Summary
Este artículo describe una técnica de trasplante de tejido que fue diseñada para probar las propiedades de señalización y patrones del prosencéfalo basal durante el desarrollo craneofacial.
Abstract
El embrión aviar se ha utilizado como sistema modelo durante más de un siglo y ha llevado a una comprensión fundamental del desarrollo de los vertebrados. Una de las fortalezas de este sistema modelo es que el efecto y la interacción entre los tejidos se pueden evaluar directamente en embriones quiméricos. Hemos demostrado previamente que las señales del cerebro anterior contribuyen a la morfogénesis facial al regular la forma del dominio de expresión del erizo sónico (SHH) en la zona ectodérmica frontonasal (FEZ). En este artículo, se describe el método para generar las quimeras del cerebro anterior y proporcionar ilustraciones de los resultados de estos experimentos.
Introduction
Gran parte de la investigación contemporánea en biología del desarrollo se centra en el papel de los genes en la formación de embriones. Existen buenas herramientas para examinar los mecanismos de desarrollo desde una perspectiva genética. Sin embargo, los embriones se ensamblan y sufren morfogénesis en respuesta a las interacciones tisulares. El sistema aviar es una herramienta clásica utilizada para evaluar la variedad de interacciones tisulares que regulan el desarrollo por las siguientes razones: la embriología es bien entendida, los embriones son fácilmente accesibles, las herramientas para el análisis de los sistemas aviares están bien desarrolladas y los embriones son baratos.
El sistema de trasplante aviar ha sido ampliamente empleado para el rastreo del linaje y para evaluar las interacciones tisulares durante el desarrollo durante casi un siglo 1,2,3,4. Este sistema fue utilizado para investigar un centro de señalización, la Zona Ectodérmica Frontonasal (FEZ), que regula la morfogénesis del maxilar superior5, y se publicó un video describiendo esa técnica previamente6. Además de la codorniz-polluelo, otras especies también se han utilizado para producir quimeras para el análisis de las interacciones tisulares. Por ejemplo, el ratón FEZ fue trasplantado de ratones salvajes tipo7 y mutantes8, y otros han utilizado sistemas de pato, codorniz y polluelo para evaluar el papel de la cresta neural en el modelado del esqueleto facial 9,10,11,12.
En este trabajo, se evaluó el papel del cerebro anterior en la regulación del patrón de expresión génica en el FEZ mediante el trasplante del prosencéfalo ventral recíprocamente entre embriones de codorniz, pato y pollo, porque se requiere una señal del cerebro anterior para inducir la expresión del erizo sónico en el FEZ. Los trasplantes de prosencéfalo no son únicos en el campo. Estos trasplantes se utilizaron para evaluar el desarrollo de la motilidad en embriones de codorniz y pato13, aunque en estos experimentos también se trasplantaron tejidos que contribuyeron a derivados no neurales. En otros trabajos, los circuitos auditivos en aves han sido evaluados por trasplante de prosencéfalo14, pero estos trasplantes contenían presuntas células de la cresta neural, que contribuyen a la forma facial 9,10 y participan en la regulación de la expresión de SHH en el FEZ 15. Por lo tanto, se diseñó un sistema para trasplantar solo el prosencéfalo ventral de una especie de ave a otra antes del cierre del tubo neural para evaluar el papel del cerebro en la forma facial16 (Figura 1A, B). Este método carecía de contaminación de la cresta neural del injerto. En este artículo, se ilustra el método y se describen los resultados esperados, y se discuten los desafíos enfrentados.
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Protocol
El pato blanco de Pekín (Anas platyrhynchos), el pollo Livorno blanco (Gallus gallus) y la codorniz japonesa (Cortunix coturnix japonica) se incuban a 37 °C en una cámara humidificada hasta que se ajustan a HH7/817.
1. Preparación del tejido del donante
NOTA: Se ha descrito la preparación de reactivos y herramientas y cómo abrir huevos para la manipulación experimental6.
- Prepare medios DMEM con rojo neutro, una pipeta de transferencia de vidrio y agujas de tungsteno afiladas.
- Exponga los embriones (como se muestra en6).
