En ny statisk plattform brukes til å karakterisere proteinstruktur og interaksjonssteder i det opprinnelige cellemiljøet ved hjelp av en proteinfotavtrykksteknikk kalt in-cell rask fotokjemisk oksidasjon av proteiner (IC-FPOP).
Rask fotokjemisk oksidasjon av proteiner (FPOP) kombinert med massespektrometri (MS) har blitt et uvurderlig verktøy i strukturell proteomikk for å forhøre proteininteraksjoner, struktur og proteinkonformasjonsdynamikk som en funksjon av løsningsmiddeltilgjengelighet. I de senere år har omfanget av FPOP, en hydroksylradikal proteinfotutskriftsteknikk (HRPF), blitt utvidet til proteinmerking i levende cellekulturer, noe som gir midler til å studere proteininteraksjoner i det innviklede cellulære miljøet. In-cell protein modifikasjoner kan gi innsikt i ligand induserte strukturelle endringer eller konformasjonsendringer som følger med proteinkompleksdannelse, alt innenfor den cellulære konteksten. Proteinfotavtrykk er oppnådd ved hjelp av et vanlig strømningsbasert system og en 248 nm KrF excimer laser for å gi hydroksylradikaler via fotolyse av hydrogenperoksid, som krever 20 minutters analyse for en celleprøve. For å lette tidsavklarte FPOP-eksperimenter ble bruken av en ny 6-brønns platebasert IC-FPOP-plattform banebrytende. I det nåværende systemet bestråler en enkelt laserpuls en hel brønn, noe som avkorter FPOP eksperimentell tidsramme som resulterer i 20 sekunders analysetid, en 60 ganger reduksjon. Denne sterkt reduserte analysetiden gjør det mulig å forske på cellulære mekanismer som biokjemiske signalkaskader, proteinfolding og differensialeksperimenter (dvs. stofffrie vs. legemiddelbundne) på en tidsavhengig måte. Denne nye instrumenteringen, med tittelen Platform Incubator with Movable XY Stage (PIXY), lar brukeren utføre cellekultur og IC-FPOP direkte på den optiske benken ved hjelp av en plattforminkubator med temperatur, CO2 og fuktighetskontroll. Plattformen inkluderer også et posisjoneringsstadium, peristaltiske pumper og speiloptikk for laserstråleveiledning. IC-FPOP-forhold som optikkkonfigurasjon, strømningshastigheter, forbigående transfeksjoner og H2O2-konsentrasjon i PIXY er optimalisert og fagfellevurdert. Automatisering av alle komponenter i systemet vil redusere menneskelig manipulering og øke gjennomstrømningen.
Proteinfotavtrykksteknikker kan avsløre dyp informasjon om organisering av proteiner. Disse essensielle strukturelle biologi MS-baserte teknikkene er en komponent i massespektrometri verktøykassen. Disse metodene sonderer protein høyere ordensstruktur (HOS) og synergi via kovalente merking1,2,3,4. Rask fotokjemisk oksidasjon av proteiner (FPOP) bruker hydroksylradikaler for å oksidativt modifisere løsningsmiddel tilgjengelige sidekjeder av aminosyrer5,6 (Tabell 1). Metoden benytter en excimer laser på 248 nm for fotolyse av hydrogenperoksid(H2O2) for å generere hydroksylradikaler. Teoretisk sett kan 19 av de 20 aminosyrene oksidativt modifiseres med Gly som det eneste unntaket. På grunn av de varierende reaktivitetsratene for aminosyrer med hydroksylradikaler, har imidlertid modifikasjon av bare en undergruppe av disse blitt observert eksperimentelt. Likevel har metoden potensial for analyse over lengden på en proteinsekvens5. FPOP endrer proteiner på mikrosekund tidsskalaen, noe som gjør det nyttig å studere svake interaksjoner med raske avhastigheter. Løsningsmiddeltilgjengelighet endres ved ligandbinding eller en endring i proteinkonformasjon, og dermed ligger metodens kraft i sammenligningen av etikettmønsteret til et protein i flere tilstander (dvs. ligandfritt sammenlignet med ligandbundet). Som et resultat har FPOP lykkes i å identifisere proteinprotein og protein-ligand interaksjonssteder og områder av