Summary
В этой статье описывается метод трансплантации тканей, который был разработан для проверки сигнальных и паттернирующих свойств базального переднего мозга во время черепно-лицевого развития.
Abstract
Птичий эмбрион использовался в качестве модельной системы более века и привел к фундаментальному пониманию развития позвоночных. Одной из сильных сторон этой модельной системы является то, что влияние и взаимодействие между тканями могут быть непосредственно оценены у химерных эмбрионов. Ранее мы показали, что сигналы от переднего мозга способствуют морфогенезу лица, регулируя форму домена экспрессии звукового ежа (SHH) в лобно-эктодермальной зоне (FEZ). В данной статье описан метод генерации химер переднего мозга и приведены иллюстрации результатов этих экспериментов.
Introduction
Многие современные исследования в области биологии развития сосредоточены на роли генов в формировании эмбрионов. Существуют хорошие инструменты для изучения механизмов развития с генетической точки зрения. Однако эмбрионы собираются и подвергаются морфогенезу в ответ на тканевые взаимодействия. Птичья система является классическим инструментом, используемым для оценки разнообразия тканевых взаимодействий, регулирующих развитие, по следующим причинам: эмбриология хорошо изучена, эмбрионы легко доступны, инструменты для анализа птичьих систем хорошо развиты, а эмбрионы недороги.
Система трансплантации птиц широко используется для отслеживания происхождения и оценки тканевых взаимодействий во время развития в течение почти столетия 1,2,3,4. Эта система была использована для исследования сигнального центра, фронтоназальной эктодермальной зоны (FEZ), которая регулирует морфогенез верхней челюсти5, и ранее было опубликовано видео, описывающее эту технику6. В дополнение к перепелам-птенцам, другие виды также использовались для получения химер для анализа тканевых взаимодействий. Например, мышь FEZ была пересажена от дикого типа7 и мутантных мышей8, а другие использовали системы утки, перепела и цыплят для оценки роли нервного гребня в формировании паттерна лицевого скелета 9,10,11,12.
В этой работе была оценена роль переднего мозга в регуляции паттерна экспрессии генов в СЭЗ путем реципрокной трансплантации вентрального переднего мозга между эмбрионами перепелов, уток и цыплят, поскольку для индуцирования экспрессии звукового ежа в СЭЗ требуется сигнал от переднего мозга. Трансплантация переднего мозга не уникальна в этой области. Эти трансплантаты использовали для оценки развития подвижности у эмбрионов перепелов и уток13, хотя в этих экспериментах также трансплантировали ткани, которые вносили вклад в ненейронные производные. В другой работе слуховые контуры у птиц были оценены с помощью трансплантации переднего мозга14, но эти трансплантаты содержали предполагаемые клетки нервного гребня, которые вносят вклад в форму лица 9,10 и участвуют в регуляции экспрессии SHH в FEZ 15. Следовательно, для оценки роли мозга в формелица 16 была разработана система для пересадки только вентрального переднего мозга от одного вида птиц к другому до закрытия нервной трубки (рис. 1A, B). Этот метод был лишен контаминации нервного гребня трансплантата. В этой статье проиллюстрирован метод и описаны ожидаемые результаты, а также обсуждены проблемы, с которыми приходится сталкиваться.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Белая пекинская утка (Anas platyrhynchos), белая курица породы леггорн (Gallus gallus) и японский перепел (Cortunix coturnix japonica) инкубируются при температуре 37 °C во влажной камере до согласования стадии HH7/817.
1. Подготовка донорской ткани
ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовление реагентов и инструментов, а также способ вскрытия яиц для экспериментальных манипуляций был описан6.
- Подготовьте носитель DMEM с нейтральным красным цветом, стеклянной пипеткой для переноса и заточенными вольфрамовыми иглами.
- Экспонируйте эмбрионы (как показано нарисунке 6).
- Забор тканевых трансплантатов с левой стороны базального переднего мозга эмбрионов 7/8 стадии. Используйте изогнутые заостренные вольфрамовые иглы6 , чтобы аккуратно надрезать кусок переднего мозга размером ~ 0,3 мм в длину и 0,2 мм в ширину, следя за тем, чтобы не включать нижележащую энтодерму, скользя иглой под передним мозгом так, чтобы игла была параллельна оси нервной трубки.
