Proteinlerin hücre içi hızlı fotokimyasal oksidasyonu (IC-FPOP) adı verilen bir protein ayak izi tekniği kullanılarak yerel hücre ortamındaki protein yapısını ve etkileşim alanlarını karakterize etmek için yeni bir statik platform kullanılır.
Proteinlerin hızlı fotokimyasal oksidasyonu (FPOP) kütle spektrometresi (MS) ile birleştiğinde, solvent erişilebilirliğinin bir işlevi olarak protein etkileşimlerini, yapısını ve protein konformasyon dinamiklerini sorgulamak için yapısal proteomikte paha biçilmez bir araç haline gelmiştir. Son yıllarda, bir hidroksil radikal protein ayak basımı (HRPF) tekniği olan FPOP’un kapsamı, canlı hücre kültürlerinde protein etiketlemeye genişletilerek, dolambaçlı hücresel ortamda protein etkileşimlerini incelemenin imkanı sağlanmıştır. Hücre içi protein modifikasyonları, hepsi hücresel bağlamda, protein kompleksi oluşumuna eşlik eden ligand indüklenmiş yapısal değişiklikler veya konformasyon değişiklikleri hakkında fikir verebilir. Protein ayak izi, bir hücre örneği için 20 dakikalık analiz gerektiren hidrojen peroksitin fotolizi yoluyla hidroksil radikalleri elde etmek için geleneksel akış tabanlı bir sistem ve 248 nm KrF ekscimer lazer kullanarak gerçekleştirildi. Zaman çözümlü FPOP deneylerini kolaylaştırmak için, 6 kuyu tabanlı yeni bir IC-FPOP platformunun kullanılmasına öncülük edildi. Mevcut sistemde, tek bir lazer darbesi tüm kuyuyu ışınlar, bu da FPOP deneysel zaman dilimini keserek 20 saniyelik analiz süresine, 60 kat azalmaya neden olan. Bu büyük ölçüde azaltılmış analiz süresi, biyokimyasal sinyal basamakları, protein katlama ve diferansiyel deneyler (yani, ilaçsız ve ilaca bağlı) gibi hücresel mekanizmaların zamana bağlı bir şekilde araştırılmasını mümkün kılar. Hareketli XY Stage (PIXY) ile Platform İnkübatörü başlıklı bu yeni enstrümantasyon, kullanıcının sıcaklık, CO2 ve nem kontrolüne sahip bir platform inkübatörü kullanarak hücre kültürünü ve IC-FPOP’u doğrudan optik tezgahta gerçekleştirmesini sağlar. Platform ayrıca lazer ışını yönlendirmesi için konumlandırma aşaması, peristaltik pompalar ve ayna optikleri içerir. PIXY’de optik konfigürasyonu, akış hızları, geçici transeksiyonlar ve H 2 O2 konsantrasyonu gibi IC-FPOP koşulları optimize edilmiş ve hakemli olarak incelenmiştir. Sistemin tüm bileşenlerinin otomasyonu insan manipülasyonu azaltacak ve verimi artıracaktır.
Protein ayak izi teknikleri, proteinlerin organizasyonu hakkında derin bilgiler ortaya açabilir. Bu temel yapısal biyoloji MS tabanlı teknikler kütle spektrometresi araç kutusunun bir bileşenidir. Bu yöntemler protein yüksek sıra yapısını (HOS) ve sinerjiyi1,2, 3,4kovalent etiketlemesi ile araştırır. Proteinlerin hızlı fotokimyasal oksidasyonu (FPOP), amino asitlerin solventle erişilebilir yan zincirlerini oksidatif olarak değiştirmek için hidroksil radikalleri kullanmaktadır5,6 (Tablo 1). Yöntem, hidroksil radikalleri üretmek için hidrojen peroksitin fotolizi (H2 O 2)için248nm’de bir ekscimer lazer kullanır. Teorik olarak, 20 amino asidin 19’ı Gly yalnız istisnası olarak oksidatif olarak değiştirilebilir. Bununla birlikte, hidroksil radikalleri olan amino asitlerin değişen reaktivite oranları nedeniyle, bunların sadece bir alt kümesinin