En ny statisk platform bruges til at karakterisere proteinstruktur og interaktionssteder i det oprindelige cellemiljø ved hjælp af en proteinfodaftryksteknik kaldet in-cell hurtig fotokemisk oxidation af proteiner (IC-FPOP).
Hurtig fotokemisk oxidation af proteiner (FPOP) kombineret med massespektrometri (MS) er blevet et uvurderligt værktøj i strukturelle proteomics til at afhøre proteininteraktioner, struktur og proteinformationsdynamik som funktion af tilgængelighed af opløsningsmidler. I de senere år er fpop-området, en hydroxylradikale proteinfodstrykteknik (HRPF), blevet udvidet til proteinmærkning i levende cellekulturer, hvilket giver mulighed for at studere proteininteraktioner i det indviklede cellulære miljø. In-cell protein modifikationer kan give indsigt i ligand induceret strukturelle ændringer eller konformationelle ændringer, der ledsager protein kompleks dannelse, alle inden for cellulære sammenhæng. Proteinaftryk er opnået ved hjælp af et sædvanligt flowbaseret system og en 248 nm KrF excimer laser til at give hydroxylradikaler via fotolyse af hydrogenperoxid, der kræver 20 minutters analyse for en celleprøve. For at lette tidsløste FPOP-eksperimenter blev brugen af en ny 6-brønds pladebaseret IC-FPOP-platform banebrydende. I det nuværende system bestråler en enkelt laserpuls en hel brønd, hvilket afkorter FPOP eksperimentel tidsramme, hvilket resulterer i 20 sekunders analysetid, et 60-fold fald. Denne stærkt reducerede analysetid gør det muligt at forske i cellulære mekanismer såsom biokemiske signalkaskader, proteinfoldning og differentialeksperimenter (dvs. stoffri vs. bundet lægemiddel) på en tidsafhængig måde. Denne nye instrumentering med titlen Platform Incubator with Movable XY Stage (PIXY) giver brugeren mulighed for at udføre cellekultur og IC-FPOP direkte på den optiske bænk ved hjælp af en platforminkubator med temperatur, CO2 og fugtighedskontrol. Platformen indeholder også en positioneringsfase, peristaltiske pumper og spejloptik til laserstrålevejledning. IC-FPOP-forhold såsom optikkonfiguration, strømningshastigheder, forbigående transinfektioner og H2O2-koncentration i PIXY er blevet optimeret og peer-reviewed. Automatisering af alle komponenter i systemet vil reducere menneskelig manipulation og øge gennemstrømningen.
Protein footprinting teknikker kan afsløre dybtgående oplysninger om organiseringen af proteiner. Disse væsentlige ms-baserede teknikker til strukturel biologi er en del af værktøjskassen massespektrometri. Disse metoder sonde protein højere orden struktur (HOS) og synergi via kovalente mærkning1,2,3,4. Hurtig fotokemisk oxidation af proteiner (FPOP) anvender hydroxylradikaler til oxidativt at ændre opløsningsmiddeltilgængelige sidekæder af aminosyrer5,6 (Tabel 1). Metoden anvender en excimer laser ved 248 nm til fotolyse af hydrogenperoxid (H2O2) til at generere hydroxylradikaler. Teoretisk set kan 19 af de 20 aminosyrer oxideres oxidativt, og Gly er den eneste undtagelse. På grund af de forskellige reaktivitetsrater for aminosyrer med hydroxylradikaler er der imidlertid eksperimentelt observeret ændring af en delmængde af disse. Alligevel har metoden potentialet til analyse over længden af en proteinsekvens5. FPOP ændrer proteiner på mikrosekund tidshorisonten, hvilket gør det nyttigt at studere svage interaktioner med hurtige hastigheder. Tilgængeligheden af opløsningsmidler ændres ved ligandbinding eller en ændring i proteinformationen, således at metodens effekt ligger i sammenligningen af mærkningsmønsteret for et protein i flere tilstande (dvs. ligandfri sammenlignet med ligand-bundet). Som følge heraf har FPOP haft succes med at identificere proteinprotein- og protein-ligand-interaktionssteder og regioner med kropsbygningsændring7,8,9,10. FPOP-metoden er blevet udvidet fra studiet af rensede proteinsystemer til in-cell-analyse. In-cell FPOP (IC-FPOP) kan oxidativt ændre over tusind proteiner i celler for at give strukturelle oplysninger på tværs af proteome11,12. Den konventionelle IC-FPOP-platform bruger et flowsystem til at flyde celler enkelt fil forbi laserstrålen. Udviklingen af dette system gjorde det muligt for de enkelte celler at have samme eksponering for laserbestråling. Dette førte til en 13-fold stigning i antallet af oxidativt mærkede proteiner12. En begrænsning af strømningssystemet er imidlertid længden af et enkelt prøveeksperiment bestående af et bestrålingsinterval på 10 minutter, hvor ændringen finder sted, og en yderligere 10-minutters vaskecyklus. Tidsbegrænsningerne for IC-FPOP gør det uegnet til at studere kortlivede proteinfoldende mellemprodukter eller ændringer, der findes blandt interaktionsnetværk i biokemiske signalkaskader. Denne tidsmæssige begrænsning inspirerede til designet af en ny IC-FPOP-platform udstyret med højere gennemløb.