- Используя стеклянную пипетку для переноса, возьмите трансплантат у донорского эмбриона.
- Перенесите трансплантат в DMEM, содержащий нейтральный красный (0,01% в PBS, 23 °C), на 2 минуты, чтобы окрасить его, а затем поместите окрашенный трансплантат в DMEM, который не содержит нейтрального красного, до тех пор, пока он не будет готов к приживлению.
2. Подготовка хоста
- Инкубируют оплодотворенные яйца белой курицы породы Леггорн (Gallus gallus) при 37 °C в увлажненной камере до HH7/8 17.
- Экспонируйте эмбрионы (как показано нарисунке 6).
- Используя заостренные вольфрамовые иглы, подготовьте место трансплантата, аккуратно разрезав, а затем удалив кусок базального переднего мозга размером 0,3 мм на 0,2 мм с левой стороны, чтобы разместить трансплантат, как это было сделано для изоляции донорской ткани.
- Позаботьтесь о том, чтобы избежать чрезмерного разрушения основной энтодермы, что будет очевидно, поскольку гранулы желтка начнут просачиваться через любой сделанный разрыв. Это требует практики, и не все попытки будут успешными.
- После переноса на хозяина6 поместите трансплантат так, чтобы заменить экстирпированный базальный передний мозг хозяина.
- Плотно наклейте ленту на отверстие и верните эмбрион в инкубатор с температурой 37 °C на соответствующий период времени для анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Оценка химеризма и контаминации трансплантата
Чтобы оценить химеры, следует рассмотреть степень химеризма и контаминации трансплантата другими типами клеток. Создание химер путем пересадки тканей перепелов в эмбрионы цыплят позволяет проводить этот тип анализа. С помощью антител QCPN клетки перепелов можно визуализировать и отличить от тканей хозяина (рис. 1 C,D). В этом случае только ткани, полученные из вентрального переднего мозга, были окрашены антителом, указывающим на то, что трансплантат не был загрязнен другими типами клеток, включая нервный гребень. Степень химеризма может быть оценена по этим срезам с использованием стереологии либо для подсчета клеток хозяина и донора, либо путем оценки площади, занимаемой тканями донора и хозяина.
Оценка морфологических и молекулярных исходов
Цель состояла в том, чтобы оценить влияние вентрального переднего мозга на морфологию лица и экспрессию SHH в СЭЗ. Первоначально ткань перепела была пересажена эмбрионам уток, чтобы использовать QCPN для оценки химеризма, как описано выше. Однако более быстро развивающийся мозг перепелов приводил к сильно деформированным химерам (рис. 2), что исключало такой подход в экспериментах. Из-за этого ограничения для экспериментального анализа использовалась трансплантация тканей уток в куриные эмбрионы. Хотя это не позволило оценить химеризм, для этого была использована система цыплят перепелов, которая подтвердила, что все трансплантаты состояли только из нервной ткани16. Полученные химеры утки-цыплята имели морфологические изменения, которые предполагали, что мозг участвует в регуляции морфологии (рис. 3). Утиная сторона трансплантата, по-видимому, развивалась медленнее и казалась более похожей на уток. Количественный анализ был использован для определения того, что эти химеры были смещены в сторону морфологии уток16. В качестве контрольной стадии соответствовали эмбрионы утки и цыпленка, а также химеры цыпленка-цыпленка.
Для оценки экспрессии SHH использовали гибридизацию in situ. Подобно морфологии, экспрессия SHH на утиной стороне химеры казалась более похожей на утку (рис. 3). Количественный анализ18 также был использован для того, чтобы показать, что эта область экспрессии коррелирует с формойголовы 16.
