Summary
यह लेख एक ऊतक प्रत्यारोपण तकनीक का वर्णन करता है जिसे क्रानियोफेशियल विकास के दौरान बेसल फोरब्रेन के सिग्नलिंग और पैटर्निंग गुणों का परीक्षण करने के लिए डिज़ाइन किया गया था।
Abstract
एवियन भ्रूण का उपयोग एक सदी से अधिक समय से एक मॉडल प्रणाली के रूप में किया गया है और इससे कशेरुक विकास की मौलिक समझ हुई है। इस मॉडल प्रणाली की शक्तियों में से एक यह है कि ऊतकों के प्रभाव और बातचीत का मूल्यांकन सीधे चिमेरिक भ्रूण में किया जा सकता है। हमने पहले दिखाया है कि फोरब्रेन से संकेत फ्रंटोनेसल एक्टोडर्मल ज़ोन (एफईजेड) में सोनिक हेजहोग (एसएचएच) के अभिव्यक्ति डोमेन के आकार को विनियमित करके चेहरे के मोर्फोजेनेसिस में योगदान करते हैं। इस लेख में, फोरब्रेन चिमेरा उत्पन्न करने और इन प्रयोगों के परिणामों के चित्र प्रदान करने की विधि का वर्णन किया गया है।
Introduction
विकासात्मक जीव विज्ञान में अधिकांश समकालीन अनुसंधान भ्रूण को आकार देने में जीन की भूमिका पर केंद्रित है। आनुवंशिक परिप्रेक्ष्य से विकास तंत्र की जांच करने के लिए अच्छे उपकरण हैं। हालांकि, भ्रूण को इकट्ठा किया जाता है और ऊतक इंटरैक्शन के जवाब में मोर्फोजेनेसिस से गुजरना पड़ता है। एवियन सिस्टम एक क्लासिक उपकरण है जिसका उपयोग विभिन्न प्रकार के ऊतक इंटरैक्शन का आकलन करने के लिए किया जाता है जो निम्नलिखित कारणों से विकास को नियंत्रित करता है: भ्रूणविज्ञान अच्छी तरह से समझा जाता है, भ्रूण आसानी से सुलभ हैं, एवियन सिस्टम के विश्लेषण के लिए उपकरण अच्छी तरह से विकसित हैं, और भ्रूण सस्ते हैं।
एवियन प्रत्यारोपण प्रणाली को व्यापक रूप से वंश अनुरेखण के लिए और लगभग एक सदी 1,2,3,4 के लिए विकास के दौरान ऊतक इंटरैक्शन का आकलन करने के लिए नियोजित किया गया है। इस प्रणाली का उपयोग एक सिग्नलिंग सेंटर, फ्रंटोनासल एक्टोडर्मल ज़ोन (एफईजेड) की जांच करने के लिए किया गया था, जो ऊपरी जबड़े5 के मोर्फोजेनेसिस को नियंत्रित करता है, और उस तकनीक का वर्णन करते हुए एक वीडियो प्रकाशितकिया गया था। बटेर-चूजे के अलावा, ऊतक इंटरैक्शन के विश्लेषण के लिए चिमेरा का उत्पादन करने के लिए अन्य प्रजातियों का भी उपयोग किया गया है। उदाहरण के लिए, माउस एफईजेड को जंगली प्रकार 7 और उत्परिवर्ती चूहों8 से प्रत्यारोपित किया गया था, और अन्य ने चेहरे के कंकाल 9,10,11,12 को पैटर्न करने में तंत्रिका शिखा की भूमिका का आकलन करने के लिए बतख, बटेर और चिक सिस्टम का उपयोग किया है।
इस काम में, बटेर, बतख और चूजा भ्रूण के बीच पारस्परिक रूप से वेंट्रल फोरब्रेन को प्रत्यारोपित करके एफईजेड में जीन अभिव्यक्ति के पैटर्न को विनियमित करने में फोरब्रेन की भूमिका का आकलन किया गया था, क्योंकि एफईजेड में सोनिक हेजहोग अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए फोरब्रेन से एक संकेत की आवश्यकता होती है। फोरब्रेन प्रत्यारोपण क्षेत्र में अद्वितीय नहीं हैं। इन प्रत्यारोपणों का उपयोग बटेर और बतख भ्रूण13 में गतिशीलता के विकास का आकलन करने के लिए किया गया था, हालांकि इन प्रयोगों में