modifikasyonu deneysel olarak gözlenmiştir. Yine de, yöntem bir protein dizisinin uzunluğu üzerinde analiz potansiyeline sahiptir5. FPOP, mikrosaniye zaman ölçeğindeki proteinleri değiştirerek hızlı kapatma oranlarıyla zayıf etkileşimleri çalışmada yararlı hale getirir. Solvent erişilebilirliği ligand bağlama veya protein uyumundaki bir değişiklik üzerine değişir, bu nedenle yöntemin gücü, bir proteinin birden fazla durumda etiketleme deseninin (yani ligand-bound ile karşılaştırıldığında ligand içermeyen) karşılaştırılmasında yatır. Sonuç olarak, FPOP protein-protein ve protein-ligand etkileşim alanlarını ve konformasyonsal değişim bölgelerini belirlemede başarılı olmuştur7,8,9,10. FPOP yöntemi saflaştırılmış protein sistemlerinin çalışmasından hücre içi analize kadar genişletilmiştir. Hücre içi FPOP (IC-FPOP), proteom11,12arasında yapısal bilgi sağlamak için hücrelerdeki binden fazla proteini oksidatif olarak değiştirebilir. Geleneksel IC-FPOP platformu, hücreleri lazer ışınını tek bir dosyadan geçirmek için bir akış sistemi kullanır. Bu sistemin gelişimi, bireysel hücrelerin lazer ışınlanmasına eşit maruz kalmasına izin sağladı. Bu, oksidatif olarak etiketlenmiş proteinlerin sayısında 13 kat artışa yol açtı12. Bununla birlikte, akış sisteminin bir sınırlaması, değişikliğin gerçekleştiği 10 dakikalık ışınlama aralığından ve ek 10 dakikalık yıkama döngüsünden oluşan tek bir örnek deneyin uzunluğudur. IC-FPOP’un zaman kısıtlamaları, biyokimyasal sinyal basamaklarında kısa ömürlü protein katlama aralarını veya etkileşim ağları arasında var olan değişiklikleri incelemek için uygun değildir. Bu zamansal sınırlama, daha yüksek verimle donatılmış yeni bir IC-FPOP platformunun tasarımına ilham verdi.
Yerel hücre ortamında protein yüksek dereceli yapıyı doğru bir şekilde ölçmek için, yeni tasarım hücre kültürünün doğrudan lazer platformunda gerçekleştirilmesine izin verir ve bu da IC-FPOP’un yüksek verim olmasını sağlar. Bu kurulum ayrıca, yapıştırılan hücrelerin alt tabakadan çıkarılması gereken akışı kullanarak IC-FPOP’un aksine hücresel ortama en aza indirilmiş pertürbasyonlara izin verir. Yeni platform, IC-FPOP’un co2 ve sıcaklık kontrollü bir sahne üst odası kullanarak steril bir inkübasyon sisteminde gerçekleşmesine izin verirken, lazer ışını güdümü için yapılandırılmış ayna optikleri, XY hareketi için bir konumlandırma sistemi ve kimyasal değişim için peristaltik pompalar kullanır. IC-FPOP’u yürütmek için yeni platform Hareketli XY Stage (PIXY) ile Platform İnkübatörü(Şekil 1)olarak ad altındadır. PIXY’de IC-FPOP, platform inkübatör odası içinde altı kuyulu plakalarda yetiştirilen insan hücreleri üzerinde gerçekleştirilir. Bu yapılandırma için, lazer ışını, inkübatörün XY düzleminde hareket ettirilme aşaması olarak ışın uyumlu aynalar kullanılarak plakaya aşağı doğru yansıtılır, bu nedenle lazer ışını stratejik olarak aynı anda sadece bir kuyu ışınlamak için hizalanır. Doğrulama çalışmaları, IC-FPOP’un PIXY’de akış sistemine göre daha hızlı gerçekleştirilebileceğini ve protein başına amino asit modifikasyonlarının artmasına yol açtığını göstermektedir. Bu yeni IC-FPOP platformunun geliştirilmesi, hücresel deneylerden elde edilebilecek bilgileri ortaya çıkar13.
