פלטפורמה סטטית חדשה משמשת לאפיון מבנה החלבון ואתרי האינטראקציה בסביבת התאים המקומית תוך שימוש בטכניקת טביעת רגל של חלבון הנקראת חמצון פוטוכימי מהיר בתא של חלבונים (IC-FPOP).
חמצון פוטוכימי מהיר של חלבונים (FPOP) בשילוב עם ספקטרומטריית מסה (MS) הפך לכלי רב ערך בפרוטאומיקה מבנית כדי לחקור אינטראקציות חלבון, מבנה ודינמיקה קונפורמטיבית של חלבונים כפונקציה של נגישות ממס. בשנים האחרונות הורחב היקף ה-FPOP, טכניקה להדפסת רגלי חלבון רדיקלית הידרוקסיל (HRPF), לתיוג חלבונים בתרביות תאים חיים, המספקים את האמצעים לחקר אינטראקציות חלבון בסביבה התאית המפותלת. שינויים בחלבון בתא יכולים לספק תובנות לגבי שינויים מבניים הנגרמים על ידי ליגנד או שינויים קונפורמיים הנלווים להיווצרות קומפלקס חלבונים, הכל בהקשר התאי. טביעת רגל של חלבונים הושגה באמצעות מערכת מבוססת זרימה מקובלת לייזר 248 ננומטר KrF excimer להניב רדיקלים הידרוקסיל באמצעות פוטוליזה של מי חמצן, הדורש 20 דקות של ניתוח עבור מדגם תא אחד. כדי להקל על ניסויי FPOP שנפתרו בזמן, השימוש בפלטפורמת IC-FPOP חדשה המבוססת על 6 בארות היה חלוץ. במערכת הנוכחית, פולס לייזר יחיד מקרין באר שלמה אחת, אשר חותכת את מסגרת הזמן הניסיונית FPOP וכתוצאה מכך 20 שניות של זמן ניתוח, ירידה של פי 60. זמן ניתוח מופחת מאוד זה מאפשר לחקור מנגנונים תאיים כגון מפלים איתות ביוכימי, קיפול חלבונים, וניסויים דיפרנציאליים (כלומר, ללא סמים לעומת סמים מאוגדים) באופן תלוי זמן. מכשור חדש זה, שכותרתו חממת פלטפורמה עם שלב Movable XY (PIXY), מאפשר למשתמש לבצע תרבות תאים ו- IC-FPOP ישירות על הספסל האופטי באמצעות חממת פלטפורמה עם טמפרטורה, CO2 ובקרת לחות. הפלטפורמה כוללת גם שלב מיצוב, משאבות פריסטליות ואופטיקה מראה להנחיית קרן לייזר. תנאי IC-FPOP כגון תצורת אופטיקה, קצב זרימה, טרנזיט ארעי וריכוז H2O2 ב- PIXY עברו אופטימיזציה וסקרו עמיתים. אוטומציה של כל מרכיבי המערכת תפחית את המניפולציה האנושית ותגדיל את התפוקה.
טכניקות טביעת רגל של חלבונים יכולות לחשוף מידע מעמיק על ארגון החלבונים. טכניקות חיוניות אלה המבוססות על ביולוגיה מבנית MS הן מרכיב בארגז הכלים של ספקטרומטריית המסה. שיטות אלה בדיקה חלבון מבנה מסדר גבוה יותר (HOS) וסינרגיה באמצעות תיוג covalent1,2,3,4. חמצון פוטוכימי מהיר של חלבונים (FPOP) מעסיק רדיקלים הידרוקסיל כדי לשנות באופן חמצוני שרשראות צד נגיש ממס של חומצות אמינו5,6 (טבלה 1). השיטה משתמשת לייזר excimer ב 248 ננומטר עבור פוטוליזה של מי חמצן (H2O2) כדי ליצור רדיקלים הידרוקסיל. תיאורטית, 19 מתוך 20 חומצות האמינו ניתן לשנות באופן חמצוני עם גלי להיות היוצא מן הכלל הבודד. עם זאת, בשל שיעורי תגובתיות