गैर-तंत्रिका डेरिवेटिव में योगदान देने वाले ऊतकों को भी प्रत्यारोपित किया गया था। अन्य काम में, पक्षियों में श्रवण सर्किट का मूल्यांकन फोरब्रेन प्रत्यारोपण14 द्वारा किया गया है, लेकिन इन प्रत्यारोपणों में अनुमानित तंत्रिका शिखा कोशिकाएं शामिल हैं, जो चेहरे के आकार 9,10 में योगदान करती हैं और एफईजेड15 में एसएचएच अभिव्यक्ति को विनियमित करने में भाग लेती हैं। इसलिए, तंत्रिका ट्यूब के बंद होने से पहले पक्षी की एक प्रजाति से दूसरी प्रजाति में उदर अग्रमस्तिष्क को प्रत्यारोपित करने के लिए एक प्रणाली तैयार की गई थी ताकि चेहरे के आकार16 (चित्रा 1 ए, बी) में मस्तिष्क की भूमिका का आकलन किया जा सके। यह विधि ग्राफ्ट के तंत्रिका शिखा संदूषण से रहित थी। इस लेख में, विधि को चित्रित किया गया है और अपेक्षित परिणामों का वर्णन किया गया है, और सामना की जाने वाली चुनौतियों पर चर्चा की गई है।
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Protocol
सफेद पेकिन बतख (अनास प्लैटायरहिंकोस), सफेद लेगहॉर्न चिकन (गैलस गैलस) और जापानी बटेर (कॉर्टुनिक्स कोटरनिक्स जापोनिका) को एक ह्यूमिडिफाइड कक्ष में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया जाता है, जब तक कि एचएच 7/817 पर चरण-मिलान नहीं किया जाता है।
1. दाता ऊतक तैयार करना
नोट: अभिकर्मकों और उपकरणों की तैयारी और प्रयोगात्मक हेरफेर के लिए अंडे खोलने का तरीका6 वर्णित किया गया है।
- तटस्थ लाल, ग्लास ट्रांसफर पिपेट और तेज टंगस्टन सुइयों के साथ डीएमईएम मीडिया तैयार करें।
- भ्रूण को उजागर करें (जैसा कि6 में दिखाया गया है)।
- चरण 7/8 भ्रूण के बेसल फोरब्रेन के बाईं ओर से ऊतक ग्राफ्ट की कटाई करें। घुमावदार तेज टंगस्टन सुइयों6 का उपयोग करके ~ 0.3 मिमी लंबाई और चौड़ाई में ~ 0.3 मिमी मापने वाले फोरब्रेन के एक टुकड़े को धीरे से इंजेक्ट करें, ताकि फोरब्रेन के नीचे सुई को स्लाइड करके अंतर्निहित एंडोडर्म को शामिल न किया जाए ताकि सुई तंत्रिका ट्यूब की धुरी के समानांतर हो।
- ग्लास ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करके, दाता भ्रूण से ग्राफ्ट उठाएं।
- ग्राफ्ट को न्यूट्रल रेड (पीबीएस में 0.01%, 23 डिग्री सेल्सियस) युक्त डीएमईएम में 2 मिनट के लिए स्थानांतरित करें, और फिर दाग वाले ग्राफ्ट को डीएमईएम में रखें जिसमें न्यूट्रल रेड नहीं होता है जब तक कि एनग्राफमेंट के लिए तैयार न हो।
2. मेजबान को तैयार करना
- एचएच 7/8 17 तक एक ह्यूमिडिफाइड कक्ष में 37 डिग्री सेल्सियस पर सफेद लेगहॉर्न चिकन (गैलस गैलस) से निषेचित अंडे को इनक्यूबेट करें।
- भ्रूण को उजागर करें (जैसा कि6 में दिखाया गया है)।
- तेज टंगस्टन सुइयों का उपयोग करके, धीरे से काटकर ग्राफ्ट साइट तैयार करें, फिर ग्राफ्ट को समायोजित करने के लिए बाईं ओर से बेसल फोरब्रेन के 0.3 मिमी बाय 0.2 मिमी टुकड़े को हटा दें जैसा कि दाता ऊतक को अलग करने के लिए किया गया था।
- अंतर्निहित एंडोडर्म के अत्यधिक व्यवधान से बचने के लिए ध्यान रखें, जो स्पष्ट होगा क्योंकि जर्दी कणिकाएं किसी भी आंसू के माध्यम से लीक होना शुरू हो जाएंगी। इसके लिए अभ्यास की आवश्यकता होती है और सभी प्रयास सफल नहीं होंगे।
