En ny statisk plattform används för att karakterisera proteinstruktur och interaktionsplatser i den inhemska cellmiljön med hjälp av en proteinavtrycksteknik som kallas snabb fotokemisk oxidation av proteiner (IC-FPOP).
Snabb fotokemisk oxidation av proteiner (FPOP) i kombination med masspektrometri (MS) har blivit ett ovärderligt verktyg inom strukturell proteomik för att förhöra proteininteraktioner, struktur och proteinkonformationsdynamik som en funktion av lösningsmedelstillgänglighet. Under de senaste åren har omfattningen av FPOP, en hydroxylradikal proteinfottrycksteknik (HRPF), utvidgats till proteinmärkning i levande cellkulturer, vilket ger möjlighet att studera proteininteraktioner i den invecklade cellmiljön. In-cell protein modifieringar kan ge insikt i ligand inducerade strukturella förändringar eller conformational förändringar som åtföljer protein komplexa bildandet, allt inom cellulära sammanhang. Proteinavtryck har åstadkommits med hjälp av ett vanligt flödesbaserat system och en 248 nm KrF excimerlaser för att ge hydroxylradikaler via fotolys av väteperoxid, vilket kräver 20 minuters analys för ett cellprov. För att underlätta tidsbesedda FPOP-experiment var användningen av en ny 6-brunns plattbaserad IC-FPOP-plattform banbrytande. I det nuvarande systemet bestrålar en enda laserpuls en hel brunn, vilket trunkerar FPOP-experimentell tidsram vilket resulterar i 20 sekunders analystid, en 60-faldig minskning. Denna kraftigt minskade analystid gör det möjligt att undersöka cellulära mekanismer som biokemiska signalkaskader, proteinvikning och differentialexperiment (dvs. läkemedelsfria kontra läkemedelsbundna) på ett tidsberoende sätt. Denna nya instrumentering, med titeln Platform Incubator with Movable XY Stage (PIXY), gör det möjligt för användaren att utföra cellkultur och IC-FPOP direkt på den optiska bänken med hjälp av en plattformsinkubator med temperatur, CO2 och fuktighetskontroll. Plattformen innehåller också ett positioneringssteg, peristaltiska pumpar och spegeloptik för laserstrålestyrning. IC-FPOP-förhållanden som optikkonfiguration, flödeshastigheter, övergående transfektioner och H2O2-koncentration i PIXY har optimerats och peer-reviewed. Automatisering av alla komponenter i systemet kommer att minska mänsklig manipulation och öka dataflödet.
Proteinavtryckstekniker kan avslöja djup information om proteinorganisationen. Dessa viktiga strukturbiologiska MS-baserade tekniker är en komponent i verktygslådan för masspektrometri. Dessa metoder sondprotein högre ordning struktur (HOS) och synergi via kovaleent märkning1,2,3,4. Snabb fotokemisk oxidation av proteiner (FPOP) använder hydroxylradikaler för att oxidativt modifiera lösningsmedelsanpassade sidokedjor avaminosyror 5,6 (Tabell 1). Metoden använder en excimerlaser vid 248 nm för fotolys av väteperoxid (H2O2) för att generera hydroxylradikaler. Teoretiskt kan 19 av de 20 aminosyrorna oxidativt modifieras med Gly som det enda undantaget. På grund av de varierande reaktivitetshastigheterna hos aminosyror med hydroxylradikaler har dock modifiering av endast en delmängd av dessa observerats experimentellt. Ändå har metoden potential för analys över längden på en proteinsekvens5. FPOP modifierar proteiner på mikrosekunds tidsskalan, vilket gör det användbart att studera svaga interaktioner med snabba priser. Lösningsmedelstillgänglighet förändras vid ligandbindning eller en förändring i proteinkonformationen, vilket innebär att metodens kraft ligger i jämförelsen av märkningsmönstret för ett protein i flera tillstånd (dvs. ligandfri jämfört med ligand-bunden). Som ett resultat har FPOP lyckats identifiera protein-protein och protein-ligand interaktion platser och regioner för conformational förändring7,8,9,10. FPOP-metoden har utvidgats från studier av renade proteinsystem till cellanalys. In-cell FPOP (IC-FPOP) kan oxidativt modifiera över tusen proteiner i celler för att ge strukturell information över proteomen11,12. Den konventionella IC-FPOP-plattformen använder ett flödessystem för att flöda celler enkel fil förbi laserstrålen. Utvecklingen av detta system gjorde det möjligt för enskilda celler att ha lika exponering för laser bestrålning. Detta ledde till en 13-faldig ökning av antalet oxidativt märkta proteiner12. En begränsning av flödessystemet är dock längden på ett enda provförsök som består av ett 10-minuters bestrålningsintervall under vilket modifiering sker och ytterligare 10 minuters tvättcykel. Tidsbegränsningarna för IC-FPOP gör det olämpligt för att studera kortlivade proteinvikningsinteraler eller förändringar som finns bland interaktionsnätverk i biokemiska signalkaskader. Denna tidsbegränsning inspirerade utformningen av en ny IC-FPOP-plattform utrustad med högre genomströmning.