For præcist at måle protein højere orden struktur i den oprindelige celle miljø, det nye design gør det muligt cellekultur, der skal udføres direkte på laser platform, som gør det muligt IC-FPOP at være høj gennemløb. Denne opsætning giver også mulighed for minimerede forstyrrelser i mobilmiljøet i modsætning til IC-FPOP ved hjælp af flow, hvor vedhængende celler skal fjernes fra substratet. Den nye platform tillader IC-FPOP at forekomme i et sterilt inkubationssystem ved hjælp af et CO2 og temperaturstyret øverste kammer, mens du bruger konfigureret spejloptik til laserstrålestyring, et positioneringssystem til XY-bevægelse og peristaltiske pumper til kemisk udveksling. Den nye platform for gennemførelse af IC-FPOP har titlen Platform Incubator with Movable XY Stage (PIXY) (Figur 1). I PIXY udføres IC-FPOP på menneskelige celler, der dyrkes i seksbrøndsplader i platformens inkubatorkammer. Til denne konfiguration reflekteres laserstrålen nedad på pladen ved hjælp af strålekompatible spejle, da et positioneringstrin, der holder inkubatoren, flyttes i XY-flyet, så laserstrålen er strategisk justeret til kun at bestråle en brønd ad gangen. Valideringsundersøgelser viser, at IC-FPOP kan udføres hurtigere i PIXY end i flowsystemet og fører til øgede aminosyremodifikationer pr. protein. Udviklingen af denne nye IC-FPOP-platform vil forklare den viden, der kan opnås ved cellulære eksperimenter13.
Proteiner udfører meget af arbejdet i levende celler. I betragtning af denne betydning er der behov for detaljerede data om proteinfunktion og højere ordensstruktur (HOS) i cellemiljøet for at uddybe forståelsen af snørklede i større komplekser og enzymatiske reaktioner i celler i modsætning til rensede systemer. For at gøre dette blev der anvendt en hydroxylradikale proteinfodtrykningsmetode (HRFP) med titlen In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins (IC-FPOP). De fleste FPOP-undersøgelser er blevet udført in vitro i relativt rene proteinsystemer, hvilket markant står i kontrast til det overfyldte molekylære miljø, som påvirker bindende interaktioner og proteinkonformationsdynamik. Som følge heraf er der en kløft mellem resultaterne fra in vitro-eksperimenter 18 og dem, der ville blive opnået i et faktisk cellulært miljø. For at bygge bro mellem de idealiserede forhold i et in vitro FPOP-eksperiment og cellens komplekse karakter er der udviklet en ny automatiseret seks-godt pladebaseret i celle-FPOP-platform. Denne nye FPOP-teknologi er i stand til at identificere og karakterisere disse molekylære arter og spore deres dynamiske molekylære interaktioner i både sunde og syge tilstande. Denne nye platform kaldes Platform Incubator med Movable XY stage (PIXY).
FPOP er med succes blevet brugt til at karakterisere de strukturelle oplysninger inden for proteomet. Men hver biologisk teknik har visse begrænsninger, der kræver yderligere forbedring. Specifikke reagenser er påkrævet under laserfotolyse og for effektivt at slukke ureagerede hydroxylradikaler. Adskillelse af fordøjede peptider kan kræve store mængder tid for at maksimere strukturelle oplysninger. Denne mængde information kan også kræve omfattende kvantantitation under dataanalyser efter MS1. Platforminkubatoren, herunder de perifere maskiner, der er nødvendige for cellekultur og IC-FPOP på laserplatformen, leveres med en stor omkostning, der muligvis ikke er mulig for nogle laboratorier. Efterhånden som der fortsat gøres fremskridt, bør robuste software- og analyseværktøjer fremme teknikken yderligere; hvoraf nogle er fremvist i denne undersøgelse. Aktuelle undersøgelser i denne platform inkubator er blevet udført på HEK293T celler og i C. elegans. IC-FPOP-metoden har vist sig at være kompatibel med en lang række cellelinjer, herunder kinesisk hamster æggestokke (CHO), Vero, MCF-7 og MCF10-A celler19. Da den generelle IC-FPOP-metode kan oversættes til denne statiske platform, bør disse cellelinjer også kunne studeres ved hjælp af PIXY.