משתנים של חומצות אמינו עם רדיקלים hydroxyl, שינוי של רק תת קבוצה של אלה נצפתה באופן ניסיוני. עדיין, השיטה יש פוטנציאל לניתוח לאורך רצף חלבון5. FPOP משנה חלבונים בציר הזמן של מיקרו-שניות, מה שהופך אותו לשימושי בחקר אינטראקציות חלשות עם קצבי ניתוק מהירים. נגישות ממס משתנה על קשירה ליגנד או שינוי קונפורמציה חלבון, ולכן, כוחה של השיטה טמון בהשוואה של דפוס תיוג של חלבון במצבים מרובים (כלומר, ללא ליגנד בהשוואה ליגנד מאוגד). כתוצאה מכך, FPOP הצליחה לזהות אתרי אינטראקציה של חלבון-חלבון וחלבון-ליגנד ואזורים של שינוי קונפורמי7,8,9,10. שיטת FPOP הורחבה ממחקר של מערכות חלבון מטוהרות לניתוח תאים. FPOP בתא (IC-FPOP) יכול לשנות באופן חמצוני מעל אלף חלבונים בתאים כדי לספק מידע מבני על פני פרוטאום11,12. פלטפורמת IC-FPOP הקונבנציונלית משתמשת במערכת זרימה כדי לזרום תאים קובץ יחיד מעבר לקרן הלייזר. הפיתוח של מערכת זו אפשר לתאים בודדים יש חשיפה שווה הקרנת לייזר. זה הוביל לעלייה של פי 13 במספר החלבונים המסומנים בצורה חמצונית12. עם זאת, מגבלה של מערכת הזרימה היא אורך של ניסוי מדגם יחיד המורכב מרווח הקרנה של 10 דקות שבמהלכו מתרחש שינוי ומחזור שטיפה נוסף של 10 דקות. אילוצי הזמן של IC-FPOP הופכים אותו לבלתי מתאים לחקר ביניים מתקפלים של חלבונים קצרי מועד או לשינויים הקיימים בין רשתות אינטראקציה במפלים של איתות ביוכימי. מגבלה זמנית זו נתנה השראה לעיצוב פלטפורמת IC-FPOP חדשה המצוידת בתפוקה גבוהה יותר.
כדי למדוד במדויק מבנה חלבון בסדר גבוה יותר בסביבת התאים המקורית, העיצוב החדש מאפשר תרבית תאים להתבצע ישירות בפלטפורמת הלייזר, המאפשרת IC-FPOP להיות תפוקה גבוהה. התקנה זו מאפשרת גם הפרעה ממוזערת לסביבה הסלולרית, בניגוד ל- IC-FPOP באמצעות זרימה שבה יש להסיר תאים חסידים מהמצע. הפלטפורמה החדשה מאפשרת ל- IC-FPOP להתרחש במערכת דגירה סטרילית באמצעות CO2 ותא עליון שלב מבוקר טמפרטורה תוך שימוש באופטיקה מראה מוגדרת להנחיית קרן לייזר, מערכת מיקום עבור תנועת XY ומשאבות פריסטליות להחלפה כימית. הפלטפורמה החדשה לניהול IC-FPOP נקראת חממת פלטפורמה עם שלב XY נייד (PIXY) (איור 1). ב- PIXY, IC-FPOP מתבצע על תאים אנושיים הגדלים בלוחות שש בארות בתוך תא החממה של הפלטפורמה. עבור תצורה זו, קרן הלייזר משתקפת כלפי מטה אל הצלחת באמצעות מראות תואמות קרן כשלב מיקום המחזיק את החממה מועברת, במישור ה- XY, כך שקרן הלייזר מיושרת אסטרטגית להקרין רק באר אחת בכל פעם. מחקרי אימות מראים כי IC-FPOP יכול להתבצע מהר יותר ב- PIXY מאשר במערכת הזרימה ומוביל לשינויים מוגברים בחומצות אמינו לחלבון. הפיתוח של פלטפורמת IC-FPOP חדשה זו תסביר את הידע שניתן להשיג מניסויים סלולריים13.
