प्रोटीन के इन-सेल फास्ट फोटोकेमिकल ऑक्सीकरण (आईसी-एफओपी) नामक प्रोटीन फुटप्रिंटिंग तकनीक का उपयोग करते हुए देशी सेल वातावरण में प्रोटीन संरचना और इंटरैक्शन साइटों की विशेषता के लिए एक नया स्थिर मंच का उपयोग किया जाता है।
प्रोटीन का फास्ट फोटोकेमिकल ऑक्सीकरण (एफओपी) मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) के साथ मिलकर सॉल्वेंट पहुंच के एक समारोह के रूप में प्रोटीन इंटरैक्शन, संरचना और प्रोटीन अनुरूप गतिशीलता से पूछताछ करने के लिए संरचनात्मक प्रोटेओमिक्स में एक अमूल्य उपकरण बन गया है। हाल के वर्षों में, FPOP, एक हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी प्रोटीन फुट प्रिंटिंग (HRPF) तकनीक के दायरे, लाइव सेल संस्कृतियों में प्रोटीन लेबलिंग के लिए विस्तारित किया गया है, जटिल सेलुलर वातावरण में प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने का साधन प्रदान करते हैं । इन-सेल प्रोटीन संशोधनों से लिगांड प्रेरित संरचनात्मक परिवर्तनों या प्रोटीन जटिल गठन के साथ अनुरूप परिवर्तनों में अंतर्दृष्टि प्रदान की जा सकती है, सभी सेलुलर संदर्भ में। प्रोटीन पदचिह्निंग को एक प्रथागत प्रवाह-आधारित प्रणाली और हाइड्रोजन पेरोक्साइड के फोटोलिसिस के माध्यम से हाइड्रोक्सिल रेडिकल्स को उपज देने के लिए 248 एनएम केआरएफ एक्सीमर लेजर को नियोजित किया गया है, जिसमें एक सेल नमूने के लिए 20 मिनट के विश्लेषण की आवश्यकता होती है। समय-हल FPOP प्रयोगों की सुविधा के लिए, एक नए 6-वेल प्लेट-आधारित आईसी-एफपीओपी प्लेटफॉर्म के उपयोग का बीड़ा उठाया गया था। वर्तमान प्रणाली में, एक एकल लेजर पल्स एक पूरे कुएं से विकिरणित होती है, जो एफओपी प्रायोगिक समय सीमा को काटती है जिसके परिणामस्वरूप विश्लेषण समय के 20 सेकंड होते हैं, 60 गुना कमी आती है। यह बहुत कम विश्लेषण समय एक समय पर निर्भर तरीके से जैव रासायनिक सिग्नलिंग झरना, प्रोटीन तह, और अंतर प्रयोगों (यानी, दवा मुक्त बनाम दवा बाध्य) के रूप में सेलुलर तंत्र अनुसंधान करने के लिए संभव बनाता है । यह नया इंस्ट्रूमेंटेशन, जिसका हकदार प्लेटफ़ॉर्म इनक्यूबेटर विद चल XY Stage (PIXY) है, उपयोगकर्ता को तापमान, सीओ 2 और आर्द्रता नियंत्रण के साथ एक मंच इनक्यूबेटर का उपयोग करके ऑप्टिकल बेंच पर सीधे सेल कल्चर औरआईसी-एफओपी प्रदर्शन करने की अनुमति देता है। मंच भी लेजर बीम मार्गदर्शन के लिए एक स्थिति मंच, peristaltic पंप, और दर्पण प्रकाशिकी भी शामिल है । आईसी-एफओपी स्थितियों जैसे प्रकाशिकी विन्यास, प्रवाह दर, क्षणिक ट्रांसफेक्शन, और PIXY में एच2ओ2 एकाग्रता को अनुकूलित और सहकर्मी-समीक्षा की गई है। प्रणाली के सभी घटकों के स्वचालन से मानव हेरफेर में कमी आएगी और थ्रूपुट में वृद्धि होगी।
प्रोटीन पदचिह्न तकनीक प्रोटीन के संगठन के बारे में गहन जानकारी प्रकट कर सकती है। ये आवश्यक संरचनात्मक जीव विज्ञान एमएस आधारित तकनीक बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री टूलबॉक्स का एक घटक हैं। ये तरीके प्रोटीन हायर ऑर्डर स्ट्रक्चर (एचओएस) और तालमेल को सहसंयोजक लेबलिंग 1,2,3,4के माध्यम से जांच करते हैं । प्रोटीन के फास्ट फोटोकेमिकल ऑक्सीकरण (FPOP) अमीनो एसिड5,6 (तालिका 1)के विलायक सुलभ साइड चेन को ऑक्सीडेटिव रूप से संशोधित करने के लिए हाइड्रोक्सिल रेडिकल्स को रोजगार देता है। यह विधि हाइड्रोक्सिल