- Recolectar injertos de tejido del lado izquierdo del prosencéfalo basal de embriones en etapa 7/8. Use agujas de tungsteno afiladas curvas6 para incidir suavemente un pedazo del prosencéfalo que mide ~0.3 mm de largo por 0.2 mm de ancho, asegurándose de no incluir el endodermo subyacente deslizando la aguja debajo del cerebro anterior para que la aguja quede paralela al eje del tubo neural.
- Usando la pipeta de transferencia de vidrio, recoja el injerto del embrión donante.
- Transfiera el injerto a DMEM que contenga rojo neutro (0.01% en PBS, 23 ° C) durante 2 minutos para teñirlo, y luego coloque el injerto teñido en DMEM que no contenga rojo neutro hasta que esté listo para el injerto.
2. Preparación del anfitrión
- Incubar huevos fertilizados de gallina blanca Livorno (Gallus gallus) a 37 °C en una cámara humidificada hasta HH7/8 17.
- Exponga los embriones (como se muestra en6).
- Usando agujas de tungsteno afiladas, prepare el sitio del injerto cortando suavemente, luego extrayendo una pieza de 0.3 mm por 0.2 mm de prosencéfalo basal del lado izquierdo para acomodar el injerto como se hizo para aislar el tejido del donante.
- Tenga cuidado de evitar la interrupción excesiva del endodermo subyacente, que será evidente ya que los gránulos de yema comenzarán a filtrarse a través de cualquier desgarro que se haga. Esto requiere práctica y no todos los intentos tendrán éxito.
- Después de transferir al huésped6, coloque el injerto para reemplazar el prosencéfalo basal extirpado del huésped.
- Coloque la cinta adhesiva firmemente sobre el orificio y devuelva el embrión a la incubadora a 37 °C durante el tiempo adecuado para el análisis.
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Representative Results
Evaluación del quimerismo y la contaminación por trasplantes
Para evaluar las quimeras, se debe abordar el alcance del quimerismo y la contaminación del injerto con otros tipos de células. La creación de quimeras mediante el trasplante de tejidos de codorniz en embriones de pollo permite este tipo de análisis. Usando el anticuerpo QCPN las células de codorniz se pueden visualizar y distinguir de los tejidos del huésped (Figura 1 C, D). En este caso, solo los tejidos derivados del prosencéfalo ventral se tiñeron con el anticuerpo, lo que indica que el injerto no estaba contaminado con otros tipos de células, incluida la cresta neural. El alcance del quimerismo podría estimarse a partir de estas secciones utilizando la estereología para contar las células huésped y donante o evaluando el área ocupada por el donante y los tejidos del huésped.
Evaluación de resultados morfológicos y moleculares
El objetivo fue evaluar el impacto del prosencéfalo ventral sobre la morfología facial y la expresión de SHH en el FEZ. Inicialmente, el tejido de codorniz se trasplantó en embriones de pato para usar QCPN para evaluar el quimerismo como se describió anteriormente. Sin embargo, el cerebro de codorniz de desarrollo más rápido condujo a quimeras severamente deformadas (Figura 2), lo que impidió este enfoque en los experimentos. Debido a esta limitación, el trasplante de tejidos de pato en embriones de pollo se utilizó para el análisis experimental. Si bien esto no permitió la evaluación del quimerismo, se utilizó el sistema de pollos de codorniz para hacer esto y confirmó que todos los injertos estaban compuestos solo de tejido neural16. Las quimeras pato-polluelo resultantes tenían cambios morfológicos que sugerían que el cerebro participaba en la regulación de la morfología (Figura 3). El lado del pato del trasplante parecía desarrollarse más lentamente y parecía más parecido al pato. Se utilizó un análisis cuantitativo para determinar que estas quimeras se desplazaron hacia la morfología del pato16. Como etapa de control, se utilizaron embriones de pato y pollito, así como quimeras de polluelo.
Se utilizó hibridación in situ de montaje completo para evaluar la expresión de SHH . Similar a la morfología, la expresión de SHH en el lado del pato de la quimera parecía más parecida a la del pato (Figura 3). También se utilizó un análisis cuantitativo18 para mostrar que este dominio de expresión se correlacionó con la forma de la cabeza16.