konformasjonsendring7,8,9,10. FPOP-metoden er utvidet fra studiet av rensede proteinsystemer til in-cell analyse. In-cell FPOP (IC-FPOP) kan oksidativt modifisere over tusen proteiner i celler for å gi strukturell informasjon på tvers av proteomet11,12. Den konvensjonelle IC-FPOP-plattformen bruker et strømningssystem for å strømme celler enkeltfil forbi laserstrålen. Utviklingen av dette systemet tillot individuelle celler å ha lik eksponering for laserbestråling. Dette førte til en 13 ganger økning i antall oksidativt merkede proteiner12. En begrensning av strømningssystemet er imidlertid lengden på et enkelt prøveeksperiment som består av et 10-minutters bestrålingsintervall der modifikasjonen finner sted og en ekstra 10-minutters vaskesyklus. Tidsbegrensningene til IC-FPOP gjør det uegnet til å studere kortvarige proteinfoldende mellomprodukter eller endringer som eksisterer blant interaksjonsnettverk i biokjemiske signalkaskader. Denne tidsbegrensningen inspirerte utformingen av en ny IC-FPOP-plattform utstyrt med høyere gjennomstrømning.
For å nøyaktig måle protein høyere ordensstruktur i det opprinnelige cellemiljøet, gjør den nye designen det mulig å oppnå cellekultur direkte på laserplattformen, noe som gjør at IC-FPOP kan være høy gjennomstrømning. Dette oppsettet tillater også minimerte perturbasjoner til mobilmiljøet, i motsetning til IC-FPOP ved hjelp av flyt der tilhengerceller må fjernes fra substratet. Den nye plattformen tillater IC-FPOP å forekomme i et sterilt inkubasjonssystem ved hjelp av et CO2- og temperaturkontrollert toppkammer mens du bruker konfigurert speiloptikk for laserstråleveiledning, et posisjoneringssystem for XY-bevegelse og peristaltiske pumper for kjemisk utveksling. Den nye plattformen for gjennomføring av IC-FPOP har tittelen Plattforminkubator med bevegelig XY Stage (PIXY) (Figur 1). I PIXY utføres IC-FPOP på menneskelige celler som vokser i seks brønnplater i plattforminkubatorkammeret. For denne konfigurasjonen reflekteres laserstrålen nedover på platen ved hjelp av strålekompatible speil som et posisjoneringsstadium som holder inkubatoren, i XY-flyet, slik at laserstrålen er strategisk justert for å bare bestråle en brønn om gangen. Valideringsstudier viser at IC-FPOP kan utføres raskere i PIXY enn i strømningssystemet og fører til økte aminosyremodifikasjoner per protein. Utviklingen av denne nye IC-FPOP-plattformen vil avsløre kunnskapen som kan oppnås fra cellulære eksperimenter13.
Proteiner utfører mye av arbeidet i levende celler. Gitt denne betydningen er det nødvendig med detaljerte data om proteinfunksjon og høyere ordensstruktur (HOS) i det cellulære miljøet for å utdype forståelsen av vanskelighetene i større komplekser og enzymatiske reaksjoner i celler i motsetning til rensede systemer. For å gjøre dette ble en hydroksylradikal proteinfotutskrift (HRFP) -metode vedtatt med tittelen In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins (IC-FPOP). De fleste FPOP-studier har blitt gjort in vitro i relativt rene proteinsystemer, som markert står i kontrast til det overfylte molekylære miljøet som påvirker bindende interaksjoner og proteinkonformasjonsdynamikk. Som et resultat er det en kløft mellom funnene fra in vitro-eksperimenter 18 og de som vil bli oppnådd i et faktisk mobilmiljø. For å bygge bro mellom de idealiserte forholdene til et in vitro FPOP-eksperiment og cellens komplekse natur, er det utviklet en ny automatisert seksbrønns platebasert i celle-FPOP-plattformen. Denne nye FPOP-teknologien er i stand til å identifisere og karakterisere disse molekylære artene og spore deres dynamiske molekylære interaksjoner i både sunne og syke tilstander. Denne nye plattformen kalles Platform Incubator med Bevegelig XY-trinn (PIXY).