IC-FPOP anvender H2O2 til oxidativt at ændre opløsningsmiddeltilgængelige bivirkninger af aminosyrer for derefter yderligere at skelne proteininteraktioner, struktur og metaboliske virkninger i levedygtige celler, hvilket er signifikant for at give biologisk kontekst. Det er vigtigt, før et IC-FPOP-eksperiment bekræfter, at cellerne er levedygtige efter H2O2-tilsætning. Celle levedygtighed undersøgelser viste, at cellerne var levedygtige i nærværelse af H2O2 koncentrationer op til 200 mM 13. Det er også vigtigt at sikre, at H2O2 infunderes ved en endelig koncentration på 200 mM direkte på celler, efter at mediet er fjernet. Hvis cellekulturmedierne ikke fjernes fuldstændigt, vil det medføre forskellige koncentrationer af H2O2. Sammenlignet med standardbetingelser førte en forøgelse af inkubationstiden til 10 sekunder sammen med en forøgelse af H2O2-koncentrationen til et højere antal proteiner modificeret af IC-FPOP i platforminkubatoren. Det er bydende nødvendigt at prime peristaltic pumper før brug for at sikre pumper fungerer korrekt og væske bliver spredt. Hvis dette ikke gøres, kan luftbobler i slangen, utilstrækkeligt volumen på H2O2 til at nedsænke celler og/eller utilstrækkelig lydstyrke.
Et andet problem, der kan opstå, er uønskede forsinkelser i systemet. Et eksempel på dette er processen med at verificere modtagne kommandoer til pumpesystemerne, hvilket tilføjer betydelige forsinkelser i størrelsesordenen 1000 eller flere millisekunder ved hjælp af integrationssoftwaren. Dette problem kan løses ved at minimere kommunikationen med pumperne under eksperimentet og ved hjælp af forudindstillede kommandoer på forhånd så meget som muligt.
I fremtiden er målet for PIXY at producere et fuldt automatiseret og integreret system. Ud over de peristaltiske pumper vil udløsningen af laserpulsen blive automatiseret. Et nyt positioneringssystem vil også blive brugt til hurtig bevægelse af platforminkubatoren for at forbedre hastighed og nøjagtighed. Alle komponenter i systemet vil fortsat blive programmeret ved hjælp af integrationssoftwaren for yderligere at øge gennemløbet.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af et tilskud fra NIH R01 GM128983-01.
Ismatec Reglo ICC Peristaltic Pumps | Cole-Palmer | 122270050 | |
Kinematic Mirror Mount for Ø2" Optics | Thor Labs | ||
10X trypsin−EDTA | Corning | AB00490-00005 | |
50.0mm 248nm 45°, Excimer Laser Line Mirror | Edmond Optics | ||
Acetone, HPLC Grade | Fisher Scientific | ||
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | ||
ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100Å, 5 µm, 180 µm x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg | Waters | 23275 | other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used |
ACQUITY UPLC M-Class System | Waters | A53225 | |
Afinia H480 3D Printer | (Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library) | ||
air pump | OKOlabs | D12345 | |
Aluminum Foil | Fisher Scientific | Stock #63-120 | |
Aqua 5 µm C18 125 Å packing material | Phenomenex | ||
carbon dioxide unit | OKOlabs | MadMotor®-UHV | |
Centrifuge | Eppendorf | ||
connectors (Y PP 1/16” and 1/16×1/8”) | Cole-Palmer | 116891000 | |
Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 022625501 | |
Dithiothreiotol (DTT) | AmericanBio | ||
DMSO, Anhydrous | Invitrogen | LS118-500 | |
Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Corning | SK-78001-82 | |
EX350 excimer laser | GAM Laser | PI89900 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Corning | SK-12023-78 | |
Formic Acid, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A929-4 | 4 L quantity is not necessary |
HEK293T cells | Paul Shapiro Lab (University of Maryland Baltimore) | ||
humidifier | OKOlabs | Nano-LPMW stage | |
HV3-2 VALVE | Hamilton | BP152-500 | |
Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | LS120-500 | |
Iodoacetamide (IAA) | ACROS Organics | ||
LABVIEW Professional 2018 | National Instruments | 86728 | |
MadMotor Positioning system and controllers | Mad City Labs | W6-4 | |
Methanol, LC/MS Grade | Fisher Scientific | 01-213-100 | any brand is sufficient |
Microcentrifuge | Thermo Scientific | H301-T Unit-BL-PLUS | |
N,N′-Dimethylthiourea (DMTU) | ACROS Organics | ||
Nanopositioinging stage | Mad City Labs | ||
N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN) | ACROS Organics | ||
OKO Touch Monitoring System | OKOlabs | ||
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | 7Z02936 | |
PE50-C pyroelectric energy meter | Ophir Optronics | ||
Penicillin-streptomycin | Corning | ||
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | ||
Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | ||
Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Scientific | 75002436 | |
Pierce Universal Nuclease for Cell Lysis | Fisher Scientific | 06-666A | |
pressure gauge | OKOlabs | OKO-AIR-PUMP-BL | |
PTFE filter | OKOlabs | CO2-UNIT-BL | |
Six 33 mm PLA filament rings | (Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library) | ||
sterile incubator | OKOlabs | ||
temperature unit | OKOlabs | OKO-TOUCH | |
Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer | Fisher Scientific | A117-50 | |
TiNKERcad | (Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library) | ||
Tris Base | Fisher Scientific | H325-100 | any 30% hydrogen peroxide is sufficient |
tubing (Tygon 3.18 and 1.59 ID) | Cole-Palmer | 177350250 | |
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | A454SK-4 | 4 L quantity is not necessary |
Water, LC/MS Grade | Fisher Scientific | 88702 | |
90058 | |||
KM200 | |||
186007496 |