חלבונים מבצעים חלק גדול מהעבודה בתאים חיים. בהתחשב בחשיבות זו, יש צורך בנתונים מפורטים על תפקוד החלבון ומבנה מסדר גבוה יותר (HOS) בסביבה התאית כדי להעמיק את ההבנה של המורכבות במתחמים גדולים יותר ותגובות אנזימטיות בתאים לעומת מערכות מטוהרות. כדי לעשות זאת, שיטה להדפסת רגל חלבון רדיקלית הידרוקסיל (HRFP) אומצה בשם בתא חמצון פוטוכימי מהיר של חלבונים (IC-FPOP). רוב מחקרי FPOP נעשו במבחנה במערכות חלבון טהורות יחסית, המנוגדות במידה ניכרת לסביבה המולקולרית הצפופה המשפיעה על אינטראקציות מחייבות ודינמיקה קונפורמציה של חלבונים. כתוצאה מכך, יש תהום בין הממצאים מניסויי במבחנה 18 לבין אלה שיושגו בסביבה תאית בפועל. כדי לגשר על הפער בין התנאים האידיאליים של ניסוי FPOP במבחנה לבין האופי המורכב של התא, פותחה פלטפורמת FPOP אוטומטית חדשה בת שש בארות בפלטפורמת cell-FPOP. טכנולוגיית FPOP חדשנית זו מסוגלת לזהות ולאפיין מינים מולקולריים אלה ולאתר את האינטראקציות המולקולריות הדינמיות שלהם במצבים בריאים וחולים כאחד. פלטפורמה חדשה זו נקראת חממת פלטפורמה עם שלב Movable XY (PIXY).
FPOP שימש בהצלחה כדי לאפיין את המידע המבני בתוך הפרוטום. עם זאת, לכל טכניקה ביולוגית יש מגבלות מסוימות הדורשות שיפור נוסף. ריאגנטים ספציפיים נדרשים במהלך פוטוליזה בלייזר כדי להרוות ביעילות רדיקלים הידרוקסיל unreacted. הפרדת פפטידים מתעכלים יכולה לדרוש כמויות גדולות של זמן כדי למקסם את המידע המבני. שפע זה של מידע יכול גם לדרוש כמותיות נרחבת במהלך ניתוח נתונים שלאחר MS1. חממת הפלטפורמה, כולל המכונות ההיקפיות הדרושות לתרבות התאים ו- IC-FPOP בפלטפורמת הלייזר, מגיעה עם עלות גדולה שעשויה שלא להיות אפשרית עבור מעבדות מסוימות. ככל שההתקדמות ממשיכה להתבצע, כלי תוכנה וניתוח חזקים צריכים לקדם את הטכניקה עוד יותר; חלקם מוצגים במחקר זה. מחקרים עדכניים באינקובטור פלטפורמה זה בוצעו על תאי HEK293T וב- C. elegans. שיטת IC-FPOP הוכח להיות תואם עם מגוון רחב של קווי תאים כולל השחלה אוגר סינית (CHO), Vero, MCF-7, ו MCF10-A תאים19. מכיוון ששיטת IC-FPOP הכללית ניתנת לתרגום לפלטפורמה סטטית זו, קווי תאים אלה צריכים להיות נוחים למחקר גם באמצעות PIXY.
IC-FPOP מנצל H2O 2 כדי לשנות חמצונישרשראות צד נגיש ממס של חומצות אמינו, ולאחר מכן להבחין עוד יותר אינטראקציות חלבון, מבנה, והשפעות מטבוליות בתוך תאים קיימא אשר משמעותי במתן הקשר ביולוגי. זה חיוני לפני ניסוי IC-FPOP כדי לאשר כי התאים הם קיימא לאחר H2O2 תוספת. מחקרי הכדאיות של התא הראו כי התאים היו קיימא בנוכחות ריכוזי H2O2 עד 200 מ”מ 13. חשוב גם לוודא H2O2 הוא חדורים בריכוז הסופי של 200 mM ישירות על תאים לאחר הסרת מדיה. כישלון להסיר לחלוטין את המדיה תרבות התא יגרום ריכוזים שונים של H2O2. בהשוואה לתנאים סטנדרטיים, הגדלת זמן הדגירה ל -10 שניות יחד עם הגדלת ריכוז H2O2 הוביל למספר גבוה יותר של חלבונים ששונו על ידי IC-FPOP באינקובטור הפלטפורמה. זה הכרחי כדי משאבות פרייסטליות הממשלה לפני השימוש כדי להבטיח משאבות פועלות כראוי נוזלים מפוזרים. כישלון לעשות זאת עלול לגרום בועות אוויר בצינורות, נפח מספיק של H2O2 כדי לטבול תאים, ו / או נפח מספיק של פתרון להרוות.
