Una nuova piattaforma statica viene utilizzata per caratterizzare la struttura proteica e i siti di interazione nell’ambiente delle cellule native utilizzando una tecnica di impronta proteica chiamata ossidazione fotochimica veloce in cella delle proteine (IC-FPOP).
L’ossidazione fotochimica veloce delle proteine (FPOP) accoppiata con la spettrometria di massa (SM) è diventata uno strumento inestimabile nella proteomica strutturale per interrogare le interazioni proteiche, la struttura e la dinamica conformazionale delle proteine in funzione dell’accessibilità dei solventi. Negli ultimi anni, l’ambito della FPOP, una tecnica di stampa del piede proteico radicale idrossile (HRPF), è stato ampliato all’etichettatura proteica nelle colture di cellule vive, fornendo i mezzi per studiare le interazioni proteiche nell’ambiente cellulare contorto. Le modifiche delle proteine in cellule possono fornire informazioni sui cambiamenti strutturali indotti dal ligando o sui cambiamenti conformazionali che accompagnano la formazione di complessi proteici, il tutto all’interno del contesto cellulare. L’impronta proteica è stata realizzata utilizzando un consueto sistema basato sul flusso e un laser ad eccimeri KrF da 248 nm per produrre radicali idrossili tramite fotolisi del perossido di idrogeno, richiedendo 20 minuti di analisi per un campione di cellule. Per facilitare esperimenti FPOP risolti nel tempo, è stato introdotto l’uso di una nuova piattaforma IC-FPOP basata su piastre a 6 pozzi. Nel sistema attuale, un singolo impulso laser irradia un intero pozzo, che tronca il periodo di tempo sperimentale FPOP con conseguente 20 secondi di tempo di analisi, una diminuzione di 60 volte. Questo tempo di analisi notevolmente ridotto consente di ricercare meccanismi cellulari come cascate di segnalazione biochimica, piegatura delle proteine ed esperimenti differenziali (cioè senza farmaci vs legati al farmaco) in modo dipendente dal tempo. Questa nuova strumentazione, intitolata Platform Incubator with Movable XY Stage (PIXY), consente all’utente di eseguire la coltura cellulare e IC-FPOP direttamente sul banco ottico utilizzando un incubatore di piattaforme con controllo della temperatura, della CO2 e dell’umidità. La piattaforma include anche uno stadio di posizionamento, pompe peristaltiche e ottiche a specchio per la guida del raggio laser. Le condizioni IC-FPOP come la configurazione ottica, le portate, le transettorità transitori e la concentrazione di H2O2 in PIXY sono state ottimizzate e riviste tra pari. L’automazione di tutti i componenti del sistema ridurrà la manipolazione umana e aumenterà la velocità effettiva.
Le tecniche di impronta proteica possono rivelare informazioni profonde sull’organizzazione delle proteine. Queste tecniche essenziali basate sulla biologia strutturale ms sono una componente della cassetta degli attrezzi di spettrometria di massa. Questi metodi sondano la struttura di ordine superiore delle proteine (HOS) e la sinergia tramite l’etichettaturacovalente 1,2,3,4. L’ossidazione fotochimica rapida delle proteine (FPOP) impiega radicali idrossilici per modificare ossidativamente le catene laterali accessibili ai solventi degli amminoacidi5,6 (tabella 1). Il metodo utilizza un laser ad eccimeri a 248 nm per la fotolisi del perossido di idrogeno (H2O2) per generare radicali idrossilici. Teoricamente, 19 dei 20 amminoacidi possono essere modificati ossidativamente con Gly come unica eccezione. Tuttavia, a causa dei vari tassi di reattività degli amminoacidi con radicali idrossilici, la modifica di un solo sottoinsieme