रेडिकल्स उत्पन्न करने के लिए हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच 2 ओ2)के फोटोलिसिस के लिए248एनएम पर एक एक्सिमर लेजर का उपयोग करती है। सैद्धांतिक रूप से, 20 अमीनो एसिड में से 19 को ग्लाइ अपवाद होने के साथ ऑक्सीडेटिव रूप से संशोधित किया जा सकता है। हालांकि, हाइड्रोक्सिल रेडिकल्स के साथ अमीनो एसिड की अलग-अलग प्रतिक्रियाशीलता दरों के कारण, इनमें से केवल एक सबसेट का संशोधन प्रयोगात्मक रूप से देखा गया है। फिर भी, विधि में प्रोटीन अनुक्रम5की लंबाई में विश्लेषण की क्षमता है। FPOP माइक्रोसेकंड टाइमस्केल पर प्रोटीन को संशोधित करता है, जिससे यह तेजी से दरों के साथ कमजोर बातचीत का अध्ययन करने में उपयोगी हो जाता है। लिगांड-बाइंडिंग या प्रोटीन संरचना में परिवर्तन पर सॉल्वेंट पहुंच में परिवर्तन होता है, इस प्रकार, विधि की शक्ति कई राज्यों में प्रोटीन के लेबलिंग पैटर्न की तुलना में निहित है (यानी, लिगांड-बाउंड की तुलना में लिगांड-मुक्त)। नतीजतन, एफओपी प्रोटीन-प्रोटीन और प्रोटीन-लिगांड इंटरैक्शन साइटों और अनुरूप परिवर्तन7, 8,9,10के क्षेत्रों की पहचान करने में सफल रहा है। एफओपी विधि को शुद्ध प्रोटीन प्रणालियों के अध्ययन से इन-सेल विश्लेषण तक बढ़ाया गया है। इन-सेल एफओपी (आईसी-एफपीओपी) प्रोटेम11, 12में संरचनात्मक जानकारी प्रदान करने के लिए कोशिकाओं में एक हजार से अधिक प्रोटीन को ऑक्सीडेटिव रूप से संशोधित कर सकता है। पारंपरिक आईसी-एफपीओपी मंच लेजर बीम के पिछले एकल फ़ाइल को प्रवाहित करने के लिए एक प्रवाह प्रणाली का उपयोग करता है। इस प्रणाली के विकास ने व्यक्तिगत कोशिकाओं को लेजर विकिरण के समान जोखिम की अनुमति दी। इसके कारण ऑक्सीडेटिव लेबल वाले प्रोटीन 12 की संख्या में13गुना वृद्धि हुई । हालांकि, प्रवाह प्रणाली की एक सीमा एक नमूना प्रयोग की लंबाई है जिसमें 10 मिनट का विकिरण अंतराल होता है जिसके दौरान संशोधन होता है और एक अतिरिक्त 10 मिनट का वॉश चक्र होता है। आईसी-एफओपी की समय की कमी इसे जैव रासायनिक सिग्नलिंग कैस्केड में इंटरैक्शन नेटवर्क के बीच मौजूद अल्पकालिक प्रोटीन तह मध्यवर्ती या परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए अनुपयुक्त बनाती है। इस लौकिक सीमा ने उच्च थ्रूपुट से लैस एक नए आईसी-एफपीओपी प्लेटफॉर्म के डिजाइन को प्रेरित किया।
देशी सेल वातावरण में प्रोटीन उच्च आदेश संरचना को सही ढंग से मापने के लिए, नया डिजाइन सेल संस्कृति को सीधे लेजर प्लेटफॉर्म पर पूरा करने की अनुमति देता है, जो आईसी-एफपीओपी को उच्च थ्रूपुट होने में सक्षम बनाता है। यह सेटअप सेलुलर पर्यावरण के लिए कम से कम क्षोभ की अनुमति देता है, प्रवाह का उपयोग करके आईसी-एफपीओपी के विपरीत जहां अनुयायी कोशिकाओं को सब्सट्रेट से हटाया जाना चाहिए। नया मंच आईसी-एफओपी को एक बाँझ इनक्यूबेशन प्रणाली में होने की अनुमति देता है, जबकि लेजर बीम मार्गदर्शन, XY गति के लिए एक स्थिति प्रणाली, और रासायनिक विनिमय के लिए पेरिस्टाल्टिक पंपों के लिए कॉन्फ़िगर दर्पण प्रकाशिकी का उपयोग करतेहुए एक बाँझ इनक्यूबेशन प्रणाली में होते हैं। आईसी-एफपीओपी के संचालन के लिए नया मंच चल XY स्टेज (PIXY)(चित्रा 1)के साथ प्लेटफ़ॉर्म इनक्यूबेटर का हकदार है। PIXY में, आईसी-एफओपी मंच इनक्यूबेटर कक्ष के भीतर छह अच्छी प्लेटों में उगाई जाने वाली मानव कोशिकाओं पर किया जाता