Рисунок 1. Трансплантация и оценка химеризма у экспериментальных эмбрионов
(A) Дорсальный вид куриного эмбриона 8-й стадии, окрашенного в нейтральный красный цвет, показывающий расположение трансплантата и место приживления. Пунктирная линия - это приблизительный уровень, показанный в B. (B) Поперечное сечение куриного эмбриона 8-й стадии после гибридизации in situ, чтобы показать экспрессию SHH . Примерное расположение привоя показано красным пунктиром. (C) Иммуноокрашивание для обнаружения QCPN у химер перепелов и цыплят показывает, что трансплантат широко распространен и способствует только вентро-латеральной нервной трубке (стрелка) и вентральной зрительной чашечке (наконечник стрелки). (D) Большее увеличение в C. Масштабные линейки: A: 500 мкм, B: 100 мкм, C: 1 мм, D: 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2. Оценка морфологии химер перепелов и уток.
(А, Б) Два примера химер перепелов-уток на стадии 22. Эти эмбрионы имеют серьезные пороки развития, которые исключают дальнейший анализ. Масштабная линейка: 2 мм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3. Оценка химер утки-цыпленка.
(A) Нормальные эмбрионы цыплят и (B) уток на стадии 22 после гибридизации in situ для визуализации экспрессии SHH . (C) Контрольная группа цыплят и цыплят демонстрирует паттерн SHH и морфологию, напоминающую нормальный эмбрион цыпленка. (D) Химера утки-цыпленка демонстрирует измененный паттерн выражения SHH . На пересаженной стороне выражение SHH (желтая пунктирная линия) более округлое и напоминает утиный рисунок. Носовая ямка также более округлая на пересаженной стороне (желтая стрелка) по сравнению с более «щелевидной» на стороне хозяина (красная стрелка). Красная полоса обозначает среднюю линию, а трансплантат находится в правой части изображения. Масштабная линейка: 1 мм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описанный метод позволяет исследовать тканевые взаимодействия между базальным передним мозгом и прилегающей эктодермой. Этот подход отличается от предыдущих методов трансплантации переднего мозга, потому что донорская ткань была ограничена вентральным передним мозгом. Это исключает трансплантацию клеток нервного гребня, которые, как было показано, участвуют в формировании морфологии лица 9,10. Следовательно, ограничение трансплантата базальным передним мозгом было необходимо для оценки запланированных экспериментальных результатов.
В предыдущем исследовании, в котором использовалась трансплантация переднего мозга13,14, наличие экстранервной ткани не мешало интерпретации запланированных показателей результатов, поскольку результаты были либо поведенческими, либо специально проверяли среду хозяина и донора на общее развитие мозга. Это важное соображение при планировании экспериментов с использованием этих эмбриологических подходов, и осуществимость должна быть сбалансирована со строгостью. Например, требование исключить предполагаемые клетки нервного гребня создавало значительные препятствия для преодоления. Трансплантация должна была быть выполнена на ранних эмбрионах на стадии нейрулы. На этих стадиях энтодерма непосредственно примыкает к месту трансплантации, и необходимо соблюдать крайнюю осторожность, чтобы не повредить энтодерму, потому что это снижает выживаемость. Хотя неясно, повлияет ли загрязнение трансплантата энтодермой на результаты измерений, цель состояла в том, чтобы исключительно изолировать влияние вентрального переднего мозга на развитие лица. Таким образом, для этой цели была оправдана дополнительная строгость.
Необходимо учитывать скорость развития видов-хозяев и доноров. В то время как различия в показателях этих животных были использованы для оценки роли клеток нервного гребня в формировании структуры развивающегося лицевого скелета19,20, в этом случае более быстро развивающаяся нервная ткань перепелов создавала чрезвычайно уродливые эмбрионы при пересадке в медленно развивающуюся утку. Это означало, что химеризм и загрязнение должны были быть оценены в другом наборе химеров, созданных путем прививки ткани перепела к цыплятам-хозяевам, и, хотя это и не идеально, это обеспечило уверенность в технике прививки.