FPOP har blitt brukt til å karakterisere strukturinformasjonen i proteomet. Imidlertid har hver biologisk teknikk visse begrensninger som krever ytterligere forbedring. Spesifikke reagenser kreves under laserfotolyse og for effektivt å slukke ikke-utførte hydroksylradikaler. Separasjon av fordøyde peptider kan kreve store mengder tid for å maksimere strukturell informasjon. Denne mengden informasjon kan også kreve omfattende mengder under dataanalyse etter MS1. Plattforminkubatoren, inkludert det perifere maskineriet som trengs for cellekultur og IC-FPOP på laserplattformen, kommer med en stor kostnad som kanskje ikke er mulig for noen laboratorier. Etter hvert som fremgangen fortsetter å bli gjort, bør robuste programvare- og analyseverktøy fremme teknikken ytterligere; noen av dem vises frem i denne studien. Nåværende studier i denne plattformen inkubator har blitt utført på HEK293T celler og i C. elegans. IC-FPOP-metoden har vist seg å være kompatibel med en rekke cellelinjer, inkludert kinesisk hamsterovarie (CHO), Vero, MCF-7 og MCF10-A-cellene19. Siden den generelle IC-FPOP-metoden kan oversettes til denne statiske plattformen, bør disse cellelinjene også være egnet for studier ved hjelp av PIXY.
IC-FPOP bruker H2O2 til å oksidativt modifisere løsemiddel tilgjengelige sidekjeder av aminosyrer, for deretter å ytterligere skjelne proteininteraksjoner, struktur og metabolske effekter i levedyktige celler som er signifikante i å gi biologisk kontekst. Det er viktig før et IC-FPOP-eksperiment for å bekrefte at cellene er levedyktige etter H2O2 tillegg. Celle levedyktighetsstudier viste at cellene var levedyktige i nærvær av H2O2-konsentrasjoner opp til 200 mM 13. Det er også viktig å sørge for at H2O2 er infundert ved en endelig konsentrasjon på 200 mM direkte på celler etter at mediet er fjernet. Unnlatelse av å fjerne cellekulturmedier helt vil føre til varierende konsentrasjoner av H2O2. Sammenlignet med standardforhold førte økning av inkubasjonstiden til 10 sekunder sammen med å øke H2O2-konsentrasjonen til et høyere antall proteiner modifisert av IC-FPOP i plattforminkubatoren. Det er viktig å klargjøre peristaltiske pumper før bruk for å sikre at pumpene fungerer som de skal og at væsken spres. Unnlatelse av å gjøre dette kan føre til luftbobler i slangen, utilstrekkelig volum av H2O2 til å senke ned celler, og / eller utilstrekkelig volum av slukkeoppløsning.
Et annet problem som kan oppstå er uønskede forsinkelser i systemet. Et eksempel på dette er prosessen med å verifisere mottatte kommandoer for pumpesystemene som legger til betydelige forsinkelser i rekkefølgen 1000 eller flere millisekunder ved hjelp av integrasjonsprogramvaren. Dette problemet kan løses ved å minimere kommunikasjonen med pumpene under eksperimentet og bruke forhåndsinnstilte kommandoer på forhånd så mye som mulig.