di questi è stata osservata sperimentalmente. Tuttavia, il metodo ha il potenziale di analisi sulla lunghezza di una sequenza proteica5. FPOP modifica le proteine sulla scala cronologica dei microsecondi, rendendola utile nello studio delle interazioni deboli con tassi di spegnimento rapidi. L’accessibilità del solvente cambia sul legame del ligando o su un cambiamento nella conformazione proteica, quindi, la potenza del metodo sta nel confronto del modello di etichettatura di una proteina in più stati (cioè senza ligandi rispetto al legante ligando). Di conseguenza, FPOP è riuscito a identificare siti di interazione proteina-proteina e proteina-ligando e regioni di cambiamento conformazionale7,8,9,10. Il metodo FPOP è stato esteso dallo studio dei sistemi proteici purificati all’analisi in cella. L’FPOP in-cell (IC-FPOP) può modificare ossidativamente oltre mille proteine nelle cellule per fornire informazioni strutturali attraverso il proteoma11,12. La piattaforma IC-FPOP convenzionale utilizza un sistema di flusso per scorrere le celle a singolo file oltre il raggio laser. Lo sviluppo di questo sistema ha permesso alle singole cellule di avere la stessa esposizione all’irradiazione laser. Ciò ha portato a un aumento di 13 volte del numero di proteine etichettate ossidativamente12. Tuttavia, una limitazione del sistema di flusso è la lunghezza di un singolo esperimento campione costituito da un intervallo di irradiazione di 10 minuti durante il quale avviene la modifica e da un ciclo di lavaggio aggiuntivo di 10 minuti. I vincoli di tempo dell’IC-FPOP lo rendono inadatto allo studio di intermedi di piegatura delle proteine di breve durata o cambiamenti che esistono tra le reti di interazione nelle cascate di segnalazione biochimica. Questa limitazione temporale ha ispirato il design di una nuova piattaforma IC-FPOP dotata di una maggiore produttività.
Per misurare con precisione la struttura di ordine superiore delle proteine nell’ambiente delle cellule native, il nuovo design consente di realizzare la coltura cellulare direttamente sulla piattaforma laser, il che consente all’IC-FPOP di essere ad alta produttività. Questa configurazione consente anche perturbazioni ridotte al minimo nell’ambiente cellulare, a differenza dell’IC-FPOP utilizzando il flusso in cui le cellule aderenti devono essere rimosse dal substrato. La nuova piattaforma consente a IC-FPOP di verificarsi in un sistema di incubazione sterile utilizzando una camera superiore a CO 2 e a temperatura controllatamentre si utilizzano ottiche a specchio configurate per la guida del raggio laser, un sistema di posizionamento per il movimento XY e pompe peristaltiche per lo scambio chimico. La nuova piattaforma per la conduzione di IC-FPOP si intitola Platform Incubator with Movable XY Stage (PIXY) (Figura 1). In PIXY, IC-FPOP viene effettuato su cellule umane coltivate in piastre a sei po porti all’interno della camera dell’incubatore della piattaforma. Per questa configurazione, il raggio laser viene riflesso verso il basso sulla piastra utilizzando specchi compatibili con il fascio come uno stadio di posizionamento che tiene l’incubatore viene spostato, nel piano XY, quindi il raggio laser è strategicamente allineato per irradiare solo un pozzo alla volta. Studi di convalida mostrano che IC-FPOP può essere eseguito più velocemente in PIXY che nel sistema di flusso e porta ad un aumento delle modifiche degli amminoacidi per proteina. Lo sviluppo di questa nuova piattaforma IC-FPOP esporrà le conoscenze che possono essere acquisite dagli esperimenti cellulari13.