है। इस विन्यास के लिए, लेजर बीम एक स्थिति मंच है कि इनक्यूबेटर रखती है के रूप में बीम संगत दर्पण का उपयोग कर थाली पर नीचे परिलक्षित होता है, XY-विमान में ले जाया जाता है, तो लेजर बीम रणनीतिक केवल एक समय में एक अच्छी तरह से विकिरणित करने के लिए गठबंधन किया है । सत्यापन अध्ययनों से पता चलता है कि प्रवाह प्रणाली की तुलना में PIXY में आईसी-एफपीओपी तेजी से किया जा सकता है और प्रति प्रोटीन अमीनो एसिड संशोधनों में वृद्धि की ओर जाता है। इस नए आईसी-एफओपीओ मंच का विकास उस ज्ञान पर व्याख्या करेगा जिसे सेलुलर प्रयोगों13से प्राप्त किया जा सकता है।
प्रोटीन जीवित कोशिकाओं में बहुत काम करते हैं। इस महत्व को देखते हुए, शुद्ध प्रणालियों के विपरीत कोशिकाओं में बड़े परिसरों और एंजाइमेटिक प्रतिक्रियाओं में जटिलताओं की समझ को गहरा करने के लिए सेलुलर वातावरण में प्रोटीन फ़ंक्शन और उच्च क्रम संरचना (एचओएस) पर विस्तृत डेटा की आवश्यकता है। ऐसा करने के लिए, इन-सेल फास्ट फोटोकेमिकल ऑक्सीडेशन ऑफ प्रोटीन (आईसी-एफओपी) नामक एक हाइड्रोक्सिल रेडिकल प्रोटीन फुट प्रिंटिंग (एचआरएफपी) विधि अपनाई गई थी। अधिकांश एफओपी अध्ययन अपेक्षाकृत शुद्ध प्रोटीन प्रणालियों में विट्रो में किए गए हैं, जो भीड़ वाले आणविक वातावरण के साथ स्पष्ट रूप से विरोधाभासों को प्रभावित करता है जो बाध्यकारी बातचीत और प्रोटीन अनुरूप गतिशीलता को प्रभावित करता है। नतीजतन, इन विट्रो प्रयोगों18 और उन लोगों के निष्कर्षों के बीच एक खाई है जो वास्तविक सेलुलर वातावरण में प्राप्त किए जाएंगे। इन विट्रो एफपीओपी प्रयोग की आदर्शीकृत स्थितियों और सेल की जटिल प्रकृति के बीच के अंतर को पाटने के लिए सेल-एफपीओपी प्लेटफॉर्म में एक नया स्वचालित छह-वेल प्लेट-आधारित विकसित किया गया है। यह उपन्यास एफपीओपी तकनीक इन आणविक प्रजातियों की पहचान करने और उनकी विशेषता बनाने और स्वस्थ और रोगग्रस्त दोनों राज्यों में उनके गतिशील आणविक बातचीत का पता लगाने में सक्षम है। इस नए प्लेटफॉर्म को चल XY स्टेज (PIXY) के साथ प्लेटफॉर्म इनक्यूबेटर कहा जाता है।
एफओपी का उपयोग प्रोटेम के भीतर संरचनात्मक जानकारी को चित्रित करने के लिए सफलतापूर्वक किया गया है। हालांकि, हर जैविक तकनीक की कुछ सीमाएं होती हैं जिन्हें और सुधार की आवश्यकता होती है। लेजर फोटोलिसिस के दौरान और बिना किसी रिएक्टेड हाइड्रोक्सिल रेडिकल्स को कुशलतापूर्वक बुझाने के लिए विशिष्ट अभिकर्मकों की आवश्यकता होती है। पचा पेप्टाइड्स के पृथक्करण संरचनात्मक जानकारी को अधिकतम करने के लिए बड़ी मात्रा में समय की आवश्यकता हो सकती है। जानकारी के इस धन के बाद एमएस डेटा विश्लेषण1के दौरान व्यापक मात्रा की आवश्यकता हो सकती है । लेजर प्लेटफॉर्म पर सेल कल्चर और आईसी-एफपीओपी के लिए जरूरी पेरिफेरल मशीनरी सहित प्लेटफॉर्म इनक्यूबेटर एक बड़ी लागत के साथ आता है जो कुछ लैब्स के लिए संभव नहीं हो सकता है । चूंकि प्रगति जारी है, इसलिए मजबूत सॉफ्टवेयर और विश्लेषण उपकरण तकनीक को आगे बढ़ाना चाहिए; जिनमें से कुछ इस अध्ययन में प्रदर्शित किया गया है । इस प्लेटफ़ॉर्म इनक्यूबेटर में वर्तमान अध्ययन एचईके 293टी कोशिकाओं और सी एलिगेंसमें किए गए हैं। आईसी-एफओपी विधि को चीनी हम्सटर अंडाशय (चो), वेरो, एमसीएफ-7 और एमसीएफ10-ए कोशिकाओं19सहित विभिन्न प्रकार की सेल लाइनों के साथ संगत दिखाया गया है। चूंकि सामान्य आईसी-एफओपीओ विधि इस स्थिर मंच के लिए अनुवादयोग्य है, इसलिए इन सेल लाइनों को PIXY का उपयोग करके अध्ययन के लिए भी उत्तरदायी होना चाहिए।