Figura 1. Trasplante y evaluación del quimerismo en embriones experimentales
(A) Vista dorsal del embrión de pollo en etapa 8 teñido de rojo neutro que muestra la ubicación del injerto y el sitio del injerto. La línea punteada es el nivel aproximado que se muestra en B. (B) Sección transversal a través de un embrión de pollo en etapa 8 después de la hibridación in situ para mostrar la expresión de SHH . Se muestra la ubicación aproximada del injerto, cuadro punteado rojo. (C) La inmunotinción para detectar QCPN en quimeras de codorniz muestra que el injerto está muy extendido y contribuye solo al tubo neural ventrolateral (flecha) y la copa óptica ventral (punta de flecha). (D) Mayor aumento en C. Barras de escala: A: 500 μm, B: 100 μm, C: 1 mm, D: 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Evaluación de la morfología de quimeras de codorniz-pato.
(A, B) Dos ejemplos de quimeras de codorniz en la etapa 22. Estos embriones tienen malformaciones graves que impiden un análisis posterior. Barra de escala: 2 mm Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Evaluación de quimeras pato-polluelos.
(A) embriones normales de pollo y (B) de pato en la etapa 22 después de la hibridación in situ de montaje completo para visualizar la expresión de SHH . (C) Un control de pollito-pollito muestra un patrón de SHH y morfología que se asemeja a un embrión de pollito normal. (D) Una quimera pato-polluelo muestra un patrón alterado de expresión de SHH . En el lado trasplantado, la expresión de SHH (línea punteada amarilla) es más redondeada y se asemeja al patrón de pato. La fosa nasal también es más redondeada en el lado trasplantado (flecha amarilla) en comparación con la apariencia más "hendidura" en el lado del huésped (flecha roja). La barra roja indica la línea media y el trasplante está en el lado derecho de la imagen. Barra de escala: 1 mm Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El método descrito permite examinar las interacciones tisulares entre el prosencéfalo basal y el ectodermo adyacente. Este enfoque difiere de los métodos anteriores de trasplante del cerebro anterior, porque el tejido del donante estaba restringido al prosencéfalo ventral. Esto elimina el trasplante de las células de la cresta neural, que han demostrado participar en la morfología facial de patrones 9,10. Por lo tanto, restringir el injerto al prosencéfalo basal fue esencial para evaluar los resultados experimentales planificados.
En la investigación previa que empleó trasplantes de prosencéfalo13,14 la presencia de tejido extraneural no interfirió con la interpretación de las medidas de resultado planificadas, porque los resultados fueron conductuales o probaron específicamente el entorno del huésped y del donante en el desarrollo general del cerebro. Esta es una consideración importante en el diseño de experimentos utilizando estos enfoques embriológicos y la viabilidad debe equilibrarse con rigor. Por ejemplo, el requisito de excluir las presuntas células de la cresta neural creó obstáculos significativos que superar. Los trasplantes tuvieron que realizarse en embriones en etapa temprana de la neurula. En estas etapas, el endodermo está inmediatamente adyacente al sitio del trasplante, y se tuvo que tener mucho cuidado para evitar dañar el endodermo, ya que esto reduce la supervivencia. Si bien no está claro que la contaminación del injerto por endodermo afectaría las medidas de resultado, el objetivo era aislar exclusivamente el efecto del prosencéfalo ventral en el desarrollo facial. Por lo tanto, para este propósito se justificaba el rigor adicional.
Es necesario tener en cuenta la tasa de desarrollo de las especies hospedadoras y donantes. Si bien las diferencias en las tasas de estos animales se han utilizado para evaluar el papel de las células de la cresta neural en el modelado del esqueleto facial en desarrollo19,20, en este caso, el tejido neural de codorniz de desarrollo más rápido creó embriones extremadamente malformados cuando se trasplantaron en el pato de desarrollo más lento. Esto significaba que el quimerismo y la contaminación tenían que evaluarse en otro conjunto de quimeras creadas al injertar tejido de codorniz en huéspedes de polluelos, y aunque no era ideal, esto proporcionó confianza en la técnica de injerto.