Le proteine eseguono gran parte del lavoro nelle cellule viventi. Data questa importanza, sono necessari dati dettagliati sulla funzione proteica e sulla struttura di ordine superiore (HOS) nell’ambiente cellulare per approfondire la comprensione delle complessità in complessi più grandi e reazioni enzimatiche nelle cellule rispetto ai sistemi purificati. Per fare questo, è stato adottato un metodo di stampa a piedi proteica radicale idrossile (HRFP) intitolato In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins (IC-FPOP). La maggior parte degli studi FPOP sono stati effettuati in vitro in sistemi proteici relativamente puri, il che contrasta marcatamente con l’ambiente molecolare affollato che influisce sulle interazioni di legame e sulla dinamica conformazionale delle proteine. Di conseguenza, c’è un abisso tra i risultati degli esperimenti in vitro 18 e quelli che si oserebbe in un ambiente cellulare reale. Per colmare il divario tra le condizioni idealizzate di un esperimento FPOP in vitro e la natura complessa della cellula, è stata sviluppata una nuova piattaforma automatizzata a sei pozzi basata su piastre in cell-FPOP. Questa nuova tecnologia FPOP è in grado di identificare e caratterizzare queste specie molecolari e tracciare le loro interazioni molecolari dinamiche sia in stati sani che massati. Questa nuova piattaforma si chiama Platform Incubator con stadio Movable XY (PIXY).
FPOP è stato utilizzato con successo per caratterizzare le informazioni strutturali all’interno del proteoma. Tuttavia, ogni tecnica biologica ha alcune limitazioni che richiedono ulteriori miglioramenti. Durante la fotolisi laser sono necessari reagenti specifici per temprare in modo efficiente radicali idrossilici non reagenti. La separazione dei peptidi digeriti può richiedere grandi quantità di tempo per massimizzare le informazioni strutturali. Questa ricchezza di informazioni può anche richiedere un’ampia quantificazione durante l’analisi dei dati post-MS1. L’incubatore di piattaforme, compresi i macchinari periferici necessari per la coltura cellulare e IC-FPOP sulla piattaforma laser, ha un costo elevato che potrebbe non essere fattibile per alcuni laboratori. Man mano che si continuano a compiere progressi, software e strumenti di analisi robusti dovrebbero far avanzare ulteriormente la tecnica; alcuni dei quali sono esposti in questo studio. Studi attuali in questo incubatore di piattaforme sono stati eseguiti su cellule HEK293T e in C. elegans. Il metodo IC-FPOP ha dimostrato di essere compatibile con un’ampia varietà di linee cellulari tra cui ovaio di criceto cinese (CHO), Vero, MCF-7 e cellule MCF10-A19. Poiché il metodo IC-FPOP generale è traducibile in questa piattaforma statica, queste linee cellulari dovrebbero essere suscettibili di studio anche utilizzando PIXY.
IC-FPOP utilizza H2O2 per modificare ossidativamente catene laterali accessibili ai solventi di amminoacidi, per poi discernere ulteriormente le interazioni proteiche, la struttura e gli effetti metabolici all’interno di cellule vitali che è significativo nel fornire contesto biologico. È essenziale prima di un esperimento IC-FPOP confermare che le cellule sono vitali dopo l’aggiunta di H2O2. Studi di vitalità cellulare hanno dimostrato che le cellule erano vitali in presenza di concentrazioni di H2O2 fino a 200 mM 13. È anche importante assicurarsi che H2O2 venga infuso ad una concentrazione finale di 200 mM direttamente sulle cellule dopo la rimozione del supporto. La mancata rimozione completa dei mezzi di coltura cellulare causerà concentrazioni variabili di H2O2. Rispetto alle condizioni standard, l’aumento del tempo di incubazione a 10 secondi insieme all’aumento della concentrazione di H2O2 ha portato a un numero maggiore di proteine modificate da IC-FPOP nell’incubatore della piattaforma. È imperativo innescare pompe peristaltiche prima dell’uso per garantire che le pompe funzionino correttamente e che il liquido venga disperso. In caso di incapacità di farlo, le bolle d’aria nei tubi, il volume insufficiente di H2O2 per immergere le celle e/o il volume insufficiente di soluzione di tempra.
Un altro problema che può sorgere sono i ritardi indesiderati nel sistema. Un esempio di ciò è il processo di verifica dei comandi ricevuti per i sistemi di pompaggio che aggiunge ritardi significativi dell’ordine di 1000 o più millisecondi utilizzando il software di integrazione. Questo problema può essere risolto riducendo al minimo la comunicazione con le pompe durante l’esperimento e utilizzando comandi pre-impostati in anticipo il più possibile.