I fremtiden produserer målet for PIXY et helautomatisk og integrert system. I tillegg til de peristaltiske pumpene, vil utløsningen av laserpulsen bli automatisert. Et nytt posisjoneringssystem vil også bli brukt til rask bevegelse av plattforminkubatoren for å forbedre hastighet og nøyaktighet. Alle komponenter i systemet vil fortsatt være programmert ved hjelp av integrasjonsprogramvaren for å øke gjennomstrømningen ytterligere.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra NIH R01 GM128983-01.
Ismatec Reglo ICC Peristaltic Pumps | Cole-Palmer | 122270050 | |
Kinematic Mirror Mount for Ø2" Optics | Thor Labs | ||
10X trypsin−EDTA | Corning | AB00490-00005 | |
50.0mm 248nm 45°, Excimer Laser Line Mirror | Edmond Optics | ||
Acetone, HPLC Grade | Fisher Scientific | ||
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | ||
ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100Å, 5 µm, 180 µm x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg | Waters | 23275 | other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used |
ACQUITY UPLC M-Class System | Waters | A53225 | |
Afinia H480 3D Printer | (Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library) | ||
air pump | OKOlabs | D12345 | |
Aluminum Foil | Fisher Scientific | Stock #63-120 | |
Aqua 5 µm C18 125 Å packing material | Phenomenex | ||
carbon dioxide unit | OKOlabs | MadMotor®-UHV | |
Centrifuge | Eppendorf | ||
connectors (Y PP 1/16” and 1/16×1/8”) | Cole-Palmer | 116891000 | |
Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 022625501 | |
Dithiothreiotol (DTT) | AmericanBio | ||
DMSO, Anhydrous | Invitrogen | LS118-500 | |
Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Corning | SK-78001-82 | |
EX350 excimer laser | GAM Laser | PI89900 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Corning | SK-12023-78 | |
Formic Acid, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A929-4 | 4 L quantity is not necessary |
HEK293T cells | Paul Shapiro Lab (University of Maryland Baltimore) | ||
humidifier | OKOlabs | Nano-LPMW stage | |
HV3-2 VALVE | Hamilton | BP152-500 | |
Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | LS120-500 | |
Iodoacetamide (IAA) | ACROS Organics | ||
LABVIEW Professional 2018 | National Instruments | 86728 | |
MadMotor Positioning system and controllers | Mad City Labs | W6-4 | |
Methanol, LC/MS Grade | Fisher Scientific | 01-213-100 | any brand is sufficient |
Microcentrifuge | Thermo Scientific | H301-T Unit-BL-PLUS | |
N,N′-Dimethylthiourea (DMTU) | ACROS Organics | ||
Nanopositioinging stage | Mad City Labs | ||
N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN) | ACROS Organics | ||
OKO Touch Monitoring System | OKOlabs | ||
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | 7Z02936 | |
PE50-C pyroelectric energy meter | Ophir Optronics | ||
Penicillin-streptomycin | Corning | ||
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | ||
Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | ||
Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Scientific | 75002436 | |
Pierce Universal Nuclease for Cell Lysis | Fisher Scientific | 06-666A | |
pressure gauge | OKOlabs | OKO-AIR-PUMP-BL | |
PTFE filter | OKOlabs | CO2-UNIT-BL | |
Six 33 mm PLA filament rings | (Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library) | ||
sterile incubator | OKOlabs | ||
temperature unit | OKOlabs | OKO-TOUCH | |
Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer | Fisher Scientific | A117-50 | |
TiNKERcad | (Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library) | ||
Tris Base | Fisher Scientific | H325-100 | any 30% hydrogen peroxide is sufficient |
tubing (Tygon 3.18 and 1.59 ID) | Cole-Palmer | 177350250 | |
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | A454SK-4 | 4 L quantity is not necessary |
Water, LC/MS Grade | Fisher Scientific | 88702 | |
90058 | |||
KM200 | |||
186007496 |