En general, la creación de quimeras para evaluar las interacciones de los tejidos durante el desarrollo puede ser un enfoque poderoso para ayudar a comprender los mecanismos del desarrollo. Se debe prestar atención durante las etapas de planificación para garantizar que los resultados sean lo más concluyentes posible, y se deben determinar los controles apropiados que incluyen embriones normales y otras quimeras para tener en cuenta la variación debida a la cirugía. En este caso, fue muy importante emplear análisis cuantitativos, porque los cambios observados fueron sutiles.
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Disclosures
Todos los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional de Investigación Dental y Craneofacial de los Institutos Nacionales de Salud bajo los números de adjudicación R01DE019648, R01DE018234 y R01DE019638.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | TEK | TEKZR114 | |
| 35x10 mm Petri dish | Falcon | 1008 | |
| DMEM | Thermofisher | 11965084 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Neutral Red | Sigma | 553-24-2 | |
| No. 5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Pasteur Pipets | Thermofisher | 13-678-6B | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma bank, Iowa University, Iowa, USA | ||
| Scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Tungsten Needle | Fine Science Tools | 26000 |
References
- Waddington, C. Developmental Mechanics of Chicken and Duck Embryos. Nature. 125, 924-925 (1930).
- Noden, D. M. The role of the neural crest in patterning of avian cranial skeletal, connective, and muscle tissues. Developmental Biology. 96 (1), 144-165 (1983).
- Borue, X., Noden, D. M. Normal and aberrant craniofacial myogenesis by grafted trunk somitic and segmental plate mesoderm. Development. 131 (16), 3967-3980 (2004).
- Teillet, M. A., Ziller, C., Le Douarin, N. M.
- Hu, D., Marcucio, R. S., Helms, J. A. A zone of frontonasal ectoderm regulates patterning and growth in the face. Development. 130 (9), 1749-1758 (2003).
- Hu, D., Marcucio, R. S. Assessing signaling properties of ectodermal epithelia during craniofacial development. Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).
- Hu, D., Marcucio, R. S. Unique organization of the frontonasal ectodermal zone in birds and mammals. Developmental Biology. 325 (1), 200-210 (2009).
- Griffin, J. N., et al. Fgf8 dosage determines midfacial integration and polarity within the nasal and optic capsules. Developmental Biology. 374 (1), 185-197 (2013).
- Schneider, R. A., Helms, J. A. The cellular and molecular origins of beak morphology. Science. 299 (5606), 565-568 (2003).
- Tucker, A. S., Lumsden, A. Neural crest cells provide species-specific patterning information in the developing branchial skeleton. Evolution & Development. 6 (1), 32-40 (2004).
- Fish, J. L., Schneider, R. A. Assessing species-specific contributions to craniofacial development using quail-duck chimeras. Journal of Visualized Experiments. (87), (2014).
- Schneider, R. A. Neural crest and the origin of species-specific pattern. Genesis. 56 (6-7), 23219 (2018).
- Sohal, G. S. Effects of reciprocal forebrain transplantation on motility and hatching in chick and duck embryos. Brain Research. 113 (1), 35-43 (1976).
- Chen, C. C., Balaban, E., Jarvis, E. D. Interspecies avian brain chimeras reveal that large brain size differences are influenced by cell-interdependent processes. PLoS One. 7 (7), 42477 (2012).
- Hu, D., Marcucio, R. S. Neural crest cells pattern the surface cephalic ectoderm during FEZ formation. Developmental Dynamics. 241 (4), 732-740 (2012).
- Hu, D., et al. Signals from the brain induce variation in avian facial shape. Developmental Dynamics. 244 (9), 1133-1143 (2015).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Xu, Q., et al. Correlations Between the Morphology of Sonic Hedgehog Expression Domains and Embryonic Craniofacial Shape. Evolutionary Biology. 42 (3), 379-386 (2015).
- Eames, B. F., Schneider, R. A. The genesis of cartilage size and shape during development and evolution. Development. 135 (23), 3947-3958 (2008).
- Merrill, A. E., Eames, B. F., Weston, S. J., Heath, T., Schneider, R. A. Mesenchyme-dependent BMP signaling directs the timing of mandibular osteogenesis. Development. 135 (7), 1223-1234 (2008).