בעיה נוספת שעלולה להתעורר היא עיכובים לא רצויים במערכת. דוגמה לכך היא תהליך אימות הפקודות שהתקבלו עבור מערכות המשאבה אשר מוסיף עיכובים משמעותיים בסדר גודל של 1000 אלפיות שניה או יותר באמצעות תוכנת האינטגרציה. ניתן לתקן בעיה זו על ידי מזעור התקשורת עם המשאבות במהלך הניסוי ושימוש בפקודות מוגדרות מראש מראש ככל האפשר.
בעתיד, המטרה של PIXY היא לייצר מערכת אוטומטית ומשולבת לחלוטין. בנוסף למשאבות peristaltic, הפעלת פולס הלייזר יהיה אוטומטי. מערכת מיצוב חדשה תנוצל גם לתנועה מהירה של חממת הפלטפורמה כדי לשפר את המהירות והדיוק. כל רכיבי המערכת ימשיכו להיות מתוכנתים באמצעות תוכנת האינטגרציה כדי להגדיל עוד יותר את התפוקה.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי מענק של NIH R01 GM128983-01.
Ismatec Reglo ICC Peristaltic Pumps | Cole-Palmer | 122270050 | |
Kinematic Mirror Mount for Ø2" Optics | Thor Labs | ||
10X trypsin−EDTA | Corning | AB00490-00005 | |
50.0mm 248nm 45°, Excimer Laser Line Mirror | Edmond Optics | ||
Acetone, HPLC Grade | Fisher Scientific | ||
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | ||
ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100Å, 5 µm, 180 µm x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg | Waters | 23275 | other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used |
ACQUITY UPLC M-Class System | Waters | A53225 | |
Afinia H480 3D Printer | (Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library) | ||
air pump | OKOlabs | D12345 | |
Aluminum Foil | Fisher Scientific | Stock #63-120 | |
Aqua 5 µm C18 125 Å packing material | Phenomenex | ||
carbon dioxide unit | OKOlabs | MadMotor®-UHV | |
Centrifuge | Eppendorf | ||
connectors (Y PP 1/16” and 1/16×1/8”) | Cole-Palmer | 116891000 | |
Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 022625501 | |
Dithiothreiotol (DTT) | AmericanBio | ||
DMSO, Anhydrous | Invitrogen | LS118-500 | |
Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Corning | SK-78001-82 | |
EX350 excimer laser | GAM Laser | PI89900 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Corning | SK-12023-78 | |
Formic Acid, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A929-4 | 4 L quantity is not necessary |
HEK293T cells | Paul Shapiro Lab (University of Maryland Baltimore) | ||
humidifier | OKOlabs | Nano-LPMW stage | |
HV3-2 VALVE | Hamilton | BP152-500 | |
Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | LS120-500 | |
Iodoacetamide (IAA) | ACROS Organics | ||
LABVIEW Professional 2018 | National Instruments | 86728 | |
MadMotor Positioning system and controllers | Mad City Labs | W6-4 | |
Methanol, LC/MS Grade | Fisher Scientific | 01-213-100 | any brand is sufficient |
Microcentrifuge | Thermo Scientific | H301-T Unit-BL-PLUS | |
N,N′-Dimethylthiourea (DMTU) | ACROS Organics | ||
Nanopositioinging stage | Mad City Labs | ||
N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN) | ACROS Organics | ||
OKO Touch Monitoring System | OKOlabs | ||
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | 7Z02936 | |
PE50-C pyroelectric energy meter | Ophir Optronics | ||
Penicillin-streptomycin | Corning | ||
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | ||
Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | ||
Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Scientific | 75002436 | |
Pierce Universal Nuclease for Cell Lysis | Fisher Scientific | 06-666A | |
pressure gauge | OKOlabs | OKO-AIR-PUMP-BL | |
PTFE filter | OKOlabs | CO2-UNIT-BL | |
Six 33 mm PLA filament rings | (Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library) | ||
sterile incubator | OKOlabs | ||
temperature unit | OKOlabs | OKO-TOUCH | |
Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer | Fisher Scientific | A117-50 | |
TiNKERcad | (Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library) | ||
Tris Base | Fisher Scientific | H325-100 | any 30% hydrogen peroxide is sufficient |
tubing (Tygon 3.18 and 1.59 ID) | Cole-Palmer | 177350250 | |
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | A454SK-4 | 4 L quantity is not necessary |
Water, LC/MS Grade | Fisher Scientific | 88702 | |
90058 | |||
KM200 | |||
186007496 |