- मेजबान6 में स्थानांतरित करने के बाद, मेजबान के एक्सटिर्पेटेड बेसल फोरब्रेन को बदलने के लिए ग्राफ्ट को स्थिति दें।
- छेद पर टेप कसकर रखें और विश्लेषण के लिए उचित समय के लिए भ्रूण को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में वापस करें।
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Representative Results
चिमेरिज्म और प्रत्यारोपण संदूषण का आकलन
चिमेरा का आकलन करने के लिए, अन्य सेल प्रकारों के साथ ग्राफ्ट के चिमेरिज्म और संदूषण की सीमा को संबोधित किया जाना चाहिए। बटेर के ऊतकों को चूजे के भ्रूण में प्रत्यारोपित करके चिमेरा बनाना इस प्रकार के विश्लेषण की अनुमति देता है। क्यूसीपीएन एंटीबॉडी बटेर कोशिकाओं का उपयोग करके मेजबान ऊतकों (चित्रा 1 सी, डी) से कल्पना और अलग किया जा सकता है। इस मामले में, केवल वेंट्रल फोरब्रेन से प्राप्त ऊतकों को एंटीबॉडी के साथ दाग दिया गया था जो दर्शाता है कि ग्राफ्ट तंत्रिका शिखा सहित अन्य सेल प्रकारों से दूषित नहीं था। चिमेरिज्म की सीमा का अनुमान इन वर्गों से मेजबान और दाता कोशिकाओं की गणना करने या दाता और मेजबान ऊतकों द्वारा कब्जा किए गए क्षेत्र का आकलन करके स्टेरोलॉजी का उपयोग करके लगाया जा सकता है।
रूपात्मक और आणविक परिणामों का आकलन
इसका उद्देश्य एफईजेड में चेहरे की आकृति विज्ञान और एसएचएच अभिव्यक्ति पर वेंट्रल फोरब्रेन के प्रभाव का आकलन करना था। प्रारंभ में, बटेर ऊतक को बतख भ्रूण में प्रत्यारोपित किया गया था ताकि ऊपर वर्णित चिमेरिज्म का आकलन करने के लिए क्यूसीपीएन का उपयोग किया जा सके। हालांकि, तेजी से विकसित बटेर मस्तिष्क ने गंभीर रूप से विकृत चिमेरा (चित्रा 2) को जन्म दिया, जिसने प्रयोगों में इस दृष्टिकोण को रोक दिया। इस सीमा के कारण चिकन भ्रूण में बतख के ऊतकों को प्रत्यारोपित करने का उपयोग प्रयोगात्मक विश्लेषण के लिए किया गया था। हालांकि इसने चिमेरिज्म के आकलन की अनुमति नहीं दी, लेकिन ऐसा करने के लिए बटेर चिक सिस्टम का उपयोग किया गया और पुष्टि की गई कि सभी ग्राफ्ट में केवल तंत्रिका ऊतक16 शामिल थे। परिणामस्वरूप बतख-चिक चिमेरा में रूपात्मक परिवर्तन थे जो सुझाव देते थे कि मस्तिष्क ने आकृति विज्ञान को विनियमित करने में भाग लिया (चित्रा 3)। प्रत्यारोपण का बतख पक्ष धीमी गति से विकसित हुआ और अधिक बतख की तरह दिखाई दिया। यह निर्धारित करने के लिए एक मात्रात्मक विश्लेषण का उपयोग किया गया था कि इन चिमेरा को बतख आकृति विज्ञान16 की ओर स्थानांतरित कर दिया गया था। चूंकि नियंत्रण चरण बतख और चूजा भ्रूण से मेल खाता था, साथ ही चूजा-चूजा चिमेरा का उपयोग किया गया था।
एसएचएच अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए सीटू संकरण में पूरे माउंट का उपयोग किया गया था। आकृति विज्ञान के समान, चिमेरा के बतख पक्ष पर एसएचएच अभिव्यक्ति अधिक बतख जैसी दिखाई दी (चित्रा 3)। इस अभिव्यक्ति डोमेन को सिर के आकार16 के साथ सहसंबद्ध दिखाने के लिए एक मात्रात्मक विश्लेषण18 का भी उपयोग किया गया था।