Proteinler işin çoğunu canlı hücrelerde gerçekleştirir. Bu önem göz önüne alındığında, daha büyük komplekslerdeki inceliklerin ve hücrelerdeki enzymatic reaksiyonların saflaştırılmış sistemlerin aksine anlaşılmasını derinleştirmek için hücresel ortamda protein fonksiyonu ve daha yüksek sıra yapısı (HOS) hakkında ayrıntılı verilere ihtiyaç vardır. Bunu yapmak için, Proteinlerin Hücre İçi Hızlı Fotokimyasal Oksidasyonu (IC-FPOP) başlıklı bir hidroksil radikal protein ayak baskısı (HRFP) yöntemi benimsenmiştir. Çoğu FPOP çalışması nispeten saf protein sistemlerinde in vitro olarak yapılmıştır, bu da bağlayıcı etkileşimleri ve protein konformasyon dinamiklerini etkileyen kalabalık moleküler ortamla belirgin bir şekilde tezat oluşturur. Sonuç olarak, in vitro deneyler18’den elde edilen bulgular ile gerçek bir hücresel ortamda elde edilecek bulgular arasında bir uçurum vardır. Bir in vitro FPOP deneyinin idealize edilmiş koşulları ile hücrenin karmaşık doğası arasındaki boşluğu kapatmak için, hücre-FPOP platformunda altı kuyulu yeni bir otomatik plaka tabanlı geliştirilmiştir. Bu yeni FPOP teknolojisi, bu moleküler türleri tanımlayıp karakterize edebilir ve hem sağlıklı hem de hastalıklı durumlarda dinamik moleküler etkileşimlerini takip edebilir. Bu yeni platforma Hareketli XY aşamasına (PIXY) sahip Platform Inkübatörü denir.
FPOP, proteom içindeki yapısal bilgileri karakterize etmek için başarıyla kullanılmıştır. Bununla birlikte, her biyolojik tekniğin daha fazla iyileştirme gerektiren belirli sınırlamaları vardır. Lazer fotoliz sırasında ve reaktifsiz hidroksil radikallerini verimli bir şekilde söndürmek için spesifik reaktifler gereklidir. Sindirilmiş peptitlerin ayrılması, yapısal bilgileri en üst düzeye çıkarmak için büyük miktarda zaman gerektirebilir. Bu bilgi zenginliği, MS sonrası veri analizi sırasında da kapsamlı nicelik gerektirebilir1. Hücre kültürü için gerekli periferik makineler ve lazer platformundaki IC-FPOP da dahil olmak üzere platform inkübatörü, bazı laboratuvarlar için mümkün olmayabilecek büyük bir maliyetle birlikte gelir. İlerleme kaydedilmeye devam ettikçe, sağlam yazılım ve analiz araçları tekniği daha da ilerletmelidir; bazıları bu çalışmada sergilenmiştir. Bu platform inkübatörde güncel çalışmalar HEK293T hücrelerinde ve C. elegans’ta gerçeklenmiştir. IC-FPOP yönteminin Çin hamster yumurtalığı (CHO), Vero, MCF-7 ve MCF10-A hücreleri19dahil olmak üzere çok çeşitli hücre hatları ile uyumlu olduğu gösterilmiştir. Genel IC-FPOP yöntemi bu statik platforma çevrilebilir olduğundan, bu hücre hatları PIXY kullanılarak da çalışmaya uygun olmalıdır.
IC-FPOP, amino asitlerin solventle erişilebilir yan zincirlerini oksidatif olarak değiştirmek içinH2 O2’yi kullanır, daha sonra biyolojik bağlam sağlamada önemli olan canlı hücreler içindeki protein etkileşimlerini, yapısını ve metabolik etkilerini daha da ayırt eder. Hücrelerin H2O2 ilavesinden sonra uygulanabilir olduğunu doğrulamak için bir IC-FPOP deneyinden önce gereklidir. Hücre canlılığı çalışmaları, hücrelerin200mM 13’ekadar H2 O 2 konsantrasyonlarının varlığında uygulanabilir olduğunu göstermiştir. H 2O 2’ninortam çıkarıldıktan sonra doğrudan hücrelere 200 mM’lik son bir konsantrasyonda aşılandığından emin olmak da önemlidir. Hücre kültürü ortamlarının tamamen kaldırılmaması, değişen konsantrasyonlarda H2O2. Standart koşullarla karşılaştırıldığında, kuluçka süresinin 10 saniyeye çıkarılması ve H2O2 konsantrasyonunun artırılması, platform inkübatörde IC-FPOP tarafından değiştirilen daha yüksek sayıda proteine yol açtı. Pompaların düzgün çalıştığından ve sıvının dağıldığından emin olmak için kullanmadan önce peristaltik pompaların astar edilmesi zorunludur. Bunun yapılmaması boruda hava kabarcıklarına, hücreleri batırmak için yetersiz H2O2 hacmine ve/veya yetersiz söndürme çözeltisine neden olabilir.