В целом, создание химер для оценки тканевых взаимодействий во время развития может быть мощным подходом, помогающим понять механизмы развития. На этапах планирования необходимо проявлять осторожность, чтобы гарантировать, что результаты будут как можно более убедительными, и определены соответствующие средства контроля, включающие нормальные эмбрионы и другие химеры, чтобы учесть изменения из-за хирургического вмешательства. В этом случае было очень важно использовать количественный анализ, потому что наблюдаемые изменения были незначительными.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Всем авторам раскрывать нечего.
Acknowledgments
Исследования, представленные в этой публикации, были поддержаны Национальным институтом стоматологических и черепно-лицевых исследований Национальных институтов здравоохранения под номерами R01DE019648, R01DE018234 и R01DE019638.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | TEK | TEKZR114 | |
| 35x10 mm Petri dish | Falcon | 1008 | |
| DMEM | Thermofisher | 11965084 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Neutral Red | Sigma | 553-24-2 | |
| No. 5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Pasteur Pipets | Thermofisher | 13-678-6B | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma bank, Iowa University, Iowa, USA | ||
| Scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Tungsten Needle | Fine Science Tools | 26000 |
References
- Waddington, C. Developmental Mechanics of Chicken and Duck Embryos. Nature. 125, 924-925 (1930).
- Noden, D. M. The role of the neural crest in patterning of avian cranial skeletal, connective, and muscle tissues. Developmental Biology. 96 (1), 144-165 (1983).
- Borue, X., Noden, D. M. Normal and aberrant craniofacial myogenesis by grafted trunk somitic and segmental plate mesoderm. Development. 131 (16), 3967-3980 (2004).
- Teillet, M. A., Ziller, C., Le Douarin, N. M.
- Hu, D., Marcucio, R. S., Helms, J. A. A zone of frontonasal ectoderm regulates patterning and growth in the face. Development. 130 (9), 1749-1758 (2003).
- Hu, D., Marcucio, R. S. Assessing signaling properties of ectodermal epithelia during craniofacial development. Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).
- Hu, D., Marcucio, R. S. Unique organization of the frontonasal ectodermal zone in birds and mammals. Developmental Biology. 325 (1), 200-210 (2009).
- Griffin, J. N., et al. Fgf8 dosage determines midfacial integration and polarity within the nasal and optic capsules. Developmental Biology. 374 (1), 185-197 (2013).
- Schneider, R. A., Helms, J. A. The cellular and molecular origins of beak morphology. Science. 299 (5606), 565-568 (2003).
- Tucker, A. S., Lumsden, A. Neural crest cells provide species-specific patterning information in the developing branchial skeleton. Evolution & Development. 6 (1), 32-40 (2004).
- Fish, J. L., Schneider, R. A. Assessing species-specific contributions to craniofacial development using quail-duck chimeras. Journal of Visualized Experiments. (87), (2014).
- Schneider, R. A. Neural crest and the origin of species-specific pattern. Genesis. 56 (6-7), 23219 (2018).
- Sohal, G. S. Effects of reciprocal forebrain transplantation on motility and hatching in chick and duck embryos. Brain Research. 113 (1), 35-43 (1976).
- Chen, C. C., Balaban, E., Jarvis, E. D. Interspecies avian brain chimeras reveal that large brain size differences are influenced by cell-interdependent processes. PLoS One. 7 (7), 42477 (2012).
- Hu, D., Marcucio, R. S. Neural crest cells pattern the surface cephalic ectoderm during FEZ formation. Developmental Dynamics. 241 (4), 732-740 (2012).
- Hu, D., et al. Signals from the brain induce variation in avian facial shape. Developmental Dynamics. 244 (9), 1133-1143 (2015).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Xu, Q., et al. Correlations Between the Morphology of Sonic Hedgehog Expression Domains and Embryonic Craniofacial Shape. Evolutionary Biology. 42 (3), 379-386 (2015).
- Eames, B. F., Schneider, R. A. The genesis of cartilage size and shape during development and evolution. Development. 135 (23), 3947-3958 (2008).
- Merrill, A. E., Eames, B. F., Weston, S. J., Heath, T., Schneider, R. A. Mesenchyme-dependent BMP signaling directs the timing of mandibular osteogenesis. Development. 135 (7), 1223-1234 (2008).