चित्र 1. प्रायोगिक भ्रूण में चिमेरिज्म का प्रत्यारोपण और मूल्यांकन
(ए) चरण 8 चिकन भ्रूण का पृष्ठीय दृश्य जो तटस्थ लाल रंग से सना हुआ है, ग्राफ्ट और एनग्राफमेंट साइट के स्थान को दर्शाता है। (बी) एसएचएच अभिव्यक्ति दिखाने के लिए सीटू संकरण के बाद चरण 8 चिकन भ्रूण के माध्यम से क्रॉस सेक्शन में दिखाया गया है। ग्राफ्ट का अनुमानित स्थान दिखाया गया है, लाल बिंदीदार बॉक्स। (सी) बटेर-चिक चिमेरा में क्यूसीपीएन का पता लगाने के लिए इम्यूनोस्टेनिंग से पता चलता है कि ग्राफ्ट व्यापक है और केवल वेंट्रो-लेटरल न्यूरल ट्यूब (तीर) और वेंट्रल ऑप्टिक कप (एरोहेड) में योगदान देता है। स्केल बार: A: 500 μm, B: 100 μm, C: 1 mm, D: 200 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 2. बटेर-डक चिमेरा की आकृति विज्ञान का आकलन।
(ए, बी) स्टेज 22 में बटेर-डक चिमेरा के दो उदाहरण। इन भ्रूणों में गंभीर विकृतियां हैं जो आगे के विश्लेषण को रोकती हैं। स्केल पट्टी: 2 मिमी कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 3. डक-चिक चिमेरा का आकलन।
(ए) एसएचएच अभिव्यक्ति की कल्पना करने के लिए सीटू संकरण में पूरे माउंट के बाद चरण 22 में सामान्य चूजा और (बी) बतख भ्रूण। (सी) एक चूजा-चूजा नियंत्रण एसएचएच और आकृति विज्ञान का एक पैटर्न दिखाता है जो एक सामान्य चूजा भ्रूण जैसा दिखता है। (डी) एक बतख-चूजा चिमेरा एसएचएच अभिव्यक्ति का एक परिवर्तित पैटर्न दिखाता है। प्रत्यारोपित पक्ष पर एसएचएच अभिव्यक्ति (पीली बिंदीदार रेखा) अधिक गोल होती है और बतख पैटर्न जैसा दिखता है। नाक का गड्ढा भी मेजबान पक्ष (लाल तीर) पर अधिक "स्लिट" जैसी उपस्थिति की तुलना में प्रत्यारोपित पक्ष (पीला तीर) पर अधिक गोल होता है। लाल पट्टी मध्य रेखा को इंगित करती है और प्रत्यारोपण छवि के दाईं ओर है। स्केल पट्टी: 1 मिमी कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
वर्णित विधि बेसल फोरब्रेन और आसन्न एक्टोडर्म के बीच ऊतक इंटरैक्शन की परीक्षा की अनुमति देती है। यह दृष्टिकोण पिछले फोरब्रेन प्रत्यारोपण विधियों से भिन्न है, क्योंकि दाता ऊतक वेंट्रल फोरब्रेन तक ही सीमित था। यह तंत्रिका शिखा कोशिकाओं के प्रत्यारोपण को समाप्त करता है, जिन्हें चेहरे की आकृति विज्ञान 9,10 के पैटर्न में भाग लेने के लिए दिखाया गया है। इसलिए, नियोजित प्रयोगात्मक परिणामों का मूल्यांकन करने के लिए ग्राफ्ट को बेसल फोरब्रेन तक सीमित करना आवश्यक था।
पिछले शोध में जो फोरब्रेन प्रत्यारोपण13,14 को नियोजित करते थे, अतिरिक्त-तंत्रिका ऊतक की उपस्थिति ने नियोजित परिणाम उपायों की व्याख्या में हस्तक्षेप नहीं किया, क्योंकि परिणाम या तो व्यवहारिक थे, या विशेष रूप से समग्र मस्तिष्क विकास पर मेजबान और दाता वातावरण का परीक्षण किया था। इन भ्रूण संबंधी दृष्टिकोणों का उपयोग करके प्रयोगों को डिजाइन करने में यह एक महत्वपूर्ण विचार है और व्यवहार्यता को कठोरता के साथ संतुलित किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, अनुमानित