Ortaya çıkabilecek bir diğer konu da sistemdeki istenmeyen gecikmelerdir. Bunun bir örneği, entegrasyon yazılımını kullanarak 1000 veya daha fazla milisaniyelik siparişte önemli gecikmeler ekleyen pompa sistemleri için alınan komutları doğrulama işlemidir. Bu sorun, deney sırasında pompalarla iletişimi en aza indirerek ve önceden ayarlanmış komutları mümkün olduğunca önceden kullanarak düzeltilebilir.
Gelecekte, PIXY için hedef tam otomatik ve entegre bir sistem üretmektir. Peristaltik pompalara ek olarak, lazer darbesinin tetiklenilmesi otomatikleştirilecektir. Hız ve doğruluğu artırmak için platform inkübatörünün hızlı hareketi için yeni bir konumlandırma sistemi de kullanılacaktır. Sistemin tüm bileşenleri, verimi daha da artırmak için entegrasyon yazılımı kullanılarak programlanarak programlanarak devam edecektir.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma NIH R01 GM128983-01’den bir hibe ile desteklendi.
Ismatec Reglo ICC Peristaltic Pumps | Cole-Palmer | 122270050 | |
Kinematic Mirror Mount for Ø2" Optics | Thor Labs | ||
10X trypsin−EDTA | Corning | AB00490-00005 | |
50.0mm 248nm 45°, Excimer Laser Line Mirror | Edmond Optics | ||
Acetone, HPLC Grade | Fisher Scientific | ||
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | ||
ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100Å, 5 µm, 180 µm x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg | Waters | 23275 | other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used |
ACQUITY UPLC M-Class System | Waters | A53225 | |
Afinia H480 3D Printer | (Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library) | ||
air pump | OKOlabs | D12345 | |
Aluminum Foil | Fisher Scientific | Stock #63-120 | |
Aqua 5 µm C18 125 Å packing material | Phenomenex | ||
carbon dioxide unit | OKOlabs | MadMotor®-UHV | |
Centrifuge | Eppendorf | ||
connectors (Y PP 1/16” and 1/16×1/8”) | Cole-Palmer | 116891000 | |
Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 022625501 | |
Dithiothreiotol (DTT) | AmericanBio | ||
DMSO, Anhydrous | Invitrogen | LS118-500 | |
Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Corning | SK-78001-82 | |
EX350 excimer laser | GAM Laser | PI89900 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Corning | SK-12023-78 | |
Formic Acid, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A929-4 | 4 L quantity is not necessary |
HEK293T cells | Paul Shapiro Lab (University of Maryland Baltimore) | ||
humidifier | OKOlabs | Nano-LPMW stage | |
HV3-2 VALVE | Hamilton | BP152-500 | |
Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | LS120-500 | |
Iodoacetamide (IAA) | ACROS Organics | ||
LABVIEW Professional 2018 | National Instruments | 86728 | |
MadMotor Positioning system and controllers | Mad City Labs | W6-4 | |
Methanol, LC/MS Grade | Fisher Scientific | 01-213-100 | any brand is sufficient |
Microcentrifuge | Thermo Scientific | H301-T Unit-BL-PLUS | |
N,N′-Dimethylthiourea (DMTU) | ACROS Organics | ||
Nanopositioinging stage | Mad City Labs | ||
N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN) | ACROS Organics | ||
OKO Touch Monitoring System | OKOlabs | ||
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | 7Z02936 | |
PE50-C pyroelectric energy meter | Ophir Optronics | ||
Penicillin-streptomycin | Corning | ||
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | ||
Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | ||
Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Scientific | 75002436 | |
Pierce Universal Nuclease for Cell Lysis | Fisher Scientific | 06-666A | |
pressure gauge | OKOlabs | OKO-AIR-PUMP-BL | |
PTFE filter | OKOlabs | CO2-UNIT-BL | |
Six 33 mm PLA filament rings | (Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library) | ||
sterile incubator | OKOlabs | ||
temperature unit | OKOlabs | OKO-TOUCH | |
Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer | Fisher Scientific | A117-50 | |
TiNKERcad | (Innovation Space University of Maryland Baltimore Campus Library) | ||
Tris Base | Fisher Scientific | H325-100 | any 30% hydrogen peroxide is sufficient |
tubing (Tygon 3.18 and 1.59 ID) | Cole-Palmer | 177350250 | |
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | A454SK-4 | 4 L quantity is not necessary |
Water, LC/MS Grade | Fisher Scientific | 88702 | |
90058 | |||
KM200 | |||
186007496 |