आईसी-एफओपी एच2ओ2 का उपयोग अमीनो एसिड की सॉल्वेंट सुलभ साइड चेन को ऑक्सीडेटिव रूप से संशोधित करने के लिए करता है, फिर व्यवहार्य कोशिकाओं के भीतर प्रोटीन इंटरैक्शन, संरचना और मेटाबोलिक प्रभाव को आगे बढ़ाने के लिए जो जैविक संदर्भ प्रदान करने में महत्वपूर्ण है। यह एक आईसी-FPOP प्रयोग से पहले आवश्यक है पुष्टि करने के लिए कि कोशिकाओं को एच2O2 इसके अलावा के बाद व्यवहार्य हैं । कोशिका व्यवहार्यता अध्ययनों से पता चला है कि200m M 13तक एच 2 ओ2 सांद्रता की उपस्थिति में कोशिकाएं व्यवहार्य थीं। यह भी सुनिश्चित करें कि एच 2 O2मीडिया को हटा दियाजाता है के बाद कोशिकाओं पर सीधे २०० mm की अंतिम एकाग्रता पर संचार है बनाने के लिए महत्वपूर्ण है । सेल कल्चर मीडिया को पूरी तरह से हटाने में विफलता के कारण एच2ओ2की सांद्रता अलग – अलग हो जाएगी । मानक स्थितियों की तुलना में, एच 2ओ 2 एकाग्रता बढ़ाने केसाथ-साथइनक्यूबेशन समय को 10 सेकंड तक बढ़ाने के कारण प्लेटफ़ॉर्म इनक्यूबेटर में आईसी-एफपीओपी द्वारा संशोधित प्रोटीन की संख्या अधिक हो गई। यह सुनिश्चित करने के लिए पंप ठीक से काम कर रहे है और तरल फैलाया जा रहा है सुनिश्चित करने के लिए उपयोग से पहले प्रधानमंत्री peristaltic पंपों के लिए जरूरी है । ऐसा न करने पर टयूबिंग में हवा के बुलबुले, कोशिकाओं को विसर्जित करने के लिए एच2ओ2 की अपर्याप्त मात्रा, और/या शमन समाधान की अपर्याप्त मात्रा हो सकती है ।
एक और मुद्दा जो पैदा हो सकता है वह है प्रणाली में अवांछित देरी । इसका एक उदाहरण पंप सिस्टम के लिए प्राप्त आदेशों को सत्यापित करने की प्रक्रिया है जो एकीकरण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके 1000 या अधिक मिलीसेकंड के आदेश पर महत्वपूर्ण देरी जोड़ता है। इस समस्या को प्रयोग के दौरान पंपों के साथ संचार को कम करके और जितना संभव हो उतना समय से पहले प्री-सेट कमांड का उपयोग करके तय किया जा सकता है।
भविष्य में, PIXY के लिए लक्ष्य एक पूरी तरह से स्वचालित और एकीकृत प्रणाली का उत्पादन कर रहा है । पेरिस्टाल्टिक पंपों के अलावा, लेजर पल्स का ट्रिगर स्वचालित होगा। गति और सटीकता बढ़ाने के लिए प्लेटफार्म इनक्यूबेटर के तेजी से आवागमन के लिए एक नई पोजिशनिंग प्रणाली का भी उपयोग किया जाएगा। सिस्टम के सभी घटकों को आगे बढ़ाने के लिए एकीकरण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके प्रोग्राम किया जाना जारी रहेगा।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को एनआईएच आर01 जीएम128983-01 से मिलने वाले अनुदान से समर्थन मिला ।
Ismatec Reglo ICC Peristaltic Pumps | Cole-Palmer | 122270050 | |
Kinematic Mirror Mount for Ø2" Optics | Thor Labs | ||
10X trypsin−EDTA | Corning | AB00490-00005 | |
50.0mm 248nm 45°, Excimer Laser Line Mirror | Edmond Optics | ||
Acetone, HPLC Grade | Fisher Scientific | ||
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | ||
ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100Å, 5 µm, 180 µm x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg | Waters | 23275 | other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used |