तंत्रिका शिखा कोशिकाओं को बाहर करने की आवश्यकता ने दूर करने के लिए महत्वपूर्ण बाधाएं पैदा कीं। प्रत्यारोपण प्रारंभिक न्यूरुला चरण भ्रूण पर किया जाना था। इन चरणों में एंडोडर्म प्रत्यारोपण स्थल से तुरंत सटे होते हैं, और एंडोडर्म को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए अत्यधिक देखभाल की जानी चाहिए, क्योंकि इससे अस्तित्व कम हो जाता है। हालांकि यह स्पष्ट नहीं है कि एंडोडर्म द्वारा ग्राफ्ट का संदूषण परिणाम उपायों को प्रभावित करेगा, लक्ष्य विशेष रूप से चेहरे के विकास पर वेंट्रल फोरब्रेन के प्रभाव को अलग करना था। इसलिए, इस उद्देश्य के लिए अतिरिक्त कठोरता की आवश्यकता थी।
मेजबान और दाता प्रजातियों के विकास की दर पर विचार करने की आवश्यकता है। जबकि इन जानवरों की दरों में अंतर का उपयोग विकासशील चेहरे के कंकाल19,20 को पैटर्न करने में तंत्रिका शिखा कोशिकाओं की भूमिका का आकलन करने में लाभ के लिए किया गया है, इस मामले में, तेजी से विकसित बटेर तंत्रिका ऊतक ने धीमी विकासशील बतख में प्रत्यारोपित होने पर बेहद विकृत भ्रूण बनाए। इसका मतलब था कि चिमेरिज्म और संदूषण का मूल्यांकन चिक मेजबानों में बटेर ऊतक ग्राफ्टिंग द्वारा बनाए गए चिमेरा के एक अन्य सेट में किया जाना था, और जबकि आदर्श नहीं था, इसने ग्राफ्टिंग तकनीक में विश्वास प्रदान किया।
कुल मिलाकर, विकास के दौरान ऊतक इंटरैक्शन का आकलन करने के लिए चिमेरा बनाना विकास के तंत्र को समझने में मदद करने के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण हो सकता है। योजना के चरणों के दौरान देखभाल की आवश्यकता होती है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि परिणाम यथासंभव निर्णायक होंगे, और उचित नियंत्रण निर्धारित किए गए हैं जिनमें सर्जरी के कारण भिन्नता के लिए सामान्य भ्रूण और अन्य चिमेरा शामिल हैं। इस मामले में, मात्रात्मक विश्लेषण को नियोजित करना बहुत महत्वपूर्ण था, क्योंकि देखे गए परिवर्तन सूक्ष्म थे।
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Disclosures
सभी लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
इस प्रकाशन में रिपोर्ट किए गए शोध को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ डेंटल एंड क्रैनियोफेशियल रिसर्च द्वारा पुरस्कार संख्या आर01डीई019648, आर01डीई018234 और आर01डीई019638 के तहत समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | TEK | TEKZR114 | |
| 35x10 mm Petri dish | Falcon | 1008 | |
| DMEM | Thermofisher | 11965084 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Neutral Red | Sigma | 553-24-2 | |
| No. 5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Pasteur Pipets | Thermofisher | 13-678-6B | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma bank, Iowa University, Iowa, USA | ||
| Scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Tungsten Needle | Fine Science Tools | 26000 |
References
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