13.
Les protéines effectuent une grande partie du travail dans les cellules vivantes. Compte tenu de cette importance, des données détaillées sur la fonction protéique et la structure de l’ordre supérieur (HOS) dans l’environnement cellulaire sont nécessaires pour approfondir la compréhension des subtilités dans les grands complexes et les réactions enzymatiques dans les cellules par opposition aux systèmes purifiés. Pour ce faire, une méthode d’impression de pieds de protéine radicale hydroxyle (HRFP) a été adoptée intitulée Oxydation photochimique rapide des protéines (IC-FPOP). La plupart des études FPOP ont été faites in vitro dans des systèmes protéiques relativement purs, ce qui contraste nettement avec l’environnement moléculaire surpeuplé qui affecte les interactions contraignantes et la dynamique conformationnelle des protéines. En conséquence, il y a un gouffre entre les résultats des expériences in vitro 18 et ceux qui seraient obtenus dans un environnement cellulaire réel. Pour combler le fossé entre les conditions idéalisées d’une expérience FPOP in vitro et la nature complexe de la cellule, une nouvelle plate-forme automatisée à six puits à base de plaques cellulaires-FPOP a été développée. Cette nouvelle technologie FPOP est capable d’identifier et de caractériser ces espèces moléculaires et de retracer leurs interactions moléculaires dynamiques dans des états sains et maladies. Cette nouvelle plate-forme s’appelle Platform Incubator avec Movable XY stage (PIXY).
FPOP a été utilisé avec succès pour caractériser l’information structurelle dans le protéome. Cependant, chaque technique biologique a certaines limites qui nécessitent une amélioration supplémentaire. Des réagencés spécifiques sont nécessaires lors de la photolyse laser et pour étancher efficacement les radicaux hydroxyles non réagis. La séparation des peptides digérés peut nécessiter de grandes quantités de temps pour maximiser l’information structurelle. Cette mine d’informations peut également nécessiter une quantitation approfondie lors de l’analyse des donnéespost-SP 1. L’incubateur de plate-forme, y compris les machines périphériques nécessaires à la culture cellulaire et IC-FPOP à la plate-forme laser, est livré avec un coût élevé qui peut ne pas être réalisable pour certains laboratoires. Au fur et à mesure que des progrès continuent d’être réalisés, des logiciels et des outils d’analyse robustes devraient faire progresser la technique; dont certains sont présentés dans cette étude. Des études actuelles dans cet incubateur de plate-forme ont été réalisées sur les cellules HEK293T et dans C. elegans. La méthode IC-FPOP s’est montrée compatible avec une grande variété de lignées cellulaires, y compris l’ovaire hamster chinois (CHO), Vero, MCF-7, et mcf10-A cellules19. Puisque la méthode générale d’IC-FPOP est traduisible à cette plate-forme statique, ces lignes cellulaires devraient être aimables pour l’étude utilisant PIXY aussi bien.
IC-FPOP utilise H2O2 pour modifier oxydativement les chaînes latérales accessibles aux solvants d’acides aminés, puis discerner davantage les interactions protéiques, la structure et les effets métaboliques dans les cellules viables, ce qui est important dans la fourniture de contexte biologique. Il est essentiel avant une expérience IC-FPOP de confirmer que les cellules sont viables après l’ajout de H2O2. Les études de viabilité cellulaire ont démontré que les cellules étaient viables en présence des concentrations de H2O2 jusqu’à 200 mM 13. Il est également important de s’assurer que H2O2 est infusé à une concentration finale de 200 mM directement sur les cellules après l’enlever des supports. L’omission d’enlever complètement les médias de culture cellulaire causera des concentrations variables de H2O2. Par rapport aux conditions standard, l’augmentation du temps d’incubation à 10 secondes ainsi que l’augmentation de la concentration de H2O2 ont conduit à un plus grand nombre de protéines modifiées par IC-FPOP dans l’incubateur de plate-forme. Il est impératif d’amorcer les pompes périssaltiques avant utilisation pour s’assurer que les pompes fonctionnent correctement et que le liquide est dispersé. Si vous ne le faites pas, vous risquez de provoquer des bulles d’air dans le tube, un volume insuffisant de H2O2 pour immerger les cellules et/ou un volume insuffisant de solution d’assaisons.