ACQUITY UPLC M-Class System | Waters | A53225 | |
Afinia H480 3D Printer | (Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library) | ||
air pump | OKOlabs | D12345 | |
Aluminum Foil | Fisher Scientific | Stock #63-120 | |
Aqua 5 µm C18 125 Å packing material | Phenomenex | ||
carbon dioxide unit | OKOlabs | MadMotor®-UHV | |
Centrifuge | Eppendorf | ||
connectors (Y PP 1/16” and 1/16×1/8”) | Cole-Palmer | 116891000 | |
Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 022625501 | |
Dithiothreiotol (DTT) | AmericanBio | ||
DMSO, Anhydrous | Invitrogen | LS118-500 | |
Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Corning | SK-78001-82 | |
EX350 excimer laser | GAM Laser | PI89900 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Corning | SK-12023-78 | |
Formic Acid, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A929-4 | 4 L quantity is not necessary |
HEK293T cells | Paul Shapiro Lab (University of Maryland Baltimore) | ||
humidifier | OKOlabs | Nano-LPMW stage | |
HV3-2 VALVE | Hamilton | BP152-500 | |
Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | LS120-500 | |
Iodoacetamide (IAA) | ACROS Organics | ||
LABVIEW Professional 2018 | National Instruments | 86728 | |
MadMotor Positioning system and controllers | Mad City Labs | W6-4 | |
Methanol, LC/MS Grade | Fisher Scientific | 01-213-100 | any brand is sufficient |
Microcentrifuge | Thermo Scientific | H301-T Unit-BL-PLUS | |
N,N′-Dimethylthiourea (DMTU) | ACROS Organics | ||
Nanopositioinging stage | Mad City Labs | ||
N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN) | ACROS Organics | ||
OKO Touch Monitoring System | OKOlabs | ||
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | 7Z02936 | |
PE50-C pyroelectric energy meter | Ophir Optronics | ||
Penicillin-streptomycin | Corning | ||
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | ||
Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | ||
Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Scientific | 75002436 | |
Pierce Universal Nuclease for Cell Lysis | Fisher Scientific | 06-666A | |
pressure gauge | OKOlabs | OKO-AIR-PUMP-BL | |
PTFE filter | OKOlabs | CO2-UNIT-BL | |
Six 33 mm PLA filament rings | (Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library) | ||
sterile incubator | OKOlabs | ||
temperature unit | OKOlabs | OKO-TOUCH | |
Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer | Fisher Scientific | A117-50 | |
TiNKERcad | (Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library) | ||
Tris Base | Fisher Scientific | H325-100 | any 30% hydrogen peroxide is sufficient |
tubing (Tygon 3.18 and 1.59 ID) | Cole-Palmer | 177350250 | |
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | A454SK-4 | 4 L quantity is not necessary |
Water, LC/MS Grade | Fisher Scientific | 88702 | |
90058 | |||
KM200 | |||
186007496 |