In futuro, l’obiettivo di PIXY è produrre un sistema completamente automatizzato e integrato. Oltre alle pompe peristaltiche, l’attivazione dell’impulso laser sarà automatizzata. Un nuovo sistema di posizionamento sarà utilizzato anche per il rapido movimento dell’incubatore di piattaforme per migliorare la velocità e la precisione. Tutti i componenti del sistema continueranno a essere programmati utilizzando il software di integrazione per aumentare ulteriormente la velocità effettiva.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione del NIH R01 GM128983-01.
Ismatec Reglo ICC Peristaltic Pumps | Cole-Palmer | 122270050 | |
Kinematic Mirror Mount for Ø2" Optics | Thor Labs | ||
10X trypsin−EDTA | Corning | AB00490-00005 | |
50.0mm 248nm 45°, Excimer Laser Line Mirror | Edmond Optics | ||
Acetone, HPLC Grade | Fisher Scientific | ||
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | ||
ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100Å, 5 µm, 180 µm x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg | Waters | 23275 | other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used |
ACQUITY UPLC M-Class System | Waters | A53225 | |
Afinia H480 3D Printer | (Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library) | ||
air pump | OKOlabs | D12345 | |
Aluminum Foil | Fisher Scientific | Stock #63-120 | |
Aqua 5 µm C18 125 Å packing material | Phenomenex | ||
carbon dioxide unit | OKOlabs | MadMotor®-UHV | |
Centrifuge | Eppendorf | ||
connectors (Y PP 1/16” and 1/16×1/8”) | Cole-Palmer | 116891000 | |
Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 022625501 | |
Dithiothreiotol (DTT) | AmericanBio | ||
DMSO, Anhydrous | Invitrogen | LS118-500 | |
Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Corning | SK-78001-82 | |
EX350 excimer laser | GAM Laser | PI89900 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Corning | SK-12023-78 | |
Formic Acid, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A929-4 | 4 L quantity is not necessary |
HEK293T cells | Paul Shapiro Lab (University of Maryland Baltimore) | ||
humidifier | OKOlabs | Nano-LPMW stage | |
HV3-2 VALVE | Hamilton | BP152-500 | |
Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | LS120-500 | |
Iodoacetamide (IAA) | ACROS Organics | ||
LABVIEW Professional 2018 | National Instruments | 86728 | |
MadMotor Positioning system and controllers | Mad City Labs | W6-4 | |
Methanol, LC/MS Grade | Fisher Scientific | 01-213-100 | any brand is sufficient |
Microcentrifuge | Thermo Scientific | H301-T Unit-BL-PLUS | |
N,N′-Dimethylthiourea (DMTU) | ACROS Organics | ||
Nanopositioinging stage | Mad City Labs | ||
N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN) | ACROS Organics | ||
OKO Touch Monitoring System | OKOlabs | ||
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | 7Z02936 | |
PE50-C pyroelectric energy meter | Ophir Optronics | ||
Penicillin-streptomycin | Corning | ||
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | ||
Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | ||
Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Scientific | 75002436 | |
Pierce Universal Nuclease for Cell Lysis | Fisher Scientific | 06-666A | |
pressure gauge | OKOlabs | OKO-AIR-PUMP-BL | |
PTFE filter | OKOlabs | CO2-UNIT-BL | |
Six 33 mm PLA filament rings | (Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library) | ||
sterile incubator | OKOlabs | ||
temperature unit | OKOlabs | OKO-TOUCH | |
Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer | Fisher Scientific | A117-50 | |
TiNKERcad | (Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library) | ||
Tris Base | Fisher Scientific | H325-100 | any 30% hydrogen peroxide is sufficient |
tubing (Tygon 3.18 and 1.59 ID) | Cole-Palmer | 177350250 | |
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | A454SK-4 | 4 L quantity is not necessary |
Water, LC/MS Grade | Fisher Scientific | 88702 | |
90058 | |||
KM200 | |||
186007496 |