Un autre problème qui peut survenir est les retards indésirables dans le système. Un exemple de ceci est le processus de vérification des commandes reçues pour les systèmes de pompe qui ajoute des retards significatifs de l’ordre de 1000 millisecondes ou plus utilisant le logiciel d’intégration. Ce problème peut être résolu en minimisant autant que possible la communication avec les pompes pendant l’expérience et en utilisant des commandes prédéfigurées à l’avance.
À l’avenir, l’objectif de PIXY est de produire un système entièrement automatisé et intégré. En plus des pompes périssaltiques, le déclenchement de l’impulsion laser sera automatisé. Un nouveau système de positionnement sera également utilisé pour le mouvement rapide de l’incubateur de plate-forme afin d’améliorer la vitesse et la précision. Tous les composants du système continueront d’être programmés à l’aide du logiciel d’intégration afin d’augmenter encore le débit.
The authors have nothing to disclose.
Ces travaux ont été appuyés par une subvention des NIH R01 GM128983-01.
Ismatec Reglo ICC Peristaltic Pumps | Cole-Palmer | 122270050 | |
Kinematic Mirror Mount for Ø2" Optics | Thor Labs | ||
10X trypsin−EDTA | Corning | AB00490-00005 | |
50.0mm 248nm 45°, Excimer Laser Line Mirror | Edmond Optics | ||
Acetone, HPLC Grade | Fisher Scientific | ||
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | ||
ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100Å, 5 µm, 180 µm x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg | Waters | 23275 | other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used |
ACQUITY UPLC M-Class System | Waters | A53225 | |
Afinia H480 3D Printer | (Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library) | ||
air pump | OKOlabs | D12345 | |
Aluminum Foil | Fisher Scientific | Stock #63-120 | |
Aqua 5 µm C18 125 Å packing material | Phenomenex | ||
carbon dioxide unit | OKOlabs | MadMotor®-UHV | |
Centrifuge | Eppendorf | ||
connectors (Y PP 1/16” and 1/16×1/8”) | Cole-Palmer | 116891000 | |
Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 022625501 | |
Dithiothreiotol (DTT) | AmericanBio | ||
DMSO, Anhydrous | Invitrogen | LS118-500 | |
Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Corning | SK-78001-82 | |
EX350 excimer laser | GAM Laser | PI89900 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Corning | SK-12023-78 | |
Formic Acid, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A929-4 | 4 L quantity is not necessary |
HEK293T cells | Paul Shapiro Lab (University of Maryland Baltimore) | ||
humidifier | OKOlabs | Nano-LPMW stage | |
HV3-2 VALVE | Hamilton | BP152-500 | |
Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | LS120-500 | |
Iodoacetamide (IAA) | ACROS Organics | ||
LABVIEW Professional 2018 | National Instruments | 86728 | |
MadMotor Positioning system and controllers | Mad City Labs | W6-4 | |
Methanol, LC/MS Grade | Fisher Scientific | 01-213-100 | any brand is sufficient |
Microcentrifuge | Thermo Scientific | H301-T Unit-BL-PLUS | |
N,N′-Dimethylthiourea (DMTU) | ACROS Organics | ||
Nanopositioinging stage | Mad City Labs | ||
N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN) | ACROS Organics | ||
OKO Touch Monitoring System | OKOlabs | ||
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | 7Z02936 | |
PE50-C pyroelectric energy meter | Ophir Optronics | ||
Penicillin-streptomycin | Corning | ||
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | ||
Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | ||
Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Scientific | 75002436 | |
Pierce Universal Nuclease for Cell Lysis | Fisher Scientific | 06-666A | |
pressure gauge | OKOlabs | OKO-AIR-PUMP-BL | |
PTFE filter | OKOlabs | CO2-UNIT-BL | |
Six 33 mm PLA filament rings | (Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library) | ||
sterile incubator | OKOlabs | ||
temperature unit | OKOlabs | OKO-TOUCH | |
Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer | Fisher Scientific | A117-50 | |
TiNKERcad | (Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library) | ||
Tris Base | Fisher Scientific | H325-100 | any 30% hydrogen peroxide is sufficient |
tubing (Tygon 3.18 and 1.59 ID) | Cole-Palmer | 177350250 | |
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | A454SK-4 | 4 L quantity is not necessary |
Water, LC/MS Grade | Fisher Scientific | 88702 | |
90058 | |||
KM200 | |||
186007496 |