För att noggrant mäta proteinstrukturen med högre ordning i den ursprungliga cellmiljön gör den nya designen det möjligt att åstadkomma cellkulturen direkt på laserplattformen, vilket gör att IC-FPOP kan vara hög genomströmning. Den här inställningen möjliggör också minimerade störningar i cellmiljön, i motsats till IC-FPOP med hjälp av flöde där vidhäftande celler måste tas bort från substratet. Den nya plattformen tillåter IC-FPOP att uppstå i ett sterilt inkubationssystem med hjälp av en CO2 och temperaturstyrd stegskiva medan den använder konfigurerad spegeloptik för laserstrålestyrning, ett positioneringssystem för XY-rörelse och peristaltiska pumpar för kemiskt utbyte. Den nya plattformen för att genomföra IC-FPOP heter Platform Incubator with Movable XY Stage (PIXY) (Figur 1). I PIXY utförs IC-FPOP på mänskliga celler som odlas i sexbrunnsplattor i plattformens inkubatorkammare. För denna konfiguration reflekteras laserstrålen nedåt på plattan med strålkompatibla speglar som ett positioneringssteg som håller inkubatorn flyttad, i XY-planet, så laserstrålen är strategiskt justerad för att endast bestråla en brunn i taget. Valideringsstudier visar att IC-FPOP kan utföras snabbare i PIXY än i flödessystemet och leder till ökade aminosyramodifieringar per protein. Utvecklingen av denna nya IC-FPOP-plattform kommer att förklara den kunskap som kan vinnas från cellulära experiment13.
Proteiner utför mycket av arbetet i levande celler. Med tanke på denna betydelse behövs detaljerade data om proteinfunktion och högre orderstruktur (HOS) i cellmiljön för att fördjupa förståelsen för invecklingarna i större komplex och enzymatiska reaktioner i celler i motsats till renade system. För att göra detta antogs en hydroxylradikal proteinfottryck (HRFP) metod med titeln In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins (IC-FPOP). De flesta FPOP-studier har gjorts in vitro i relativt rena proteinsystem, vilket tydligt står i kontrast till den trånga molekylära miljön som påverkar bindningsinteraktioner och proteinkonformationsdynamik. Som ett resultat finns det en klyfta mellan resultaten från in vitro-experiment 18 och de som skulle erhållas i en faktisk cellulär miljö. För att överbrygga klyftan mellan de idealiserade förhållandena för ett in vitro FPOP-experiment och cellens komplexa natur har en ny automatiserad sex-brunnsplatta-baserad i cell-FPOP-plattform utvecklats. Denna nya FPOP-teknik kan identifiera och karakterisera dessa molekylära arter och spåra deras dynamiska molekylära interaktioner i både friska och sjuka tillstånd. Denna nya plattform kallas Platform Incubator med Movable XY-scenen (PIXY).
FPOP har framgångsrikt använts för att karakterisera den strukturella informationen i proteomen. Varje biologisk teknik har dock vissa begränsningar som kräver ytterligare förbättringar. Specifika reagenser krävs under laser fotolys och för att effektivt släcka oreacted hydroxyl radikaler. Separation av smälta peptider kan kräva stora mängder tid för att maximera strukturell information. Denna mängd information kan också kräva omfattande kvantifiering under dataanalysen efter medlemsstaterna1. Plattformsinkubatorn, inklusive de perifera maskiner som behövs för cellkultur och IC-FPOP vid laserplattformen, kommer med en stor kostnad som kanske inte är genomförbar för vissa laboratorier. I och med att framsteg fortsätter att göras bör robusta programvaru- och analysverktyg föra tekniken vidare. några av dem visas i denna studie. Aktuella studier i denna plattform inkubator har utförts på HEK293T celler och i C. elegans. IC-FPOP-metoden har visat sig vara kompatibel med en mängd olika cellinjer, inklusive kinesisk hamster äggstock (CHO), Vero, MCF-7 och MCF10-A celler19. Eftersom den allmänna IC-FPOP-metoden kan översättas till denna statiska plattform, bör dessa cellinjer också vara mottagliga för studier med PIXY.
IC-FPOP använder H2O2 för att oxidativt modifiera lösningsmedelsanpassade sidokedjor av aminosyror, för att sedan ytterligare urskilja proteininteraktioner, struktur och metabola effekter inom livskraftiga celler som är signifikant för att ge biologiskt sammanhang. Det är viktigt före ett IC-FPOP-experiment att bekräfta att cellerna är livskraftiga efter H2O2-tillägg. Studier av cellens livskraft visade att cellerna var livskraftiga i närvaro av H2O2-koncentrationer upp till 200 mM 13. Det är också viktigt att se till att H2O2 infunderas vid en slutlig koncentration på 200 mM direkt på celler efter att media har avlägsnats. Underlåtenhet att helt ta bort cellkulturmedier kommer att orsaka varierande koncentrationer av H2O2. Jämfört med standardförhållanden ledde en ökning av inkubationstiden till 10 sekunder tillsammans med att öka H2O2-koncentrationen till ett högre antal proteiner som modifierats av IC-FPOP i plattformsinkubatorn. Det är absolut nödvändigt att prime peristaltic pumpar före användning för att säkerställa att pumparna fungerar korrekt och vätska sprids. Underlåtenhet att göra detta kan orsaka luftbubblor i slangen, otillräcklig volym på H2O2 för att nedsänka celler och/eller otillräcklig volym av släcklösning.
En annan fråga som kan uppstå är oönskade förseningar i systemet. Ett exempel på detta är processen att verifiera mottagna kommandon för pumpsystemen, vilket innebär betydande förseningar i storleksordningen 1000 eller fler millisekunder med hjälp av integrationsprogrammet. Det här problemet kan åtgärdas genom att minimera kommunikationen med pumparna under experimentet och använda förinställt kommandon i förväg så mycket som möjligt.
I framtiden är målet för PIXY att producera ett helt automatiserat och integrerat system. Förutom de peristaltiska pumparna kommer utlösningen av laserpulsen att automatiseras. Ett nytt positioneringssystem kommer också att användas för plattformsinkubatorns snabba rörelse för att öka hastigheten och noggrannheten. Alla komponenter i systemet kommer även fortsättningsvis att programmeras med hjälp av integrationsprogramvaran för att ytterligare öka dataflödet.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av ett bidrag från NIH R01 GM128983-01.
Ismatec Reglo ICC Peristaltic Pumps | Cole-Palmer | 122270050 | |
Kinematic Mirror Mount for Ø2" Optics | Thor Labs | ||
10X trypsin−EDTA | Corning | AB00490-00005 | |
50.0mm 248nm 45°, Excimer Laser Line Mirror | Edmond Optics | ||
Acetone, HPLC Grade | Fisher Scientific | ||
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | ||
ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100Å, 5 µm, 180 µm x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg | Waters | 23275 | other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used |
ACQUITY UPLC M-Class System | Waters | A53225 | |
Afinia H480 3D Printer | (Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library) | ||
air pump | OKOlabs | D12345 | |
Aluminum Foil | Fisher Scientific | Stock #63-120 | |
Aqua 5 µm C18 125 Å packing material | Phenomenex | ||
carbon dioxide unit | OKOlabs | MadMotor®-UHV | |
Centrifuge | Eppendorf | ||
connectors (Y PP 1/16” and 1/16×1/8”) | Cole-Palmer | 116891000 | |
Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 022625501 | |
Dithiothreiotol (DTT) | AmericanBio | ||
DMSO, Anhydrous | Invitrogen | LS118-500 | |
Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Corning | SK-78001-82 | |
EX350 excimer laser | GAM Laser | PI89900 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Corning | SK-12023-78 | |
Formic Acid, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A929-4 | 4 L quantity is not necessary |
HEK293T cells | Paul Shapiro Lab (University of Maryland Baltimore) | ||
humidifier | OKOlabs | Nano-LPMW stage | |
HV3-2 VALVE | Hamilton | BP152-500 | |
Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | LS120-500 | |
Iodoacetamide (IAA) | ACROS Organics | ||
LABVIEW Professional 2018 | National Instruments | 86728 | |
MadMotor Positioning system and controllers | Mad City Labs | W6-4 | |
Methanol, LC/MS Grade | Fisher Scientific | 01-213-100 | any brand is sufficient |
Microcentrifuge | Thermo Scientific | H301-T Unit-BL-PLUS | |
N,N′-Dimethylthiourea (DMTU) | ACROS Organics | ||
Nanopositioinging stage | Mad City Labs | ||
N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN) | ACROS Organics | ||
OKO Touch Monitoring System | OKOlabs | ||
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | 7Z02936 | |
PE50-C pyroelectric energy meter | Ophir Optronics | ||
Penicillin-streptomycin | Corning | ||
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | ||
Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | ||
Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Scientific | 75002436 | |
Pierce Universal Nuclease for Cell Lysis | Fisher Scientific | 06-666A | |
pressure gauge | OKOlabs | OKO-AIR-PUMP-BL | |
PTFE filter | OKOlabs | CO2-UNIT-BL | |
Six 33 mm PLA filament rings | (Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library) | ||
sterile incubator | OKOlabs | ||
temperature unit | OKOlabs | OKO-TOUCH | |
Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer | Fisher Scientific | A117-50 | |
TiNKERcad | (Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library) | ||
Tris Base | Fisher Scientific | H325-100 | any 30% hydrogen peroxide is sufficient |
tubing (Tygon 3.18 and 1.59 ID) | Cole-Palmer | 177350250 | |
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | A454SK-4 | 4 L quantity is not necessary |
Water, LC/MS Grade | Fisher Scientific | 88702 | |
90058 | |||
KM200 | |||
186007496 |